Ten RT-PCR w czasie rzeczywistym wykorzystujący barwnik interkalacyjny dsDNA jest odpowiedni do diagnozowania infekcji wirusem lyssa. Metoda rozpoczyna się od ekstrakcji RNA z próbek przedubojowych lub pośmiertnych z podejrzeniem wścieklizny, szczegółowo opisując przygotowanie mieszanki wzorcowej, dodanie RNA, ustawienie maszyny w czasie rzeczywistym i prawidłową interpretację wyników.
Artykuł metodologiczny
Pan-lyssavirus RT-PCR w czasie rzeczywistym do diagnozowania wścieklizny
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Testy molekularne są szybkie, czułe i specyficzne, i stały się kluczowe w diagnozowaniu wścieklizny. Testy oparte na PCR są stosowane od dziesięcioleci w celu potwierdzenia diagnozy wścieklizny, ale dopiero niedawno zostały zaakceptowane przez OIE (Światową Organizację Zdrowia Zwierząt) jako podstawowa metoda wykrywania zakażenia wścieklizną. Testy RT-PCR w czasie rzeczywistym dostarczają danych w czasie rzeczywistym i są systemami z zamkniętą probówką, minimalizując ryzyko zanieczyszczenia podczas konfiguracji. Testy RT-PCR z fluorochromem interkalującym DNA w czasie rzeczywistym nie wymagają drogich sond, co minimalizuje koszt na próbkę, a gdy startery są projektowane w konserwatywnych regionach, możliwe są testy, które są specyficzne dla różnych rodzajów wirusów, a nie tylko dla jednego gatunku wirusa. W tym miejscu opisujemy test RT-PCR w czasie rzeczywistym SYBR pan-lyssavirus, który wykrywa lyssawirusy z całego rodzaju Lyssavirus, w tym najbardziej rozbieżne wirusy IKOV, WCBV i LLEBV. W połączeniu z analizą krzywej dysocjacji, test ten jest czuły i specyficzny, a jego zaletą jest wykrywanie wszystkich gatunków wirusa lyssa. Test został przyjęty w wielu laboratoriach diagnostycznych ze środowiskami o gwarantowanej jakości, umożliwiając solidną, szybką i czułą diagnostykę przypadków wścieklizny u zwierząt i ludzi.
Wprowadzenie
Diagnoza wścieklizny przy użyciu metodologii molekularnych została zaakceptowana przez OIE w 2018 roku1, uznając zalety tych technik w potwierdzaniu przypadków wścieklizny, szczególnie w sytuacjach, gdy próbki są nieoptymalne, lub do diagnozy przedśmiertnej, ponieważ nie ma wymogu żywego wirusa lub świeżych próbek. Testy PCR dla lyssawirusów wymagają odwrotnej transkrypcji (RT) przed rozpoczęciem PCR, ponieważ genom jest RNA. Testy RT-PCR, które wykrywają proksymalny region 3' genomu, są uważane za najbardziej czułe, ponieważ podczas replikacji wirusa lyssa występują gradienty transkrypcyjne. Powszechnie stosowane testy RT-PCR można ogólnie podzielić na dwie kategorie: punktowe końcowe (lub żelowe) i działające w czasie rzeczywistym. Oba podejścia są wrażliwe i specyficzne; Jednak test w czasie rzeczywistym ma pewne dodatkowe korzyści, takie jak uzyskiwanie wyników w czasie rzeczywistym i przeprowadzanie w całkowicie zamkniętym systemie probówkowym, co zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia operatora. Istnieją dwa główne podejścia do wykrywania amplikonów specyficznych dla wirusa lyssa uzyskanych za pomocą testów w czasie rzeczywistym. Pierwsza z nich wykorzystuje sondy hydrolizy (takie jak sondy TaqMan), które zawierają fluorofor i wygaszacz. Gdy sonda wiąże się z obszarem docelowym podczas amplifikacji, aktywność egzonukleazy polimerazy powoduje dysocjację fluoroforu i wygaszania, umożliwiając pomiar uzyskanej fluorescencji. Drugi wykorzystuje barwnik interkalacyjny DNA (fluorochrom, taki jak SYBR Green), który wiąże się z dwuniciowym DNA podczas amplifikacji. Związane fluorochromy emitują fluorescencję, która jest wykrywana w każdym cyklu, umożliwiając wykrywanie i kwantyfikację produktu w czasie rzeczywistym. Ze względu na niespecyficzny charakter wiązania z dowolnym dsDNA, przeprowadza się analizę krzywej dysocjacji w celu potwierdzenia swoistości reakcji. RT-PCR w czasie rzeczywistym są szybkie ze względu na małe rozmiary amplikonów, zwykle mniej niż 200 pz długości; Jednak zidentyfikowanie odpowiednich regionów do zaprojektowania starterów i sond w regionach chronionych może okazać się wyzwaniem, dlatego wyeliminowanie wymogu stosowania sondy jest wyraźną zaletą.
Wiele testów RT-PCR w czasie rzeczywistym zostało zaprojektowanych specjalnie do wykrywania poszczególnych szczepów lub linii RABV2, a także do wykrywania lyssawirusów w całym rodzaju3,4,5,6,7,8,9. Wszystkie testy będą miały granicę wykrywalności zależną od tego, jak konserwatywne są sekwencje starterów (i, jeśli to konieczne, sondy) w całym rodzaju. Rzeczywiście, pojawiające się lub nowe szczepy wirusa mogą sprawić, że wysoce specyficzne testy oparte na sondach staną się nieskuteczne. Wybór detekcji w czasie rzeczywistym (barwnik vs. sonda) będzie zależał od zamierzonego zastosowania. Dla laboratorium prowadzącego nadzór nad lokalnie pozyskiwanym materiałem mózgowym i spodziewającego się dużej liczby próbek ujemnych, użycie tańszego barwnika interkalacyjnego jest rozsądnym wyborem. Podejście SYBR Green byłoby również optymalne w przypadku prowadzenia nadzoru skaningowego, w którym obecność nowych lub rozbieżnych lyssawirusów nie zostałaby wykryta przez bardziej ograniczone testy oparte na sondach.
