Artykuł metodologiczny

Przygotowanie tkanki mózgowej nowonarodzonego szczura do ultrastrukturalnej analizy morfometrycznej rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych na zakończeniach nerwowych

DOI:

10.3791/59694

⸱

7 czerwca 2019

 , 
1Department of Anesthesiology, University of Virginia Health System, 2Department of Anesthesiology, Universita' degli Studi di Padova

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy procedury przetwarzania tkanki mózgowej nowonarodzonego szczura w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości mikrofotografii elektronowej do analizy morfometrycznej rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych na zakończeniach nerwowych. Mikrofotografie uzyskane tymi metodami mogą być również wykorzystane do badania morfologii wielu innych składników komórkowych i ich wymiarowych relacji strukturalnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasze laboratorium i wiele innych wykorzystało wysoką zdolność rozdzielczą transmisyjnej mikroskopii elektronowej do badania morfologii i organizacji przestrzennej pęcherzyków synaptycznych. W celu uzyskania wysokiej jakości mikrofotografii elektronowych, które mogą zapewnić stopień szczegółowości morfologicznej niezbędny do analizy ilościowej rozmieszczenia pęcherzyków presynaptycznych, kluczowe znaczenie ma optymalne przygotowanie próbki. Utrwalanie chemiczne jest pierwszym krokiem w procesie przygotowania próbki i ma ogromne znaczenie dla zachowania drobnej ultrastruktury. Utrwalenie naczyń krwionośnych roztworem aldehydu glutarowego i formaldehydu, a następnie potraktowanie próbek wyciętych wibratomem tetratlenkiem osmu, stabilizuje maksymalną liczbę cząsteczek, zwłaszcza białek i lipidów, i skutkuje lepszą konserwacją ultrastruktury. Tkanka jest następnie przetwarzana za pomocą barwienia przeciwstawnego, sekwencyjnego odwadniania i zatapiania w żywicy. Barwienie en bloc octanem uranylu (tj. barwienie tkanki wyciętej wibratomem przed zatopieniem w żywicy) zwiększa kontrast endogenny i stabilizuje składniki komórek przed ekstrakcją podczas przetwarzania próbki. Kontrast można dodatkowo zwiększyć, nakładając octan uranylu jako post-stain na ultracienkie odcinki. Podwójne barwienie ultracienkich skrawków cytrynianem ołowiu po leczeniu octanem uranylu poprawia również rozdzielczość obrazu, poprzez intensyfikację nieprzezroczystości elektronów struktur zawierających kwas nukleinowy poprzez selektywne wiązanie ołowiu z octanem uranylu. Transmisyjna mikroskopia elektronowa jest potężnym narzędziem do charakteryzowania szczegółów morfologicznych pęcherzyków synaptycznych oraz ilościowego określania ich wielkości i organizacji przestrzennej w końcowym bulionie. Ponieważ jednak wykorzystuje utrwaloną tkankę, transmisyjna mikroskopia elektronowa może dostarczyć tylko pośrednich informacji na temat żywych lub ewoluujących procesów. Dlatego należy rozważyć inne techniki, gdy głównym celem jest badanie dynamicznych lub funkcjonalnych aspektów transportu pęcherzyków synaptycznych i egzocytozy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metody przygotowania tkanki mózgowej nowonarodzonego szczura w celu uzyskania wysokiej jakości mikrofotografii elektronowych do dogłębnej analizy morfometrycznej przestrzennego rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych na zakończeniach nerwowych1,2. Mikrografie o wysokim kontraście, które można uzyskać, przetwarzając próbki zgodnie z tymi metodami, mogą być również wykorzystane do badania szczegółowej morfologii wielu składników komórkowych i ich wymiarowych relacji strukturalnych3,4.

Transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM) jest potężnym narzędziem do ilościowego badania morfologii organelli i innych struktur komórkowych. Od tej dekady nie ma innych metod badawczych, które mogłyby zapewnić taki sam stopień rozdzielczości błon lipidowych i organelli bez znakowania immunologicznego, z wyjątkiem kriofiksacji przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem. Jednak techniki substytucji przez zamrożenie nie są powszechnie stosowane i zwykle wymagają drogiego sprzętu i długiego czasu przygotowania.

Aby skorzystać z wysokiej zdolności rozdzielczej TEM, optymalne przygotowanie próbki jest niezwykle ważne. Głównymi celami przygotowania próbki są zachowanie struktury tkanki przy minimalnych zmianach w stosunku do stanu żywego, zwiększenie kontrastu próbki oraz stabilizacja tkanki przed ekstrakcją składników komórkowych podczas przetwarzania i ekspozycji na wiązkę elektronów. Na przestrzeni lat kilka laboratoriów wprowadziło i udoskonaliło liczne protokoły przygotowania tkanek TEM. Wielu z nich skupiło się na metodach optymalnej wizualizacji pęcherzyków synaptycznych5,6,7,8,9,10,11. Spośród wielu dobrze znanych, złotych standardów, które są obecnie stosowanymi, wybraliśmy procedury utrwalania chemicznego, po utrwaleniu, barwienia en bloc, sekwencyjnego odwadniania, zatapiania żywicy i barwienia końcowego, które mają na celu zachowanie optymalnej struktury tkanki i osiągnięcie doskonałego kontrastu obrazu. Warto zauważyć, że zachowanie drobnej ultrastruktury może być szczególnie trudne podczas pracy z tkanką mózgową nowonarodzonego szczura. W rzeczywistości ośrodkowy układ nerwowy bardzo młodych zwierząt charakteryzuje się wyższą zawartością wody niż mózg dorosłego, wyraźniejszym powiększeniem przestrzeni zewnątrzkomórkowych i luźniejszymi połączeniami między komórkami12. To sprawia, że tkanka mózgowa nowonarodzonego szczura jest głęboko wrażliwa na zmiany w osmolarności i wyjątkowo podatna na sztuczne kurczenie się i/lub pęcznienie podczas przetwarzania za pomocą sekwencyjnych roztworów o różnej toniczności12. W związku z tym w naszych metodach wykorzystano rozwiązania do przetwarzania próbek, których osmolarność jest jak najbardziej zbliżona do mózgu nowonarodzonego szczura. Naszym celem było uzyskanie wysokiej jakości obrazów z mikroskopii elektronowej o wysokiej rozdzielczości do ilościowej oceny przestrzennego rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych na zakończeniach nerwowych. W szczególności staraliśmy się zmierzyć liczbę pęcherzyków w zakończeniu nerwowym, odległość pęcherzyków synaptycznych od presynaptycznej błony plazmatycznej, liczbę pęcherzyków zadokowanych na błonie presynaptycznej, rozmiar pęcherzyków synaptycznych i odległości między pęcherzykami1.

