Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja subkomórkowej aktywności ubikwityny-proteasomu w mózgu gryzoni

DOI:

10.3791/59695

⸱

21 maja 2019

 ,  , 
1Department of Animal and Poultry Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2School of Neuroscience, Virginia Polytechnic Institute and State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół ma na celu efektywne ilościowe określanie aktywności systemu ubikwityna-proteasom (UPS) w różnych przedziałach komórkowych mózgu gryzoni. Użytkownicy mogą badać działanie UPS we frakcjach jądrowych, cytoplazmatycznych i synaptycznych u tego samego zwierzęcia, co skraca czas i liczbę zwierząt potrzebnych do przeprowadzenia tych złożonych analiz.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System ubikwityna-proteasom jest kluczowym regulatorem degradacji białek i wielu innych procesów komórkowych u eukariontów. W mózgu wzrost aktywności ubikwityny-proteasomu ma kluczowe znaczenie dla plastyczności synaptycznej i tworzenia pamięci, a nieprawidłowe zmiany w tym systemie są związane z różnymi zaburzeniami neurologicznymi, neurodegeneracyjnymi i psychiatrycznymi. Jednym z problemów w badaniu funkcjonowania ubikwityny-proteasomu w mózgu jest to, że jest on obecny we wszystkich przedziałach komórkowych, w których cele białkowe, rola funkcjonalna i mechanizmy regulacji mogą się znacznie różnić. W rezultacie, możliwość bezpośredniego porównania ukierunkowania na białko ubikwityny w mózgu i aktywności katalitycznej proteasomu w różnych przedziałach subkomórkowych u tego samego zwierzęcia ma kluczowe znaczenie dla pełnego zrozumienia, w jaki sposób UPS przyczynia się do plastyczności synaptycznej, pamięci i choroby. Opisana tutaj metoda pozwala na pobranie jądrowych, cytoplazmatycznych i surowych frakcji synaptycznych z tego samego mózgu gryzonia (szczura), a następnie jednoczesne określenie ilościowe aktywności katalitycznej proteasomu (pośrednio, zapewniając aktywność tylko rdzenia proteasomu) i znakowanie białka ubikwityny specyficzne dla wiązania. W związku z tym metoda ta może być wykorzystana do bezpośredniego porównania subkomórkowych zmian w aktywności ubikwityny-proteasomu w różnych regionach mózgu u tego samego zwierzęcia podczas plastyczności synaptycznej, tworzenia pamięci i różnych stanów chorobowych. Metoda ta może być również stosowana do oceny subkomórkowej dystrybucji i funkcji innych białek w tym samym zwierzęciu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System ubikwityna-proteasom (UPS) to złożona sieć połączonych ze sobą struktur białkowych i ligaz, która kontroluje degradację większości krótkożyciowych białek w komórkach1. W tym systemie białka są oznaczane do degradacji lub innych procesów/losów komórkowych przez mały modyfikator ubikwitynę. Białko docelowe może nabywać 1-7 modyfikacji ubikwityny, które mogą łączyć się ze sobą w jednym z siedmiu miejsc lizyny (K) (K6, K11, K27, K29, K33, K48 i K63) lub N-końcowej metioniny (M1; znanej jako liniowa) w poprzedniej klasie ubikwityny2. Niektóre z tych znaczników poliubikwityny są specyficzne dla degradacji (K48)3, podczas gdy inne są w dużej mierze niezależne od procesu degradacji białka (M1)4,5,6. W związku z tym proces ubikwitynacji białek jest niezwykle złożony, a zdolność do ilościowego określenia zmian w określonym znaczniku poliubikwityny ma kluczowe znaczenie dla ostatecznego zrozumienia roli tej modyfikacji w funkcjonowaniu komórki. Badanie tego układu dodatkowo komplikuje fakt, że proteasom, który jest strukturą katalityczną klasy UPS7, zarówno degraduje białka, jak i może być zaangażowany w inne procesy nieproteolityczne8,9. Nic więc dziwnego, że od czasu pierwszego odkrycia, normalna i nieprawidłowa aktywność ubikwityny-proteasomu jest zaangażowana w tworzenie pamięci długotrwałej i różne stany chorobowe, w tym wiele zaburzeń neurologicznych, neurodegeneracyjnych i psychiatrycznych10,11. W rezultacie, metody, które mogą skutecznie i wydajnie określić ilościowo aktywność UPS w mózgu, mają kluczowe znaczenie dla ostatecznego zrozumienia, w jaki sposób system ten jest rozregulowany w stanach chorobowych i ostatecznego opracowania opcji leczenia ukierunkowanego na funkcjonowanie ubikwityny i/lub proteasomu.