Wszyscy członkowie rodzaju Lyssavirus wywołują chorobę wścieklizny, która jest śmiertelna po pojawieniu się objawów. Zdecydowana większość przypadków wścieklizny u ludzi i zwierząt jest spowodowana wirusem wścieklizny (RABV), którego dominującym rezerwuarem jest pies domowy10. Nietoperze są ważnymi rezerwuarami żywicielskimi dla lyssawirusów i wszystkie scharakteryzowane gatunki lyssawirusa z wyjątkiem dwóch zostały zidentyfikowane bezpośrednio u nietoperzy - Ikoma lyssavirus (IKOV) i wirus Mokola (MOKV) - i spekuluje się, że z tych dwóch, IKOV ma rezerwuar gospodarza nietoperzy11. Oprócz 16 uznanych gatunków lyssawirusów12, istnieją dwa lyssawirusy, które zostały niedawno opisane: Taiwan bat lyssavirus (TWBLV)13 i Kotalahti bat lyssavirus (KBLV)14. Lyssawirusy można genetycznie podzielić na trzy filogrupy, przy czym większość lyssawirusów, w tym RABV, należy do filogrupy I. Jednak najbardziej rozbieżne lizsawirusy należą do filogrupy III i jest mało prawdopodobne, aby zostały wykryte przez RT-PCR przeznaczone do zwalczania sekwencji wirusa RABV lub filogrupy I.
Opisany tutaj test wykorzystuje parę starterów czasu rzeczywistego JW12-N165, po raz pierwszy opisaną w 20053. Startery zostały zaprojektowane jako pan-lyssawirus, chociaż pierwotne zastosowanie polegało na tym, że był to test TaqMan z sondami do różnicowania gatunków wirusa lyssa. Późniejsze potwierdzenie, że para starterów była specyficzna dla pan-lyssawirusa, uzyskano przy użyciu 2-etapowego testu SYBR w czasie rzeczywistym na wszystkich dostępnych gatunkach wirusa Lyssa, w tym WCBV15. Para starterów jest opisana tutaj w jednoetapowym teście RT-PCR w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem interkalującego fluorochromu, zwalidowanego przy użyciu przedstawicieli wszystkich 16 uznanych gatunków lyssawirusa. Ten jednoetapowy test w czasie rzeczywistym jest szybkim, czułym, specyficznym dla lyssawirusa testem i pokazuje, że solidność zestawu starterów do identyfikacji nawet bardzo rozbieżnych gatunków wirusa lyssa.
Protokół
Próbki z materiału diagnostycznego otrzymanego w APHA po naturalnym zakażeniu, lub uzyskane przez inokulację myszy przy użyciu protokołów ocenionych przez komisję etyki i statystyki APHA zgodnie z przepisami brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych na podstawie licencji 70/7394.
1. Kwantyfikacja RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego
- Upewnij się, że ustawienia spektrofotometru są ustawione na RNA.
- Użyj 1-2 μl wody molekularnej, aby zainicjować maszynę i ustawić linię bazową.
- Użyj 1-2 μl każdej badanej próbki RNA, aby ocenić ilość RNA.
- Zapisz odczyty i dokumentuj.
- W razie potrzeby dostosować RNA do 1 μg/μl.
nuta: RNA musi być przez cały czas przechowywane na lodzie (lub w chłodnym bloku). Jeśli RNA jest otrzymywany przy użyciu metody kolumnowej lub perełkowej, RNA jest zwykle mniejszy niż 1 μg/μL. W takiej sytuacji użyj RNA schludnie.
2. Przygotowanie serii rozcieńczeń RNA w celu określenia czułości punktu końcowego
- Wykonaj 10-krotne seryjne rozcieńczenie RNA.
- Oznaczyć probówki serią rozcieńczeń (np. 10-1, 10-2 itd.) i szczegółami RNA.
- Do każdej probówki dodać 45 μl wody molekularnej.
- Dodać 5 μl RNA (uprzednio rozcieńczonego do 1 μg/μl) i dobrze wymieszać.
- Wyrzuć końcówkę pipety do odpowiedniego środka dezynfekującego i zastąp ją świeżą końcówką.
- Weź 5 μl z 10-1 probówki i dodaj do 10-2 probówki i dobrze wymieszaj.
- Powtórzyć czynności 2.1.3-2.1.5 z pozostałymi rozcieńczeniami.
nuta: RNA musi być przez cały czas przechowywane na lodzie (lub w chłodnym bloku).
3. Przygotowanie reakcji RT-PCR w czasie rzeczywistym
- Korzystając z arkusza kalkulacyjnego, zaplanuj układ płytek zgodnie z liczbą próbek testowych i próbek kontrolnych, zarówno dla testów na wirusa lyssa, jak i ß-aktyny.
nuta: Jeżeli 4 próbki mają być badane podwójnie z kontrolą dodatnią i ujemną, odpowiada to 10 reakcjom dla obu testów. - W "pomieszczeniu czystym" lub obszarze oddzielonym od matrycy RNA przed użyciem przetrzyj powierzchnie odpowiednim środkiem dezynfekującym lub przygotuj stację roboczą do PCR (jeśli używasz). Aby przygotować stanowisko pracy, należy przetrzeć powierzchnię szafy odpowiednim środkiem dezynfekującym i umieścić potrzebne przedmioty na stanowisku pracy i zamknąć drzwi. Włącz światło UV na 10 minut
- Wyjmij regenty i startery z zamrażarki i rozmroź (odczynniki wymienione w tabeli 1 i startery w tabeli 2).
nuta: Mieszanina enzymów jest przechowywana w glicerolu, więc nie wymaga rozmrażania i musi być przez cały czas przechowywana na lodzie (lub w chłodnym bloku). Wszystkie inne odczynniki można rozmrażać w temperaturze pokojowej. - Po rozmrożeniu wymieszaj odczynniki i krótko odwiruj, aby zebrać płyn.
nuta: Nie mieszaj mieszanki enzymów, tylko krótko odwiruj. - Przygotować oddzielne mieszanki wzorcowe dla lizsywirusa i ß-aktyny. Do każdej reakcji dodać 7,55 μl wody molekularnej, 10 μl 2x uniwersalnej zielonej mieszanki reakcyjnej SYBR, 0,6 μl startera do przodu, 0,6 μl startera odwrotnego, 0,25 μl mieszanki enzymatycznej iTaq RT.
