Kwantyfikacja aktywności chemotaktycznej monocytów in vivo i charakterystyka makrofagów pochodzących z monocytów we krwi

Summary

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określenia aktywności chemotaktycznej monocytów krwi w modelach mysich, do oceny wpływu interwencji żywieniowych, farmakologicznych i genetycznych na monocyty krwi oraz do scharakteryzowania makrofagów pochodzących z monocytów krwi w modelach mysich przy użyciu zatyczek żelowych pochodzących z błony podstawnej monocytów-chemoattraktantu-1 (MCP-1).

Abstract

Homeostaza i naprawa tkanek są krytycznie zależne od rekrutacji makrofagów pochodzących z monocytów. Zarówno niedostateczna, jak i nadmierna rekrutacja makrofagów pochodzących z monocytów może upośledzać gojenie się ran. Wykazaliśmy, że diety wysokotłuszczowe i wysokocukrowe sprzyjają pobudzaniu i dysfunkcji monocytów, przekształcając zdrowe monocyty krwi w fenotyp hiperchemotaktyczny gotowy do różnicowania się w makrofagi o rozregulowanych profilach aktywacji i upośledzonej plastyczności fenotypowej. Uważa się, że nadmierna rekrutacja makrofagów pochodzących z monocytów i rekrutacja makrofagów o rozregulowanych profilach aktywacji jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do rozwoju przewlekłych chorób zapalnych związanych z zaburzeniami metabolicznymi, w tym miażdżycą i otyłością. Celem tego protokołu jest ilościowe określenie aktywności chemotaktycznej monocytów krwi jako biomarkera pobudzania i dysfunkcji monocytów oraz scharakteryzowanie fenotypu makrofagów, w który monocyty krwi są gotowe do różnicowania się w tych modelach mysich. Korzystając z analizy Western blot pojedynczych komórek, pokazujemy, że po 24 godzinach 33% komórek zrekrutowanych do wypełnionych MCP-1 żelowych czopów pochodzących z błony podstawnej wstrzykniętych myszom to monocyty i makrofagi; 58% po 3 dniu. Jednak w 5 dniu liczba monocytów i makrofagów znacznie się zmniejszyła. Wreszcie pokazujemy, że testy te pozwalają również na izolację żywych makrofagów z chirurgicznie pobranych zatyczek żelowych pochodzących z błony podstawnej, które można następnie poddać późniejszej charakterystyce za pomocą analizy Western blot pojedynczej komórki.

Introduction

Rekrutacja makrofagów pochodzących z monocytów jest niezbędna do rozwoju przewlekłych chorób zapalnych związanych z zaburzeniami metabolicznymi, w tym miażdżycą i otyłością^1,2,3,4. Liczba makrofagów pochodzących z monocytów w miejscach uszkodzenia tkanek, a także ich plastyczność mają kluczowe znaczenie dla homeostazy i naprawy tkanek. Zarówno niedostateczna, jak i nadmierna rekrutacja makrofagów pochodzących z monocytów może upośledzać gojenie się ran⁵. Wywołanie miejscowego zapalenia tkanek, na przykład poprzez akumulację i utlenianie lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) w ścianie aorty lub zapalną aktywację adipocytów przez kwasy tłuszczowe lub lipopolisacharyd bakteryjny przeciekający przez barierę jelitową, prowadzi do uwolnienia mediatorów stanu zapalnego, w tym chemokin, takich jak białko chemoatraktantu monocytów-1 (MCP-1/CCL2). MCP-1 należy do rodziny chemokinów C-C i jest kluczowym chemoatraktantem odpowiedzialnym za rekrutację makrofagów pochodzących z monocytów do miejsc zapalenia i uszkodzenia tkanek^6,7,8,9,10. Zapalna aktywacja śródbłonka naczyń krwionośnych powoduje ekspresję cząsteczek adhezyjnych, takich jak międzykomórkowa cząsteczka adhezyjna 1 (ICAM-1) i cząsteczka adhezyjna komórek naczyniowych 1 (VCAM-1)^11,12, umożliwiając krążącym monocytom aktywowanym przez MCP-1 toczenie się, mocne przyleganie, a następnie transmigrację do przestrzeni podśródbłonkowej¹². Naciekające monocyty różnicują się w makrofagi, które mogą być aktywowane do fenotypu prozapalnego, napędzając ostry proces zapalny. Napędzane przez mikrośrodowisko, prozapalne makrofagi mogą przekształcać się w makrofagi rozwiązujące stan zapalny, które odgrywają kluczową rolę w oczyszczaniu komórek zapalnych, usuwaniu sygnałów prozapalnych i zakończeniu naprawy tkanek i gojenia się ran^12,13.