Istnieje wiele problemów w ilościowym określaniu aktywności ubikwityny-proteasomu w tkance mózgowej szczurów i myszy, które są najczęstszymi systemami modelowymi używanymi do badania funkcji UPS, w tym 1) różnorodność modyfikacji ubikwityny, oraz 2) dystrybucja i różnicowa regulacja funkcjonowania UPS w przedziałach subkomórkowych12,13,14. Na przykład, wiele wczesnych demonstracji funkcji ubikwityny i proteasomu w mózgu podczas tworzenia pamięci wykorzystywało lizaty całych komórek i wskazywało na zależny od czasu wzrost zarówno ubikwitynacji białek, jak i aktywności proteasomów15,16,17,18,19,20. Jednak niedawno odkryliśmy, że aktywność ubikwityny-proteasomu różniła się znacznie w przedziałach subkomórkowych w odpowiedzi na uczenie się, z jednoczesnym wzrostem w niektórych regionach i spadkiem w innych, wzorzec, który znacznie różni się od tego, co wcześniej zgłaszano w lizatach całych komórek21. Jest to zgodne z ograniczeniem podejścia obejmującego całą komórkę, ponieważ nie może ono dysocjować wkładu zmian w aktywności UPS w różnych przedziałach subkomórkowych. Chociaż nowsze badania wykorzystały protokoły frakcji synaptycznej do zbadania UPS w szczególności w synapsach w odpowiedzi na uczenie się22,23,24, zastosowane metody uniemożliwiają pomiar zmian jądrowych i cytoplazmatycznych ubikwityny-proteasomu u tego samego zwierzęcia. Powoduje to niepotrzebną konieczność wielokrotnego powtarzania eksperymentów, zbierając w każdym z nich inną frakcję subkomórkową. Powoduje to nie tylko większą utratę życia zwierząt, ale także eliminuje możliwość bezpośredniego porównywania aktywności UPS w różnych przedziałach subkomórkowych w odpowiedzi na dane zdarzenie lub podczas określonego stanu chorobowego. Biorąc pod uwagę, że cele białkowe ubikwityny i proteasomu różnią się znacznie w całej komórce, zrozumienie, w jaki sposób sygnalizacja ubikwityna-proteasom różni się w odrębnych przedziałach subkomórkowych, ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji funkcjonalnej roli UPS w mózgu podczas tworzenia pamięci i zaburzeń neurologicznych, neurodegeneracyjnych i psychiatrycznych.

Aby zaspokoić tę potrzebę, niedawno opracowaliśmy procedurę, w której frakcje jądrowe, cytoplazmatyczne i synaptyczne mogą być pobierane dla danego regionu mózgu od tego samego zwierzęcia21. Dodatkowo, aby uwzględnić ograniczoną ilość białka, którą można uzyskać z zebrania wielu frakcji subkomórkowych z tej samej próbki, zoptymalizowaliśmy wcześniej ustalone protokoły do oznaczania in vitro aktywności proteasomu i ubikwitynacji białek specyficznych dla wiązania w lizowanych komórkach pobranych z tkanki mózgowej gryzoni. Korzystając z tego protokołu, byliśmy w stanie zebrać i bezpośrednio porównać zależne od uczenia się zmiany w aktywności proteasomu, K48, K63, M1 i ogólnych poziomach poliubikwitynacji białek w jądrze i cytoplazmie oraz w synapsach w bocznym ciele migdałowatym szczurów. W tym miejscu szczegółowo opisujemy naszą procedurę (Rysunek 1), która może znacznie poprawić naszą wiedzę na temat tego, w jaki sposób UPS jest zaangażowany w tworzenie pamięci długotrwałej i różne stany chorobowe. Należy jednak zauważyć, że aktywność proteasomu in vitro omówiona w naszym protokole, choć szeroko stosowana, nie mierzy bezpośrednio aktywności kompletnych kompleksów proteasomów 26S. Test ten mierzy raczej aktywność rdzenia 20S, co oznacza, że może służyć jedynie jako wskaźnik zastępczy do zrozumienia aktywności samego rdzenia, w przeciwieństwie do całego kompleksu proteasomu 26S.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury, w tym tematy zwierzęce, zostały zatwierdzone przez Virginia Polytechnic Institute i State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Pobieranie i sekcja tkanki mózgowej gryzoni

UWAGA: Ten protokół może być stosowany do różnych obszarów mózgu i używany przy różnych procedurach pobierania tkanek. Poniżej znajduje się procedura stosowana w naszym laboratorium do subkomórkowej tkanki mózgowej szczura, przy użyciu 8-9 tygodniowych samców szczurów Sprague Dawley. W celu przetworzenia wszystkich przedziałów komórkowych u tego samego zwierzęcia, sekcja 1.3. muszą być przestrzegane niezależnie od zastosowanej procedury pobierania tkanek.

