Method Article

Analiza interakcji między endobiotykami a mikrobiotą jelitową człowieka przy użyciu systemów fermentacji w kąpieli in vitro

DOI:

10.3791/59725

⸱

August 23rd, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Comprehensive Utilization of Advantage Plants Resources in Hunan South, College of Chemistry and Bioengineering, Hunan University of Science and Engineering, 2College of Food and Biological Engineering, Zhejiang Gongshang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj jest protokół do badania interakcji między endobiotykami a ludzką mikrobiotą jelitową za pomocą systemów fermentacji in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroorganizmy jelitowe człowieka stały się ostatnio ważnym celem badań w zakresie promowania ludzkiego zdrowia i zapobiegania chorobom. W związku z tym badania nad interakcjami między endobiotykami (np. lekami i prebiotykami) a mikrobiotą jelitową stały się ważnym tematem badawczym. Jednak eksperymenty in vivo z udziałem ochotników nie są idealne do takich badań ze względu na ograniczenia bioetyczne i ekonomiczne. W rezultacie do oceny tych interakcji in vivo wykorzystano modele zwierzęce. Niemniej jednak badania na modelach zwierzęcych są nadal ograniczone względami bioetycznymi, a także różnymi składami i różnorodnością mikrobioty u zwierząt i ludzi. Alternatywną strategią badawczą jest wykorzystanie eksperymentów fermentacji okresowej, które umożliwiają ocenę interakcji między endobiotykami a mikrobiotą jelitową in vitro. Aby ocenić tę strategię, zastosowano egzopolisacharydy bifidobakteryjne (Bif) (EPS) jako reprezentatywny ksenobiotyk. Następnie zbadano interakcje między Bif EPS a ludzką mikrobiotą jelitową przy użyciu kilku metod, takich jak chromatografia cienkowarstwowa (TLC), analiza składu społeczności bakteryjnej z wysokoprzepustowym sekwencjonowaniem genu 16S rRNA oraz chromatografia gazowa krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA). Przedstawiono protokół badania interakcji między endobiotykami a mikrobiotą jelitową człowieka przy użyciu systemów fermentacji okresowej in vitro. Co ważne, protokół ten można również zmodyfikować w celu zbadania ogólnych interakcji między innymi endobiotykami a mikrobiotą jelitową.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrobiota jelitowa odgrywa ważną rolę w funkcjonowaniu ludzkich jelit i w zdrowiu gospodarza. W związku z tym mikrobiota jelitowa stała się ostatnio ważnym celem w profilaktyce i terapii chorób1. Co więcej, bakterie jelitowe wchodzą w interakcje z komórkami jelitowymi gospodarza i regulują podstawowe procesy gospodarza, w tym aktywność metaboliczną, dostępność składników odżywczych, modulację układu odpornościowego, a nawet funkcjonowanie mózgu i podejmowanie decyzji2,3. Endobiotyki mają znaczny potencjał wpływania na skład bakteryjny i różnorodność mikrobioty jelitowej. W związku z tym interakcje między endobiotykami a ludzką mikrobiotą jelitową przyciągają coraz większą uwagę badaczy4,5,6,7,8,9.

Trudno jest ocenić interakcje między endobiotykami a ludzką mikrobiotą jelitową in vivo ze względu na ograniczenia bioetyczne i ekonomiczne. Na przykład eksperymenty badające interakcje między endobiotykami a ludzką mikrobiotą jelitową nie mogą być przeprowadzane bez zgody Agencji ds. Żywności i Leków, a rekrutacja ochotników jest kosztowna. W związku z tym do takich badań często wykorzystuje się modele zwierzęce. Wykorzystanie modeli zwierzęcych jest jednak ograniczone ze względu na różny skład mikrobioty i różnorodność w społecznościach związanych ze zwierzętami i ludźmi. Alternatywną metodą in vitro do badania interakcji między endobiotykami a mikrobiotą jelitową człowieka jest wykorzystanie eksperymentów z hodowlami wsadowymi.