Przewlekły stres metaboliczny pobudza monocyty do radykalnego zwiększenia reakcji na chemo-atraktanty i zwiększenia rekrutacji monocytów, a my wykazaliśmy, że zaszczepione monocyty powodują powstawanie makrofagów z rozregulowanymi programami aktywacji i stanami polaryzacji^14,15,16. Gruntowanie monocytów sprzyja miażdżycy, otyłości i prawdopodobnie innym przewlekłym chorobom zapalnym związanym z zaburzeniami metabolicznymi, takimi jak stłuszczeniowe zapalenie wątroby, choroby nerek i prawdopodobnie rak. Aby ocenić i określić ilościowo torowanie monocytów w mysich modelach chorób ludzkich, opracowaliśmy nową technikę oceny stanu primingu monocytów krwi poprzez pomiar aktywności chemotaktycznej in vivo^14,15,16,17. Nasze podejście polega na wstrzyknięciu żelu pochodzącego z błony podstawnej załadowanego chemoatraktantem - zwykle używamy MCP-1 - lub nośnika odpowiednio w lewą i prawą flankę myszy. Po ostrożnym wstrzyknięciu podskórnym, żel pochodzący z błony podstawnej utworzy pojedynczą czop, z której chemokiny mogą dyfundować i tworzyć określony gradient chemotaktowy, na który nie ma wpływu stan metaboliczny lub zapalny otaczającej tkanki lub myszy biorcy.

Żel pochodzący z błony podstawnej, którego używamy do naszego testu, to rozpuszczony preparat błony podstawnej, wyekstrahowany z mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), guza bogatego w takie białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Ta złożona mieszanina białkowa zawiera lamininę (60%), kolagen IV (30%), cząsteczkę pomostową entaktynę (8%) i szereg czynników wzrostu. Test zatyczki macierzy błony podstawnej został pierwotnie opracowany w celu zbadania angiogenezy w odpowiedzi na różne czynniki wzrostu^18,19. Jednak w celu zbadania chemotaksji monocytów ważne jest użycie żelu pochodzącego z błony podstawnej zubożonej w czynnik wzrostu, aby zminimalizować rekrutację komórek śródbłonka i angiogenezę. To, co sprawia, że Matrigel (zwany dalej żelem pochodzącym z błony podstawnej) jest wyjątkowy i szczególnie użyteczny, to fakt, że w temperaturach poniżej 10 °C upłynnia się, co pozwala na rozpuszczenie chemokin. W temperaturach powyżej 22 °C roztwór pochodzący z błony podstawnej szybko ulega przemianie fazowej i szybko tworzy hydrożel. Zatyczki mogą być chirurgicznie wycinane, czyszczone i rozpuszczane za pomocą neutralnej metaloproteazy pochodzącej z Bacillus w celu uzyskania zawiesin pojedynczych komórek, które można analizować na sortowniku komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), za pomocą RNAseq, RNA pojedynczej komórki i wielu innych technik omicznych. W tym miejscu opisujemy zastosowanie analizy Western blot pojedynczej komórki do scharakteryzowania populacji komórek rekrutowanych do zatyczek żelowych pochodzących z błony podstawnej jeden, trzy lub pięć dni po wstrzyknięciu.

Protocol

Wszystkie metody opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Wake Forest School of Medicine.

1. Przygotowanie roztworu pochodzącego z błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu MCP-1

UWAGA: To jest sterylna procedura.