Zadowalające utrwalenie chemiczne jest warunkiem koniecznym do uzyskania wysokiej jakości mikrofotografii elektronowych, które mogą dostarczyć szczegółów morfologicznych niezbędnych do badania morfologii pęcherzyków synaptycznych i organizacji przestrzennej. Chociaż istnieje kilka sposobów utrwalania, utrwalanie tkanki mózgowej przez perfuzję naczyniową jest zdecydowanie lepsze od innych metod. Ponieważ utrwalenie poprzez perfuzję naczyniową rozpoczyna się natychmiast po zatrzymaniu krążenia ogólnoustrojowego, skraca to odstęp między odtlenieniem tkanki mózgowej a sieciowaniem białek z utrwalaczami, co skutkuje minimalnymi zmianami w strukturze komórki. Ponadto osiąga szybką i równomierną penetrację, dzięki szybkiemu przepływowi utrwalacza z łożyska naczyniowego do przedziałów zewnątrzkomórkowych i komórkowych12,13,14. Pierwotne utrwalenie aldehydem glutarowym, a następnie wtórne utrwalenie (po utrwaleniu) tetratlenkiem osmu, zapewnia doskonałe zachowanie drobnej struktury15,16,17. Mieszanina aldehydu glutarowego i paraformaldehydu ma dodatkową zaletę w postaci szybszej penetracji do tkanki12.

Ponieważ tkanki biologiczne nie są wystarczająco sztywne, aby można je było ciąć na cienkie odcinki bez wsparcia matrycy żywicznej, muszą one zostać osadzone w podłożu przed cienkim cięciem. Niemieszające się z wodą żywice epoksydowe są powszechnie stosowane jako medium do zatapiania w TEM. W przypadku stosowania tego typu matrycy, cała wolna woda w próbce musi zostać zastąpiona rozpuszczalnikiem organicznym przed infiltracją żywicy. Woda jest usuwana przez przepuszczenie próbki przez serię roztworów o rosnących stężeniach etanolu i/lub acetonu12. W tym protokole próbki są najpierw płasko osadzane między elastycznymi arkuszami aklaracji, a następnie umieszczane w kapsułce. Efektem końcowym jest tkanka znajdująca się na końcu cylindrycznego bloku żywicy, która ma idealną geometrię, aby w jak najmniejszym stopniu ulegała drganiom powstającym podczas cięcia mikrotomem.

Barwienie metalami ciężkimi w celu zwiększenia kontrastu tkanek endogennych to kolejny ważny aspekt przygotowania próbki. Kontrast obrazu w TEM jest spowodowany rozpraszaniem elektronów przez atomy w tkance. Jednak materiały biologiczne składają się w dużej mierze z cząsteczek o niskiej masie atomowej (tj. węgla, wodoru, tlenu i azotu). Dlatego wytworzenie wystarczającego kontrastu rozpraszającego wymaga włączenia atomów o dużej masie atomowej do składników komórkowych tkanki. Osiąga się to poprzez barwienie próbki metalami ciężkimi12,18,19. Tetratlenek osmu, uran i ołów, które silnie wiążą się z lipidami, są najczęstszymi metalami ciężkimi stosowanymi jako barwienie elektronów.

Osm (liczba atomowa 76) jest jednym z najgęstszych istniejących metali. Jest to zarówno utrwalacz, jak i plama, chociaż jego podstawową rolą w TEM jest bycie niezawodnym utrwalaczem12. Spośród różnych stosowanych protokołów utrwalania, metoda podwójnego utrwalania aldehydem glutarowym, a następnie osmem jest najbardziej skuteczna w zmniejszaniu ekstrakcji składników komórkowych podczas przygotowywania próbki. Te dwa utrwalacze są używane do stabilizacji maksymalnej liczby różnych typów cząsteczek, zwłaszcza białek i lipidów, i zapewniają doskonałe zachowanie ultrastruktury tkanki12,14,15,16,17.

Uran (liczba atomowa 92) jest najcięższym metalem używanym jako barwnik elektronowy, najczęściej w postaci octanu uranylu. Podobnie jak osm, działa jako barwnik i utrwalacz, chociaż jego główną rolą w TEM jest plama20,21. Struktury błoniaste zawierające kwasy nukleinowe są silnie i preferencyjnie barwione solami uranylowymi w tkankach utrwalonych aldehydami22,23. Traktowanie tkanek octanem uranylu po osmikacji, a przed odwodnieniem, powoduje stabilizację struktur błoniastych i zawierających kwasy nukleinowe, a także zwiększony kontrast i pozwala na identyfikację niektórych szczegółów strukturalnych, które nie byłyby łatwe do wykrycia w próbkach barwionych samym osmem12,24,25. Uważa się, że octan uranylu może stabilizować delikatną strukturę poprzez połączenie ze zredukowanym osmem, który został osadzony na błonach lipidowych podczas osmikacji24. Maksymalny kontrast uzyskuje się, gdy octan uranylu jest nakładany przed zatopieniem i jako post-stainin w cienkich sekcjach12.

Ołów (liczba atomowa 82) jest najczęściej używanym barwnikiem do TEM i jest głównie używany do barwienia cienkich odcinków. Sole ołowiu mają wysoką nieprzezroczystość elektronów i wykazują powinowactwo do szerokiego zakresu struktur komórkowych, w tym błon, białek jądrowych i cytoplazmatycznych, kwasów nukleinowych i glikogenu26,27. Gdy stosowana jest metoda podwójnego barwienia (tj. po barwieniu octanem uranylu następuje obróbka ołowiem), ten ostatni działa jako twórca barwienia octanem uranylu. Na przykład, barwienie chromatyny ołowiem utrwalonym aldehydem glutarowym zwiększa trzykrotnie wychwyt octanu uranylu28,29,30,31,32. Ołów wzmacnia również zabarwienie nadawane przez inne metale, takie jak osm. Uważa się, że sole ołowiu zabarwiają błony tkanek utrwalonych przez osm, przyłączając się do polarnej grupy fosfatydów w obecności zredukowanego osmu33. Potencjalną wadą barwienia zarówno octanem uranylu, jak i ołowiem, szczególnie przez dłuższy czas, jest to, że wiele różnych elementów strukturalnych jest barwionych jednakowo i niespecyficznie, a zatem nie można ich łatwo odróżnić od siebie12.