- Użyj arkusza kalkulacyjnego do obliczenia prawidłowych objętości, aby uniknąć błędów w ręcznym obliczaniu. Upewnij się, że przygotowana jest wystarczająca ilość mieszanki wzorcowej, aby skompensować błąd pipetowania. Dlatego, jeżeli wymaganych jest 10 reakcji (patrz UWAGA w ppkt 3.1), należy przygotować 12 reakcji
- Przygotuj mieszankę wzorcową na lodzie (lub w chłodnym bloku) i pozostań na lodzie do momentu umieszczenia w maszynie czasu rzeczywistego.
- Wymieszać przygotowane mieszanki wzorcowe, krótko odwirować i dozować 19 μl do odpowiednich dołków w probówkach paskowych lub na 96-dołkowej płytce kompatybilnej z używaną maszyną działającą w czasie rzeczywistym.
nuta: Zminimalizuj wytwarzanie pęcherzyków powietrza w studzienkach podczas pipetowania. - W oddzielnym pomieszczeniu lub w komorze UV przygotowanej zgodnie z opisem w ppkt 3.2, ostrożnie dodać 1 μl RNA uprzednio dostosowanego do 1 μg/μl (patrz krok 1.5) poniżej powierzchni odpowiedniej studzienki wzorcowej i delikatnie wymieszać. Wyrzuć końcówkę pipety do środka dezynfekującego bezpośrednio po użyciu (pod powierzchnią).
- Dodać kontrole po próbkach testowych, z kontrolą pozytywną dodaną jako następną i kontrolą bez matrycy (NTC – woda o jakości cząsteczkowej) dodaną na końcu. Ilość użytego RNA może być zmieniona w zależności od rodzaju próbki i zastosowanej ekstrakcji RNA. Użyta ilość musi zostać zweryfikowana, aby zapewnić optymalizację reakcji.
- Uszczelnić płytkę za pomocą wieczek paskowych lub zgrzewarki, zwracając uwagę, aby upewnić się, że wszystkie pokrywki są szczelnie zamknięte i wystarczająco oznaczone, aby można było zorientować próbki. Oznacz krawędź rurki z płytą/paskiem.
- Odwiruj próbki za pomocą wirówki, aby zebrać całą ciecz na dnie studzienek.
- Przenieś płytkę do maszyny do PCR w czasie rzeczywistym, otwórz drzwi i umieść w uchwycie, zapewniając prawidłowe położenie/orientację próbek zgodnie z układem płytki.
nuta: Jeśli używane są paski rurowe, upewnij się, że uchwyt jest na swoim miejscu. - Otwórz program maszyny do PCR w czasie rzeczywistym i wybierz opcję eksperymentu SYBR w czasie rzeczywistym z krzywą dysocjacji. Zaprogramować maszynę do PCR w czasie rzeczywistym, korzystając z warunków cykli termicznych określonych w tabeli 3, w tym punktów gromadzenia danych.
- Wybierz SYBR jako barwnik fluorescencyjny i wybierz nieznany jako typ próbki i wstaw nazwę w odpowiednim polu nazwy próbki.
nuta: Rozróżnij między powtórzeniami, a także między studzienkami lyssawirusa i ß-aktyny. - Wybierz lokalizację pliku, aby zapisać dane eksperymentalne, upewnij się, że lampa zostanie wyłączona po zakończeniu przebiegu, a następnie rozpocznij uruchamianie.
nuta: Ponieważ pierwszym krokiem jest stage RT, w tym czasie nie są zbierane żadne dane, dlatego jeśli lampa wymaga okresu nagrzewania, może to nastąpić podczas etapu RT. Maszyna i oprogramowanie działające w czasie rzeczywistym będą wyświetlać krzywe wzmocnienia w czasie rzeczywistym, podczas gdy krzywa topnienia zostanie wygenerowana pod koniec cyklu.
4. Analiza danych
- Po zakończeniu przebiegu przeprowadź analizę danych w następujący sposób.
- Najpierw przeanalizuj wyniki wykresu amplifikacji próbek testowych wraz z próbkami kontrolnymi. Próbki dodatnie wykazują rampy wykładnicze, po których zwykle następuje plateau i wartość Ct. Próbki ujemne mają płaskie wykresy amplifikacji bez wartości Ct (Rysunek 1A). Wartość Ct jest automatycznie obliczana przez oprogramowanie, chociaż należy ją sprawdzić i w razie potrzeby ręcznie zmienić.
- Po drugie, przeanalizuj wyniki krzywej dysocjacji próbek testowych wraz z próbkami kontrolnymi. Próbka dodatnia będzie miała temperaturę topnienia (Tm) 77 – 80 °C i będzie pokrywać się z kontrolą pozytywną Rysunek 1B).
- Uzyskaj ogólny wynik diagnostyczny, upewniając się, że kontrole są prawidłowe. Tabelę 4 należy wykorzystać do interpretacji wyników w odniesieniu do wewnętrznej kontroli ß-aktyny. Jeżeli dodatnie próbki kontrolne są ujemne i/lub próbki ujemne są dodatnie, serię nie należy brać pod uwagę.
- Zapisać wartości Ct i Tm uzyskane dla kontrolnego RNA na "karcie kontrolnej", aby umożliwić analizę tendencji i pomóc w identyfikacji odchyleń czułości testu.
