Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Fizjologiczne sferoidy 3D pochodzące od pacjenta do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych w celu ukierunkowania na rakowe komórki macierzyste

8.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59696

⸱

5 lipca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, 2Department of Materials Science and Engineering, University of Michigan, 3Rogel Cancer Center, School of Medicine, University of Michigan, 4Macromolecular Science and Engineering, University of Michigan

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje generowanie sferoid pochodzących od pacjentów oraz dalszą analizę, w tym kwantyfikację proliferacji, testy cytotoksyczności, cytometrię przepływową, barwienie immunofluorescencyjne i obrazowanie konfokalne, w celu oceny potencjału kandydatów na leki jako terapii przeciwnowotworowych. Protokół ten wspiera medycynę precyzyjną w identyfikacji specyficznych leków dla każdego pacjenta i stadium choroby.

Streszczenie

W tym protokole opisujemy procedurę generowania sferoid guza w 384-dołkowych wiszących kropelkach, aby umożliwić wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków przeciwnowotworowych w fizjologicznie reprezentatywnym mikrośrodowisku. Przedstawiamy tworzenie się sferoid komórek macierzystych raka pochodzących od pacjenta, a także manipulację tymi sferoidami w celu dokładnej analizy po leczeniu farmakologicznym. W szczególności opisujemy zbiór danych dotyczących morfologii sferoidów, proliferacji, żywotności, toksyczności leków, fenotypu komórek i lokalizacji komórek. Protokół ten koncentruje się w dużej mierze na technikach analizy, które można łatwo wdrożyć za pomocą 384-dołkowej platformy wiszącej kropli, dzięki czemu idealnie nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków. Chociaż podkreślamy znaczenie tego modelu w badaniach nad rakiem jajnika i badaniami nad rakowymi komórkami macierzystymi, platforma 384-well jest otwarta na badania nad innymi typami nowotworów i modelami chorób, rozszerzając użyteczność platformy na wiele dziedzin. Przewiduje się, że dzięki poprawie szybkości spersonalizowanych badań przesiewowych leków i jakości wyników badań przesiewowych dzięki łatwym do wdrożenia fizjologicznie reprezentatywnym kulturom 3D, platforma ta pomoże w opracowaniu nowych terapii i strategii leczenia specyficznych dla pacjenta, a tym samym będzie miała szeroki wpływ kliniczny.

Wprowadzenie

Światowa śmiertelność związana z rakiem osiągnęła liczbę 9,8 miliona zgonów w 2018 roku1, podkreślając potrzebę rozwoju ulepszonych metod terapeutycznych. Niestety, koszty opracowania leków przeciwnowotworowych rosną, a opracowanie pojedynczego leku kosztuje około 650 milionów USD2 wskazuje na potrzebę poprawy strategii opracowywania nowych leków przeciwnowotworowych. Rakowe komórki macierzyste (CSC), które charakteryzują się zwiększoną odpornością na chemoodporność3, zdolnością do samoodnawiania się i zdolnością do zasiewania nowych nowotworów4 są uważane za odpowiedzialne za nawroty nowotworu4, metastasis5, oraz chemoresistance4,6, które przyczyniają się do złośliwości guza, a tym samym do wysokiej liczby zgonów. W raku jajnika komórki te znajdują się wzbogacone w złośliwy płyn wodobrzuszny w jamie otrzewnej, co jest stanem związanym ze złymi wynikami klinicznymi1. Ze względu na złośliwe zdolności CSC do stosowania nowych leków ukierunkowanych na CSC do stosowania w połączeniu z tradycyjnymi chemioterapiami. Istnieje kilka wyzwań, które towarzyszą rozwojowi CSC ukierunkowanych na leki, w tym: 1) trudności w rozszerzaniu i utrzymywaniu CSC in vitro; 2) niedobór próbek pobranych od pacjentów; 3) fizjologiczne znaczenie platformy hodowlanej; oraz 4) niejednorodność wrażliwości na leki między pacjentami. Protokół ten przedstawia implementację platformy hodowli 3D o wysokiej przepustowości, która może przezwyciężyć każde z tych wyzwań. W szczególności system ten pozwala na szybkie badania przesiewowe leków przy użyciu niewielkiej liczby CSC jajników pochodzących od pacjentki i jest wysoce podatny na dalsze techniki analizy. Chociaż nasza platforma jest idealna do badania raka jajnika i CSC, jest również cenna w badaniu innych nowotworów i zróżnicowanych typów komórek w złożonych środowiskach 3D.

Złożone modele trójwymiarowe (3D) są kluczowe w badaniu mikrośrodowiska guza (TME), które jest niszą 3D składającą się z komórek rakowych, nienowotworowych komórek podporowych i białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)4. To środowisko 3D skutkuje unikalną morfologią komórki, interakcjami komórka-komórka i komórka-macierz, różnicowaniem komórek, migracją komórek, gęstością komórek i gradientami dyfuzji w porównaniu z tradycyjną hodowlą komórkową 2D in vitro4. Wszystkie te czynniki prowadzą do zróżnicowanej odpowiedzi na lek w obrębie kultur 3D, wykazując zwiększoną oporność na leki i znaczenie fizjologiczne7,8. Ze względu na rolę 3D TME w różnicowaniu CSC i chemooporności, konieczne jest przeprowadzenie badań przesiewowych w kierunku CSC ukierunkowanych na leki w mikrośrodowiskach fizjologicznych. Poprawa fizjologicznego znaczenia platform do badań przesiewowych leków CSC może poprawić badania przesiewowe leków specyficzne dla pacjenta, opracowywanie leków, formułowanie strategii leczenia i ostatecznie wyniki kliniczne. Równie ważne jest, aby platforma wykorzystywana do badań przesiewowych leków była wysokoprzepustowa i kompatybilna z dalszymi metodami analizy, aby zminimalizować koszty, czas i czas tłumaczenia klinicznego obiecujących leków9.

Obecnie, kompleks TME jest najlepiej utrzymany do zastosowań w badaniach przesiewowych leków poprzez modele in vivo, takie jak mysie modele guzów syngenicznych, ksenografty pochodzące z linii komórkowych i modele ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX)12, ponieważ zapewniają one warunki fizjologiczne. Jednak niska przepustowość tych modeli, a także koszt, czas i umiejętności techniczne, których wymagają, ograniczają ich użyteczność w szybkich, wysokoprzepustowych aplikacjach przesiewowych leków13. Jako alternatywę dla tych modeli in vivo, wiele modeli 3D in vitro wykorzystujących hydrożele8, hodowlę w urządzeniach mikroprzepływowych lub urządzeniach "organ-on-a-chip"10,14 oraz kultury nieprzylegające3,8, ze względu na ich niską barierę wejścia pod względem kosztów, czasu i wymaganego zestawu umiejętności.