Egzopolisacharydy (EPS) to prebiotyki, które znacząco przyczyniają się do utrzymania zdrowia człowieka10. Odrębne EPS, które składają się z różnych kompozycji i struktur monosacharydowych, mogą wykazywać różne funkcje. Poprzednie analizy określiły skład Bif EPS, które są reprezentatywnym ksenobiotykiem docelowym w obecnym badaniu11. Nie wzięto jednak pod uwagę skutków metabolicznych związanych z gospodarzem w odniesieniu do składu i różnorodności EPS.

Opisany tutaj protokół wykorzystuje mikrobiotę kałową od 12 ochotników do fermentacji Bif EPS. Chromatografia cienkowarstwowa (TLC), wysokoprzepustowe sekwencjonowanie genu 16S rRNA i chromatografia gazowa (GC) są następnie stosowane w połączeniu w celu zbadania interakcji między EPS a ludzką mikrobiotą jelitową. Wyraźnymi zaletami tego protokołu w porównaniu z eksperymentami in vivo są jego niski koszt i unikanie zakłócających efektów metabolizmu gospodarza. Ponadto opisany protokół może być wykorzystany w innych badaniach, które badają interakcje między endobiotykami a ludzką mikrobiotą jelitową.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etyki Uniwersytetu Nauki i Inżynierii Hunan (Hunan, Chiny) oraz Uniwersytetu Zhejiang Gongshang (Zhejiang, Chiny).

1. Przygotowanie bakterii

  1. Przygotowanie bulionu z pożywki bifidobacterium
    1. Połączyć następujące składniki w 950 ml wody destylowanej: ekstrakt mięsny 5 g/l; ekstrakt drożdżowy 5 g/l; pepton kazeinowy 10 g/l; sojton 5 g/l; glukoza 10 g/l; K2HPO4, 2,04 g/l; MgSO4·7H2O, 0,22 g/L; MnSO4. H20, 0,05 g/l; NaCl, 5 g/l; Animacja 80, 1 mL; roztwór soli, 40 ml (CaCl 2,2H2O,0,25 g/L; KH2PO4, 1 g/L; NaHCO3, 10 g/l; NaCl, 2 g/l); i resazuryna, 0,4 ml (2,5 mg/l). Doprowadzić pH do 6,8 za pomocą 2 M NaOH.
    2. Autoklawać w temperaturze 121 °C przez 15 minut i pozostawić bulion do ostygnięcia do temperatury pokojowej (RT) w warunkach beztlenowych (10% H2, 10 % CO2, 80% N2). Do pożywki dodać sterylizowaną przez filtr cysteinę-HCl (0,5 g/l) i mupirocynę (5 mg/l).
  2. Dodać podwielokrotność (50 μl) zamrożonego Bifidobacterium longum do probówki hodowlanej z 5 ml bulionu z pożywką bifidobacterium w warunkach beztlenowych, a następnie hodować w inkubatorze beztlenowym przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.