  1. Wyjmij mózg szczura i umieść go w kriogenicznym kubku wstępnie schłodzonym na suchym lodzie. Błyskawicznie zamroź mózg na suchym lodzie lub użyj ciekłego azotu, jeśli jest dostępny, i przenieś do zamrażarki o temperaturze -80 °C. Mózgi można poddać sekcji tego samego dnia lub w późniejszym czasie.
  2. Wyjmij zamrożony mózg z kubka kriogenicznego i umieść go w matrycy mózgu szczura schłodzonej suchym lodem. Każda szczelina na matrycy odpowiada 0,5 mm, co można wykorzystać do określenia przybliżonej lokalizacji obszaru zainteresowania (ROI).
    1. Korzystając z atlasu mózgu szczura, włóż żyletkę do matrycy bezpośrednio przed (przed) przewidywanym początkiem zwrotu z inwestycji. Następnie włóż żyletkę natychmiast na przewidywanym końcu (tylnym) ROI.
    2. Usuń plasterek między żyletkami za pomocą skalpela i umieść na szkiełku mikroskopowym schłodzonym na suchym lodzie. Zazwyczaj sekcje mają grubość 2-3 mm, ale różni się to w zależności od zwrotu z inwestycji.
  3. Za pomocą skalpela wypreparuj ROI półkula po półkuli. Umieść każdą półkulę w oddzielnych probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml wstępnie schłodzonych na suchym lodzie. Zamrożona tkanka może być natychmiast wykorzystana do frakcjonowania subkomórkowego lub przetworzona w późniejszym czasie, jeśli jest przechowywana w temperaturze -80 °C.

2. Ekstrakcja jądrowa i cytoplazmatyczna

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje gotowe roztwory podstawowe popularnych chemikaliów laboratoryjnych, w tym 0,1 M HEPES, 1 M MgCl2, 1 M Ditiothreitol (DTT), 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 5 M NaCl, 10% NP-40 (IGEPAL) i 50% glicerolu. Jeśli punkt końcowy jest używany w testach aktywności proteasomu, glicerol i ATP można dodać do wszystkich, aby zapobiec rozpadowi kompleksów proteasomów podczas lizy.

  1. Przygotować bufor do lizy. Dodaj 8,63 ml ultraczystej (dejonizowanej i destylowanej) wody do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    1. Do probówki stożkowej dodać 1 000 μL 0,1 M HEPES, 15 μL 1 M MgCl, 100 μL 1 M DTT i 50 μL 10% NP-40.
    2. Dodaj 100 μl koktajlu inhibitorów proteazy i 100 μl koktajlu inhibitorów fosfatazy. Krótko zmieszaj roztwór, aby wymieszać i umieść na mokrym lodzie, aby się schłodził. Należy zauważyć, że roztwór może mieć żółty odcień od inhibitora fosfatazy.
      nuta: Stosowanie inhibitorów proteazy jest niezbędne do zachowania białka i zapewnienia swoistości testu aktywności proteasomu in vitro. Jednak inhibitory te mogą również powodować nieznaczne zmniejszenie aktywności proteasomu, co oznacza, że aktywność mierzona w teście in vitro może być niedoszacowana w stosunku do rzeczywistych poziomów aktywności.
  2. Przygotować bufor ekstrakcyjny. Dodaj 5,925 ml ultraczystej (dejonizowanej i destylowanej) wody do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    1. Do stożkowej probówki dodać 2 000 μL 0,1 M HEPES, 1250 μL 50% glicerolu, 15 μL 1 M MgCl2, 5 μL 1 M DTT, 5 μL 0,5 M EDTA i 600 μL 5 M NaCl.
    2. Dodaj 100 μl koktajlu inhibitorów proteazy i 100 μl koktajlu inhibitorów fosfatazy. Krótko zmieszaj roztwór, aby wymieszać i umieść na mokrym lodzie, aby się schłodził. Należy pamiętać, że roztwór może mieć żółty odcień od inhibitora fosfatazy.
  3. Wyjmij mikroprobówkę wirówkową o pojemności 1,5 ml zawierającą jedną półkulę ROI z zamrażarki o temperaturze -80 °C. Upewnij się, że użyta półkula jest zrównoważona w różnych warunkach ekstrakcji dla każdej grupy eksperymentalnej. Na przykład w eksperymencie dwugrupowym użyj lewej półkuli dla pierwszych dwóch zwierząt w każdej grupie, a prawej półkuli dla następnych dwóch próbek itd.
  4. Za pomocą skalpela przenieś zamrożoną tkankę mózgową do szklanego homogenizatora teflonowego o pojemności 2 ml. Dodać 500 μl buforu do lizy do probówki teflonowej.
    1. Za pomocą tłuczka B homogenizuj tę samą tkankę, wykonując 15 pociągnięć, aż nie będzie widocznej ilości materiału stałego. Używaj ruchu obrotowego (zgodnie z ruchem wskazówek zegara lub przeciwnie do ruchu wskazówek zegara) podczas każdego pociągnięcia.
  5. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl przenieś homogenizowaną próbkę do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Umieść probówkę na mokrym lodzie i inkubuj przez 30 minut.
  6. Umieścić probówkę w mikrowirówce i wirować przez 10 minut w temperaturze 845 x g i temperaturze 4 °C. Po zakończeniu ostrożnie usunąć sklarowany osad za pomocą pipetowania i umieścić w nowej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml; jest to frakcja cytoplazmatyczna, która może być przechowywana na lodzie lub w temperaturze 4 °C do sekcji 2.9.
  7. Dodać 50 μl buforu ekstrakcyjnego do otrzymanego osadu i ponownie zawiesić przez pipetowanie. Nie wirować granulki. Umieścić probówkę zawierającą zawieszony osad na lodzie i inkubować przez 30 minut.
  8. Umieścić probówkę w mikrowirówce i wirować przez 20 minut w temperaturze 21 456 x g, 4 °C. Po zakończeniu ostrożnie usunąć sklarowany osad za pomocą pipetowania i umieścić w nowej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml; to jest frakcja jądrowa. Śrut można teraz wyrzucić.
  9. Zmierzyć stężenie białka w ekstrakcji cytoplazmatycznej i jądrowej za pomocą testu białka Dc (zgodnie z instrukcjami producenta) lub innego równoważnego testu dla próbek pobranych przy użyciu detergentów niejonowych. Natychmiast przystąp do oznaczania aktywności proteasomu (sekcja 4) lub Western blot (sekcja 5). Alternatywnie, próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą potrzebne.