Platformy do hodowli hydrożelu są korzystne w precyzyjnej kontroli nad składem matrycy, właściwościami mechanicznymi i strukturą matrycy15; jednak mogą hamować hodowlę komórek o dużej gęstości14. Dodatkowo, pobieranie komórek z hydrożeli może komplikować dalszą analizę, ze względu na potencjalnie szkodliwe skutki metod zbierania15. Z drugiej strony urządzenia mikroprzepływowe to urządzenia w mikroskali, które pozwalają na wykrywanie danych wyjściowych w tym samym urządzeniu i hodowlę komórek w fizjologicznie odpowiednich skalach przy minimalnym zużyciu odczynników, skróconym czasie reakcji, zminimalizowanym marnotrawstwie i szybkiej dyfuzji14. Te cechy sprawiają, że są to obiecujące platformy do badania toksyczności, skuteczności i farmakokinetyki leków. Jednak wyzwania związane z wydajną, wymierną, powtarzalną i przyjazną dla użytkownika hodowlą komórek 3D, a także nieporęcznymi i kosztownymi systemami pompowania ograniczyły zastosowania mikroprzepływowe w badaniach o wysokiej przepustowości10. Wydajne konfiguracje detekcji i potencjalnie trudna implementacja w różnych dziedzinach utrudniły również powszechne przyjęcie systemów mikroprzepływowych10.

Przeciwnie, sferoidy generowane w warunkach nieprzylegających w mieszalnikach wirujących (nutatorach), bardzo niskich płytkach mocujących i wiszących kroplach nie zawierają zdefiniowanych przez użytkownika komponentów matrycy. Metodologie te są szczególnie istotne dla badania raka jajnika, ponieważ warunki nieprzylegające są reprezentatywne dla warunków, w których sferoidy rosną w jamie otrzewnej5. W ramach tych nieprzylegających metod hodowli wykazano, że nutatory i sferoidy wiszących kropli wykazują wyższe zagęszczenie, przebudowę i chemoodporność w porównaniu ze sferoidami generowanymi na bardzo niskich płytkach mocujących, co sugeruje zwiększone znaczenie fizjologiczne16,17,18,19. Ze względu na zwiększoną zdolność do wysokoprzepustowych badań przesiewowych z mniejszych rozmiarów studni i minimalną wymaganą liczbę komórek, generowanie sferoid w wiszących płytkach kroplowych jest idealną platformą do badań przesiewowych leków. Tutaj prezentujemy przestrajalną platformę fizjologiczną 3D w 384-dołkowych wiszących płytkach kroplowych, która jest łatwa do wdrożenia i wysoce podatna na dalszą analizę, dzięki czemu idealnie nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków w kierunku raka jajnika i CSC jajników.

Nasza platforma fizjologiczna 3D zapewnia wszystkie zalety hodowli 3D, w tym fizjologiczne kontakty komórka-komórka, gradienty dyfuzji, gęstości komórek i naturalnie wytwarzane białka ECM, które mogą przyczynić się do realistycznych odpowiedzi na leki16,17,18,19. Dodatkowo, generując te sferoidy z CSC pochodzącymi od pacjenta, jesteśmy w stanie określić specyficzne dla pacjenta reakcje na leki1 z wieloma technicznymi powtórzeniami jednocześnie, aby przezwyciężyć niejednorodność, którą można znaleźć w próbkach guza pacjenta20. Ponadto wykazano, że hodowla 3D poprawia utrzymanie populacji CSC3,16, a zatem jest reprezentatywna dla wzbogaconych populacji CSC w ascites7. To, w połączeniu z łatwą analizą dalszą, w tym analizą żywotności i proporcji CSC za pomocą cytometrii przepływowej, pozwala na optymalną ocenę CSC pod kątem skuteczności leku. Wreszcie, ta platforma fizjologiczna jest kompatybilna z obrazowaniem w wielu punktach czasowych podczas eksperymentu, oceną śmierci i proliferacji komórek, organizacją i morfologią komórek za pomocą immunohistochemii, rozpuszczalną sygnalizacją za pomocą ELISA na kondycjonowanej pożywce, fenotypami komórek z cytometrią przepływową i ekspresją genów po PCR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie próbki od pacjentów są pobierane zgodnie z zatwierdzonym protokołem IRB od pacjentów, którzy wyrazili na to zgodę, których próbki są pozbawione elementów pozwalających na identyfikację po usunięciu guza i wodobrzuszu.