2. Przygotowanie bifidobakteryjnych styropianów

  1. Przygotowanie podłoża agarowego PYG
    1. Połącz następujące składniki: pepton, 20 g/l; ekstrakt drożdżowy, 10 g/l; glukoza, 5 g/l; NaCl, 0,08 g/l; CaCl2, 0,008 g/l; MgSO4·7H2O, 0,008 g/l; K2HPO4, 0,04 g/l; KH2PO4, 0,04 g/L; NaHCO3, 0,4 g/l; agar, 12 g/l. Doprowadzić pH do 7,2 za pomocą 10 M NaOH.
    2. Autoklawować pożywkę w temperaturze 121 °C przez 15 minut i schłodzić do temperatury ~50 °C. Następnie na 1 l pożywki dodać 0,5 ml wysterylizowanego przez filtr roztworu witaminy K1 (1 g witaminy K1 rozpuszczonej w 99 ml 99% etanolu), 5 ml roztworu heminy (0,5 g heminy rozpuszczonej w 1 ml 1 mol/l NaOH, a następnie doprowadzonej do 100 ml wodą destylowaną) i 0,5 g cysteiny-HCl.
    3. Przed rozlaniem płytek PYG do podłoża
      dodać wysterylizowany filtrem 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galaktopyranozyd (X-Gal, 0,06 g/L), LiCl·3H2O (5,7 g/L) i mupirocynę (5 mg/L).UWAGA: X-Gal i LiCl.3H2O umożliwiają identyfikację kolonii B. longum na płytkach poprzez zmiany ubarwienia.
  2. Zaszczepić 20 μl szczepów B. longum (krok 1.2) na płytki PYG i umieścić w inkubatorze beztlenowym w temperaturze 37 °C na 72 godziny.
  3. Zebrać kolonie bakterii śluzowatych z płytek PYG za pomocą miarki wagowej, a następnie całkowicie ponownie zawiesić w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) za pomocą oscylatora wirowego.
    UWAGA: Mieszaniny bakterii i EPS należy całkowicie zawiesić poprzez wielokrotne wirowanie lub pipetowanie w górę iw dół, aż włókna całkowicie rozpuszczą się w PBS.
  4. Odwirować zawiesinę o stężeniu 6 000 x g przez 5 min.
  5. Ostrożnie przenieść supernatanty do nowej probówki wirówkowej i całkowicie wymieszać z trzema objętościami zimnego 99% etanolu poprzez wielokrotne odwracanie i mieszanie.
  6. Odwirować mieszaninę o stężeniu 6 000 x g przez 5 minut i całkowicie usunąć supernatanty.
  7. Usunąć osady z probówek wirówkowych, zeskrobując i susząc ekstrakty EPS przez noc przy użyciu próżni o dużej prędkości.

3. Przygotowanie pożywki fermentacyjnej

  1. Przygotowanie podstawowego podłoża hodowlanego VI
    1. Połącz następujące składniki: pepton, 3 g/l, trypton, 3 g/l, ekstrakt drożdżowy, 4,5 g/l, mucyna, 0,5 g/l, sole żółciowe nr 3, 0,4 g/l; NaCl, 4,5 g/l; KCl, 2,5 g/L; MgCl2·6H2O, 4,5 g/L; 1 ml Tween 80; CaCl 2,6H2 O, 0,2 g/L; KH2PO4, 0,4 g/L; MgSO4·7H2O, 3,0 g/L; MnCl2·4H2O, 0,32 g/L; FeSO4·7H2O, 0,1 g/l; CoSO4·7H2O, 0,18 g/L; CaCl2·2H2O, 0,1 g/L; ZnSO4·7H2O, 0,18 g/L; CuSO4·5H2O, 0,01 g/L; i NiCl2·6H2O, 0,092 g/L. Doprowadzić pH do 6,5 za pomocą 1 M HCl.
    2. Przygotować heminę i cysteinę, jak opisano w sekcji 2.1 i dodać po sterylizacji w autoklawie i schłodzeniu.
  2. Przygotować pożywki hodowlane zawierające różne źródła węgla z pożywką na bazie VI. Przed autoklawowaniem dodać 8 g/l włókien Bif EPS do podłoża VI, obejmującego grupę VI_Bif. Ponadto dodać 8 g/l skrobi do podłoża VI, aby reprezentowało grupę VI_Starch. Wreszcie jako kontrolę stosuje się pożywkę VI bez dodatku źródła węgla (grupa VI).
    UWAGA: Bif EPS i skrobia są najpierw rozpuszczane w gorącej wodzie za pomocą mieszadła magnetycznego, a następnie mieszane z przygotowanym podłożem VI.
  3. Wszystkie media należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut i pozostawić do ostygnięcia do temperatury RT.
  4. Przenieść podpróbkę (5 ml) z każdej pożywki do probówek hodowlanych w inkubatorze beztlenowym i przechowywać pozostałe pożywki w temperaturze 4 °C.