3. Kolekcja frakcji synaptycznych

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje gotowe roztwory podstawowe popularnych chemikaliów laboratoryjnych, w tym 1 M Tris (pH 7,5), 0,5 M EDTA, 5 M NaCl i 10% SDS. Jeśli punkt końcowy jest stosowany w testach aktywności proteasomów, glicerol i ATP można dodać do wszystkich, aby zapobiec rozpadowi kompleksów proteasomów podczas lizy

  1. Przygotować bufor TEVP z 320 mM sacharozy. Dodaj 60 ml ultraczystej (dejonizowanej i destylowanej) wody do czystej zlewki o pojemności 100 ml.
    1. Do zlewki dodać 1 300 μl 1 M Tris (pH 7,5), 260 μl 0,5 M EDTA, 100 μl koktajlu inhibitorów proteazy, 100 μl koktajlu inhibitorów fosfatazy i 10,944 g sacharozy. Mieszaj z mieszadłem, aż sacharoza całkowicie się rozpuści.
    2. Doprowadzić pH do ~7,4, dodając kroplami kwas solny (HCl) do roztworu za pomocą pipety.
    3. Przenieść roztwór do kolby miarowej o pojemności 100 ml. Doprowadzić objętość do 100 ml, dodając ultraczystą wodę. Schłodź końcowy roztwór na lodzie, aż będzie potrzebny.
  2. Przygotować bufor homogenizacyjny. Dodaj 60 ml ultraczystej (dejonizowanej i destylowanej) wody do czystej zlewki o pojemności 100 ml.
    1. Do zlewki dodać 5 000 μl 1 M Tris (pH 7,5), 3 000 μl 5 M NaCl, 100 μl koktajlu inhibitorów proteazy, 100 μl koktajlu inhibitorów fosfatazy i 2 000 μl 10% SDS. Wymieszać z mieszadłem.
      nuta: Detergenty jonowe mogą zakłócać testy aktywności proteasomu, powodując denaturację kompleksu proteasomowego. W razie potrzeby objętość SDS można zmniejszyć, aby pomóc zachować funkcję proteasomu.
    2. Doprowadzić pH do ~7,4, dodając kroplami HCl do roztworu za pomocą pipety.
    3. Przenieść roztwór do kolby miarowej o pojemności 100 ml. Doprowadzić objętość do 100 ml, dodając ultraczystą wodę. Przechowywać końcowy roztwór w temperaturze pokojowej; nie schładzać, ponieważ SDS wytrąci się z roztworu.
  3. Wyjmij wirówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą jedną półkulę ROI z zamrażarki o temperaturze -80 °C. Upewnij się, że użyta półkula jest zrównoważona w różnych warunkach ekstrakcji dla każdej grupy eksperymentalnej. Na przykład w eksperymencie dwugrupowym użyj lewej półkuli dla pierwszych dwóch zwierząt w każdej grupie, a prawej półkuli dla następnych dwóch próbek itd.
  4. Za pomocą skalpela przenieś zamrożoną tkankę mózgową do szklanego homogenizatora teflonowego o pojemności 2 ml. Dodać 500 μl buforu TEVP do probówki teflonowej.
    1. Za pomocą tłuczka B homogenizuj tę samą tkankę za pomocą 15 pociągnięć, aż nie będzie widocznych transferów materiału stałego. Używaj ruchu obrotowego (zgodnie z ruchem wskazówek zegara lub przeciwnie do ruchu wskazówek zegara) podczas każdego pociągnięcia.
  5. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl przenieś homogenizowaną próbkę do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odwirować próbkę o masie 1 000 x g przez 10 minut, w temperaturze 4 °C.
  6. Zebrać supernatant i przenieść do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl. Odwirować próbkę o masie 10 000 x g przez 10 minut, w temperaturze 4 °C. Oryginalna osadówka (P1) zawiera jądra i duże zanieczyszczenia i może zostać wyrzucona.
  7. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Jest to frakcja cytozolowa. Dodać 50 μl buforu homogenizacyjnego do osadu (P2) i zawiesić ponownie przez pipetowanie do momentu, gdy nie będzie widoczny żaden materiał stały.
  8. Odwirować próbkę o masie 20 000 x g przez 10 minut, w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml; jest to surowa frakcja błony synaptosomalnej (synaptyczna). Granulkę można wyrzucić.
  9. Zmierzyć stężenie białka we frakcji synaptycznej za pomocą testu białka Dc (zgodnie z instrukcjami producenta) lub dowolnego równoważnego testu dla próbek pobranych przy użyciu detergentów jonowych. Natychmiast przystąp do oznaczania aktywności proteasomu (sekcja 4) lub Western blot (sekcja 5). Alternatywnie, próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą potrzebne.