1. Oczyść kaptur do hodowli komórkowych środkiem dezynfekującym przed przygotowaniem roztworu pochodzącego z błony podstawnej (np. Matrigel).
2. Przygotować pojedynczo zapakowaną sterylną strzykawkę o pojemności 1 ml i przetrzeć górną część fiolki z roztworem pochodzącym z błony podstawnej wacikiem nasączonym alkoholem przed włożeniem jej do strzykawki.
3. Całkowicie rozmrozić na lodzie roztwór pochodzący z błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu.
   ostrożność: Jeśli matryca błony podstawnej zostanie rozmrożona w temperaturze pokojowej (RT), upewnij się, że pozostała niewielka cząsteczka lodu, aby zapobiec żelowaniu roztworu.
4. Po rozmrożeniu otworzyć fiolkę i wymieszać MCP-1 lub 1xPBS z 0,1% BSA w kapturze do hodowli komórkowych.
5. Przygotować 1 ml sterylnej strzykawki za pomocą igły 26 G i ostudzić na lodzie.
6. Przygotować roztwór podstawowy MCP-1, rozpuszczając MCP-1 do końcowego stężenia 50 μg/ml w 1x PBS z 0,1% BSA.
7. Rozcieńczyć MCP-1 w 5 ml zimnego roztworu pochodzącego z błony podstawowej do końcowego stężenia 500 ng / ml. Przygotować równą ilość roztworu pochodzącego z błony podstawnej tylko z samym nośnikiem (1x PBS zawiera 0,1% BSA).
8. Załadować 500 μl roztworu pochodzącego z błony podstawnej (z MCP-1 lub bez) do zimnej strzykawki o pojemności 1 ml.
9. Przed wykonaniem wstrzyknięcia należy usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza ze strzykawki z roztworem zawierającym błonę podstawną, aby zapewnić równomierne uformowanie czopa.

2. Wstrzykiwanie roztworu pochodzącego z błony podstawnej

1. Rozpyl 70% etanolu wokół obszaru zabiegowego przed i w trakcie wstrzyknięć, aby zdezynfekować środowisko.
2. Aby wywołać znieczulenie, umieść mysz w komorze anestezjologicznej i ustaw przepływomierz_O2 na 1 litr/min, a następnie wyreguluj parownik na 2% izofluranu.
3. Monitoruj głębokość znieczulenia, monitorując częstość oddechów (szybkość/min), odruch rogówkowy i ruch wąsów.
4. Podczas całego zabiegu należy utrzymywać znieczulenie za pomocą stożka nosowego.
5. Podczas zabiegu należy monitorować częstość oddechów (szybkość/min), odruch rogówkowy i ruch wąsów, aby zweryfikować głębokość znieczulenia.
6. Po potwierdzeniu braku odpowiedzi na uszczypnięcie palca u nogi, powoli wstrzyknąć (około 100 μl/s) roztwór pochodzący z błony podstawnej podskórnie odpowiednio w prawy (bez MCP-1) i lewy (z MCP-1) bok myszy. Jeśli wstrzyknięcie jest zbyt powolne, czopki żelowe pochodzące z błony podstawnej mogą stać się nieregularnie ukształtowane, a nawet rozdrobnione i trudne do usunięcia.
7. Trzymać strzykawkę przez 20-30 s po wstrzyknięciu, aby zapobiec wyciekowi roztworu i umożliwić utworzenie pojedynczej, gładkiej zatyczki żelowej.
8. Po wstrzyknięciu umieszczenie myszy na podkładce rozgrzewającej z monitorowaniem do czasu wyzdrowienia.
9. Przywróć mysz do oryginalnej klatki, gdy mysz zostanie w pełni odzyskana.

3. Zbierz zatyczki żelowe pochodzące z błony podstawnej

1. Zważ dwie oddzielne probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml dla każdej myszy i oznacz je.
2. Trzy dni po wstrzyknięciu roztworu pochodzącego z błony podstawnej, należy poddać mysz eutanazji w komorze anestezjologicznej przy użyciu 3% izofluranu, a następnie zwichnąć szyjkę macicy.
3. Usuń sierść grzbietową myszy za pomocą maszynki do strzyżenia włosów lub nałóż krem do depilacji patyczkami z bawełnianą końcówką na 5 minut, a następnie wytrzyj.
4. Przytrzymaj skórę myszy za pomocą kleszczy wokół dolnego kręgu piersiowego i górnego kręgu lędźwiowego i wykonaj nacięcie o długości 2 mm w skórze.
5. Za pomocą nożyczek chirurgicznych przetnij linię środkową grzbietu myszy od nacięcia do kręgów szyjnych i do 1 cm powyżej połączenia kręgów ogonowych (połączenia ogonowego).
6. Oddziel skórę od warstwy mięśniowej i przygwoźdź skórę do platformy z pianki polistyrenowej.
7. Ostrożnie przytrzymaj włóknistą kapsułkę, która zawiera korek żelowy pochodzący z błony podstawnej, za pomocą cienkich kleszczyków i wyjmij włóknistą kapsułkę za pomocą cienkich nożyczek, aby wyczyścić zatyczkę.
8. Usunąć oczyszczony korek żelowy pochodzący z błony podstawnej i przenieść do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml (patrz 3.1).
9. Zważyć probówkę do mikrowirówki z oczyszczonym korkiem żelowym pochodzącym z błony podstawnej i obliczyć masę korka żelowego pochodzącego z błony podstawnej.