4. Przygotowanie próbki kału ludzkiego

  1. Pobrać świeże próbki kału natychmiast po świeżym wypróżnieniu od zdrowych dorosłych ochotników za pomocą pojemników na kał, a następnie użyć do przygotowania gnojowicy.
    UWAGA: Przed pobraniem próbki wszyscy ochotnicy powinni zostać przebadani, aby upewnić się, że nie otrzymają antybiotyków, probiotyków ani terapii prebiotycznych przez co najmniej 3 miesiące przed oddaniem próbek. Ponadto wszyscy dawcy muszą wyrazić świadomą, pisemną zgodę.
  2. Przenieść świeżą próbkę kału (1 g) do 10 ml 0,1 M beztlenowego PBS (pH 7,0) do szklanych zlewek, a następnie użyć szklanych pałeczek do przygotowania 10% (w/v) zawiesiny.
  3. Użyj sita 0,4 mM, aby przefiltrować gnojowicę kałową. Następnie należy użyć podpróbki przefiltrowanej zawiesiny do zaszczepienia eksperymentów fermentacji w kulturach okresowych, a pozostałą część przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszych analiz.
    UWAGA: Kroki 4.2–4.3 przeprowadza się w komorze beztlenowej.

5. Fermentacja okresowa in vitro

  1. Dodać przefiltrowaną gnojowicę kałową (500 μl) do pożywki fermentacyjnej przygotowanej w kroku 3.2 w komorze beztlenowej, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C.
  2. Zebrać 2 ml sfermentowanych próbek po 24 godzinach i 48 godzinach w komorze beztlenowej, a następnie odwirować na zewnątrz komory przy 6 000 x g przez 3 minuty.
  3. Ostrożnie przenieść supernatanty do nowej probówki wirówkowej, która będzie używana do analizy degradacji polisacharydów i pomiarów krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA).
  4. Przechowywać granulki wirowania w temperaturze -80 °C, a następnie użyć do ekstrakcji bakteryjnego genomowego DNA.

6. EPS degradacja przez ludzką mikrobiotę kałową

  1. Załaduj 0,2 μl sfermentowanych supernatantów na wstępnie powlekane aluminiowe płytki z żelem krzemionkowym-60 TLC, a następnie wysusz w suszarce do włosów.
  2. Rozwiń płytki w 20 ml roztworu kwasu mrówkowego/n-butanolu/wody (6:4:1, v:v:v) i wysusz za pomocą suszarki do włosów.
  3. Namocz płytki w odczynniku orcinol do farbowania, a następnie wysusz za pomocą suszarki do włosów.
    1. Przygotuj odczynniki orcinolu, rozpuszczając 900 mg lichenolu w 25 ml wody destylowanej, a następnie dodając 375 ml etanolu. Następnie należy powoli dodawać stężony kwas siarkowy i dokładnie wymieszać roztwór.
  4. Podgrzej płyty w temperaturze 120 °C przez 3 minuty w piecu do pieczenia i oceń degradację EPS, mierząc pasma TLC.