Wyniki
Zgodnie z opisanym powyżej protokołem, czułość pan-lyssavirus RT-PCR wykazano na serii rozcieńczeń kontrolnego wirusa standardowego (CVS) (Rysunek 1) oraz dla szeregu innych lyssavirusów (Rysunek 2 i Rysunek 3). Wykorzystano barwnik SYBR Green I w uniwersalnym jednokrokowym RT-PCR, w którym synteza cDNA i amplifikacja PCR odbywają się w jednej probówce. W miarę powstawania specyficznego produktu amplifikacji wiąże się więcej barwnika, co prowadzi do wzrostu poziomu fluorescencji w czasie rzeczywistym. Wszystkie testy czasu rzeczywistego z użyciem barwników interkalujących muszą być interpretowane w dwóch fazach: amplifikacji i dysocjacji. Faza amplifikacji jest identyczna dla każdego procesu amplifikacji w czasie rzeczywistym (Rysunek 1A). W początkowych cyklach występuje liniowa „faza wczesna”, w której nie można obliczyć amplifikacji DNA ze względu na niewystarczający sygnał w stosunku do tła. Jej długość jest bezpośrednio związana z ilością celu w próbce. Następnie następuje faza wykładnicza, w której wykrywane i rejestrowane jest podwajanie cząsteczek DNA. Na koniec osiągana jest faza plateau (z wyjątkiem próbek silnie rozcieńczonych, które mogą nie osiągnąć tej fazy przed zakończeniem programu). W tej fazie intensywność fluorescencji stabilizuje się z powodu wyczerpania odczynników. Wykresy amplifikacji uzyskane przy użyciu 10-krotnych rozcieńczeń seryjnych CVS były zgodne z oczekiwanymi przebiegami (Rysunek 1A,C), gdzie test na lyssavirusy wykazał wyższą czułość niż test dla ß-aktyny. Krzywą dysocjacji obliczono po amplifikacji, w której dsDNA uległ dysocjacji do ssDNA poprzez stopniowe zwiększanie temperatury, a fluorescencję monitorowano jako funkcję temperatury (Rysunek 1B, D-F). Temperatura progowa, przy której specyficzny amplikon dysocjuje do ssDNA, spowodowała uwolnienie fluorescencji, która została zmierzona przez oprogramowanie termocyklera (Tm). Ta faza dysocjacji dostarczyła danych o wielkości amplikonu, umożliwiając użytkownikowi interpretację wyniku w porównaniu z kontrolą pozytywną, co skutkuje znikomym prawdopodobieństwem wyników fałszywie dodatnich. Wartości Tm obserwowane dla CVS przy użyciu testu pan-lyssavirus (Rysunek 1B) oraz testu ß-aktyny (Rysunek 1D) są odrębne, co pomogło użytkownikowi potwierdzić poprawność analizy testu na podstawie uzyskanej Tm (Rysunek 1E). Ponadto oceniono wartości Ct i Tm pomiędzy poszczególnymi uruchomieniami i operatorami, wykazując ich powtarzalność (Tabela 5). Próg użyty do obliczenia wartości Ct był obliczany automatycznie przez oprogramowanie i zależał od wielu czynników, w tym od mieszaniny reakcyjnej lub użytego instrumentu. W ciągu 12 niezależnych uruchomień średnie Ct wynosiło 20.66 (SD 0.63) dla testu lyssavirus i 27.5 (SD 1.13) dla testu ß-aktyny. W przeciwieństwie do tego, zmienność obserwowana w wartościach Tm była znacznie niższa ze względu na brak wpływów zewnętrznych na ten pomiar. Na przykład średnia Tm dla testu lyssavirus CVS wynosiła 78.92 (SD 0.16) (Tabela 5), w porównaniu ze średnią dla wszystkich lyssavirusów wynoszącą 78.81 °C (SD 0.531) (Tabela 6 i Rysunek 1F). Ten brak zmienności Tm w obrębie rodzaju Lyssavirus jest korzystny, ponieważ to samo kontrolne RNA może być stosowane niezależnie od rodzaju lyssavirusa w próbce; jednak różnicowanie gatunków lyssavirusów na podstawie Tm nie jest możliwe, zwłaszcza że różne sublinie RABV obejmowały cały zakres obserwowanych wartości Tm (Tabela 6). Wykresy niespecyficznej amplifikacji są rzadko obserwowane w tym teście; jednak wymagane są specyficzne parametry do zdefiniowania wyniku dodatniego w kontraście do niespecyficznego wyniku ujemnego. Odchylenie standardowe SD zaobserwowane dla wszystkich lyssavirusów (0.531) zastosowano do najniższej (77.34 - LBVa) i najwyższej (79.67 - IKOV) obserwowanej wartości Tm, aby ustalić zakres 76.8 °C - 80.2 °C dla dodatnich prążków specyficznych. Zatem wartości Tm poza tym zakresem uznano za niespecyficzne, a tym samym za wynik ujemny. Sporadycznie w próbce obserwuje się wiele pików. Jeśli dominujący pik znajduje się przy prawidłowej Tm (dla każdego powtórzenia), próbka jest uznawana za dodatnią. Najczęstszą przyczyną wystąpienia niespecyficznego piku są dimery starterów; test został zoptymalizowany w celu zminimalizowania ich powstawania. Dimery starterów zazwyczaj prowadzą do powstania amplikonu mniejszego niż sekwencja docelowa, w związku z czym ich Tm byłaby niższa niż w przypadku produktu specyficznego.
Przeprowadzono równoległe 10-krotne rozcieńczenia szeregowe RNA z trzech próbek mózgu dodatnich pod kątem obecności lyssavirusów, ekstrahowanych przy użyciu TRIzol, a następnie narysowano odpowiednie wykresy (Rysunek 2). Granica wykrywalności dla trzech lyssavirusów była zróżnicowana, jednak dla żadnego z nich nie przekroczyła wartości Ct 36. Wartości współczynnika R2 dla wirusów przedstawionych na Rysunku 2 mieściły się w zakresie od 0,9637 do 0,996. W przypadku wszystkich analizowanych wirusów (Tabela 6) zakres ten nie został przekroczony; ponadto dla 7 z 29 lyssavirusów R2 >0,99 (dane nie zostały przedstawione). Biorąc pod uwagę, że serie rozcieńczeń przygotowano z całkowitych ekstrakcji RNA, obserwowana liniowość dowodzi, że test jest odporny. Na koniec zbadano wykrywalność wszystkich gatunków lyssavirusów (w szczególności najbardziej zróżnicowanych wirusów z filogrupy III), wykorzystując panel RNA obejmujący wszystkie trzy filogrupy w obrębie rodzaju Lyssavirus. Wykorzystano RNA ekstrahowane z materiału mózgowego myszy pierwotnie lub eksperymentalnie zainfekowanych, zgodnie z opisanymi powyżej protokołami. Wyniki potwierdzają, że primery amplifikują wszystkie gatunki lyssavirusów, w tym dywergentne lyssavirusy z filogrupy III: IKOV, WBCV i LLEBV (Tabela 6 oraz Rysunek 3). Przesiewowo przebadano zróżnicowany panel rhabdovirusów innych niż lyssavirusy, pierwotnie zebranych i analizowanych antygenowo16, a w późniejszym czasie genetycznie17; nie wykryto reakcji krzyżowej, co wskazuje, że primery są specyficzne wyłącznie dla członków rodzaju Lyssavirus (dane nie zostały przedstawione). Pan-lyssavirusowy test w czasie rzeczywistym jest włączony do międzylaboratoryjnych programów oceny biegłości EURL (EU Reference Laboratory) od 2013 roku, wykazując 100% zgodności z innymi testami molekularnymi, takimi jak pan-lyssavirusowy test TaqMan i konwencjonalny test RT-PCR, a także z testem FAT (testem przeciwciał fluorescencyjnych).