4. Trawienie zatyczek żelowych pochodzących z błony podstawnej

1. Rozmrozić dispazę (10 ml) na lodzie.
2. Zmiel korek żelowy pochodzący z błony podstawnej w probówce mikrowirówki za pomocą czystych, drobnych nożyczek.
3. Dodać 800 μl dypazy do każdej probówki mikrowirówki zawierającej korek żelowy pochodzący z błony podstawnej.
4. Wiruj z maksymalną prędkością przez 10 s, aby zakłócić działanie wtyczki.
5. Inkubować probówki do mikrowirówek przez 2 godziny w temperaturze 37 °C przy 1 400 obr./min w termomikserze w celu całkowitego rozpuszczenia korka żelowego pochodzącego z błony podstawnej.
6. Po 2 godzinach odwirować przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant.
7. Ponownie zawiesić osad w 1 ml 1x PBS, odwracając lub stukając.
8. Powtórzyć wirowanie przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant.
9. Zawiesić osad w 300 μl PBS.
10. Pobrać 50 μl zawiesiny komórkowej do oddzielnej probówki do mikrowirówki.
11. Dodać 0,5 μl kalceiny AM (1 M) do zawiesiny komórek.
    nuta: Calceina AM jest zielonym fluorescencyjnym barwnikiem żywotności komórek, który gromadzi się tylko w żywych komórkach.
12. Inkubować komórki w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
13. Policz zielone fluorescencyjne (żywe) i niefluorescencyjne (martwe) komórki za pomocą automatycznego licznika komórek.

