Opisujemy metodę w roztworze, polegającą na zastosowaniu równomiernego ścinania do receptorów powierzchni płytek krwi za pomocą wiskozymetrii stożko-płytkowej. Metoda ta może być również stosowana w szerszym zakresie do stosowania ścinania do innych typów komórek i fragmentów komórek i nie musi być ukierunkowana na określoną parę ligand-receptor
.Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Jednolity test ścinania dla ludzkich receptorów płytkowych i komórkowych za pomocą wiskozymetrii stożkowo-płytkowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wiele biologicznych komórek/tkanek wyczuwa właściwości mechaniczne swojego lokalnego środowiska za pomocą mechanoreceptorów, białek, które mogą reagować na siły takie jak ciśnienie czy zakłócenia mechaniczne. Mechanoreceptory wykrywają swoje bodźce i przekazują sygnały za pomocą wielu różnych mechanizmów. Niektóre z najczęstszych ról mechanoreceptorów to reakcje neuronalne, takie jak dotyk i ból, lub komórki rzęsate, które działają w równowadze i słuchu. Mechanosensacja jest również ważna dla typów komórek, które są regularnie narażone na stres ścinający, takich jak komórki śródbłonka, które wyściełają naczynia krwionośne lub komórki krwi, które doświadczają ścinania w normalnym krążeniu. Lepkościomierze to urządzenia, które wykrywają lepkość płynów. Lepkościomierze rotacyjne mogą być również używane do przykładania znanej siły ścinającej do płynów. Zdolność tych instrumentów do wprowadzania równomiernego ścinania do płynów została wykorzystana do badania wielu płynów biologicznych, w tym krwi i osocza. Wiskozymetria może być również stosowana do nakładania ścinania na komórki w roztworze oraz do testowania wpływu ścinania na określone pary ligand-receptor. W tym przypadku wykorzystujemy wiskozymetrię stożkowo-płytkową do zbadania wpływu endogennych poziomów naprężeń ścinających na płytki krwi traktowane przeciwciałami przeciwko kompleksowi receptorów mechanosensorycznych GPIb-IX.
Wprowadzenie
Mechanoreceptory to białka, które reagują na bodźce mechaniczne, takie jak ciśnienie czy mechaniczne zakłócenia/deformacje. W przypadku niektórych mechanoreceptorów wyczuwanie tych mechanicznych zakłóceń jest jednoznaczne z funkcją typów komórek, w których są one wyrażane. Weźmy na przykład receptory rozciągania w neuronach baroreceptorowych; Te mechanowrażliwe kanały jonowe regulują ciśnienie krwi, wykrywając "rozciąganie" naczyń krwionośnych1,2. W uchu wewnętrznym kanały jonowe na komórkach rzęsatych wykrywają deformacje mechaniczne spowodowane przez fale dźwiękowe3, a mechanoreceptory niskoprogowe skóry (LTMRs) ułatwiają przekazywanie informacji dotykowych4. W innych przypadkach mechanoreceptory dostarczają komórce ważnych informacji w celu ustanowienia adhezji lub wzrostu. Komórki mogą wyczuwać sztywność swojego lokalnego środowiska i mogą polegać na siłach kurczliwych za pośrednictwem cytoszkieletu aktynowego i integryn, aby dyktować wzrost lub rozprzestrzenianie się5,6.
Podczas badania interakcji receptor-ligand w modelach komórkowych lub tkankowych, istnieją powszechne testy, które mogą szybko i dokładnie raportować efekty zmiany temperatury, pH, stężenia ligandów, toniczności, potencjału błonowego i wielu innych parametrów, które mogą się różnić in vivo. Jednak te same testy mogą być niewystarczające, jeśli chodzi o wykrycie udziału siły mechanicznej w aktywacji receptora. Niezależnie od tego, czy komórki wyczuwają swoje mikrośrodowisko, wykrywają fale dźwiękowe, czy reagują na rozciąganie, jedną wspólną cechą wyżej wymienionych mechanoreceptorów jest to, że uczestniczą w interakcjach, w których ligand, receptor lub oba te elementy są zakotwiczone na powierzchni. Testy opracowane w celu zbadania wpływu sił mechanicznych na oddziaływania receptorów często odzwierciedlają ten paradygmat. Mikrofluidyka i komory przepływowe są wykorzystywane do badania wpływu przepływu ścinającego na komórki i receptory7,8. Tego typu eksperymenty mają tę zaletę, że umożliwiają precyzyjne dostrojenie szybkości ścinania za pomocą ustalonych prędkości przepływu. Inne techniki wykorzystują fluorescencyjne sondy molekularne do wykrywania sił wywieranych przez komórki na powierzchniach bogatych w ligandy, uzyskując dokładny odczyt wielkości i orientacji sił zaangażowanych w interakcję9,10.