1. Generowanie sferoid z małych liczb komórek w 384-dołkowych wiszących płytkach kroplowych

  1. Umieść wiszącą płytkę kroplową w sonikatorze wypełnionym sterylną wodą dejonizowaną (DI) i sonikuj przez 20 minut.
  2. Ręką w rękawiczce wyjmij płytkę z sonikatora i umyj ją bieżącą wodą DI.
  3. Pozostaw płytkę w kąpieli zawierającej 0,1% kwas pluronowy na 24 godziny, aby zapobiec adsorpcji białek i sferoidalnemu przyleganiu do studzienek.
  4. Wyjmij płytki ręką w rękawiczce i dokładnie spłucz obie strony płytki bieżącą wodą DI.
  5. Energicznie postukaj lub potrząśnij płytką w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby usunąć wodę ze studzienek w sterylnym środowisku.
  6. Umieść płytkę w świetle UV na 30–60 minut z każdej strony, aby wysterylizować płytki i zminimalizować zanieczyszczenie.
    nuta: Płytka może być również wystawiona na działanie gazowego tlenku etylenu w komorze do sterylizacji.
  7. Napełnij każdą studzienkę 6-dołkowej płytki 4-5 ml sterylnej, autoklawowanej wody demineralizowanej i umieść wiszącą płytkę kroplową między pokrywką a dnem płytki 6-dołkowej. Dodaj 800–1,000 μl sterylnej wody DI wokół krawędzi wiszącej płytki kroplowej, aby zapewnić wilgotne, stabilne i sterylne środowisko, aby zminimalizować objętość traconą w wyniku parowania (Rysunek 1 A-C).
  8. W przypadku komórek hodowanych w 2D należy odessać pożywkę pokrywającą komórki w ich logarytmicznej fazie wzrostu i przemyć 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), aby usunąć ślady płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w pożywce wzrostowej, ponieważ utrudnia to działanie trypsyny.
  9. Odessać PBS i dodać 1,5-2 ml 0,25% trypsyny-EDTA do 100-milimetrowej płytki do hodowli tkankowej. Inkubować komórki przez 5 minut w inkubatorze ustawionym na 37 °C.
    nuta: Komórki mogą odrywać się w różnym tempie, dlatego płytki należy sprawdzić pod mikroskopem laboratoryjnym, aby upewnić się, że komórki odrywają się po 5 minutach. Dostosuj protokół odłączania zgodnie z instrukcjami dostawcy w przypadku korzystania z linii komórkowej.
  10. Dodaj 6-8 ml pożywki komórkowej zawierającej FBS lub dowolną surowicę do naczynia, aby zneutralizować trypsynę, zbierz komórki za pomocą 10 ml pipety serologicznej i umieść je w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  11. Policz komórki, ładując 10 μl zawiesiny komórek po każdej stronie hemocytometru i postępuj zgodnie z powiązanym protokołem zliczania.
  12. W przypadku komórek pobranych od pacjenta z pierwotnych lub przerzutowych guzów litych lub z wodobrzusza, które nie były hodowane 2D, należy przygotować zawiesiny pojedynczych komórek w pożywce wolnej od surowicy (SFM) opisanej wcześniej3.
  13. Przetwarzaj tkanki nowotworowe zgodnie z wcześniejszym opisem i przechowuj zawiesiny pojedynczych komórek do późniejszego wykorzystania w odpowiednim podłożu zamrażającym21,22.
    1. W przypadku litej tkanki nowotworowej należy zmielić mechanicznie żyletką i przefiltrować otrzymany roztwór przez filtr 40 μm przed wyizolowaniem żądanych komórek z gradientu gęstości21,22.
    2. W przypadku próbek wodobrzusza należy zagęścić komórki przez odwirowanie, lizę krwinek czerwonych w buforze amonowo-chlorkowo-potasowym (ACK), przemyć 1x PBS, a następnie przepuścić przez filtr 40 μm i igłę 28 G 4 razy22.
  14. W celu wyizolowania CSC jajników należy posortować komórki za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano szczegółowo poniżej.
  15. Świeżo wyizolowane pojedyncze komórki są zamrażane do przechowywania i rozmrażane w razie potrzeby do eksperymentów.
  16. Aby przygotować zawiesinę komórek do posiewu, należy obliczyć żądaną objętość roztworu komórkowego wymaganą do posiewu: 20 μl na kroplę X całkowita liczba kropel = całkowita objętość roztworu potrzebna.
  17. Rozcieńczyć stężenie komórek do pożądanego stężenia komórek na 20 μl (tj. 100 komórek w kropli 20 μl).
  18. Przed posiewem delikatnie wymieszać zawiesinę komórek za pomocą pipety, aby zapewnić jednorodny rozkład komórek i poprawić jednorodność między kropelkami.
    nuta: Nadmierne mieszanie zawiesiny komórkowej może prowadzić do śmierci komórki i zanieczyszczeń w wiszących sferoidach kropli.
  19. Umieścić końcówkę pipety w studzience pod kątem około 45° i odpipetować 20 μl roztworu komórkowego do każdej wiszącej kropli.
    nuta: Wzory poszycia można dostosować w zależności od liczby potrzebnych sferoid. Posiewanie sferoid w co drugiej studzience jest bezpieczniejsze, gdy duże ilości sferoid nie są potrzebne w eksperymencie, ponieważ zapobiega przypadkowemu połączeniu się kropel (Rysunek 1D, E). Jeśli do eksperymentu potrzebne są duże ilości sferoid, należy pokryć każdą studzienkę płytką, pozostawiając jeden rząd studzienek granicznych ze wszystkich stron (Rysunek 1F).
  20. Umieść pokrywkę płytki 6-dołkowej z powrotem na wiszącej płytce kroplowej i użyj elastycznego paska z tworzywa termoplastycznego, który jest niewrażliwy na utratę wilgoci, aby uszczelnić krawędzie i zapobiec dodatkowemu parowaniu kropel. Inkubować w standardowym inkubatorze z nawilżanym materiałem CO2 (5% CO2, 37 °C).
  21. Podawaj wiszące krople raz na 2-3 dni, aby uzupełnić pożywkę do hodowli komórkowych w niezbędne składniki odżywcze, dodając 2-3 μl do każdej sferoidy zawierającej dobrze.
    nuta: Po obrazowaniu zawsze zaleca się karmienie wiszących kropli, ponieważ ekspozycja na powietrze podczas obrazowania prowadzi do parowania.

2. Dodawanie pożywki do hodowli komórkowych do wiszących płytek sferoidalnych

  1. Zdejmij termoplastyczny pasek i pokrywkę z komory bezpieczeństwa biologicznego i dodaj 2-3 μl odpowiedniej pożywki hodowlanej do każdej studzienki zawierającej wiszącą kroplę.
    nuta: Dodana objętość będzie zależeć od wielkości kropli i czasu między karmieniami.
  2. Po karmieniu przykryj płytkę górną pokrywą i przyłóż świeży pasek z tworzywa termoplastycznego do zewnętrznych krawędzi przed ponownym włożeniem płytki do inkubatora.

3. Obrazowanie morfologii sferoidalnej z kontrastem fazowym

  1. Usuń pasek z tworzywa termoplastycznego z okolic krawędzi płytki w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Ostrożnie wyjmij 384-dołkową wiszącą płytkę sferoidową z szafki bezpieczeństwa biologicznego z nadal założoną pokrywą i umieść ją w tacy mikroskopu pod mikroskopem epifluorescencyjnym.
  3. Użyj opcji obrazowania na żywo w oprogramowaniu do obrazowania z powiększeniem 4x, 10x lub 20x, aby obserwować wiszące sferoidy kropli i wykonać żądane obrazy.
  4. Po zapisaniu obrazów zanieś płytkę z powrotem do komory bezpieczeństwa biologicznego i komórek zasilających, jak opisano powyżej.
  5. Ponownie zamknąć płytkę świeżym paskiem z tworzywa termoplastycznego i umieścić zapieczętowaną płytkę z powrotem w inkubatorze.