7. Wpływ EPS na mikrobiotę jelitową człowieka

  1. Zamrozić i rozmrozić oryginalne próbki kału przygotowane w kroku 4.3 i próbki sfermentowane przygotowane w kroku 5.4.
  2. Wyodrębnij bakteryjne genomowe DNA (gDNA) ze wszystkich próbek za pomocą zestawu do ekstrakcji genomowego DNA bakteryjnego kału zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Określ stężenia, integralność i rozkład wielkości DNA za pomocą mikrospektrofotometru i elektroforezy w żelu agarowym.
  4. Przeprowadź PCR bakteryjnych genów 16S rRNA z wyekstrahowanego gDNA przy użyciu następujących wcześniej opisanych starterów do przodu i do tyłu12:
    -forward starter (starter z kodem kreskowym 338F): ACTCCTACGGGAGGCAGCA-starter
    odwrotny (806R): GGACTACHVGGGTWTCTAAT
    Użyj następujących warunków termocyklera:
    1. 94 °C przez 5 min.
    2. 94 °C przez 30 s.
    3. 55 °C przez 30 s.
    4. 72 °C przez 1 min.
    5. Powtórz 2-4 przez 35 cykli
    6. 72 °C przez 5 min.
    7. Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu wyjęcia z termocyklera.
  5. Przeprowadzanie wysokoprzepustowego sekwencjonowania produktów PCR w firmie zajmującej się sekwencjonowaniem DNA przy użyciu ultraprzepustowej analizy społeczności drobnoustrojów.
  6. Uzyskaj czyste, wysokiej jakości sekwencje, korzystając z potoku analizy sekwencji Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME), 13.
  7. Zdefiniuj operacyjne jednostki taksonomiczne (OTU) dla sekwencji genu 16S rRNA z podobieństwem nukleotydów większym niż 97%, korzystając z narzędzi bioinformatycznych, takich jak pakiet oprogramowania Mothur14.
  8. Wybierz reprezentatywną sekwencję z każdego OTU i użyj klasyfikatora RDP wraz z taksonomiczną bazą danych SILVA, aby sklasyfikować reprezentatywne sekwencje15.
  9. Oblicz zasięg Gooda, wskaźniki różnorodności alfa (w tym indeks Simpsona i Shannona) oraz bogactwo (obserwowaną liczbę OTU) za pomocą narzędzi bioinformatycznych16.