5. Określanie składu komórek w zawiesinie komórek za pomocą analizy jednokomórkowego Western Blot (scWB)

1. Przed użyciem należy ponownie nawodnić chip scWB w 15 ml 1x buforu zawiesiny na szalce Petriego przez co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej.
2. Dodaj 1 ml rozcieńczonej zawiesiny jednokomórkowej (10 000-100 000 komórek/ml) do uwodnionego chipa. Ułóż powierzchnię na dnie szalki Petriego o średnicy 10 cm. Upewnij się, że powierzchnia jest płaska.
3. Przykryj szalkę Petriego pokrywką, aby zapobiec wysuszeniu i pozwól komórkom osiąść przez 5-15 minut według gradientu.
4. Umieść chip pod mikroskopem jasnego pola i sprawdź studzienki w 10-krotnym powiększeniu.
   nuta: Około 15-20% mikrostudzienek powinno być zajętych przez pojedynczą komórkę, mniej niż 2% studzienek powinno zawierać 2 lub więcej komórek
5. Przechylić 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą wiór o 45 stopni.
6. Umyj chip za pomocą bufora zawiesinowego 1x, aby usunąć nieprzechwycone komórki z powierzchni chipa poprzez delikatne pipetowanie od góry do dołu chipa. Powtórz 3 razy.
7. Przygotuj jednokomórkowy instrument zachodni.
8. Ustaw czas lizy, czas elektroforezy i czas przechwytywania UV. Aby przeanalizować rekrutowane makrofagi odzyskane z czopa żelowego pochodzącego z błony podstawnej, użyj następujących ustawień: czas lizy: 0 s; czas elektroforezy: 160 s; Czas przechwytywania UV 240 s.
9. Ostrożnie załaduj chip do ogniwa elektroforetycznego jednoogniwowego zachodniego instrumentu, skierowanego w stronę żelu. Zachowaj ostrożność, aby nie uszkodzić żelowej strony chipa.
10. Wlej bufor do lizy/pracy do komory i całkowicie przykryj cały jednokomórkowy chip zachodni. Rozpocznij lizę komórek.
11. Uruchom instrument scWB przy użyciu ustawienia wymienionego w 5.8.
12. Po zakończeniu cyklu przenieś wiór na 10-centymetrową szalkę Petriego i umyj wiór dwukrotnie za pomocą 1x bufora myjącego przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
13. Przygotować rozcieńczenia przeciwciała pierwszorzędowego (anty-winkulina: 1:10; anty-CD45: 1:15, anty-CD11b: 1:20, anty-F4/80: 1:10) w całkowitej objętości 80 μl rozcieńczalnika przeciwciała (zmieszać 8 μl przeciwciała 1 plus 8 μl przeciwciała 2 plus 64 μl rozcieńczalnika).
14. Dodać 80 μl roztworu przeciwciała pierwotnego do komory sondowania przeciwciał i opuścić chip żelową stroną do dołu, tak aby roztwór przeciwciała przeniknął przez chip.
15. Inkubować z roztworem przeciwciała pierwszorzędowego przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
16. Umyj frytki trzy razy przez 10 minut w 1x buforze myjącym na shakerze.
17. Umyj frytki raz przez 10 minut w wodzie na shakerze, aby odsolić żel.
18. Przygotować rozcieńczenie 1:20 przeciwciała drugorzędowego o całkowitej objętości 80 μl (zmieszać 2 μl przeciwciała drugorzędowego plus 78 μl rozcieńczalnika).
19. Inkubować chip z przeciwciałem wtórnym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem.
20. Umyj frytki trzy razy przez 10 minut z 1x buforem myjącym na shakerze.
21. Zakręć wiórem za pomocą suwaka, aby usunąć pozostały bufor myjący.
22. Zeskanuj chip na dwulaserowym skanerze mikromatrycowym z rozdzielczością 5 μm w kanale widmowym fluoroforu sprzężonego z przeciwciałami drugorzędowymi.
23. Analizuj dane za pomocą oprogramowania specyficznego dla scWB.

6. Zdejmowanie chipa scWB

1. Przechowuj zeskanowany chip w buforze do mycia, aż będzie gotowy do rozebrania.
2. Umieść łaźnię wodną w dygestorium.
3. Umieść stojak na probówki o pojemności 50 ml w łaźni wodnej z wodą znajdującą się zaledwie 1 cm nad stojakiem i ustaw temperaturę wody na 60 °C.
4. Przygotować bufor do usuwania odpędów. Na 1 l roztworu buforowego do oddzielania rozpuścić 9,85 g Tris-HCl (pH 6,8) i 20 g SDS w 900 ml wody destylowanej i dostosować pH. Następnie napełnij wodą destylowaną do 1L. Dodaj 0,8% (v/v) β-merkaptoetanolu (β-ME; 14,3 M) bezpośrednio przed każdym użyciem.
5. Po wstępnym skanowaniu umieść chip na 10-centymetrowej szalce Petriego przed usunięciem izolacji.
6. Na każdy chip weź 40 ml buforu do oddzielania i dodaj 320 μl β-ME.
   UWAGA: β-ME jest toksyczny i niebezpieczny dla ludzi i środowiska. Poniższą procedurę należy wykonać w dygestorium.
7. Umieść chip w kanistrze i uszczelnij kanister parafilmem, aby zapobiec przedostawaniu się wody do kanistra.
8. Umieść kanister w stojaku na probówki we wstępnie podgrzanej łaźni wodnej.
9. Inkubować przez 90 minut.
10. Ostrożnie wyjmij wiór z kanistra i umieść go na świeżej szalce Petriego.
11. Krótko umyj frytki raz za pomocą 1x bufora do mycia. Następnie dodaj 15 ml 1x buforu myjącego do szalki Petriego.
12. Myj frytki przez 15 minut na shakerze. Powtórz krok prania cztery razy.
    nuta: Chip jest gotowy do podania kolejnego przeciwciała pierwszorzędowego (patrz kroki 5.12 - 5.21).