Rycina 1: 10-krotne rozcieńczenie seryjne RNA kontroli pozytywnej CVS, poddane analizie testem RT-PCR pan-lyssavirus, przedstawione jako wykres amplifikacji (A) oraz krzywa dysocjacji (B), a także poddane analizie testem RT-PCR ß-aktyny, przedstawione jako wykres amplifikacji (C) oraz krzywa dysocjacji (D). NTC = kontrola bez matrycy. Porównanie RNA kontroli CVS w teście RT-PCR pan-lyssavirus (niebieski) oraz w teście RT-PCR ß-aktyny (czerwony), wykazujące różnice w krzywych dysocjacji (E) — wartości średnie znajdują się w Tabeli 5; na koniec krzywe dysocjacji dla LBVa (niebieski) i IKOV (czerwony), demonstrujące zakres wartości Tm obserwowanych w obrębie rodzaju Lyssavirus (F). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 2: 10-krotne rozcieńczenia szeregowe dla trzech gatunków lyssavirusów: RABV (RV108), DUVV (RV131) oraz ARAV (RV3379). R2 = odpowiednio 0.996, 0.9962 i 0.9637. Punkty danych przy 10-7 (0.0001 ng/µL) osiągnęły granicę wykrywalności (tam, gdzie uzyskano wartość). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Reprezentatywne dane z 10-krotnych rozcieńczeń seryjnych dla różnych gatunków z rodzaju Lyssavirus (tożsamość poszczególnych lyssavirusów podano w legendach, a zestawienie wyników w porównaniu z innymi lyssavirusami znajduje się w Tabeli 6). Panele A, C, E, G przedstawiają wykresy amplifikacji, a panele B, D, F, H odpowiednio krzywe dysocjacji dla A, C, E i G. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
| Odczynnik | μL/Reaction |
| Woda klasy molekularnej | 7.55 |
| 2x uniwersalna mieszanina reakcyjna RT-PCR | 10 |
| Starter bezpośredni [20 μM] | 0.6 |
| Starter odwrotny [20 μM] | 0.6 |
| mieszanka enzymów RT | 0.25 |
| Łącznie na jedną reakcję | 19 |
Tabela 1: Odczynniki do master mixu w reakcji real-time RT-PCR dla pan-lyssavirusa.
| Analiza | Nazwa primera | Rola primera | Sekwencja 5’-3’ | Położenie1 |
| Lyssavirus | JW12 | RT-PCR | ATG TAA CAC CYC TAC AAT G | 53-73 |
| N165 | PCR | GCA GGG TAY TTR TAC TCA TA | 165-146 | |
| β-aktyna | intronowa β-aktyna | PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy) | CGA TGA AGA TCA AGA TCA TTG | 1051-1072 |
| odwrócony primer do $\beta$-aktyny | RT-PCR | AAG CAT TTG CGG TGG AC | 1204-1188 | |
| Pozycje starterów podano w odniesieniu do sekwencji wirusa Pasteura (M13215) oraz sekwencji genu ß-aktyny myszy (NM_007393) | ||||
Tabela 2: Szczegóły dotyczące starterów do pan-lyssavirus real-time RT-PCR.
| Etap | Cykle | Temperatura | Czas | Gromadzenie danych |
| Odwrotna transkrypcja | 1 | 50 °C | 10 min | |
| Inaktywacja RT/denaturacja wstępna | 1 | 95 °C | 5 min | |
| Amplifikacja | 40 | 95 °C | 10 s | |
| 60 °C | 30 s | punkt końcowy | ||
| Analiza krzywej dysocjacji | 1 | 9 °C | 1 min | |
| 55 °C | 1 min | |||
| 55 - 95 °C | 10 s | wszystkie punkty |
Tabela 3: Warunki cykliczne dla pan-lyssavirus real-time RT-PCR.
| Wynik testu | Wewnętrzna kontrola ß-aktyny | Wynik ogólny |
| Ujemny | Negatywny1 | Wynik nieprawidłowy. Powtórzyć ekstrakcję i analizę2 |
| Negatywny | Dodatni | Zgłoszono wynik negatywny |
| Dodatni | Dodatni | Odnotowano wynik dodatni |
| Dodatni | Negatywny1 | Powtórzenie ekstrakcji i analizy3 |
| 1Zastosowanie heterologicznej kontroli zewnętrznej byłoby korzystne podczas powtórnej ekstrakcji. | ||
| 2 Jeśli w przypadku kontroli wewnętrznej zostanie uzyskano drugi wynik negatywny, próbkę zgłosi się jako niepodlegającą badaniu za pomocą niniejszego testu. | ||
| 3 Jeśli w przypadku wyniku dodatniego testu uzyskano drugi wynik ujemny dla kontroli wewnętrznej, wtórne badanie w kierunku wścieklizny | ||
| należy przeprowadzić test diagnostyczny w celu potwierdzenia tego wyniku. | ||
Tabela 4: Podsumowanie wyników i rezultaty ogólne dla pan-lyssavirus real-time RT-PCR. Wynik negatywny przypisano próbce bez wartości Ct (amplifikacja) i bez temperatury topnienia (dysocjacja) lub z temperaturą topnienia wykraczającą poza zakres Tm dla dodatnich lyssavirusów (76.8 °C - 80.2 °C). Wynik dodatni przypisano próbce z wartością Ct (amplifikacja) oraz temperaturą topnienia (dysocjacja) mieszczącą się w zakresie Tm dla dodatnich lyssavirusów.