Niedawne wprowadzenie alternatywnych źródeł światła, takich jak w optycznej mikroskopii lokalizacyjnej aktywowanej fotowoltą, znacznie poprawiło rozdzielczość mikroskopii świetlnej34. Ponieważ jednak mikroskopia świetlna opiera się na metodach histochemicznych i immunocytochemicznych do wizualizacji indywidualnie znakowanych białek lub enzymów, moc TEM do wyświetlania wszystkich elementów strukturalnych jednocześnie pozostaje niezrównana w dogłębnych badaniach morfologii i relacji wymiarowych struktur tkankowych. W szczególności żadna inna technika nie może dostarczyć szczegółów morfologicznych niezbędnych do przeprowadzenia analizy morfometrycznej rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych w napadach nerwów presynaptycznych. Niemniej jednak ważne jest, aby pamiętać, że mikrofotografie elektronowe rejestrują strukturę tkanki po śmierci organizmu, a zatem nie mogą dostarczyć informacji na temat dynamiki transportu pęcherzyków presynaptycznych i egzocytozy. W związku z tym należy rozważyć inne narzędzia, takie jak obrazowanie na żywo barwnikiem FM i elektrofizjologia klamry, gdy głównym celem jest badanie dynamicznych i/lub funkcjonalnych aspektów transportu pęcherzyków synaptycznych i egzocytozy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Wirginii (Charlottesville, VA) i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health.

1. Utrwalenie przez perfuzję naczyniową

UWAGA: Ogólny opis metody perfuzji naczyniowej mózgu szczura został już szczegółowo opisany w tym dzienniku13 i wykracza poza zakres tego protokołu. Jednak następujące kroki są specyficzne dla przygotowania tkanki mózgowej nowonarodzonego szczura w celu uzyskania wysokiej jakości mikrofotografii elektronowych do analizy ilościowej rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych na końcach presynaptycznych.

  1. Przygotuj 4% paraformaldehydu
    1. Umieścić 800 ml 0,1 M buforu fosforanowego (PB) w szklanej zlewce o pojemności 2 l na płycie mieszającej pod wyciągiem. Podgrzać do temperatury około 60 °C bez gotowania buforu.
    2. Dodać 40 g proszku paraformaldehydu. Mieszaj w sposób ciągły
    3. Podczas pomiaru pH dodawaj małe krople 10 N NaOH, aż roztwór się klaruje. Końcowe pH powinno wynosić 7,2-7,4.
    4. Dodać pozostałe 0,1 mln PB do końcowej objętości 1 l. Pozostawić do ostygnięcia, przefiltrować za pomocą membrany 0,45 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.
      nuta: Przygotuj świeży paraformaldehyd dzień przed perfuzją.
      ostrożność: Wdychanie oparów aldehydu może powodować objawy ze strony nosa i podrażnienie dróg oddechowych. Kontakt ze skórą powoduje zapalenie skóry. Z aldehydami należy obchodzić się w dygestorii w rękawicach, fartuchu ochronnym i okularach ochronnych
  2. Przygotuj rozwiązanie Tyrode
    1. Umieścić 1 l wody destylowanej w szklanej zlewce na płycie mieszającej. Do zlewki dodać NaCl (8 g), KCl (0,15 g), CaCl2 (0,1 g), MgCl2 (0,006 g), NaH2PO4 (0,055 g), NaHCO3 (1 g) i dekstrozę (1 g).
    2. Ciągle mieszać i mierzyć pH. Utrzymuj pH między 7,2 a 7,4,
      nuta: Rozwiązanie Tyrode jest również dostępne na rynku.
  3. Zmieszać 4% paraformaldehydu z aldehydem glutarowym w końcowym stężeniu 2%. Dodać 40 ml 50% aldehydu glutarowego do 1 l 4% paraformaldehydu do mikroskopii elektronowej. Dobrze wymieszaj w talerzu mieszającym
    nuta: Około 100 ml roztworu utrwalającego paraformaldehyd i aldehyd glutarowy jest potrzebne do perfuzji ciała nowonarodzonego szczura. Dlatego co najmniej 10 nowonarodzonych szczurów można perfuzjować 1 litrem utrwalacza. Nie mieszaj paraformaldehydu i aldehydu glutarowego aż do momentu bezpośrednio przed użyciem. Doprowadź wszystkie roztwory do temperatury pokojowej przed perfuzją.
  4. Po uzyskaniu dostępu do lewej komory (patrz protokół perfuzji całego zwierzęcia13), przepłukiwać układ naczyniowy roztworem Tyrode przez 30 s przy ciśnieniu perfuzji 120 mmHg.
    nuta: Powodzenie perfuzji zależy częściowo od całkowitego wykluczenia krwi z łożyska naczyniowego
  5. Przepłukać roztworem aldehydu paraformaldehydowego i glutarowego pod tym samym ciśnieniem przez 10 min.
    nuta: Utrzymanie stałego ciśnienia perfuzyjnego jest niezbędne, aby uniknąć wprowadzania artefaktów. Ponadto temperatura perfuzatu nie powinna być niższa od temperatury ciała szczura, aby uniknąć zwężenia naczyń krwionośnych
  6. Usunąć unieruchomiony mózg z czaszki i umieścić w świeżym utrwalaczu paraformaldehydowo-glutarowym w temperaturze 4 °C na noc.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