Oprócz mechanosensacji występującej, gdy jeden lub obaj partnerzy są zakotwiczeni na powierzchni, naprężenia ścinające mogą wpływać na białka i komórki w roztworze. Jest to często obserwowane w komórkach/białkach krwi, które są stale w krążeniu i może objawiać się poprzez aktywację mechanoreceptorów, które są normalnie zakotwiczone powierzchniowo11, lub poprzez ekspozycję sekwencji docelowych, które zostałyby zasłonięte w warunkach statycznych12. Jednak stosunkowo mniej technik bada wpływ siły ścinającej na cząstki w roztworze. Niektóre podejścia w roztworze wprowadzają ścinanie poprzez wirowanie komórek w zawiesinie płynu o różnych prędkościach i czasie trwania, chociaż podejścia te mogą nie pozwalać na bardzo precyzyjne określenie generowanego naprężenia ścinającego. Lepkościomierze rotacyjne mierzą lepkość, przykładając określoną siłę ścinającą do płynów. W niniejszym artykule opisano zastosowaną metodę określania wpływu określonych szybkości ścinania laminarnego na komórki lub fragmenty komórek w roztworze.
Jednym z najbardziej ekspresyjnych białek na powierzchni płytek krwi jest kompleks Ib-IX glikoproteiny (GP). GPIb-IX jest głównym receptorem dla białka osocza czynnika von Willebranda (VWF). Razem, ta para receptor-ligand od dawna jest uznawana za podstawę odpowiedzi płytek krwi na naprężenie ścinające13. W przypadku uszkodzenia naczyń krwionośnych VWF wiąże się z odsłoniętym kolagenem w macierzy podśródbłonkowej14, rekrutując w ten sposób płytki krwi do miejsca uszkodzenia poprzez interakcję VWF-GPIb-IX. Zaangażowanie VWF w miejsce wiązania w podjednostce GPIbα, jeśli GPIb-IX pod wpływem fizjologicznego naprężenia ścinającego indukuje rozwijanie się błonowo-proksymalnej domeny mechanosensorycznej (MSD), która z kolei aktywuje GPIb-IX15. W niedawnym badaniu wykazaliśmy, że przeciwciała przeciwko GPIbα, podobnie jak te wytwarzane u wielu pacjentów z małopłytkowością immunologiczną (ITP), są również zdolne do indukowania sygnalizacji płytek krwi poprzez MSD rozwijające się pod wpływem stresu ścinającego11. Jednak w przeciwieństwie do VWF, który ułatwia indukowaną ścinaniem aktywację GPIb-IX poprzez unieruchomienie kompleksu w normalnym krążeniu, przeciwciała dwuwartościowe są w stanie sieciować płytki krwi za pośrednictwem GPIb-IX i rozwijać MSD w krążeniu. W ten sposób mechanoreceptor, który jest normalnie aktywowany przez unieruchomienie powierzchni pod ścinaniem, może być aktywowany w roztworze. W niniejszym raporcie pokażemy, w jaki sposób test jednorodnego ścinania oparty na lepkościomierzu został wykorzystany do wykrycia wpływu określonych poziomów naprężeń ścinających na aktywację receptora w roztworze.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane tutaj metody z wykorzystaniem ludzkich płytek krwi pochodzących od dawców zostały zatwierdzone przez Komisję Bioetyczną (Institutional Review Board) Uniwersytetu Emory/Children's Healthcare of Atlanta.
1. Pobieranie krwi i izolacja płytek krwi
- Pobierz krew od zdrowych, dorosłych dawców, którzy wyrazili zgodę na udział w badaniu, metodą nakłucia żyły w dniu eksperymentu do 3,8% cytrynianu trisodu. Jedna probówka zawierająca 4,5 ml krwi jest wystarczająca, aby uzyskać ilość osocza bogatopłytkowego (PRP) potrzebną do 20–25 wariantów doświadczalnych u dawców, których liczba płytek krwi oscyluje wokół 250 x 10^9/L.3 na μL.
UWAGA: Należy unikać pobierania krwi za pomocą igieł o małej średnicy (mniejszych niż 21 G). - Przygotować PRP poprzez wirowanie przy 22 °C oraz 140x g przez 12 min z długim hamowaniem. W rezultacie powstaną dwie wyraźne warstwy: erytrocyty na dnie oraz jasna warstwa PRP na górze.
- Odizolować górną, mątną, żółtą warstwę PRP, ostrożnie pipetując ją za pomocą końcówki do pipety odciętej na poziomie 45° pod kątem i oznaczyć liczbę płytek krwi za pomocą morfologii krwi (CBC).