4. Kwantyfikacja proliferacji i żywotności sferoid

  1. Sferoidy płytkowe w liczbie wystarczającej do uzyskania >10 kontrprób technicznych dla każdego punktu czasowego (tj. dnia 1 i dnia 7), który ma być zbadany.
    >nuta: Studzienki, które są używane do tego testu, na ogół nie są ponownie używane ze względu na potencjalne zanieczyszczenia barwnikiem rezazuryny.
  2. Dodać 2 μl przefiltrowanego roztworu na bazie rezazuryny do studzienek przeznaczonych do analizy proliferacji, tak jakby zasilały te studzienki i inkubować przez z góry określony okres inkubacji.
    nuta: Ten czas inkubacji może się różnić w zależności od typu komórki i liczby komórek w sferoidzie. Zaleca się określenie wymaganego czasu inkubacji potrzebnego przed rozpoczęciem eksperymentów proliferacji, rozpoczynając pomiary po 1 godzinie inkubacji, a następnie ponawiając pomiar co 30 minut, aż odczyt sygnału w studzienkach kontrolnych ustabilizuje się. Odczyty testu można wykonywać tyle razy, ile jest to pożądane. Inkubacja trwa zwykle 4 godziny w przypadku sferoid zainicjowanych ze 100 komórkami rakowymi.
  3. Najpierw włącz czytnik mikropłytek, a następnie powiązane oprogramowanie czytnika płytek co najmniej 15 minut przed pierwszym odczytem, aby umożliwić urządzeniu rozgrzanie się i zabezpieczenie temperatury wewnętrznej na poziomie 22 °C, ponieważ temperatura może mieć wpływ na odczyty.
  4. Otwórz protokół płytki 384-dołkowej z długościami fal wzbudzenia 530/25 nm i emisji 590/35 nm z optyką ustawioną na dół, wzmocnieniem ustawionym na 35, prędkością odczytu ustawioną na normalną i typem odczytu ustawionym na fluorescencję.
  5. Po okresie inkubacji otwórz wiszącą kanapkę w komorze bezpieczeństwa biologicznego i przynieś 384-dołkową płytkę z nadal założoną pokrywką do czytnika płytek.
  6. Umieść płytkę 384-dołkową z pokrywką na miejscu w tacce czytnika płytek, która zostanie wysunięta po rozgrzaniu urządzenia, a następnie kliknij przycisk OK, aby odczytać płytkę.
  7. Umieść płytkę studzienkową z powrotem w 6-dołkowej podstawie i umieść ją w inkubatorze. Jeśli wszystkie punkty czasowe zostały odczytane na dany dzień, ponownie zamknij płytkę przed ponownym umieszczeniem jej w inkubatorze.
  8. Zapisz eksperyment w oknie podręcznym, a następnie kliknij przycisk Tak po wyświetleniu monitu Czy chcesz wykonać PowerExports dla płyty 1, aby wprowadzić dane z oprogramowania czytnika płyt do arkusza kalkulacyjnego w celu organizacji.
  9. Średnie wartości fluorescencji dla każdego warunku i normalizacja przez średnią z warunku kontrolnego, aby zgłosić zmianę fałdowania w proliferacji w różnych warunkach eksperymentalnych.
  10. Porównując dzień 1 do dnia 7, znormalizuj, dzieląc przez dzień 1 średnią fluorescencję, aby uzyskać krotną zmianę proliferacji w czasie.
  11. Oblicz słupki błędów przy użyciu błędu standardowego średniej i określ istotność statystyczną między grupami eksperymentalnymi za pomocą odpowiedniego testu statystycznego, takiego jak dwustronny test T studenta.

5. Ocena toksyczności leków w sferoidach

  1. Podawanie leków
    1. W dowolnym momencie po utworzeniu sferoidy należy dostarczyć lek rozcieńczony do pożądanego stężenia tak, aby dawka 2 μl zawierała 10 razy więcej niż pożądane końcowe stężenie leku.
      nuta: Zakłada się odparowanie 2 μl z kropelki, tak aby objętość końcowa po leczeniu farmakologicznym wynosiła 20 μl. Na przykład dawka 50 μM cisplatyny będzie miała przygotowany roztwór 500 μM. Jeśli kropelki zawierają więcej niż 20 μl, stężenie leku i/lub dodana objętość powinny być odpowiednio dostosowane.
    2. Próbki kontrolne należy traktować 2 μl pożywki do hodowli komórkowych.
      nuta: Cisplatyna jest rozpuszczalna w wodzie. Dlatego kontrole to 2 μl pożywki do hodowli komórkowych; jednakże, jeśli nośnikiem leku jest inny rozpuszczalnik (np. DMSO), wówczas kontrole powinny być pożywką do hodowli komórkowych o takim samym stężeniu DMSO, jak stosowane w leczeniu farmakologicznym.
    3. Kontynuuj monitorowanie leczonego lekiem i sferoid kontrolnych przez cały okres inkubacji leku za pomocą mikroskopii fazowej, aby uzyskać wizualny zapis wpływu toksyczności leku, a także za pomocą barwnika resazurynowego, jak opisano powyżej, w celu monitorowania żywotności komórek.
      nuta: Zazwyczaj leki dodaje się po 5-7 dniach w wiszących kroplach, a toksyczność mierzy się po 48-72 godzinach, ale może się to różnić w zależności od eksperymentu. Leki można dodawać, gdy tylko utworzą się stabilne sferoidy, zwykle w ciągu 1-4 dni.
  2. Kwantyfikacja toksyczności leku przez zliczanie komórek
    1. W końcowym punkcie czasowym leczenia farmakologicznego należy zebrać po 10 sferoid ze studzienek kontrolnych i leczonych lekiem za pomocą pipety o pojemności 1000 μl i umieścić każdy zestaw sferoid we własnej probówce mikrowirówkowej.
    2. Rozbij sferoidy na pojedyncze komórki, powtarzając pipetowanie.
      nuta: Aby zmniejszyć potencjalne uszkodzenia komórek spowodowane wielokrotnym pipetowaniem, można przeprowadzić trawienie enzymatyczne z enzymem takim jak trypsyna, aby ułatwić wytwarzanie roztworów jednokomórkowych przed pipetowaniem23. Minimalizacja śmierci komórek w wyniku pipetowania zależy od typu komórki i powinna być odpowiednio zoptymalizowana. W przypadku obaw o śmierć z powodu dezagregacji, należy zapoznać się z analizą barwnika resazuryny i testem cytotoksyczności w celu uzyskania alternatywnych metod, które nie wymagają dezagregacji sferoidów.
    3. Odwirować probówki przez 5 minut przy 400 x g w celu zebrania komórek na dnie probówek do mikrowirówek i odessania supernatantu.
    4. Dodaj 20 μl świeżej pożywki lub 1x PBS do każdej probówki i dobrze wymieszaj.
    5. Dodać błękit trypanowy w proporcji 2 μl barwnika błękitu trypanowego na 20 μl zawiesiny komórkowej.
    6. Załadować 10 μl komórek i zawiesinę błękitu trypanowego do każdej komory hemocytometru i policzyć komórki pod mikroskopem świetlnym, przy czym komórki barwione na niebiesko reprezentują komórki martwe, a komórki niebarwione reprezentują komórki żywe.
      1. Aktywna komórka % = (liczba aktywnych komórek ÷ całkowita liczba komórek) x 100.

6. Charakterystyka sferoidalna za pomocą technik histologicznych

UWAGA: Istnieją dwie opcje formy wydrukowane w 3D w biokompatybilnym polimerze, aby replikować formy sferoidalne wykonane przez Ivanov et al.24: 1) 20-studzienkowa forma, która może pomieścić 28 μL na studzienkę i 2) 63-studzienna forma, która może pomieścić 9 μL na studzienkę (Rysunek 2D).