8. Wpływ EPS na produkcję SCFA przez ludzką mikrobiotę jelitową

  1. Dodać sfermentowane supernatanty (1 ml) przygotowane w kroku 5.3 do 2 ml probówek wirówkowych.
  2. Dodać 0,2 ml 25% (w/v) kwasu metafosforowego do każdej z próbek i dokładnie wymieszać roztwory przez wirowanie.
  3. Odwirować mieszaniny o stężeniu 13 000 x g przez 20 minut i przenieść supernatanty do świeżych probówek.
  4. Jednocześnie należy przygotować roztwory 120 mM kwasów octowego, propionowego, masłowego, izomasłowego, walerianowego i izowalerianowego. Następnie dodaj 1 ml każdego przygotowanego kwasu do 1,2 ml 25% (w/v) kwasu metafosforowego i użyj jako standardowych koktajli.
  5. Przefiltrować próbki za pomocą membrany 0,22 μM.
  6. Wykrywanie stężeń SCFA za pomocą wysokosprawnej chromatografii gazowej zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami11,17.
    UWAGA: Do chromatografii gazowej (GC) stosuje się kolumnę InertCap FFAP (0,25 mM x 30 m x 0,25 μM). Stężenia SCFA są następnie oznaczane ilościowo na podstawie powierzchni pików przy użyciu jednopunktowej metody wzorca wewnętrznego w pakiecie oprogramowania GC Solution.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Produkcję śluzowatego EPS można było zaobserwować w kulturach B. longum na płytkach PYG po inkubacji beztlenowej przez 72 godziny (Rysunek 1A). Odwirowanie zespolków hodowli, a następnie wytrącanie etanolu i suszenie, zaowocowało zebraniem celuloopodobnego EPS (Rysunek 1B). Suszony EPS i rozpuszczalna skrobia były następnie wykorzystywane jako źródła węgla w kulturach fermentacyjnych. TLC został użyty do separacji oligosacharydów i analizy czystości ze względu na niski kos...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatniej dekady poczyniono znaczne postępy w zrozumieniu składu i aktywności mikrobioty jelitowej człowieka. W wyniku tych badań pojawiła się koncepcja holobiontu, która reprezentuje interakcje między gospodarzami i powiązanymi społecznościami drobnoustrojów, na przykład między ludźmi a ich mikrobiotąjelitową 19,20. Co więcej, ludzie są nawet obecnie uważani za superorganizmy21, przy czym mikrobiota jelitowa została uznana za jede...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów. Dane te zostały przytoczone w Yin i wsp.Rozdział 11.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane przez Narodową Fundację Nauk o Przyrodzie Chin (nr 31741109), Fundację Nauk Przyrodniczych Hunan (nr 2018JJ3200) oraz program konstrukcyjny stosowanej dyscypliny charakterystycznej na Uniwersytecie Nauki i Inżynierii w Hunan. Dziękujemy LetPub (www.letpub.com) za pomoc językową podczas przygotowywania tego manuskryptu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,22 &mikro; m Filtry membranoweMilliporeSLGP033RBSłuży do filtrowania próbek
0,4 mm SitoThermo Fischer308080-99-1Służy do przygotowania próbek kału ludzkiego
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galaktopiranozyd (X-Gal)SolarbioX1010Służy do przygotowania płytki
kolorowej AceticSigma-Aldrich71251Próbka standardowa do agaru SCFA
SolarbioYZ-1012214Składnik średniej
komory beztlenowejElectrotek AW 400SGAutoklaw do hodowli i fermentacji bakterii
SANYOMLS-3750Służy do autoklawowania
soi BactoSigma-Aldrich70178Składnik pożywki
Piec do pieczeniaShanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240ASłuży do podgrzewania i pieczenia
ekstraktu z wołowinySolarbioG8270Składnik pożywki
Bifidobacterium longum ReuterATCCATCC® 51870™bakteria
Sole żółcioweSolarbioYZ-1071304Składnik podłoża
MasłowegoSigma-Aldrich19215Próbka wzorcowa do SCFA
CaCl2SolarbioC7250Roztwór soli średniej kolumny
kapilarnejSHIMADZU-GLInertCap FFAP (0,25 mm × 30 m × 0,25 μ m)Służy do wykrywania SCFA
Kazeina PeptonSigma-Aldrich39396Składnik pożywki
WirówkaThermo ScientificSorvall ST 8Służy do wirowania
CoSO4.7H2OSolarbioC7490Składnik pożywki
CuSO4.5H2OSolarbio203165Składnik pożywki
Cysteina-HClSolarbioL1550Składnik pożywki
EtanolSigma-AldrichE7023Służy do przygotowania witaminy K1
FeSO4.7H2OSolarbioYZ-111614Składnik pożywki
kwasu mrówkowegoSigma-Aldrich399388Używany do chromatografii
gazowejShimadzu CorporationGC-2010 PlusUżywany do wykrywania SCFA
Szklana zlewkaFisher ScientificFB10050Używany do przygotowania gnojowicy
GlukozaSolarbioG8760Składnik podłoża
HaeminSolarbioH8130Składnik pożywki
HClSigma-Aldrich30721Roztwór podstawowy stosowany do regulacji pH
IzomasłowySigma-Aldrich46935-UPróbka wzorcowa dla SCFA
Kwasy izowaleriankoweSigma-Aldrich129542Próbka wzorcowa dla SCFA
K2HPO4SolarbioD9880Roztwór soli pożywki
KClSolarbioP9921Składnik podłoża
KH2PO4SolarbioP7392Roztwór soli podłoża
LiCl.3H2OSolarbioC8380Służy do przygotowania kolorowej płytki
Ekstrakt mięsnySigma-Aldrich-Aldrich70164Składnik pożywki
Kwas metafosforowySigma-AldrichB7350Próbka wzorcowa dla SCFA
MgCl2,6H2OSolarbioM8160Składnik pożywki
MgSO4,7H2OSolarbioM8300Roztwór soli pożywki
systemu MISEQIlluminaMiSeq 300PEsekwencjonowanie DNA
systemu MnSO4. H20Sigma-AldrichM8179Roztwór soli podłoża
MupirocynaSolarbio YZ-1448901Antybiotyk
NaClSolarbioYZ-100376Roztwór soli podłoża
NaHCO3Sigma-Aldrich792519Roztwór soli podłoża
NanoDrop ND-2000NanoDrop TechnologiesND-2000Oznaczanie stężeń DNA
NaOHSigma-Aldrich30620Podstawowy roztwór stosowany do regulacji pH
n-butanolChemSpider71-36-3Używany do TLC
NiCl2Solarbio746460Składnik podłoża
OrcinolSigma-Aldrich447420Służy do przygotowania odczynników
orcynowychPropionicSigma-Aldrich94425Standardowa próbka do SCFA
QIAamp DNA Stool Mini KitQIAGEN51504Ekstrakt z bakteryjnego genomowego DNA
Gotowy do użycia proszek PBSSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A610100-0001Służy do przygotowania zawiesiny lipidowej
ResazurinSolarbioR8150Sprzęt beztlenowy
Szybki koncentrator próżniLABCONCOCentriVapSłuży do przygotowania styropianów
SkrobiaSolarbioYZ-140602Zastosowanie do źródła węgla
Kwas siarkowySigma-Aldrich150692Służy do przygotowania odczynników
T100 PCRBIO-RADAmplifikacja PCR
Arkusze aluminiowe TLCMerckMillipore116835Używany do TLC
Tryptikaza PeptonSigma-AldrichZ699209Składnik pożywki
TryptonSigma-AldrichT7293Składnik pożywki
Tween 80SolarbioT8360Roztwór soli podłoża
ValericSigma-Aldrich75054Standardowa próbka dla SCFA
Witamina K1Sigma-AldrichV3501Składnik średniego
oscylatora VortexScientific IndustriesVortex.Genie2Służy do wirowania
ekstraktu drożdżowegoSigma-AldrichY1625Składnik pożywki
ZnSO4.7H2OSigma-AldrichZ0251Składnik medium
TLC orcynowych 1861096