Results

Aby uzyskać dostęp do reakcji monocytów krwi na chemoatraktanty, wstrzyknęliśmy roztwór pochodzący z błony podstawnej załadowany nośnikiem i MCP-1 do lewej i prawej strony każdej myszy. Zatyczki żelowe pochodzące z błony podstawnej usunięto 1, 3 i 5 dni po wstrzyknięciu, rozpuszczono i policzono komórki zrekrutowane do każdej czopa (Rysunek 1A). Odejmując liczbę komórek we wtyczce załadowanej nośnikiem (otwarte pręty) od liczby komórek w wtyczce załadowanej MCP-1 (zamknięte pręty), uzyskaliśmy liczbę komórek specjalnie zrekrutowanych w odpowiedzi na MCP-1 (liczba komórek Δ, Rysunek 1B). Zaobserwowaliśmy przyspieszoną rekrutację i akumulację komórek specyficznych dla MCP-1 w okresie 5 dni, przy czym wskaźniki wzrosły z 31 000 komórek / dzień (dzień 1) do 78 000 komórek / dzień (dzień 3) i 136 000 komórek / dzień w dniu 5 (Figura 1B).

Aby zidentyfikować typy komórek, które weszły do czopów żelowych pochodzących z błony podstawnej, poddaliśmy komórki wyizolowane z każdej czopki analizie Western blot pojedynczej komórki (scWB), sondując ekspresję CD45, CD11b i F4/80 w celu zidentyfikowania monocytów (CD11b⁺F4/80^-), makrofagów (CD11b⁺F4/80⁺ plus CD11b-F4/80⁺) oraz pozostałych leukocytów niemonocytowych (CD45⁺CD11b^-F4/80^-) (Rysunek 2). Chipy scWB zostały następnie zbadane pod kątem winkuliny, aby określić całkowitą liczbę komórek na każdym żelu i potwierdzić zajęcie pojedynczych komórek w mikrostudzienkach na chipie scWB. Odsetek monocytów w zatyczkach żelowych pochodzących z błony podstawnej załadowanych MCP-1 był niski w dniu 1, 20%, osiągnął szczyt w dniu 3 na poziomie odpowiednio 47%, zanim spadł do 14% w dniu 5 (Figura 2D). Liczba makrofagów w zatyczkach żelowych pochodzących z błony podstawnej obciążonych MCP-1 stale rosła z 13% w dniu 1 do 22% w dniu 3 i 23% w dniu 5. W przypadku czopów załadowanych MCP-1 odsetek monocytów plus makrofagów w izolowanej populacji komórek był najwyższy w 3 dniu, 31% w czopach załadowanych nośnikiem (Rysunek 3A) i 58% w czopkach załadowanych MCP-1 (Figura 3B), co wskazuje, że po 3 dniach zdecydowana większość komórek rekrutowanych przez chemotaksję zależną od MCP-1 to monocyty i makrofagi. Mimo że całkowita liczba monocytów i makrofagów była wyższa w dniu 5 w porównaniu z dniem 3 (Figura 3C i D), ze względu na znacznie wyższy odsetek monocytów i makrofagów w całkowitej populacji komórek (Figura 3A i B), liczba komórek w dniu 3 dokładniej odzwierciedla chemotaksję i rekrutację monocytów krwi. Dlatego rutynowo wstrzykujemy roztwór pochodzący z błony podstawnej na trzy dni przed złożeniem zwierząt w ofierze. Nie ustalono, czy wszystkie makrofagi rekrutowane przez MCP-1 pochodzą z monocytów, czy też przyczyniły się do tego makrofagi rekrutowane z sąsiednich tkanek.

Analiza statystyczna danych tutaj pokazanych została przeprowadzona za pomocą oprogramowania analitycznego (np. SigmaPlot 14). ANOVA i test Fischera LSD zostały wykorzystane do porównania średnich wartości między grupami eksperymentalnymi. Wszystkie dane przedstawiono jako średnią ± SD z co najmniej 3 niezależnych eksperymentów. Wyniki uznano za istotne statystycznie na poziomie P < 0,05.