  1. Wysterylizuj pleśń histologiczną i jej granicę, wycierając je 70% etanolem i mocno przymocuj obramowanie wokół formy i połóż formę pionowo. Obie formy mieszczą około 3 ml płynu (3,203 ml dla 20 sferoidalnych i 3,196 ml dla 63 sferoidalnych tablic
    2. ).
  2. Lekko pokryj matrycę sferoidalną olejem Si o stężeniu 10 000 cSt za pomocą spiczastego bawełnianego wacika, aby ułatwić usunięcie odlewu żelu do przetwarzania próbki w kolejnych krokach.
  3. Podgrzej żel do przetwarzania próbek do upłynnienia w kuchence mikrofalowej przez 10–20 sekund z poluzowaną nakrętką.
  4. Dodaj od 2,6 do 2,8 ml stopionego żelu do obróbki do formy, aż mniej więcej zrówna się z górną częścią obramowania.
  5. W ciągu kilku minut, po zestaleniu, usuń odlew żelu do obróbki, oddzielając granicę od formy, a następnie odwracając formę matrycy.
  6. Włóż końcówkę pęsety między formę a obramowanie, aby ostrożnie je oddzielić, a następnie użyj skrobaka do komórek, aby pomóc usunąć odlew z formy, jeśli nie odczepi się od razu.
  7. Zbierz sferoidy z wiszącej płytki kroplowej, pipetując zawartość pojedynczego dołka na szalkę Petriego o średnicy 100 lub 150 mm z komórkami za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl i wizualnie wyizoluj sferoidę.
  8. Odmierzyć pipetą 5 μl zawartości studzienki, w tym zidentyfikowaną sferoidą, do jednego z dołków tablicy, aż do jej napełnienia.
  9. Odczekaj 3 minuty, aby upewnić się, że sferoidy osiadły na dnie matrycy, a następnie delikatnie odpipetuj stopiony żel do obróbki do każdej z dołków, uważając, aby nie naruszyć sferoid.
  10. Dodaj dodatkowy żel do obróbki, aby wyrównać górną część matrycy, a po schłodzeniu umieść zestaloną matrycę sferoidalną w oznakowanej kasecie do przetworzenia.
  11. Zanurz oznakowaną kasetę w 4% formalinie na noc, aby utrwalić sferoidy w temperaturze 4 °C, a następnie przechowuj w 70% etanolu w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowa do przetwarzania.
  12. Przetwarzaj za pomocą standardowego 1-godzinnego programu parafinowego, a następnie osadź matryce sferoidalne tak, aby przetworzone matryce były skierowane pionowo z dnem studzienek najbliżej czoła bloku.
  13. Upewnij się, że tablice są osadzone tak płasko, jak to możliwe, z dolną powierzchnią równo z dolną częścią bloku i umieść bloki na lodzie.
  14. Załaduj blok na mikrotom i wyreguluj blok tak, aby ostrze było równoległe do obciążonej powierzchni bloku.
  15. Przeciąć matrycę (głębokość próbki = 15 μm) aż do osiągnięcia dna dołków matrycy, upewniając się, że okrągłe studzienki są widoczne na pociętych próbkach.
  16. Zmienić na głębokość próbki 5 μm i kontynuować krojenie i zbieranie wstęg. Sprawdzaj pod mikroskopem co kilka plasterków, aby określić, czy osiągnięto głębokość sferoidy. Po osiągnięciu sferoid zbieraj każdy kolejny slajd, aż sferoidy przestaną być widoczne.
  17. Barwić każdy szkiełko standardowym protokołem BHP.

7. Test cytotoksyczności żywych żywych trupów

  1. Do każdej wiszącej kropli dodać barwnik z żywych komórek, kalceinę-AM do końcowego stężenia 2 μM, a barwnik martwych komórek, homodimer-1 etydyny-1 do końcowego stężenia 4 μM, pamiętając, że objętość kropli wynosi 20 μL.
    nuta: Staraj się ograniczyć dodawane objętości do minimum i zazwyczaj dodawaj 2 μl barwników w połączeniu.
  2. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze umieszczone w 6-dołkowej płytce z pokrywką i inkubować sferoidy przez 45 minut w temperaturze 37 °C.
    nuta: W zależności od wielkości sferoid czas inkubacji znacznie się różni. Na przykład sferoidy poniżej 400 μm zwykle wymagają tylko 30–45 minut czasu inkubacji, podczas gdy większe sferoidy bliżej 800 μm wymagają do 90 minut czasu inkubacji. Czas inkubacji musi być zoptymalizowany pod kątem indywidualnego eksperymentu.
  3. W celu późniejszego obrazowania należy pobrać sferoidy za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl w komorze bezpieczeństwa biologicznego i umieścić każdą sferoidę na wstępnie oczyszczonych szklanych szkiełkach mikroskopowych.
  4. Obraz sferoid przez szkło, w odwróconym mikroskopie konfokalnym.
    nuta: W zależności od odległości mikroskopu konfokalnego od laboratorium, w którym pobierane są sferoidy, sferoidy mogą być obrazowane w oryginalnej kropli pożywki umieszczonej na szkiełku lub zamknięte w 2% agarozie, jeśli do transportu sferoidów wymagana jest większa stabilność.
  5. Korzystając z trybu Akwizycji Wielowymiarowej w oprogramowaniu mikroskopu, zlokalizuj sferoidę za pomocą oświetlenia DIC przy 10-krotnym powiększeniu, a następnie zeskanuj płaszczyznę z, aby określić wysokości obejmujące sferoidę.
  6. Kliknij Seria Z i ustaw górną i dolną granicę skanowania z nieco wyżej niż górna część sferoidy i nieco niżej niż dolna część sferoidy.
  7. Wzbudzić sferoidy przy 488 nm dla kalceiny-AM (żywe komórki; zielony) i 561 nm dla homodimeru etydyny-1 (martwe komórki; czerwony) z rozmiarem kroku zalecanym przez oprogramowanie, maksymalnym wzmocnieniem i minimalną ekspozycją dla każdego koloru.
  8. Kliknij przycisk Pobierz, aby uzyskać złożony obraz stosu z żywymi i martwymi komórkami w sferoidzie.
  9. Określ ilościowo proporcje żywe/martwe za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby określić procent intensywności pikseli z kanału odpowiadającego komórkom na żywo w porównaniu z procentem intensywności pikseli z kanału odpowiadającego martwym komórkom z obrazów o projekcji z.
    nuta: Ze względu na ograniczenia w ilościowym określaniu struktury 3D za pomocą projekcji 2D, alternatywną metodą ilościowego określania fluorescencji żywej i martwej w wiszących płytkach kroplowych jest użycie czytnika płytek zgodnie z protokołem dołączonym do zestawu kalceiny-AM i homodimeru etydyny-1.