| Analiza Lyssavirus | Analiza ß-actin | |||
| Ct | Tm | Ct | Tm | |
| Średnia | 20.66 | 78.92 | 27.5 | 85.26 |
| SD | 0.63 | 0.16 | 1.13 | 0.35 |
| LCL (95%) | 19.39 | 78.59 | 25.23 | 84.56 |
| UCL (95%) | 21.93 | 79.25 | 29.76 | 85.96 |
Tabela 5: Analiza międzyseryjna dodatniej kontroli CVS w 12 niezależnych seriach z udziałem wielu operatorów.
| Filogrupa | Gatunki | Identyfikacja wirusa | Linia komórkowa | Granica wykrywalności | Tm |
| I | RABV | RV50 | nietoperz z USA | 10-5 | 79.5 |
| I | RABV | RV51 | US Fox | 10-7 | 77.6 |
| I | RABV | RV108 | nietoperz chilijski | 10-7 | 78.63 |
| I | RABV | RV313 | Lis europejski | 10-9 | 78.53 |
| I | RABV | RV437 | Europejski RacDog | 10-7 | 78.09 |
| I | RABV | RV1237 | Jeleń szlachetny | 10-8 | 78.76 |
| I | RABV | RV334 | Chińska szczepionka | 10-8 | 79.03 |
| I | RABV | RV102 | Afryka 2 | 10-7 | 78.58 |
| I | RABV | RV995 | Afryka 3a | 10-8 | 79.66 |
| I | RABV | RV410 | Afryka 3b | 10-7 | 79.03 |
| I | RABV | RV2324 | Afryka 4 | 10-7 | 79.17 |
| I | RABV | RV2417 | Pies lankijski | 10-9 | 78.71 |
| I | RABV | CVS-11 | 10-7 | 79.17 | |
| I | EBLV-1 | RV20 | Niemcy | 10-6 | 79.05 |
| I | EBLV-2 | RV1787 | Wielka Brytania | 10-7 | 78.76 |
| I | BBLV | RV2507 | Niemcy | 10-9 | 78.71 |
| I | ABLV | RV634 | 10-8 | 78.25 | |
| I | DUVV | RV131 | 10-5 | 79.03 | |
| I | GBLV | RV3269 | 10-7 | 79.15 | |
| I | ARAV | RV3379 | 10-7 | 79.46 | |
| I | KHUV | RV3380 | 10-7 | 78.97 | |
| I | SHIBV | RV3381 | 10-7 | 78.59 | |
| I | IRKV | RV3382 | 10-3 | 78.59 | |
| II | LBVa | RV767 | 10-5 | 77.34 | |
| II | LBVd | RV3383 | 10-7 | 78.59 | |
| II | MOKV | RV4 | 10-3 | 78.81 | |
| III | IKOV | RV2508 | 10-5 | 79.67 | |
| III | LLEBV | RV3208 | 10-4 | 79.15 | |
| III | WCBV | RV3384 | 10-3 | 79 |
Tabela 6: Podsumowanie swoistości, czułości i T czasu rzeczywistego RT-PCR pan-lyssavirusm dla reprezentatywnych lyssavirusów ze wszystkich trzech filogrup. Średnia wartość Tm wśród lyssavirusów wyniosło 78,81 (SD 0,531).
Dyskusja
Opisany test RT-PCR w czasie rzeczywistym pan-lyssavirus jest jednoetapowym testem z zamkniętą probówką, który wykrywa lyssawirusy we wszystkich trzech filogrupach. Test został zwalidowany zarówno do diagnozy wścieklizny u zwierząt, jak i u ludzi, w tym pośmiertnej tkanki mózgowej (optymalnie pnia mózgu) oraz próbek przedśmiertnych, takich jak biopsja skóry, seryjnie pobierana ślina lub płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF). Startery użyte w tym teście zostały po raz pierwszy zaprojektowane i wykorzystane do testu opartego na sondzie w celu rozróżnienia między RABV, EBLV-1 i EBLV-23, który był używany w wielu laboratoriach OIE zajmujących się wścieklizną i działa konsekwentnie w schematach biegłości EURL. Następnie potwierdzono "pan-lyssawirusowy" charakter tych starterów za pomocą dwuetapowego testu w czasie rzeczywistym15. Opisany tutaj test wykorzystał startery do dalszej optymalizacji RT-PCR w jednoetapowym teście SYBR, umożliwiając szybki system z zamkniętą probówką. Co więcej, szkolenie w krajach endemicznych dla wścieklizny przy użyciu tego testu potwierdziło przydatność do wdrożenia w każdym laboratorium z podstawowymi środkami ochrony osobistej i systemami jakości w celu zmniejszenia zanieczyszczenia krzyżowego i śladowymi próbkami, obiektami do przechowywania odczynników i maszyną do wykrywania SYBR w czasie rzeczywistym. Test jest niezwykle solidny i ma 100% korelację z FAT, z lepszą czułością dla rozłożonych próbek3. Jedną z głównych zalet testu opartego na barwniku interkalacyjnym DNA w porównaniu z testem opartym na sondzie jest względny koszt. Dodatkową korzyścią jest to, że test wykorzystuje tylko dwa startery, dzięki czemu istnieje mniejsze ryzyko nieudanego wykrycia z powodu rozbieżności sekwencji, co było słabością wcześniej opublikowanych testów opartych na sondzie. Rzeczywiście, przedstawiciele wszystkich gatunków wirusów lyssa (z wyjątkiem TWBLV i KBLV) są wykrywani za pomocą tego testu, a analiza sekwencji TWBLV i KBLV w miejscach starterów nie ujawnia istotnych rozbieżności, co zdecydowanie sugeruje, że zostaną one również wykryte przy użyciu tej metody. Można uznać, że zakres graniczny wykrywalności obserwowany w analizowanych wirusach wynika z dwóch głównych czynników. Pierwszym z nich jest to, że RNA zostało wyizolowane z klinicznego materiału mózgu, dlatego liczba kopii genomu w każdej nierozcieńczonej próbce nie jest bezpośrednio porównywalna. RNA "znormalizowano" poprzez dostosowanie całkowitego RNA do 1 μg/μL; jednak proporcja RNA genomu wirusa w tej próbce będzie się różnić. Drugim jest różnorodność sekwencji lyssawirusa, pomimo tego, że miejsca starterów znajdują się w regionach konserwatywnych, pozostają pozycje zmienności. Nic więc dziwnego, że większość lyssawirusów o niższej czułości dla testu to wirusy filogrupy II i III. Analiza krzywej dysocjacji stanowi istotny parametr, minimalizujący wynik fałszywie dodatni, który w przeciwnym razie mógłby wystąpić z powodu tworzenia dimerów starterów lub amplifikacji niespecyficznego regionu w genomie gospodarza. W rzeczywistości jest to rzadkie zjawisko, a analiza krzywej dysocjacji jest równoważna uruchomieniu żelu agarozowego w celu wizualizacji konwencjonalnych amplikonów RT-PCR o prawidłowej wielkości. Zakres dopuszczalnych wartości Tm został podany (77-80 °C) na podstawie danych zebranych w naszym laboratorium. Zdecydowanie zaleca się, aby poszczególne laboratoria zestawiały dane wewnętrzne, aby zapewnić możliwość przeniesienia zakresu i odpowiednio je zmieniały. Interpretacja wyników zarówno z wykresów amplifikacji, jak i dysocjacji, wraz z kontrolami dodatnimi i ujemnymi oraz wynikami ß-aktyny, umożliwia uzyskanie solidnych i powtarzalnych wyników diagnostycznych.