Rysunek 1: Kwantyfikacja komórek zrekrutowanych do podskórnych zatyczek żelowych pochodzących z błony podstawnej. (A) Bezwzględne liczby komórek dla zatyczek żelowych z membrany podstawnej załadowanych nośnikiem (pręty otwarte) i MCP-1 (pręty zamknięte). (B) Liczba komórek rekrutowanych przez MCP-1 do czopów żelowych pochodzących z błony podstawnej obliczona jako różnica w liczbie komórek między czopami załadowanymi MCP-1 i zatyczkami załadowanymi pojazdem. Wyniki są wyświetlane jako średnia ± SD (n=4) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Analiza populacji komórek zrekrutowanych do zatyczek żelowych pochodzących z błony podstawnej za pomocą analizy western blot pojedynczej komórki. (A+B) Reprezentatywne przykłady są pokazane dla analizy scWB dla pojazdu załadowanego (Kontrola) i wtyczki z wyprowadzeniami MCP-1 (MCP-1) wyizolowany od myszy trzy dni po wstrzyknięciu. Chipy znakowane przeciwciałami skierowanymi przeciwko CD45, CD11b i F4/80, a następnie fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi, jak opisano w Protokole. Intensywność fluorescencji znakowanego pasma dla każdej pojedynczej komórki jest pokazana jako obszar piku. (C+D) Populacje komórek zidentyfikowano jako monocyty (CD11b⁺F4/80^-, ), makrofagi (CD11b⁺F4/80⁺ plus CD11b-F4/80⁺, ) lub jako leukocyty niemonocytowe (CD45⁺, ). Pozostałe komórki zostały oznaczone jako "inne" (). Wyniki są przedstawione jako średnia ± SD (n = 3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Zawartość monocytów i makrofagów w zatyczkach żelowych pochodzących z błony podstawnej. Analiza ilościowa zawartości rekrutowanych monocytów i makrofagów w czopach obciążonych nośnikiem i MCP-1 usuniętych w 1., 3. i 5. dniu po wstrzyknięciu. Wartości są wyświetlane jako procent całkowitej populacji komórek (A + B) oraz w bezwzględnej liczbie komórek na wtyczkę (C + D). Wyniki są przedstawione jako średnia ± SD (n = 3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Opracowaliśmy test chemotaksji in vivo, wykorzystując unikalne właściwości fizyczne matrycy pochodzącej z błony podstawnej oraz możliwość załadowania tej unikalnej matrycy chemokinami i wstrzyknięcia jej myszom. Test pozwala nam ocenić u żywych myszy reakcję monocytów (i makrofagów) na chemokiny, jak pokazano tutaj dla MCP-1, oraz wpływ manipulacji genetycznej lub ekspozycji farmakologicznej, dietetycznej i innych środowiskowych na chemotaksję monocytów. Ponieważ gradient chemokin, który tworzymy u tych myszy, jest zasadniczo niezależny od ekspozycji genetycznej, farmakologicznej, dietetycznej lub środowiskowej, zmiany w aktywności chemotaktycznej monocytów faktycznie odzwierciedlają zmiany funkcjonalne w tych monocytach i, jak wykazaliśmy wcześniej, również przeprogramowanie zarówno na poziomie białka, jak i transkrypcji^17,20. Stwierdziliśmy, że stres metaboliczny u myszy zwiększa odpowiedź monocytów na chemoatraktant i że ta aktywność hiperchemotaktyczna koreluje ze zwiększoną S-glutationylacją białka, odwracalną, zależną od redoks potranslacyjną modyfikacją białka, która w większości przypadków prowadzi do utraty funkcji enzymatycznej i białkowej^21,22, a w niektórych przypadkach nawet sprzyja degradacji białek^16,23.