8. Immunofluorescencja

  1. Podgrzej niskotopliwy 2% roztwór agarozy, tak aby roztwór był lepki i tuż powyżej temperatury topnienia i umieść na szkiełku mikroskopowym, aby utworzyć miękkie złoże agarozy
  2. Zbierz sferoidy, przepychając 20 μl PBS przez kroplę na miękkie podłoże 2% agarozy.
    nuta: Należy to zrobić szybko, aby agaroza nie zestaliła się przed osadzeniem sferoidów.
  3. Gdy agaroza ostygnie i zżeluje się z uwięzionym w niej zebranym sferoidem (w ciągu 5 minut), dodaj 4% neutralnej buforowanej formaliny, aby utrwalić sferoidy. Alternatywnie dodać lodowaty metanol i utrwalić sferoidy zatopione w agarozie w temperaturze -20 °C przez 30 minut.
  4. Umyj 3x po 5 minut za pomocą 1x PBS, wyrzucając PBS po każdym praniu.
  5. Blokuj przez 1 godzinę w temperaturze słonecznej z 10% surowicą (tj. surowicą końską) i 0,15% roztworem mydła (Triton X-100) w 1x PBS.
  6. Umyj 3x po 5 minut za pomocą 1x PBS, wyrzucając PBS po każdym praniu.
  7. Zabarwić sferoidy pożądanym przeciwciałem fluorescencyjnym w zalecanym lub z góry ustalonym rozcieńczeniu przeciwciała (tj. znakowaną fluorescencyjnie falloidyną w rozcieńczeniu 1:100), inkubując przez co najmniej 90 minut w temperaturze pokojowej, przykryte światłem.
    nuta: Protokoły będą się różnić w zależności od przeciwciała i celu, a rozcieńczenie przeciwciał może wymagać optymalizacji w zależności od eksperymentu.
  8. Wizualizację sferoid barwionych fluorescencyjnie za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego przy użyciu metod opisanych w poprzednim rozdziale dotyczących obrazowania sferoidów.
  9. Złożone obrazy z-stack pokażą morfologię 3D sferoid.

9. Zbieranie i analiza populacji nowotworowych komórek macierzystych za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Przygotowanie sferoid do analizy metodą cytometrii przepływowej
    1. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl zebrać sferoidy z każdej studzienki na wiszących płytkach kroplowych i umieścić je w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml w celu dezagregacji z wielokrotnym pipetowaniem.
    2. Policz żywe komórki na hemocytometrze za pomocą błękitu trypanowego, aby określić liczbę komórek i stężenie, jak opisano powyżej.
    3. Podwielokrotną zawiesinę komórek do pięciu probówek do mikrowirówek tak, aby każda zawierała co najmniej 50 000 komórek.
    4. Odwirować wszystkie probówki o masie 400 x g przez 5 minut w mikrowirówce.
    5. Odessać supernatant z każdej probówki i ponownie zawiesić granulki w 100 μl buforu.
    6. Oznacz probówki odpowiednio "Niebarwione", "DAPI", "APC-iso", "DEAB" i "ALDH/CD133".
    7. Dodać 0,5 μl przeciwciała izotypu APC do probówki APC-iso i 1 μl przeciwciała CD133 do probówki ALDH/CD133, zgodnie z ustaleniami seryjnego rozcieńczania i zaleceniami producenta.
    8. Dodać 5 μl odczynnika DEAB i 0,5 μl ALDH do probówki DEAB i 1 μl ALDH do probówki ALDH/CD133.
    9. Wirować wszystkie probówki przez około 2 s i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut.
    10. Ponownie wymieszać wszystkie probówki i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w mikrowirówce.
    11. Oznacz probówki FACS jako "Niebarwione", "DAPI", "APC-iso", "DEAB" i "ALDH/CD133" i napełnij izolowany pojemnik z pianki, aby odłożyć na bok.
    12. Odessać supernatant i ponownie zawiesić "niebarwioną" kontrolę w 400 μl buforu FACS (1x PBS z 2% FBS) i wszystkich innych probówkach w 400 μl buforu FACS DAPI (bufor FACS z 300 μM 4',6-diamidino-2-fenyloindolem).
    13. Umieść probówki w pojemniku z lodem do czasu analizy na cytometrze przepływowym.
      nuta: Aby posortować komórki macierzyste raka jajnika, zbierz wszystkie komórki, które cytometr mierzy jako ALDH+ i CD133+ z bramkami ustawionymi tak, aby zawierały 0,5% niespecyficznego sygnału APC i 0,15% niespecyficznego sygnału ALDH+. Aby uzyskać wiarygodne wyniki, należy przeanalizować co najmniej 10 000 komórek. Dodatkowe informacje można znaleźć w najnowszych publikacjach3,17.
  2. Analiza populacji ALDH+/CD133+ w FlowJo
    1. Kliknij dwukrotnie ikonę FlowJo, aby otworzyć program i przeciągnij pliki .fcs uzyskane z oprogramowania do cytometrii przepływowej do obszaru roboczego.
    2. Kliknij dwukrotnie niezabarwiony plik i ustaw oś y na wysokość rozrzutu bocznego (SSC-H), a oś x na wysokość rozproszenia do przodu (FSC-H).
    3. Kliknij przycisk T obok każdej osi, aby dostosować skalę i transformację w celu zmaksymalizowania separacji między różnymi populacjami komórek.
    4. Kliknij przycisk Bramkowanie wielokątów i narysuj bramę wielokąta wokół populacji komórek i oznacz populację jako "Komórki".
    5. Kliknij dwukrotnie populację komórek w obszarze roboczym, aby wyświetlić tylko komórki w populacji "Komórki", a następnie kliknij oś FSC, aby zmienić kanał osi na szerokość FSC, a następnie kliknij oś SSC i zmień kanał osi na FSC-H.
    6. Wybierz narzędzie Bramka prostokątna i narysuj prostokąt wokół gęstej populacji komórek po lewej stronie obejmującej całą oś y, aby wykluczyć potencjalne dublety po prawej stronie okna i oznacz tę bramkę jako "Pojedyncze komórki".
    7. Kliknij prawym przyciskiem myszy i skopiuj komórki oraz zagnieżdżoną bramę pojedynczych komórek, a następnie wklej je pod każdą próbką w obszarze roboczym.
    8. Kliknij dwukrotnie bramkę pojedynczych komórek zagnieżdżoną pod próbką DAPI w obszarze roboczym, aby wyświetlić populację pojedynczych komórek z tej probówki z próbką, a następnie kliknij oś FSC i zmień kanał osi na DAPI - kanał obszaru.
    9. Kliknij oś SSC i zmień kanał osi na Histogram.
      UWAGA: Aktywne komórki będą znajdować się po lewej stronie, ponieważ wykluczają DAPI, podczas gdy martwe komórki przyjmą DAPI i pojawią się po prawej stronie wykresu.
    10. Kliknij przycisk T obok osi DAPI i kliknij Dostosuj oś, aby dostosować skalę, aby zmaksymalizować separację między dodatnimi i ujemnymi pikami DAPI.
      nuta: Pojawi się okno z opcjami skalowania. Często ustawienie pola Skala na Biex i dostosowanie Extra Negative Decades i Width Basis daje największą separację.
    11. Kliknij przycisk Zastosuj w oknie podręcznym, aby zastosować zmiany skalowania, wybierz przycisk Bramka zakresu i rozłóż go na ujemnym piku DAPI, odpowiadającym populacji żywych komórek.
    12. Oznacz tę bramkę jako "Żywe komórki" i kliknij prawym przyciskiem myszy, aby skopiować bramkę "Żywe komórki", aby wkleić ją pod bramkę "Pojedyncze komórki" pod probówkami "APC-iso, "DEAB" i "ALDH/CD133", aby wybrać tę samą część żywych komórek w każdej probówce z próbką.
    13. Następnie kliknij dwukrotnie populację Live Cells zagnieżdżoną w przykładowym pliku APC-iso i przełącz oś x na kanał ALDH — Obszar, a oś y na APC — Kanał obszaru.
    14. Ponownie dostosuj skalę osi, klikając przycisk T i Dostosuj oś każdej osi, tak aby zdarzenia były zlokalizowane w lewym dolnym obszarze wykresu, a następnie wybierz opcję Poczwórna bramka i kliknij okno wykresu, aby ustalić bramkę kwadrantową.
    15. Dostosuj przecięcie bramki tak, aby około 0,5% populacji leżało w lewym górnym rogu okna działki lub kwadrantu "APC dodatni".
      nuta: Te 0,5% reprezentuje niespecyficzne barwienie izotypu APC.
    16. Kliknij prawym przyciskiem myszy każdą etykietę kwadrantu z osobna w obszarze roboczym i zmień ich odpowiednie nazwy. Sterowanie lub Command Kliknij etykiety poszczególnych bramek kwadrantowych w obszarze roboczym i skopiuj je.
      UWAGA: "Q1" reprezentuje komórki CD133+; "Q2" oznacza komórki CD133+ i ALDH+'; "Q3" oznacza komórki ALDH+; a "Q4" reprezentuje komórki CD133 i ALDH.
    17. Wklej bramki kwadrantowe do populacji żywych komórek zagnieżdżonej w pliku "DEAB". Dostosuj linię pionową tak, aby około 0,15% populacji komórek leżało w kwadrancie "ALDH+", uważając, aby nie przesunąć linii poziomej.
      nuta: Te 0,15% reprezentuje niespecyficzny sygnał ALDH.
      1. Aby upewnić się, że linia pozioma nie zmieniła położenia, skopiuj nowe bramki kwadrantowe zagnieżdżone w pliku DEAB i wklej je do aktywnych komórek w pliku ISO APC. Wybierz opcję Tak, gdy pojawi się monit o zastąpienie istniejącej bramki kwadrantowej.
      2. Sprawdź w obszarze roboczym, czy procent "CD133+" nadal wynosi około 0,5 w pliku "APC-iso".
    18. Skopiuj i wklej bramki kwadrantowe do populacji "Żywe komórki" pliku "ALDH/CD133".
      nuta: Procent populacji żywotnych komórek obecnych w prawym górnym kwadrancie będzie procentem podwójnie dodatnich CSC ALDH+ i CD133+ w próbce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Sferoidy utworzone z linii komórkowych lub CSC wywodzących się od pacjentów mogą być formowane z różnej liczby komórek w kropelkach zwisających (Rysunek 2A). Sferoidy tworzą się niezawodnie przy użyciu nawet 10 komórek na studzienkę, co pozwala na oszczędne wykorzystanie rzadkich próbek pacjentów. Komórki w tych sferoidach są otoczone innymi komórkami w trzech wymiarach, tak jak ma to miejsce in vivo, co umożliwia fizjologiczne kontakty międzykomórkowe i fizjologiczne tempo dyfuzji. Komórki ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