4. Test aktywności proteasomu

UWAGA: Aktywność proteasomu może być mierzona w homogenizowanej tkance mózgowej za pomocą nieco zmodyfikowanej wersji zestawu do aktywności proteasomu 20S. Ten test nie mierzy bezpośrednio aktywności kompletnych kompleksów proteasomu 26S. Mierzy raczej aktywność rdzenia 20S, co oznacza, że może służyć jedynie jako wskaźnik zastępczy do zrozumienia aktywności samego rdzenia, w przeciwieństwie do całego kompleksu proteasomu 26S. Powodzenie tego testu zmniejsza się wraz z powtarzającymi się cyklami zamrażania i rozmrażania i/lub wzrostem poziomu detergentów, zwłaszcza jonowych, i wymaga użycia czytnika płytek z zestawem filtrów 360/460 (wzbudzenie/emisja) i możliwością podgrzewania do 37 °C.

  1. Ustawienia czytnika płytek: Wstępnie podgrzać do 37 °C i utrzymać przez cały przebieg.
    1. Ustaw wzbudzenie na 360 i emisję na 460. Jeśli używana płytka 96-dołkowa jest przezroczysta, ustaw pozycję optyki na dole. Jeśli używana jest ciemna/płytka 96-dołkowa, ustaw pozycję optyki na Góra.
    2. Ustaw starsze modele czytników płytek na Auto-Gain w opcjach odczytu fluorescencyjnego; nowsze modele są do tego przystosowane. Zaprogramuj bieg kinetyczny o czasie 2 h, skanowanie (odczyt) co 30 minut.
  2. Rozpuść 10-krotny bufor testowy dostarczony w zestawie w 13,5 ml ultraczystej wody. Dodaj 14 μl 100 mM ATP do teraz 1x bufora; To znacznie zwiększa aktywność proteasomu w próbkach i poprawia wiarygodność testu. Końcowy bufor do testów 20S może być przechowywany na lodzie lub w temperaturze 4 °C do czasu uzyskania potrzebnego i jest stabilny przez kilka miesięcy.
  3. Rozpuść wzorzec AMC dostarczony w zestawie ze 100 μl DMSO. Wykonaj tę czynność w ciemności lub przy słabym oświetleniu, ponieważ norma jest wrażliwa na światło.
  4. Utwórz krzywą stojaka AMC przy użyciu odtworzonego wzorca, w ciemności lub w warunkach słabego oświetlenia.
    1. W oddzielnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml dodać 16, 8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 i 0 μl wzorca AMC, co odpowiada stężeniu AMC 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0,5 i 0 μM.
    2. Do tych probówek, w tej samej kolejności, dodaj 84, 92, 93,6, 96,8, 98,4, 99,2, 99,6 i 100 μl buforu do oznaczania 20S. W ten sposób powstaje seria wysokich i niskich stężeń AMC, które zostaną wykorzystane do kalibracji czytnika płytek i analizy aktywności proteasomu w homogenizowanych próbkach.
    3. Przechowywać wszystkie rozcieńczone wzorce na lodzie w ciemności, aż będą potrzebne.
  5. Rozpuść substrat proteasomu (Suc-LLVY-AMC) dostarczony w zestawie z 65 μl DMSO. Wykonaj ten krok w ciemności lub w warunkach słabego oświetlenia, ponieważ podłoże jest wrażliwe na światło. Utworzyć rozcieńczenie substratu proteasomu w stosunku 1:20 w nowej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml przy użyciu buforu testowego 20S. Rozcieńczone podłoże należy przechowywać na lodzie w ciemności, aż będzie potrzebne.
    nuta: Na przykład, jeśli płytka będzie zawierała 10 próbek i 1 ślepą próbę, będziesz potrzebować wystarczającej ilości rozcieńczonego podłoża na 22 dołki (z duplikatami) w ilości 10 μl na studzienkę. Odpowiada to zapotrzebowaniu 220 μl + 30 μl na błędy pipetowania, co wymaga 12,5 μl substratu i 237,5 μl buforu do testu 20S.