2. Krojenie mózgu

  1. Osadź nieruchomy mózg w 4% agarozie i przyklej blok mózg-agaroza na etapie wibratomu
    nuta: Inne laboratoria uzyskały dobrej jakości skrawki, uzyskując stabilny blok na wibratomie bez podparcia agarem
  2. Przekroje o grubości 50 μm. Ustaw mikrotom na niską częstotliwość i prędkość.
    nuta: Skrawki mogą być przechowywane w 0,1 M PB z 0,05% azydkiem sodu w temperaturze 4 °C przez kilka lat.
  3. Umieścić skrawki w 0,1 M PB na szalce Petriego, zbadać skrawki pod mikroskopem preparacyjnym i wybrać próbki do zatopienia
    nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

3. Płukanie

UWAGA: Ważne jest, aby przepłukać próbkę po utrwaleniu aldehydami, a przed utrwaleniem osmem, ponieważ resztkowe utrwalacze mogą wytwarzać osady osmu

  1. Odpipetować 0,1 M PB do krótkiej, szklanej fiolki z szerokim otworem i nakrętką. Umieścić jedną próbkę w każdej fiolce. Całkowicie przykryj próbkę, aby nie wyschła.
    nuta: Próbki należy przechowywać w tej samej fiolce od tego etapu przez wszystkie zmiany roztworu, takie jak utrwalanie, odwadnianie i infiltracja, aż będą gotowe do osadzenia na płasko.
  2. Przepłukać próbkę w 0,1 M PB przez 3 minuty x 2, a następnie usunąć PB za pomocą mikropipety.
    nuta: Ponieważ mózg nowonarodzonego szczura jest bardzo wrażliwy na zmiany w osmolarności12,35,36,37, przeprowadź płukanie w tym samym pojeździe, w którym zastosowano mieszaninę utrwalającą

4. Po fiksacji za pomocą osmu

  1. Przygotowanie tetratlenku osmu (OsO4)
    nuta: Laboratorium autorskie wykorzystuje OsO4 4% dostarczany w roztworze wodnym w szklanych ampułkach (5 ml OsO4 4% w H2O). Inne laboratoria z powodzeniem używały kryształów OsO4. Jednak do rozpuszczenia kryształów OsO4 w pojeździe potrzeba kilku godzin.
    1. Weź 5 ml (jedna ampułka) 4% OsO4/H2O, otwórz i umieść w brązowej szklanej butelce
      nuta: OsO4 jest silnym utleniaczem i łatwo redukuje się pod wpływem światła. Redukcji można uniknąć podczas przygotowywania, umieszczając OsO4 w brązowej szklanej butelce
    2. Dodaj 5 ml 0,2 M PB. Daje to 10 ml 2% OsO4/0,1 M PB.
      nuta: Ponieważ mózg nowonarodzonego szczura jest bardzo wrażliwy na zmiany osmolarności, użyj tego samego bufora do przygotowania utrwalaczy aldehydu i roztworu OsO412,35,36,37
    3. Dodaj dodatkowe 10 ml 0,1 M PB. W ten sposób otrzyma się końcowy roztwór 20 ml 1% OsO4 w 0,1 m PB.
    4. Za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml wyposażonej w długą igłę pobrać 1% OsO4 i umieścić go w brązowej szklanej butelce lub fiolce z cukrem pokrytym folią aluminiową.
      ostrożność: OsO4 jest niezwykle lotny, a jego opary są toksyczne dla nosa, oczu i gardła. Wszystkie prace należy wykonywać pod wyciągiem przy użyciu rękawic i odzieży ochronnej, a żadna część ciała nie powinna być narażona na działanie OsO4. Postępowanie z odpadami i ich utylizacja powinny odbywać się zgodnie z wytycznymi Twojej instytucji. Niewykorzystany OsO4 należy przechowywać w szczelnie zakorkowanej butelce z brązowego szkła z teflonową wkładką na szklanym korku, owinąć butelkę w podwójną folię aluminiową i przechowywać w eksykatorze. W obecności wyciekających oparów OsO4 może odbarwić wewnętrzne powierzchnie i zawartość lodówki. W wyżej wymienionych warunkach przechowywania roztwór OsO4 jest stabilny przez kilka miesięcy. Kiedy roztwory utleniają się podczas przechowywania, stają się szare, w takim przypadku należy je wyrzucić.
  2. Dodać 1% OsO4 w 0,1 M PB do fiolki z próbką i odstawić na 1 godzinę. Ekstrahować OsO4 po 1 godzinie za pomocą mikropipety.
    nuta: Przed nałożeniem OsO4 na przekrój bardzo ważne jest rozłożenie i spłaszczenie próbki. Należy unikać aplikacji bezpośrednio na próbkę, zamiast tego należy użyć ścianek fiolki, aby delikatnie wkroplić OsO4 na dno fiolki. Próbka staje się brązowa i sztywna wkrótce po zastosowaniu OsO4. Od teraz należy obchodzić się delikatnie, aby uniknąć uszkodzenia tkanek

5. Płukanie

UWAGA: Ważne jest, aby przepłukać próbkę po utrwaleniu za pomocą OsO4 i przed odwodnieniem, ponieważ resztki utrwalaczy mogą reagować ze środkami odwadniającymi37.

  1. Płukać 0,1 M PB przez 3 min x 3,
    nuta: Ponieważ mózg nowonarodzonego szczura jest bardzo wrażliwy na zmiany w osmolarności, przeprowadź płukanie w tym samym pojeździe, w którym zastosowano mieszaninę utrwalającą12,35,36,37.
  2. Umieść roztwór osmu i pierwsze dwa płukanki PB w odpadach OsO4 i zutylizuj je zgodnie z wytycznymi swojej instytucji.

6. Sekwencyjne odwodnienie i barwienie octanem uranylu

UWAGA: Laboratorium tego autora używa do osadzania niemieszających się z wodą żywic epoksydowych. W przypadku stosowania żywic epoksydowych cała wolna woda w próbce musi zostać zastąpiona rozpuszczalnikiem organicznym przed infiltracją przez medium zatapiające. Woda jest usuwana przez przepuszczenie próbki przez serię roztworów o rosnących stężeniach etanolu i acetonu12.