384-dołkowa platforma do zawieszania płytek opadowych do tworzenia sferoid 3D jest łatwym do wdrożenia narzędziem dla każdego laboratorium biologii komórki lub biologii raka. Ta platforma fizjologiczna umożliwia badanie linii komórkowych, a także pierwotnych próbek pacjentów w fizjologicznie istotnych kulturach 3D, umożliwiając jednocześnie wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków. Platforma zapewnia również, że warunki hodowli są wysoce przestrajalne, umożliwiając ścisłą kontrolę nad gęstością posiewu, proporcjami ko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana głównie przez DOD OCRP Early Career Investigator Award W81XWH-13-1-0134(GM), DOD Pilot Award W81XWH-16-1-0426 (GM), DOD Investigator Initiated award W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM), Rivkin Center for Ovarian Cancer i Michigan Ovarian Cancer Alliance. Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Cancer Institute of the National Institutes of Health w ramach nagrody numer P30CA046592. CMN jest wspierany przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship w ramach grantu nr 1256260. MEB jest wspierany przez stypendium Departamentu Edukacji Graduate Assistance in Areas of National Need (GAANN).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% trypsyna-EDTAGibcoILT25200056
10 ml pipeta serologicznaFisher Scientific13-678-11E
10 000 cSt Olej SiMillipore Sigma63148-62-9Służy do powlekania formy szyku sferoidalnego w celu ułatwienia usuwania żeli do przetwarzania tkanek, takich jak Histogel, z formy.
Naczynie do hodowli tkankowych 100 mmThermo Scientific 130182
15 ml rurka stożkowaCelltreatFL4021
1x DMEM do podłoża wolnego od surowicyGibco11965-092
1x F12 do podłoża wolnego od surowicyGibco11765-054
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)GibcoILT10010023
4',6- diamidino-2-fenyloindol (DAPI)Thermo FisherD1306
40 &mikro; m filtrFisher Scientific22363547
6-dołkowa płytkaFisher Scientific353046
AccutaseInnovative Cell Technologies Inc.1449Delikatny enzym odrywający komórki złożony z enzymów proteolitycznych i kolagenolitycznych.
ACK Lysing BufferThermo ScientificA1049201
alamarBlueInvitrogenDAL1025barwnik Resazurin stosowany do pomiaru żywotności i proliferacji komórek na podstawie ich zdolności do redukcji resazuryny do rezorufiny, która jest wysoce fluorescencyjna.
Zestaw do oznaczania ALDEFLUORStem Cell Tech1700Kit do identyfikacji komórek macierzystych i progenitorowych, które wyrażają wysoki poziom dehydrogenazy aldehydowej , wskaźnika rakowych komórek macierzystych. Zestaw składa się z odczynnika ALDEFLUOR, DEAB, kwasu solnego, dimetylosulfotlenku i buforu do oznaczania ALDEFLUOR.
ALDEFLUOR Dietyloaminobenzaldehyd (DEAB)Stem Cell Tech1705Dietyloaminobenzaldehyd (DEAB) jest inhibitorem izoenzymów ALDH, stosowanym do określania nieswoistego barwienia ALDH.
Kamera CCD Andor iXon x3OxfordInstruments-Antybiotyki
i leki przeciwgrzybiczeGibco15240-062
Izotyp APC IgG2bMiltenyi biotec130-092-217Kontrola izotypu w celu ilościowego określenia niespecyficznego barwienia przeciwciał IgG2b.
B27 SuplementGibco17504044
technologie komórek macierzystychczynnika wzrostu fibroblastów78003.1
Strzykawki do insuliny BD Lo-Dose U-100Fisher Scientific14-826-79
Czytnik mikropłytek BioTek Synergy HTBioTek7091000
CD133-APCMiltenyi biotec130-113-184Przeciwciało fluorescencyjne skierowane przeciwko CD133, markerowi rakowych komórek macierzystych.
cellSens Dimension SoftwareOlympus
CisplatinSigma-AldrichP4394Środek chemioterapeutyczny na bazie platyny, który działa jako środek alkilujący, który zaburza DNA.
DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek)InvitrogenD1306
Naskórkowy czynnik wzrostuGibcoPHG0311
EVOS XL System obrazowania komórek rdzeniowychTechnologiesAME3300
Surowica bydlęca płodu - premium (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
Ficoll 400Sigma-AldrichF4375
HemacytometrHausser Scientific1490
HistogelThermo ScientificHG-4000-012Żel do przetwarzania tkanek, który może przenikać i utrzymywać próbkę w żelu, jednocześnie zapobiegając przebarwieniom wokół próbki po barwieniu.
Mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z ludzkiej tkanki tłuszczowejLonzaPT-5006
Ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowegoLonzaCC2543
Suplement insuliny-transferyny-selenuGibco51500-056
Zestaw żywotności żywej/martwejZestaw InvitrogenL3224do fluorescencyjnego wykrywania żywych (kalceina-AM) i martwych komórek (Ethidium Homodimer-1).
MEM Aminokwasy endogenneGibco11140-050
Oprogramowanie MetaMorph 7.8Urządzenia molekularne-Olympus
IX81 Odwrócony mikroskop konfokalnyOlympus-Olympus
IX83 Odwrócony mikroskop badawczyOlympus
Parafilm MThomas Scientific7315D35Paski z polimeru termoplastycznego, które służą do ograniczania parowania kropel w wiszących płytkach kroplowych, jednocześnie umożliwiając wymianę gazową.
Perfecta 3D 384 Dobrze wiszące płytki kroplowe3D BiomatrixHDP1384-8Dostępne przez Sigma-Aldrich
falloidin AlexaFluor488InvitrogenA12379Phalloidin to peptyd do fluorescencyjnego znakowania F-aktyny w utrwalonych komórkach.
ProJet 3500 HD Max3DSystems-Drukarka3D
Sterylna woda DIFisher Scientific353046
Trypan BlueGibco15250061Barwnik azowy używany do rozróżniania żywych i martwych komórek na podstawie jego zdolności do przechodzenia przez uszkodzoną błonę martwych komórek, ale nie przez nienaruszoną błonę żywych komórek.
VisiJet M3 Crystal3DSystems-Biokompatybilny materiał polimerowy do druku 3D.
Skaner konfokalny Yokogawa CSU-X1Yokogawa-
podstawowe Life