  6. Rozmrozić żądane próbki (jeśli są zamrożone) i dodać znormalizowaną ilość do płytki 96-dołkowej. Uruchom każdą próbkę w dwóch egzemplarzach. Ilość potrzebnej próbki różni się w zależności od przygotowania tkanki. Ogólnie rzecz biorąc, 10-20 μg jest wystarczające dla każdej frakcji subkomórkowej.
  7. Doprowadzić objętość studzienki próbki do 80 μl wodą ultraczystą. Dodana ilość zależy od objętości dodanej próbki. Na przykład, jeśli próbka 1 zawierała 4,5 μl białka, a próbka 2 8,7 μl, to ilość potrzebnej wody wyniesie odpowiednio 75,5 μl i 71,3 μl. W dwóch oddzielnych studzienkach dodaj 80 μl samej wody; będą to ślepe próby testowe.
    nuta: W celu ograniczenia zmian objętości białka spowodowanych błędami pipetowania, stężenia białek można znormalizować do próbki o najmniejszym stężeniu. Pozwoli to na wykorzystanie tej samej objętości próbki w każdych warunkach.
  8. Dodać 10 μl buforu do testu 20S do każdego dołka, w tym ślepych prób testowych. W tym przypadku zalecana jest pipeta powtarzalna/automatyczna, aby zapewnić stałą objętość testu we wszystkich studzienkach.
  9. Fakultatywnie: Na tym etapie należy wprowadzić manipulacje in vitro, jeśli jest to pożądane; będzie to wymagało, aby każda próbka miała dodatkowe 2 studzienki na zabieg, łącznie z nośnikiem. Jeśli tak, dodaj 5-10 μl leku/związku będącego przedmiotem zainteresowania do 2 dołków na próbkę i równoważną objętość kontroli/nośnika do kolejnych 2 studzienek. Umieścić płytkę na wstępnie podgrzanym czytniku płytek lub w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 30 minut.
  10. Wyłącz światła lub wejdź do ciemnego pokoju. Dodać wszystkie 100 μl rozcieńczonych wzorców AMC do nowego dołka; Każdy standard będzie miał pojedynczą studnię.
  11. W ciemności dodać 10 μl rozcieńczonego substratu proteasomu do studzienek zawierających próbkę i ślepe próby testowe, ale nie do wzorca AMC. W tym przypadku zalecana jest pipeta powtarzalna/automatyczna, aby zapewnić stałą objętość testu we wszystkich studzienkach.
  12. Umieścić płytkę w czytniku płytek i rozpocząć bieg kinetyczny.
    nuta: Płyta nie musi być pod ciągłym mieszaniem podczas biegu kinetycznego, jednak użytkownik może to wybrać, jeśli sobie tego życzy
  13. Po zakończeniu cyklu kinetycznego wyeksportuj surowe wartości fluorescencji 360/460 do programu Microsoft Excel.
    1. Uśrednij razem zduplikowane studzienki dla każdego wzorca, każdej próbki i ślepej próby testu dla wszystkich 5 skanów. Wartości surowej fluorescencji powinny wzrastać podczas skanowania próbek, ale pozostać stabilne (lub nieznacznie spaść) w przypadku wzorców i ślepych prób testowych.
    2. Weź najwyższą średnią z odwiertu AMC i podziel przez znane stężenie (20 μM). Podziel tę wartość przez stężenie próbki użytej w teście, aby uzyskać znormalizowaną wartość AMC. Dla każdej próbki i średniej próby ślepej podziel przez znormalizowaną wartość AMC.
    3. Weź tę wartość końcową i podziel przez stężenie próbki użytej w teście, aby uzyskać znormalizowaną wartość dla każdej próbki i ślepej próby testu. Zrób to dla wszystkich 5 skanów.
    4. Odejmij znormalizowaną wartość ślepej próby testu od każdej znormalizowanej wartości próbki dla wszystkich 5 skanów.