Poza zakresem tego protokołu znajduje się metoda ekstrakcji RNA stosowana w celu uzyskania wysokiej jakości RNA. Wszystkie RNA analizowane w tym protokole zostały przygotowane przy użyciu TRIzolu; jednak dostępnych jest wiele odpowiednich protokołów ekstrakcji RNA na bazie guanidu, w tym zestawy do ekstrakcji na bazie kolumn i kulek. Obchodzenie się z próbkami dodatnimi (lub podejrzanymi dodatnimi) wirusem lizy musi odbywać się w licencjonowanych obiektach hermetyczności biologicznej zatwierdzonych w danym kraju. Jednak całkowity wyekstrahowany RNA jest niezakaźny, dlatego jest przetwarzany w laboratoriach o niskiej hermetyzacji. W zależności od zastosowanej metody ekstrakcji należy ocenić wymóg ilościowego oznaczania i rozcieńczania RNA. W przypadku ekstrakcji na bazie fenolu, w tym TRIzolu, etap ten jest wymagany i zapobiega zahamowaniu testu przed zanieczyszczeniem gDNA; jednak ekstrakcje kolumnowe i perełkowe (szczególnie te z etapem zubożenia DNA) nie wymagają rozcieńczania przed badaniem.
W całym protokole ważne jest, aby zachować ostrożność i staranność, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu i dokładnemu dodawaniu próbki do odpowiednich studzienek. Arkusz kalkulacyjny z obliczeniami odczynnika i układem płytki jest dostępny do pobrania jako plik uzupełniający. Dobra praktyka laboratoryjna, w tym czyste powierzchnie robocze, regularna zmiana rękawic, stosowanie końcówek barierowych i różnych pomieszczeń/szaf UV w celu oddzielenia każdego etapu, zminimalizuje ryzyko zanieczyszczenia. Aby upewnić się, że badanie przebiega z oczekiwanymi parametrami, należy uwzględnić kontrole dodatnie i ujemne, a wszystkie próbki do badań należy przeprowadzić w dwóch powtórzeniach (lub trzech egzemplarzach).
Włączenie kontroli jest istotną cechą każdego PCR, szczególnie w diagnostyce. RNA kontroli pozytywnej przygotowano z mózgów myszy zakażonych CVS (Challenge Virus Standard) w partiach, a następnie zwalidowano i skalibrowano w celu zapewnienia spójności między partiami. Kontrolny RNA oznaczono ilościowo i rozcieńczono do 1 μg/μl. RNA, dla którego uzyskano pozytywny wynik w seryjnym rozcieńczeniu do co najmniej 10-4 (równego 100 pg/μl) uznano za odpowiednie do celu. RNA kontroli dodatniej przechowywano w temperaturze -80 °C w podwielokrotnościach 10-1 . W razie potrzeby podwielokrotność rozcieńczano w stosunku 1:100 w celu uzyskania zapasu roboczego w stężeniu 1 ng/μl i przechowywano w temperaturze -80 °C w 5 μl podwielokrotności jednorazowego użytku. Rozcieńczony RNA kontroli dodatniej użyto do przedstawienia próbek dodatnich o niskim poziomie i do zapewnienia, że wykryto jakiekolwiek zmniejszenie czułości testu. Dla każdej kontroli prowadzono "kartę kontrolną" w celu monitorowania wartości Ct i identyfikacji tendencji (tabela 5). W tabeli 5 wykazano dobrą porównywalność między cyklami dla wartości Ct i Tm próbki kontroli dodatniej CVS w wielu dniach i u operatorów, co daje pewność, że test jest solidny i powtarzalny. Wyniki, które odbiegają od tych pomiarów, należy zbadać i w razie potrzeby powtórzyć badania próbek. Woda molekularna została włączona do każdego cyklu jako NTC, aby potwierdzić, że odczynniki są wolne od zanieczyszczenia RNA wirusa lyssawirusa i potwierdzić ujemną próbkę. Ponadto, aby zapewnić skuteczność ekstrakcji RNA, ß-aktynę testowano wraz z próbkami testowymi w osobnej probówce. RNA kontroli pozytywnej wirusa lyssawirusa wykorzystano również do kontroli pozytywnej ß-aktyny. Można wykorzystać inne endogenne geny lub heterologiczne systemy kontroli wewnętrznej. Zastosowanie tych kontroli zapewniło, że wszystkie etapy były analizowane w tych samych warunkach, co próbki testowe. Czasami, jeśli próbka była wysoce zdegradowana lub nie zawierała wystarczającej ilości RNA gospodarza (takiego jak ślina lub płyn mózgowo-rdzeniowy), endogenny gen PCR może się nie powieść. W tym przypadku, gdy wynik RT-PCR lyssawirusa w czasie rzeczywistym był pozytywny, potwierdzenie niezależnej ekstrakcji RNA - w celu wykluczenia zanieczyszczenia podczas ekstrakcji RNA na oryginalnym teście lub przez test wtórny (molekularny, taki jak konwencjonalny RT-PCR) lub FAT. Wykorzystanie tabeli 4 podczas analizy próbki diagnostycznej zapewniło prawidłową interpretację.