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81(2018).
  2. Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309(2017).
  3. Arora, T., Bäckhed, F. The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives. Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).
  4. Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome. Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).
  5. Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).
  6. Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora. ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).
  7. Taguer, M., Maurice, C. The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).
  8. Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. A. Xenobiotic metabolism and gut microbiomes. PLoS One. 11 (10), e0163099(2016).
  9. Koppel, N., Rekdal, V. M., Balskus, E. P. Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota. Science. 356 (6344), 1246-1257 (2017).
  10. Hidalgo-Cantabrana, C., et al. Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 9-18 (2014).
  11. Liu, G., et al. Effects of bifidobacteria-produced exopolysaccharides on human gut microbiota in vitro. Applied Microbiology and Biotechnology. , 1-10 (2018).
  12. Tang, R., et al. Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy. Gut. 67 (3), 534-541 (2018).
  13. Kuczynski, J., et al. Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities. Current Protocols in Microbiology. 27 (1), 1-28 (2012).
  14. Hiltemann, S. D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur. GigaScience. , giy166 (2018).
  15. Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).
  16. Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).
  17. Bai, S., et al. Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota. Plos One. 12 (2), e0171576(2017).
  18. Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides. Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).
  19. Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis. Microbiome. 7 (5), (2019).
  20. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system. Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).
  21. Kramer, P., Bressan, P. Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior. Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).
  22. Malfertheiner, P., Nardone, G. Gut microbiota: the forgotten organ. Digestive Diseases. 29 (6), (2011).
  23. Andoh, A. The gut microbiota is a new organ in our body. The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).
  24. Mika, A., Van, W. T., González, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats. PLoS One. 10 (5), e0125889(2015).
  25. Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
  26. Takagi, R., et al. A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics. PLoS One. 11 (8), e0160533(2016).
  27. Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference. Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Endobiotics Gut MicrobiotaIn Vitro FermentationBifidobacterial EPSThin Layer ChromatographyGas Chromatography16S rRNA SequencingShort Chain Fatty AcidsAnaerobic IncubationFecal Sample PreparationPolysaccharide Degradation

Related Articles