- W razie potrzeby przemyć płytki krwi w soli fizjologicznej buforowanej PIPES (150 mM NaCl, 20 mM PIPES) w obecności prostaglandyny E1 (PGE1) i resuspender w buforze Tyrodea (134 mM NaCl, 0,34 mM Na2HPO4, 2,9 mM KCl, 1 mM MgCl22, 5 mM glukozy, 12 mM NaHCO33, 20 mM HEPES, pH 7,35) z dodatkiem 5 mM glukozy; w przeciwnym razie należy przejść do kroku 1.5. Kolejne etapy opisują w skrócie proces płukania.
- Dopełnić objętość PRP do 10 ml solą fizjologiczną buforowaną PIPES i dodać 0.6 μM PGE1.
- Wiruj przez 8 min przy 1900 x g gnastępnie należy odlać nadsącz i pozostawić osad płytkowowy w 400 μL roztworem Tyrode'a i glukozą przez 5 min.
- Ostrożnie resuspendować osad płytek i pozostawić go w spokoju na 30 min.
- Dostosować liczbę płytek krwi do poziomu ~250 x 103 płytek krwi na μL z pulą ludzkiej osocza ubogopłytkowej (PPP) i utrzymuj zawiesinę w 22 °C bez niepokojenia lub przy łagodnym mieszaniu obrotowym.
2. Traktowanie ligandem i jednorodnym ścinaniem
UWAGA: Wszystkie etapy w sekcji 2 wymagające pipetowania należy wykonywać powoli, aby uniknąć wystąpienia sił ścinających.
- Do PRP lub przemytych płytek dodać odpowiednie przeciwciało lub ligand i delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół lub mieszając końcówką pipety. Pozostawić niezakłócone w temperaturze pokojowej na 5-10 min. Do kontroli negatywnej dodać równą objętość PPP lub buforu Tyrode'a.
- Włączyć wiskozymetr stożkowo-płaskiego, ustawić temperaturę płyty na 22 °C i odczekać, aż płyta osiągnie tę temperaturę.
- Nanieść pipetą traktowane PRP lub przemyte płytki na kontrolowany temperaturowo wiskozymetr stożkowo-płaski bezpośrednio na środek płyty. Upewnić się, że cała próbka została naniesiona pomiędzy stożek a płytę w punkcie styku, a nie na zewnętrzną krawędź stożka.
- Poddać ścinaniu z odpowiednią szybkością i przez określony czas.
- Obliczyć ścinanie zgodnie z instrukcją wiskozymetru lub zgodnie z wcześniej opisanymi metodami15,16.
- Wyznaczyć szybkość ścinania na podstawie lepkości i pożądanego naprężenia ścinającego zgodnie z prawem lepkości Newtona;
; lepkość osocza wynosi 1,5-1,6 centipoise (cP)17. Na przykład normalny zakres ścinania w krążeniu człowieka wynosi 5-30 dyn/cm2, a ścinanie powinno być stosowane w skali czasu minutowej (jednocyfrowej).
- Lekko unieść stożek nad płytę (~2 mm), tak aby próbka pozostała w kontakcie zarówno z płytą, jak i stożkiem, a następnie użyć końcówki do nakładania żelu lub innej długiej końcówki pipety, aby pobrać 5-10 μL ze środka objętości próbki.
- Inkubować poddane ścinaniu próbki z odpowiednimi markerami przez 20 min w temperaturze pokojowej. W przypadku markerów ekspozycji fosfatydyloseryny, β-galaktozy i P-selektyny zastosować odpowiednio domenę C2 laktaderyny (LactC2) w stężeniu 0,08 μM18, lektynę Erythrina cristagalli (ECL) w stężeniu 6,25 μg/mL oraz przeciwciało przeciwko P-selektynie (20 µg/mL).
- Utrwalić próbki w 2% paraformaldehydzie przez 20 min w RT przed rozcieńczeniem lub przechowywaniem w chłodni, a następnie przejść do kroku 3.1 lub przechowywać próbki w 4 °C nie dłużej niż przez 12 h.
3. Wykrywanie markerów powierzchniowych i sieciowania za pomocą cytometrii przepływowej
- Przeanalizować próbkę za pomocą cytometrii przepływowej, zbierając co najmniej 20 000 zdarzeń dla każdego warunku.
- Ilościowo określić siłę sygnału markerów fluorescencyjnych, wykorzystując wartość wysokości (height) dla intensywności każdego fluoroforu lub geometryczną średnią intensywności fluorescencji (MFI).