Niezależnie od testu molekularnego zastosowanego do potwierdzenia zakażenia wścieklizną, należy również podjąć dalsze badania z wykorzystaniem sekwencjonowania Sangera w celu określenia gatunku wirusa lyssa i klasycznych technik wirusologicznych, takich jak FAT lub izolacja wirusa, aby umożliwić dalszą charakterystykę wirusa i wesprzeć powiadamianie o pozytywnych przypadkach do OIE i WHO.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować Pannomie Wise i Pannie Megan Golding za pomoc w ukończeniu eksperymentów. Opracowanie tego protokołu było wspierane finansowo przez brytyjski Departament Środowiska, Żywności i Spraw Wiejskich (Defra), rząd Szkocji i rząd walijski poprzez granty [SV3500 i SE0431] oraz przez projekt European Virus Archive global (EVAg), który otrzymał finansowanie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 na podstawie umowy o udzielenie dotacji nr 653316.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Końcówki do pipet Art Barrier (różne rozmiary) | Thermofisher | różne | |
| Wirówka | Beckman | Allegra 21R | Rotor zdolny do przechowywania wymaganych 96 płytek dołkowych. Krok 3.8. |
| Wirówka (mico) | Sigma | ||
| Finnpipety (do dozowania 0,5-1,000 &mikro; L) | Thermofisher | różne | |
| iTaq Uniwersalny SYBR Zielony jednoetapowy zestaw RT-PCR | Bio-Rad | 172-5150 | Równoważne zestawy mogą być używane, jeśli są walidowane |
| MX3000P lub MX3005P systemie real-tme PCR | Stratagene | N/A | Maszyny eqivalent mogą być używane, jeśli są zatwierdzone |
| Podstawa płytki reakcyjnej MicroAmp | Dowolna odpowiednia | Służy do bezpiecznego trzymania paska rurki i płytek. | |
| Optycznie przezroczyste płaskie przezroczyste paski (8) | ABgene | AB-0866 | |
| Idealnie dopasowana rama (w przypadku korzystania z pasków rurowych) | Stratagene | N/A | Specyficzne dla maszynowych |
| podkładów: szczegóły dotyczące podkładu znajdują się w Tabeli 2. | Zamówione po 0,05 &mikro; skala kretowa HPLC oczyszczona. | ||
| Płytki studzienne Thermo-Fast 96, bez listew przypodłogowych | ABgene | AB-600 | |
| Paski Thermo-Fast (8) Rurki termiczne | ABgene | AB-0452 | |
| Maszyna wirowa / Whirlimixer | Fisons Aparatura naukowa | SGP-202-010J | |
| O ile nie zaznaczono inaczej, można zastosować |
Bibliografia
- OIE. OIE Terrestrial Manual 2018. , 8-14 (2018).
- Panning, M., et al. Comparative analysis of rabies virus reverse transcription-PCR and virus isolation using samples from a patient infected with rabies virus. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2960-2962 (2010).
- Wakeley, P. R., et al. Development of a real-time, TaqMan reverse transcription-PCR assay for detection and differentiation of lyssavirus genotypes 1, 5, and 6. Journal of Clinical Microbiology. 43 (6), 2786-2792 (2005).
- Wang, L., et al. A SYBR-green I quantitative real-time reverse transcription-PCR assay for rabies viruses with different virulence. Virologica Sinica. 29 (2), 131-132 (2014).
- Wadhwa, A., et al. A Pan-Lyssavirus Taqman Real-Time RT-PCR Assay for the Detection of Highly Variable Rabies virus and Other Lyssaviruses. PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (1), e0005258(2017).
- Nadin-Davis, S. A., Sheen, M., Wandeler, A. I. Development of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction methods for human rabies diagnosis. Journal of Medical Virology. 81 (8), 1484-1497 (2009).
- Hoffmann, B., et al. Improved safety for molecular diagnosis of classical rabies viruses by use of a TaqMan real-time reverse transcription-PCR "double check" strategy. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 3970-3978 (2010).
- Faye, M., et al. Development and validation of sensitive real-time RT-PCR assay for broad detection of rabies virus. Journal of Virological Methods. 243, 120-130 (2017).
- Dacheux, L., et al. Dual Combined Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Assay for the Diagnosis of Lyssavirus Infection. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), e0004812(2016).
- Fooks, A. R., et al. Rabies. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091(2017).
- Marston, D. A., et al. Ikoma lyssavirus, highly divergent novel lyssavirus in an african civet. Emerging Infectious Diseases. 18 (4), 664-667 (2012).
- ICTV. Virus Taxonomy: 2018 Release: Email ratification October 2018 (MSL #33). , Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy/ (2018).
- Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Disease. 24 (4), 782-785 (2018).
- Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
- Hayman, D. T., et al. A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses. Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).
- Calisher, C. H., et al. Antigenic relationships among rhabdoviruses from vertebrates and hematophagous arthropods. Intervirology. 30 (5), 241-257 (1989).
- Aznar-Lopez, C., et al. Detection of rhabdovirus viral RNA in oropharyngeal swabs and ectoparasites of Spanish bats. Journal of General Virology. 94 (1), 69-75 (2013).
Przedruki i uprawnienia