  1. Przygotowanie octanu uranylu (UA)
    1. Umieścić szklaną kolbę miarową o pojemności 200 ml zawierającą 100 ml EtOH 70% na płytce mieszającej.
    2. Dodać 4 g UA do kolby. Zawiń w folię aluminiową (UA wytrąca się pod wpływem światła) i ciągle mieszaj.
      nuta: UA rozpuszcza się powoli i niecałkowicie w 70% EtOH. Pozwól, aby nierozpuszczone kryształy osiadły przed użyciem roztworu. Roztwór UA należy przed użyciem przefiltrować filtrem 0,45 μm. UA można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w brązowej butelce zawiniętej w folię aluminiową w temperaturze 4 °C przez miesiące.
      ostrożność: UA jest umiarkowanie radioaktywny i wysoce toksyczny. Wdychanie proszku UA może powodować zaburzenia górnych dróg oddechowych oraz choroby płuc, wątroby i nerek. UA jest niebezpieczny po spożyciu lub w bezpośrednim kontakcie ze skórą i błonami śluzowymi. Wszystkie prace należy wykonywać pod wyciągiem przy użyciu rękawic i odzieży ochronnej. Postępowanie z odpadami i ich utylizacja powinny odbywać się zgodnie z wytycznymi Twojej instytucji.
  2. Odwodnić w 50% EtOH przez 1 minutę. Usuń 50% EtOH przed dodaniem UA.
  3. Dodaj 4% UA w 70% EtOH. Odstawić na 1 godzinę lub na noc. Jeśli na noc, wstaw do lodówki w temperaturze 4 °C.
    UWAGA:     Zakręć fiolkę, aby uniknąć parowania EtOH i przykryj folią aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na światło. W tym miejscu protokół można wstrzymać.
    1. Odpady UA i dwa poniższe płukania należy usunąć zgodnie z wytycznymi Twojej instytucji
  4. Odwodnić w 70% EtOH przez 1 min.
  5. Odwodnić w 90% EtOH przez 5 min.
  6. Odwodnić w 100% EtOH przez 5 min x 2.
  7. Opłucz próbkę w acetonie przez 2 minuty x 3.

7. Infiltracja i osadzanie

UWAGA: Tkanki nie są wystarczająco sztywne, aby można je było ciąć na cienkie odcinki bez dodatkowego wsparcia w postaci matrycy żywicznej. Dlatego infiltracja i osadzanie muszą poprzedzać sectioning12.

  1. Przygotowanie żywicy EPON
    1. Użyj strzykawki do zgłębnika o pojemności 60 ml. Wyjąć tłok strzykawki i nakryć strzykawkę bezpieczną igłą.
    2. Umieścić strzykawkę otwartą stroną do góry i stopniowo dodawać objętość każdego składnika mieszanki żywicy. Dodaj 22 ml Embed-812 (żywica). Dodaj DDSA (utwardzacz) do całkowitej objętości 37 ml. Dodaj NMA (utwardzacz) do całkowitej objętości 50,5 ml. Dodać pipetą 525 μl DMP-30 (akceleratora). Przesuwać tłok pipety bardzo powoli, ponieważ DMP jest bardzo lepki.
      UWAGA: ważne jest, aby dodawać odczynniki do zatapiania w podanej kolejności. Akcelerator (DMP-30) musi być dodany na końcu. Aby uzyskać utwardzony blok o pożądanych właściwościach, bardzo ważne jest użycie dokładnej ilości utwardzacza i akceleratora. Preferowane są świeżo przygotowane mieszanki do zatapiania.
    3. Umieścić tłok z powrotem i umieścić strzykawkę na kołysce, ciągle potrząsając przez co najmniej 30 minut. Kolor zmieni się z żółtego na bursztynowy.
      nuta: Wszystkie składniki muszą być bardzo dokładnie wymieszane. Niezastosowanie się do tego skutkuje nierównomierną impregnacją próbki tkanki i blokiem o nierównej twardości
  2. Wymieszaj 1 objętość żywicy EPON z 1 objętością acetonu w fiolce ze scynt i wstrząśnij, aby wymieszać. Nałóż mieszaninę EPON:aceton 1:1 na tkankę po usunięciu ostatniego płukania acetonem. Przechowywać pod przykryciem, aby uniknąć parowania acetonu. Usuń mieszaninę żywicy i acetonu w stosunku 1:1 po 2-4 godzinach lub przechowuj na noc.
    UWAGA: w tym miejscu protokół można wstrzymać.
  3. Zastąp mieszaninę żywicy i acetonu pełną żywicą. Odstawić na 4 godziny lub na noc. Wszystkie odpady EPON należy umieścić w pojemniku zbiorczym pod maską, aby zostały spolimeryzowane i później zutylizowane.
    UWAGA: w tym miejscu protokół można wstrzymać.

8. Osadzanie płaskie

UWAGA: Próbki są płasko osadzone pomiędzy dwoma warstwami aklarnymi w sposób przypominający kanapkę.

  1. Wytnij dwa prostokątne kawałki przezroczystego arkusza aclar. Przetrzyj folie do czysta EtOH 70%. Przytnij arkusze tak, aby z każdej strony sekcji znajdowało się co najmniej 1,5 cm plastiku bez chusteczek. Arkusz aclar na górze powinien mieć taką samą szerokość jak spód, a jego wysokość powinna wynosić około dwóch trzecich dolnego arkusza.
  2. Powoli przechylić fiolkę z próbką i delikatnie podnieść tkankę z dna fiolki.
  3. Za pomocą mikroelastycznej szpatułki i cienkiej szczoteczki ostrożnie przesunąć fragment wzdłuż ścianek fiolki i przenieść na arkusz akortu.
    nuta: Z sekcjami należy obchodzić się ostrożnie, aby uniknąć uszkodzenia próbki.
  4. Delikatnie umieść arkusz aklarowany na wierzchu próbki.
    nuta: Upewnij się, że między dwoma arkuszami jest wystarczająca ilość żywicy, aby uszczelnić kanapkę
  5. Delikatnie wypchnij uwięzione pęcherzyki powietrza bez wywierania bezpośredniego nacisku na sekcję. Usuń nadmiar EPON.
    nuta: Eliminacja pęcherzyków powietrza jest ważna, ponieważ ich obecność utrudnia wizualizację próbki i osłabia stabilność wiązań żywicznych.
  6. Oznacz arkusze pisakiem odpornym na rozpuszczalniki i wstaw do piekarnika w temperaturze 60 ͦC na 2-3 dni do polimeryzacji.
    UWAGA: w tym miejscu protokół można wstrzymać.