Aby pomyślnie przeprowadzić tę procedurę i uzyskać optymalne wyniki za pomocą tego testu, bardzo ważne jest, aby dokładne objętości roztworu pochodzącego z błony podstawnej były wstrzykiwane powoli, aby utworzyć pojedynczy, dobrze uformowany czop, a włókniste kapsułki należy całkowicie usunąć, aby uzyskać czyste czopy, gdy zbiera się korki żelowe pochodzące z błony podstawnej, ułatwiają rozpuszczenie całej czopki w roztworze dypazy. Nasze dane pokazują, że pozostawienie czopa u zwierząt na trzy dni optymalizuje 1) intensywność sygnału, tj. liczbę monocytów i makrofagów rekrutowanych do każdej czopki, 2) selektywność sygnału, tj. zawartość monocytów i makrofagów w całkowitych populacjach komórek oraz 3) specyficzność sygnału, tj. wzrost monocytów i makrofagów w odpowiedzi na MCP-1 w porównaniu z nośnikiem. Na koniec pokazujemy, w jaki sposób najnowocześniejsze podejścia oparte na pojedynczych komórkach w połączeniu z testem czopów żelowych pochodzących z błony podstawnej można wykorzystać do scharakteryzowania monocytów rekrutowanych do zatyczek, a tym samym uzyskania migawki potencjalnego fenotypu makrofagów pochodzących z monocytów, które są rekrutowane do miejsc uszkodzenia w dowolnym modelu myszy w odpowiedzi na określone dane genetyczne, interwencje farmakologiczne, dietetyczne lub środowiskowe.

Istnieje szereg ograniczeń testu, które należy wziąć pod uwagę. Po pierwsze, obsługa myszy, w tym znieczulenie, wstrzyknięcie roztworu pochodzącego z błony podstawnej i chirurgiczne rozwarstwienie, wymaga praktyki w generowaniu pojedynczych zatyczek i powtarzalnych danych. Po drugie, podczas gdy większość komórek rekrutowanych do zatyczek załadowanych MCP-1 to monocyty i makrofagi, znaczna liczba nie jest. Może to mieć wpływ na interpretację innych, nieopartych na pojedynczych komórkach testów analitycznych przeprowadzonych na tej populacji komórek. Wreszcie, ponieważ warunki lizy komórek dla scWB są łagodne, odległości migracji białek mogą różnić się od standardowego WB i mogą nie korelować z wielkością białka. W związku z tym zarówno czas lizy komórek, jak i ich trwania musi zostać zweryfikowany dla każdego nowego białka, które ma być badane, i dla każdego użytego przeciwciała pierwszorzędowego.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm szalka Petriego	Griner Bio-ONE	664 160
10x bufor zawiesinowy	białkoPROSTY	R101
15 cm szalka Petriego	Falcon	353025
2-merkaptoetanol	MP BIOMEDICALS	2194705
5% bufor myjący	białko	R252
Rozcieńczalnik	przeciwciała Prosty	042-203
Wirówka stołowa	Beckman Coulter		Microfuge 22R Wirówka
Serim bydlęcy Albumina	Sigma-Aldrich	A7906-100G
Calcein AM	ThermoFisher	C3099	1 ml
CD11b	Novus Biologicals	NB110-89474
CD45 (D4H7K) królik mAb	Technologie sygnału komórkowego	727987S
CD68/SR-D1 (FA-11)	Novus Biologicals	NBP2-33337SS
Celometr Vision	Nexcelom
Dispase	BD	354235	100 mL
Sypsor
Przeciwciało anty-królicze IgG [NL557]	Novus Biologicals	NL004	NL 557 koniugat
Przeciwciało drugorzędowe przeciw szczurom IgG (H+L) [DyLight 650]	Novus Biologicals	NBP1-75655	Koniugat DyLight 650
F4/80 (CI-A3-1)	Novus Biologicals	NB600-404SS
Blok grzewczy	effendorf	22331	Thermomixer
Liza/Running buffer	białko proste	R200
Matrigel Matrix (zredukowany czynnik Grwoth)	BD	354230	Skaner
mikromatrycowy	10 ml PerkinElmer	ScanArray Gx
Probówka do mikrowirówek	Fisher Scientific	05-408-129
Mikroskop	ThermoFisher	Evos fl
Milo	proteinsimple		Jednokomórkowa zachodnia
igła	BD	305111	26 G
Parafilm
Komora pomiarowa	proteinsimple	035-020
Rekombinowane białko myszy CCL2/JE/MCP-1	R& D	479-JE-050
scWEST chip	proteinsimple	C300
Shaker	Bioexpress		Gene mate wytrząsarka orbitalna
Jednokomórkowy zachodni pojemnik na chipy	proteinsimple	035-118
Szkiełko	Labnet	C1303-T
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Fisher Scientific	BP 166-500
Strzykawka	BD	309602	1 ml
Tris-Chlorowodorek	Fisher Scientific	BP 153-500
Pęseta	proteinsimple	035-020
Łaźnia wodna	ThermoFisher