- W przypadku chęci wykrycia sieciowania płytek krwi po poddaniu ich działaniu sił ścinania, przeanalizować próbkę na cytometrze przepływowym z możliwością obrazowania i określić ilościowo sieciowanie za pomocą parametrów pola powierzchni (area) oraz współczynnika kształtu (aspect ratio).
- Wykreślić histogram pola powierzchni i/lub współczynnika kształtu.
- Użyć kontroli negatywnej z albuminą surowicy bydlęcej (BSA) lub nośnikiem, aby wyznaczyć bramkę wykluczającą większość zdarzeń w pełni kolistych (bramkę tę wyznacza się zazwyczaj przy współczynniku kształtu ~0,819,20) i określić procent zdarzeń wewnątrz tej bramki. Zdarzenia o niższym współczynniku kształtu z większym prawdopodobieństwem są sieciowane.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 1 przedstawia, w jaki sposób model spustowy aktywacji GPIb-IX, wprowadzony pierwotnie w celu wyjaśnienia zależnej od ścinania aktywacji receptora zakotwiczonego w ścianie naczynia, może również wspierać aktywację płytek krwi sieciowanych przez ligand wielowartościowy. Rysunek 2 pokazuje odczyty aktywacji ludzkich płytek krwi traktowanych dwoma przeciwciałami celującymi w domenę N-końcową GPIb-IX (6B4 i 11A8) oraz jednym przeciwciałem kontrolnym (normalne...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół opisany w tym manuskrypcie pozwala na szybką i wszechstronną ocenę wpływu ścinania laminarnego na receptory płytkowe i powierzchniowe komórek. Przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki podkreślają, w jaki sposób przepływ ścinający może wpływać na działanie ligandów multimerycznych lub dwuwartościowych. Oprócz tego zastosowania, jednolity test ścinania ma szerokie zastosowanie w obserwacji efektów zależnych od ścinania. W przypadku braku znanej pary ligand-receptor, jednolity test ścinania może również wykryć wp...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Praca związana z tym badaniem była częściowo wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH) National Heart, Lung, and Blood Institute HL082808, HL123984 (R.L.) i F31HL134241 (M.E.Q.). Finansowanie zapewnia również grant NIH National Institute of General Medical Sciences T32GM008367 (M.E.Q.); oraz pilotażowe fundusze grantowe z Children's Healthcare of Atlanta i Emory University Pediatric Flow Cytometry Core. Autorzy chcieliby podziękować dr Hansowi Deckmynowi za udostępnienie przeciwciała 6B4 oraz Emory Children's Pediatric Research Center Flow Cytometry Core za wsparcie techniczne.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| APC anty-ludzki CD62P (P-Selectin) | BioLegend | 304910 | |
| Brookfield Cap 2000+ Wiskozymetr | Brookfield-FITC | ||
| Erythrina cristagalli lektyna (ECL) | Vector Labs | FL-1141 | |
| Pooled Normal Human Plasma | Precision Biologic | CCN-10 | |
| Vacutainer Jasnoniebieska probówka do pobierania krwi (cytrynian sodu) | BD | 369714 | |
| Vacutainer Zestaw do pobierania krwi, 21G x ¾ " Igła | BD | 367287 |
Bibliografia
- Sullivan, M. J., et al. Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons. Circulation Research. 80 (6), 861-867 (1997).
- Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers. Nature. 325 (6107), 811-813 (1987).
- Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
- Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. The gentle touch receptors of mammalian skin. Science. 346 (6212), 950-954 (2014).
- Nelson, C. M., et al. Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (33), 11594-11599 (2005).
- Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (51), 20585-20590 (2011).
- Wen, L., et al. A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis. Nature Communications. 9 (1), 4301(2018).
- Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils. Scientific Reports. 6, 28870(2016).
- Brockman, J. M., et al. Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces. Nature Methods. 15 (2), 115-118 (2018).
- Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 21584(2016).
- Quach, M. E., et al. Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets. Blood. 131 (7), 787-796 (2018).
- Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105 (21), 7416-7421 (2008).
- Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).
- Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III. Journal of Biological Chemistry. 262 (28), 13835-13841 (1987).
- Deng, W., et al. Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor. Nature Communications. 7, 12863(2016).
- Ikeda, Y., et al. The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress. Journal of Clinical Investigation. 87 (4), 1234-1240 (1991).
- Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education. , Springer Science, Business Media. (2010).
- Liang, X., et al. Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (12), 2155-2162 (2013).
- Samsel, L., et al. Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (6), 379-389 (2013).
- Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. Cellular image analysis and imaging by flow cytometry. Clinics in Laboratory Medicine. 27 (3), 653-670 (2007).
- Quach, M. E., Chen, W., Li, R. Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage. Blood. 131 (14), 1512-1521 (2018).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