9. Osadzanie kapsułek

UWAGA: Ultramikrotomy są dostarczane z uchwytami do mocowania cylindrycznych bloków uzyskanych z zatapiania próbek w kapsułkach. Bloki cylindryczne mają idealną geometrię, aby w jak najmniejszym stopniu oddziaływały na nie drgania powstające podczas cięcia.

  1. Delikatnie otwórz warstwowe folie aclar. Próbka będzie przylegać do jednego z dwóch arkuszy akortu.
  2. Użyj pisaka odpornego na rozpuszczalniki, aby zaznaczyć stronę arkusza aclar, który zawiera sekcję. Zaznacz w pobliżu tkanki.
    nuta: Bardzo ważne jest, aby wykonać ten krok przed wycięciem interesującej tkanki.
  3. Użyj stempla tarczowego, aby uzyskać okrągłą próbkę przekroju. Ślad po długopisie powinien być częścią wybitej tkanki.
  4. Przygotuj wieczko kapsułki do osadzania stroną do góry na uchwycie na kapsułki. Umieść kroplę żywicy na nasadce.
  5. Umieść dziurkowany krążek wewnątrz nasadki częścią tkanki skierowaną do góry. Ślad pióra będzie błyszczał, gdy na próbkę padnie światło.
  6. Włóż kapsułkę do nakrętki i użyj cienkiej pęsety, aby wprowadzić etykietę. Zwiń i opuść wydrukowany kawałek papieru o długości 2 cm do kapsułki. Przygotuj etykietę tak, aby pasowała do krzywizny bocznych ścianek kapsułki. Poczekaj na zakończenie polimeryzacji, aby etykieta została trwale osadzona w żywicy.
  7. Wlej żywicę do zatapiania wewnątrz kapsułki i napełnij aż do krawędzi kapsułki.
  8. Dociśnij próbkę tkanki do dna kapsułki za pomocą spiczastego drewnianego patyczka i umieść w piekarniku w temperaturze 60 °C na 2-3 dni.
    nuta: Należy uważać, aby nie dociskać tkanki zbyt mocno, zamiast tego pozostawić ją luźno, tak aby między tkanką a powierzchnią kapsułki znajdowała się cienka warstwa podłoża do zatapiania. W tym miejscu protokół można wstrzymać.

10. Przycinanie powierzchni bloku

UWAGA: Mały rozmiar i odpowiedni kształt czoła bloku są warunkami koniecznymi do zadowalającego podziału na sekcje. Dlatego przycinanie bloku próbki jest koniecznością.

  1. Użyj ostrej żyletki o jednym ostrzu. Wyczyść acetonem bezpośrednio przed użyciem.
  2. Zamontuj blok kapsuły w uchwycie bloku i umieść uchwyt bloku na stoliku mikroskopu stereoskopowego.
    nuta: Procedurę przycinania należy przeprowadzać pod mikroskopem, lornetką i ukośnym oświetleniem.
  3. Usuń arkusz aclar z końcówki kapsułki za pomocą żyletki. Arkusz aclar pojawia się jako błyszcząca warstwa w świetle lunety sekcyjnej.
  4. Trzymaj żyletkę pod kątem 45 stopni i wykonaj nacięcia z czterech stron bloku kapsułki.
    nuta: Lepszą kontrolę nad przycinaniem uzyskuje się, gdy ostrze jest trzymane obiema rękami.
  5. Wykonaj skróty tak, aby blok miał formę krótkiej piramidy o kątach ścian około 45°.
    nuta: Powierzchnia czołowa próbki jest znacznie lepiej podparta, jeśli boki prowadzące do niej są krótkie. Jeśli końcówka bloku jest zbyt cienka i długa, będzie wibrować podczas cienkiego cięcia. Idealnie byłoby, gdyby obszar zainteresowania był wyśrodkowany na powierzchni bloku.
  6. Przyciąć końcówkę kapsułki, aby usunąć zbędną tkankę i zachować tylko obszar zainteresowania.
    nuta: Żadna część przekroju nie powinna być pozbawiona tkanki, ponieważ różnice w gęstości powierzchni bloku są główną przyczyną trudności w cięciu. Idealnie, powierzchnia powierzchni kapsułki nie powinna przekraczać 1 mm2.
  7. Przytnij powierzchnię kapsułki w kształcie trapezu scalene. Ponieważ w trapezie scalene żadna strona nie jest równa, ten kształt najlepiej nadaje się do orientacji obszaru zainteresowania względem reszty próbki.
    nuta: Podczas przekroju powierzchnia w kształcie trapezu jest podparta znacznie lepiej niż w przypadku jakiegokolwiek innego kształtu.

11. Sekcja mikrotomu

UWAGA: Większość próbek biologicznych jest zbyt gruba w swoim naturalnym stanie, aby mogły być penetrowane przez wiązkę elektronów. Dlatego materiał należy ciąć na cienkie odcinki, przez które może przeniknąć wiązka elektronów.

  1. Wytnij cienkie odcinki (srebrny kolor interferencyjny, 600-900 A) na ultramikrotomie w płaszczyznach równoległych do powierzchni.
  2. Umieść sekcje na siatkach. W laboratorium autora zastosowano siatki miedziane o średnicy zewnętrznej 3,05 mm.
    nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

12. Barwienie po barwieniu octanem uranylu

  1. Przygotuj 2% UA w wodzie destylowanej. Umieścić szklaną kolbę miarową o pojemności 200 ml zawierającą 100 ml wody destylowanej na płytce mieszającej. Dodać 2 g UA do kolby. Zawiń w folię aluminiową (UA wytrąca się pod wpływem światła) i ciągle mieszaj.
    nuta: Szczegółowe informacje na temat przygotowania UA znajdują się w sekcji 6 niniejszego protokołu.
  2. Umieść kilka pojedynczych kropli 2% UA na czystym arkuszu wosku dentystycznego na szalce Petriego.
  3. Unosić siatkę z próbką (sekcją skierowaną w dół) na kroplę UA przez 25 min.
    nuta: Umieść każdą siatkę na osobnej kropli UA.
  4. Przytrzymaj kratkę za krawędź kleszczami i spłucz dwukrotnie pod delikatnym strumieniem przegotowanej wody destylowanej o temperaturze pokojowej z plastikowej butelki do mycia.
    nuta: Nie dopuścić do wyschnięcia kratki przed zabarwieniem ołowiem.