5. Kwantyfikacja ubikwitynacji białek specyficznych dla sprzężeń

  1. Kwantyfikacja różnych znaczników poliubikwityny w różnych frakcjach subkomórkowych pobranych z tkanki mózgowej gryzoni powinna być przeprowadzona przy użyciu różnych standardowych protokołów Western blot w połączeniu z unikalnymi, specyficznymi dla wiązania przeciwciałami poliubikwityny.
    1. W celu denaturacji znormalizowane próbki należy zmieszać z równą objętością buforu próbki Laemmli uzupełnionego β-merkaptoetanolem do procentu 5% objętości, zgodnie z instrukcją producenta.
    2. Do ilościowego oznaczania wszystkich modyfikacji monoubikwitynacji i poliubikwitynacji, niezależnie od sprzężenia, należy użyć przeciwciała przeciwko pan-ubikwitynie.
    3. Aby rozpoznać wszystkie białka poliubikwitynowane, użyj przeciwciała ubikwityny, które nie reaguje krzyżowo z monoubikwitynacją.
    4. Do poliubikwitynacji specyficznej dla wiązania należy stosować przeciwciała, które mogą wykryć lizynę-27, lizynę-48, lizynę-63 i poliubikwitynację liniową (M1).
  2. Aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu między produktami, które mogłoby skutkować fałszywie dodatnim wynikiem lub zakłócać obrazowanie innej modyfikacji ubikwityny, należy rozebrać błony między opracowaniami za pomocą 0,1 M NaOH przez 10 minut.
    1. Umyj membrany w TBS za pomocą 0,1% tween dwa razy przez 10 minut i ponownie zablokuj (używając dowolnego środka blokującego preferowanego w zastosowanym protokole Western blot).
    2. Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym i ponownie rozwijać, aby potwierdzić, że błona została prawidłowo pozbawiona przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych.
    3. Zalecane: W celu pomyślnego wytworzenia różnych przeciwciał przeciwko ubikwitynie bez zanieczyszczenia należy stosować systemy obrazowania fluorescencyjnego lub bliskiej podczerwieni. Często może to zapobiec przenoszeniu między przeciwciałami.
  3. Niektóre obrazy ubikwityny Western blot będą zawierać kolumny z wyraźnymi prążkami (takimi jak M1), podczas gdy inne wytwarzają wzór podobny do rozmazu z kilkoma lub żadnymi wyraźnymi liniami (typowe dla K48). W celu ilościowego określenia obrazowanych zachodnich plam ubikwityny, narysuj ramkę wokół kolumny, która rozciąga całą drabinę wzorców molekularnych.
    1. Dostosuj pudełko w górę (lub w dół), jeśli barwienie ubikwityną rozciąga się przez całą drabinę; jest to powszechne w przypadku modyfikacji lizyny-48 i różni się znacznie w obrębie przedziałów subkomórkowych.
    2. Odejmij tło, które jest obliczane jako średnia gęstość optyczna tła bezpośrednio otaczającego kolumnę ze wszystkich stron.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z opisanej tutaj procedury, z bocznego ciała migdałowatego mózgu szczura pobrano frakcje jądrowe, cytoplazmatyczne i synaptyczne (Rysunek 1). Czystość poszczególnych frakcji potwierdzono za pomocą Western blot, czyli sondowania przeciwciałami przeciwko białkom, które powinny być wzbogacone lub zubożone w lizacie. W pierwszej półkuli, w której zebrano surową frakcję synaptyczną, białko o gęstości postsynaptycznej 95 (PSD95) było obecne we frakcji synaptyczne...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu demonstrujemy skuteczną metodę ilościowego określania zmian w aktywności ubikwityny-proteasomu w różnych przedziałach subkomórkowych u tego samego zwierzęcia. Obecnie większość prób pomiaru subkomórkowych zmian w aktywności układu ubikwityna-proteasom ogranicza się do jednego przedziału na próbkę, co skutkuje koniecznością powtórzenia eksperymentów. Prowadzi to do znacznych kosztów i utraty życia zwierząt. Nasz protokół łagodzi ten problem poprzez podział półkul, umożliwiając pobranie różnych frakcji komórk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez fundusze startowe z College of Agricultural and Life Sciences oraz College of Science at Virginia Tech. T.M. jest wspierany przez George Washington Carver Program w Virginia Tech.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5 M EDTAFisher15575020Różni inni dostawcy
Zestaw do aktywności proteasomu 20SMillipore SigmaAPT280Inni dostawcy oferują różne wersje
ATPFisherFERR1441Różni inni dostawcy
Przeciwciało beta-aktynySygnalizacja komórkowa4967SRóżni inni dostawcy
Komórka przeciwciała beta-tubuliny sygnalizacja2128TRóżni inni dostawcy
Czytnik płytek BioTek Synergy H1BioTekVATECHH1MT3Inni dostawcy oferują różne wersje
B-merkaptoetanolFisherICN19024280Różni inni dostawcy
Clasto laktacystyna b-laktonMillipore SigmaL7035Różni inni dostawcy
Kubek kriogenicznyFisher033377BRóżni inni dostawcy
DMSODMSOD8418Różni inni dostawcy
DTTMillipore SigmaD0632Różni inni dostawcy