Bibliografia

  1. All cancers Source: Globocan. , Globocan. http://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/cancers/39-All-cancers-fact-sheet.pdf (2018).
  2. Prasad, V., Mailankody, S. Research and Development Spending to Bring a Single Cancer Drug to Market and Revenues After Approval. JAMA Internal Medicine. 177, 1569-1575 (2017).
  3. Raghavan, S., et al. Personalized Medicine Based Approach to Model Patterns of Chemoresistance and Tumor Recurrence Using Ovarian Cancer Stem Cell Spheroids. Clinical Cancer Research. 23 (22), 6934-6945 (2017).
  4. Jordan, C. T., Guzman, M. L., Noble, M. Cancer Stem Cells. New England Journal of Medicine. 355, 1253-1261 (2006).
  5. Ishiguro, T., et al. Establishment and Characterization of an In Vitro Model of Ovarian Cancer Stem-like Cells with an Enhanced Proliferative Capacity. Cancer Research. 76, 150-160 (2016).
  6. Páez, D., et al. Cancer Dormancy: A Model of Early Dissemination and Late Cancer Recurrence. Clinical Cancer Research. 18, 645-653 (2012).
  7. Ahmed, N., Stenvers, K. L. Getting to Know Ovarian Cancer Ascites: Opportunities for Targeted Therapy-Based Translational Research. Frontiers in Oncology. 3, (2013).
  8. Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres. Biomaterials. 115, 141-154 (2017).
  9. Varna, M., Bertheau, P., Legrès, L. Tumor Microenvironment in Human Tumor Xenografted Mouse Models. Journal of Analytical Oncology. 3, 159-166 (2014).
  10. Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: Effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays. Lab on a Chip. 13, 1133-1143 (2013).
  11. Zang, R., Li, D., Tang, I. C., Wang, J., Yang, S. T. Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. , (2012).
  12. Murphy, B., et al. Evaluation of alternative in vivo drug screening methodology: a single mouse analysis. Cancer Research. 76, 5798-5809 (2016).
  13. Hidalgo, M., et al. Patient-derived Xenograft models: An emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
  14. Damiati, S., Kompella, U. B., Damiati, S. A., Kodzius, R. Microfluidic devices for drug delivery systems and drug screening. Genes. 9, (2018).
  15. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A Practical Guide to Hydrogels for Cell Culture. Nature Methods. 14, 69-81 (2016).
  16. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Control Release. , (2012).
  17. Mehta, P., Novak, C., Raghavan, S., Ward, M., Mehta, G. Self-Renewal and CSCs In Vitro Enrichment: Growth as Floating Spheres. Cancer Stem Cells: Methods and Protocols. Papaccio, G., Desiderio, V. , Springer. New York. 61-75 (2018).
  18. Raghavan, S., et al. Formation of stable small cell number three-dimensional ovarian cancer spheroids using hanging drop arrays for preclinical drug sensitivity assays. Gynecologic Oncology. 138, 181-189 (2015).
  19. Raghavan, S., et al. Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity. Oncotarget. 7, 16948-16961 (2016).
  20. Kim, S., et al. Evaluating Tumor Evolution via Genomic Profiling of Individual Tumor Spheroids in a Malignant Ascites. Scientific Reports. 8, 1-11 (2018).
  21. Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Research. 71, 3991-4001 (2011).
  22. Pulaski, H. L., et al. Identifying alemtuzumab as an anti-myeloid cell antiangiogenic therapy for the treatment of ovarian cancer. Journal of Translational Medicine. 7, 49(2009).
  23. Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61, 78-84 (2016).
  24. Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D. Scientific Reports. 7, 41160(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Sferoidy pochodzące od pacjentówtrójwymiarowa hodowla komórkowaplatforma wiszącej kropliwysokoprzepustowe przesiewianieanaliza cytometrycznatest żywotności z użyciem rezazurynyobrazowanie konfokalnesekwencjonowanie RNA pojedynczych komórekmodel raka jajnika
Fizjologiczne sferoidy 3D pochodzące od pacjenta do badań przesiewowych leków przeciwnowotworowych w celu ukierunkowania na rakowe komórki macierzyste
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.