13. Barwienie ołowiem

  1. Przygotuj komorę wolną od CO2 (CO2 w powietrzu jest głównym źródłem wytrącania się ołowiu). Umieść kawałek bibuły filtracyjnej nasączonej 1 N NaOH na szalce Petriego. Umieść mały arkusz czystego wosku dentystycznego na bibule filtracyjnej i umieść kilka granulek NaOH po jednej stronie naczynia. Przykryj naczynie.
    nuta: Przygotuj tę konfigurację przed zabarwieniem kratek UA, tak aby atmosfera w komorze była wolna od CO2 i gotowa do barwienia ołowiem do czasu zakończenia barwienia UA.
  2. Zrób 4% NaOH. Dodać 0,2 g NaOH do 5 ml wody destylowanej.
  3. Przygotuj roztwór potrójnego odprowadzenia Sato. Aby przygotować 10 ml, do szklanej butelki dodać 0,1 g azotanu ołowiu, 0,1 g cytrynianu ołowiu, 0,1 g octanu ołowiu i 0,2 g cytrynianu sodu. Dodaj 8,2 ml wody destylowanej i energicznie wstrząsaj przez 5 minut. Sonikuj przez 30 sekund, a następnie dodaj 1,8 ml świeżo przygotowanego 4% NaOH.
  4. Umieść kilka kropli ołowiu Sato na wosku na szalce Petriego.
  5. Umieść siatkę poplamioną UA (sekcją do dołu) na kropli ołowiu.
    nuta: Każda siatka powinna być unoszona na osobnej kropli ołowiu. Każda kropla powinna być na tyle mała, aby siatka mogła unosić się na kopule kropli zamiast zsuwać się po bokach.
  6. Przykryj naczynie i pozostaw plamę na 5 minut.
  7. Chwyć kratkę za krawędź kleszczami i dokładnie umyj pod delikatnym strumieniem przegotowanej wody destylowanej o temperaturze pokojowej z plastikowej butelki do mycia.
  8. Osusz siatkę na bibule filtracyjnej i przechowuj siatkę.
    nuta: Upewnij się, że sekcja nie styka się bezpośrednio z bibułą filtracyjną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólne kryteria, które są najczęściej akceptowane jako wskazujące na zadowalające lub wadliwe zachowanie próbki do TEM, zostały ustalone. Kryteria te są zilustrowane na czterech wybranych mikrofotografiach elektronowych (dwa przykłady optymalnego przygotowania, dwa przykłady wadliwego preparatu), które uzyskano poprzez leczenie młodej tkanki mózgowej szczura zgodnie z metodami opisanymi w tym protokole.

Ogólnie rzecz biorąc, dobrej jakości mikrofotografia elektronowa wygląda jak uporządkowany,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obchodzenie się z skrawkami tkanek podczas przygotowywania próbki do TEM wymaga znacznego stopnia finezji, koncentracji i cierpliwości. W przypadku używania mikropipety do dodawania i wyjmowania roztworów, próbki mogą być zasysane do końcówki pipety pod wpływem napięcia powierzchniowego, dlatego należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć uszkodzenia tkanek przez pipetę. Ponadto niektóre etapy sekwencji odwadniania mogą trwać nawet 1 minutę, dlatego operator musi działać szybko, aby upewnić się, że kolejny etap od...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt był wspierany przez NIH/NIGMS K08 123321 (do N.L.) oraz przez fundusze z Wydziału Anestezjologii Uniwersytetu Wirginii. Autorzy pragną podziękować Alev Erisir (Wydział Biologii, University of Virginia, Charlottesville, VA) za doskonałe szkolenie i pomoc techniczną w zakresie TEM oraz za jej nieocenioną krytykę manuskryptu. Autorzy dziękują również ośrodkowi Zaawansowanej Mikroskopii Elektronowej na Uniwersytecie Wirginii za pomoc techniczną w zakresie sekcji próbek i barwienia końcowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4% tetratlenek osmuMikroskopia elektronowa Sciences19170wodny
50% aldehyd glutarowyMikroskopia elektronowa Sciences16310klasa EM, wodna
folia do zatapiania Aclar 33 CMikroskopia elektronowa Sciences50425-25Grubość 7,8 mil, rozmiar 8 "x10"
Uchwyt na kapsułki BEEMMikroskopia elektronowa Sciences69916trzyma rozmiar "00" kapsułki
Kapsułki do zatapiania BEEMMikroskopia elektronowa Nauki70021"rozmiar 00, płaski (cięty dół)" "
Trymer blokowy ButlerNauki o Mikroskopii Elektronowej69945-01
Pędzel do malowania włosów wielbłądaNauki o mikroskopii elektronowej65576-01
Dziurkacz dyskowyNauki o mikroskopii elektronowej77850-09
Zestaw Embed 812Mikroskopia elektronowa Sciences14120
Octan ołowiuMikroskopia elektronowa Sciences17600
Cytrynian ołowiuMikroskopia elektronowa Sciences17800
Azotan ołowiuMikroskopia elektronowa Sciences17900
Mikrotom ultracut Leica UC7
MicroMikroskopia elektronowa Nauki62091-23
ParaformaldehydMikroskopia elektronowa Sciences19208Klasa EM, granulowana
Precyzyjna piec laboratoryjny Thelco Thelco51221159
Azydek soduSigma-AldrichtS2002
StatMarkMikroskopia elektronowa Sciences72109-01
Roztwór tylodyMikroskopia elektronowa11760-05
Octan uranyluMikroskopia elektronowa Proszek Nauki o mikroskopii elektronowej22400
Skala Leica