GlicerolMillipore SigmaG5516Różni inni dostawcy
Przeciwciało H3Abcamab1791Różni inni dostawcy
HEPESMillipore SigmaH3375Różni inni dostawcy
Kwas solnyFisherSA48Różni inni dostawcy
IGEPAL (NP-40)Millipore SigmaI3021Różni inni dostawcy
K48 Przeciwciało ubikwitynyAbcamab140601Różni inni dostawcy
K63 Ubikwityna PrzeciwciałoAbcamab179434Różni inni dostawcy
KClMillipore SigmaP9541Różne inni dostawcy
Młynek do tkanek KONTESVWRKT885300-0002Różni inni dostawcy
Bufor do próbek LaemmliBio-rad161-0737Różni inni dostawcy
czujniki żywotnościprzeciwciał ubikwitynyAB-0130-0100Tylko przeciwciało M1
MgClMillipore Sigma442611Różni inni dostawcy
MikrowirówkaEppendorf2231000213Różni inni producenci/modele
myr-AIPEnzo Life SciencesBML-P212-0500Przenoszone przez Millipore-Sigma
NaClMillipore SigmaS3014Różni inni dostawcy
System obrazowania Odyssey FcLiCor2800-02Inni dostawcy oferują różne wersje
Inhibitor fosfatazyMillipore Sigma524625Różni inni dostawcy
Precision Plus Protein StandardBio-rad161-0373Różni inni dostawcy
Inhibitor proteazyMillipore SigmaP8340Różni inni dostawcy
Przeciwciało PSD95Sygnalizacja komórkowa3450TRóżni inni dostawcy
SDSMillipore SigmaL3771Różni inni dostawcy
Wodorotlenek soduFisherSS255Różni inni dostawcy
SacharozaMillipore SigmaS0389Różni inni dostawcy
TBSAlfa AesarJ62938Różni inni dostawcy
TrisMillipore SigmaT1503Różni inni dostawcy
Tween-20FisherBP337-100Różni inni dostawcy
Ubikwityna PrzeciwciałoEnzo Nauki przyrodniczeBML-PW8810Różni inni dostawcy
Liniowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).
  2. Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. Ubiquitin chain diversity at a glance. Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).
  3. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).
  4. Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking. Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).
  5. Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).
  6. Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling. Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).
  7. Collins, G. A., Goldberg, A. L. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 169 (5), 792-806 (2017).
  8. Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).
  9. Ezhkova, E., Tansey, W. P. Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3. Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).
  10. Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation. Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).
  11. Hegde, A. N., Upadhya, S. C. The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system. Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).
  12. Adori, C., et al. Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).
  13. Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals. Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).
  14. Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast. EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).
  15. Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115(2013).
  16. Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala. PLoS One. 6 (9), e24349(2011).
  17. Lopez-Salon, M., et al. The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation. European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).
  18. Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex. Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150(2013).
  19. Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning. Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).
  20. Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).
  21. Orsi, S. A., et al. Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory. Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).
  22. Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus. Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).
  23. Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval. Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).
  24. Lee, S. H., et al. Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory. Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).
  25. Dunah, A. W., Standaert, D. G. Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane. Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).
  26. Kelly, P. T., Cotman, C. W. Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide. Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).
  27. Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS. Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

frakcjonowanie subkom rkowetest proteasomuWestern blotfrakcja synaptycznafrakcja j drowafrakcja cytoplazmatycznaubikwitynacja specyficzna dla wi zaniadegradacja bia ek

Powiązane artykuły