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum. Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).
  2. Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. General anesthesia causes long-lasting disturbances in the ultrastructural properties of developing synapses in young rats. Neurotoxicity Research. 17 (2), 179-188 (2010).
  3. Sanchez, V., et al. General anesthesia causes long-term impairment of mitochondrial morphogenesis and synaptic transmission in developing rat brain. Anesthesiology. 115 (5), 992-1002 (2011).
  4. Boscolo, A., et al. The abolishment of anesthesia-induced cognitive impairment by timely protection of mitochondria in the developing rat brain: the importance of free oxygen radicals and mitochondria integrity. Neurobiology of Disease. 45 (3), 1031-1041 (2012).
  5. Aghajanian, G. K., Bloom, F. E. The formation of synaptic junctions in developing rat brain: a quantitative electron microscopy study. Brain Research. 6 (4), 716-727 (1967).
  6. Akert, K., Sandri, C. Significance of the Maillet method for cytochemical studies of synapses. Golgi centennial symposium; Perspectives in Neurobiology. Santini, M. , Raven Press. NY. 387-399 (1975).
  7. Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Cytochemistry of synapses: selective staining for electron microscopy. Science. 154 (3756), 1575-1577 (1966).
  8. Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Fine structural and cytochemical analysis of the staining of synaptic junctions with phosphotungstic acid. Journal of Ultrastructure Research. 22 (5-6), 361-375 (1968).
  9. Burry, R. W., Lasher, R. S. A quantitative electron microscopy study of synapse formation in dispersed cell cultures of rat cerebellum stained either by O-UL or by E-PTA. Brain Research. 147 (1), 1-15 (1978).
  10. Pellegrino de Iraldi, A., Suburo, A. M. Electron staining of synaptic vesicles using the Champy-Maillet technique. Journal of Microscopy. 91 (2), 99-103 (1970).
  11. Pfenninger, K. H. The cytochemistry of synaptic densities. I. An analysis of the bismuth iodide impregnation method. Journal of Ultrastructural Research. 34 (1), 103-122 (1971).
  12. Hayat, M. A. Chemical fixation. Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications. Hayat, M. A. , Cambridge University Press. 4-84 (2000).
  13. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visual Experiments. (65), e3564(2012).
  14. Hayat, M. A. Fixation for electron microscopy. Hayat, M. A. , Academic Press. San Diego. (1981).
  15. Behrman, E. J., et al. The chemistry of osmium tetroxide fixation. The science of biological specimen preparation for microscopy and microanalysis. Revel, J. P., et al. , Scanning Electron microscopy Inc, AMF. O’Hare, Chicago. 1-5 (1983).
  16. Nielson, A. J., Griffith, W. P. Reactions of osmium tetroxide with protein side chains and unsaturated lipids. Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions. (6), 1084-1088 (1979).
  17. Nielson, A. J., Griffith, W. P. Tissue fixation by osmium tetroxide. A possible role for proteins. Journal of Hystochemistry & Cytochemistry. 27 (5), 997-999 (1979).
  18. Hanker, J. S., Deb, C., Wasserkrug, H. L., Seligman, A. M. Staining tissue for light and electron microscopy by bridging metals with multidentate ligands. Science. 152 (3729), 1631-1634 (1966).
  19. Zobel, C. R., Beer, M. The use of heavy metal salts as electron stains. International Review of Cytology. 18, 363-400 (1965).
  20. Silva, M. T., Guerra, F. C., Magalhaes, M. M. The fixative action of uranyl acetate in electron microscopy. Experientia. 24 (10), 1074(1968).
  21. Terzakis, J. A. Uranyl acetate, a stain and a fixative. Journal of Ultrastructural Research. 22 (1-2), 168-184 (1968).
  22. Feldman, I., Jones, J., Cross, R. Chelation of uranyl ions by adenine nucleotides. Journal of the American Chemical Society. 89 (1), 49-53 (1967).
  23. Shah, D. O. Interaction of uranyl ions with phospholipid and cholesterol monolayer. Journal of Colloid and Interface Science. 29 (2), 210-215 (1969).
  24. Daems, W. T., Persijn, J. P. Section staining with heavy metals of osmium-fixed and formol-fixed mouse liver tissue. Journal. Royal Microscopical Society. 81 (pts 3&4), 199-201 (1963).
  25. Lombardi, L., Prenna, G., Okolicsanyi, L., Gautier, A. Electron staining with uranyl acetate: possible role of free amino groups. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 19 (3), 161-168 (1971).
  26. Cattini, P. A., Davies, H. G. Kinetics of lead citrate staining of thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 58 (1), 29-40 (1983).
  27. Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
  28. Cattini, P. A., Davies, H. G. Observations on the kinetics of uranyl acetate and phosphotungstic acid staining of chromatin in thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 59 (5), 291-304 (1984).
  29. Derksen, J. W., Meekes, H. Selective staining of nucleic acid containing structures by uranyl acetate-lead citrate. Micron and Microscopica Acta. 15 (1), 55-58 (1984).
  30. Frasca, J. M., Parks, V. R. A routine technique for double-staining ultrathin sections using uranyl and lead salts. Journal of Cell Biology. 25 (1), 157-161 (1965).
  31. Hanaichi, T., Sato, T., Iwamoto, T., Malavasi-Yamashiro, J., Hoshino, M., Mizuno, N. A stable lead by modification of Sato’s method. Journal of Electron Microscopy. 35 (3), 304-306 (1986).
  32. Sato, T. A modified method for lead staining of thin sections. Journal of Electron Microscopy. 17 (2), 158-159 (1968).
  33. Lever, J. D. A method of staining tissues with lead for electron microscopy. Nature. , 810-811 (1960).
  34. Derek, G., et al. Self organization of the Escherichia Coli chemotaxis network imaged with super-resolution light microscopy. Public Library of Science Biology. 7 (6), e1000137(2009).
  35. Richards, J. G. Ultrastructural histochemistry of nervous tissue. Techniques in Neuroanatomical Research. Heyn, C., Forssmann, W. G. , Springer. Berlin. 277-292 (1981).
  36. Wood, R. L., Luft, J. H. The influence of the buffer system on fixation with osmium tetroxide. Journal of Ultrastructural Research. 12 (1-2), 22-45 (1965).
  37. Louw, J., Williams, K., Harper, I. S., Walfe-Coote, S. A. Electron dense artifactual deposits in tissue sections: the role of ethanol, uranyl acetate and phosphate buffer. Stain Technology. 65 (5), 243-250 (1990).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transmisyjna mikroskopia elektronowaprzygotowanie tkanekutrwalanie czwartotlenkiem osmubarwienie octanem uranyluzatapianie w ywicykrojenie w wibratomieterminale presynaptyczne

Powiązane artykuły