Eksperymentalna analiza apoptotycznego pochłaniania tymocytów przez makrofagi

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania apoptotycznych tymocytów i makrofagów otrzewnowych oraz analizy skuteczności efferocytozy i specyficznego blokowania apoptotycznych tymocytów za pośrednictwem inhibitorów. Protokół ten ma szerokie zastosowanie w usuwaniu innych cząstek, w tym sztucznych kulek i bakterii, za pośrednictwem komórek.

Streszczenie

Apoptoza komórek jest naturalnym procesem i odgrywa kluczową rolę w rozwoju embrionalnym, regulacji homeostazy, indukcji tolerancji immunologicznej i rozwiązywaniu stanów zapalnych. Nagromadzenie resztek apoptotycznych w organizmie może wywołać przewlekłe reakcje zapalne, które z czasem prowadzą do ogólnoustrojowych chorób autoimmunologicznych. Upośledzony klirens komórek apoptotycznych jest związany z różnymi chorobami autoimmunologicznymi. Klirens apoptotyczny jest złożonym procesem rzadko wykrywanym w warunkach fizjologicznych. Obejmuje obfite receptory powierzchniowe i cząsteczki sygnałowe. Badanie procesu apoptotycznego usuwania komórek dostarcza wnikliwych mechanizmów molekularnych i późniejszych odpowiedzi biologicznych, które mogą prowadzić do opracowania nowych terapii. W tym miejscu opisujemy protokoły indukcji apoptotycznych tymocytów, przygotowania makrofagów otrzewnowych oraz analizy apoptotycznego klirensu komórek za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii. Wszystkie komórki ulegną apoptozie na pewnym etapie, a wiele komórek mieszkalnych i krążących może wchłonąć resztki apoptozy. Dlatego opisany tutaj protokół może być używany w wielu aplikacjach do charakteryzowania apoptotycznego wiązania komórek i przyjmowania przez wiele innych typów komórek.

Wprowadzenie

Nasze ciało wytwarza codziennie 1-10 miliardów komórek apoptotycznych. Tak duża liczba komórek apoptotycznych musi zostać usunięta w taki sposób, aby odpowiedzi immunologiczne pozostały w stanie spoczynku. Aby zapewnić usuwanie komórek apoptotycznych w odpowiednim czasie, wiele typów komórek rezydujących w tkance i komórek krążących rozwija mechanizmy pochłaniania komórek apoptotycznych¹. Dysfunkcyjna regulacja apoptozy jest związana z powstawaniem i progresją różnych chorób zapalnych i autoimmunizacji². Apoptoza odgrywa również kluczową rolę w patogenezie rozwoju raka i jego późniejszej oporności na konwencjonalne metody leczenia^3,4. Usunięcie komórek apoptotycznych na ogół sprzyja reakcji przeciwzapalnej, która może być związana z tolerancją immunologiczną⁵. Zaburzenie apoptotycznego klirensu komórek napędza samoimmunizację i przyczynia się do rozwoju ogólnoustrojowych chorób autoimmunologicznych zarówno u ludzi, jak i u myszy⁶.

Gdy komórki przechodzą apoptozę, wystawiają fosfatydyloserynę (PtdSer) z wewnętrznej ulotki na zewnętrzną listkę błony. PtdSer zostanie wtedy rozpoznany przez fagocyty poprzez receptory powierzchniowe. Zidentyfikowano ponad tuzin receptorów, które rozpoznają i/lub ułatwiają pochłanianie komórek apoptotycznych. Ogólnie rzecz biorąc, istnieją co najmniej trzy typy receptorów powierzchniowych zaangażowanych w apoptotyczne usuwanie komórek: receptory uwięziowe, rozpoznawanie komórek apoptotycznych; łaskotanie receptorów, inicjują pochłonięcie; receptory opiekuńcze, ułatwiają cały proces7. Kinazy tyrozynowe receptora TAM (TAM RTKs) składają się z Tyro-3, Axl i Mer i są głównie wyrażane przez komórki szpikowe układu odpornościowego⁸. Podstawową funkcją TAM RTK jest służenie jako receptory wiążące, ułatwiające fagocytarne usuwanie komórek apoptotycznych i zanieczyszczeń. Nasza grupa od wielu lat bada apoptotyczny klirens komórek za pośrednictwem TAM w warunkach autoimmunizacji. Zależne od witaminy K białko zatrzymuje wzrost specyficznego białka 6 (Gas6) i białka S (ProS) i aktywuje je i aktywuje receptory TAM^9,10. Gas6 jest wytwarzany w sercu, nerkach i płucach. ProS jest produkowany głównie w klasie liver11. TAM rozpoznaje komórki apoptotyczne w taki sposób, że N-koniec Gas6 / ProS wiąże się z PtdSer na komórce apoptotycznej, a C-koniec Gas6 / ProS wiąże się z receptorami TAM, które są zakotwiczone na powierzchni fagocytów. Wraz z innymi receptorami następuje pochłonięcie komórek apoptotycznych¹². Chociaż Mer może wiązać się zarówno z ligandami ProS, jak i Gas6, odkryliśmy, że Gas6 wydaje się być jedynym ligandem dla fagocytozy komórek apoptotycznych makrofagów, w której pośredniczy Mer, które mogą być blokowane przez przeciwciało anty-Mer¹³. Makrofagi to profesjonalne fagocyty. Szybkie usuwanie komórek apoptotycznych przez makrofagi jest ważne dla hamowania stanu zapalnego i odpowiedzi autoimmunologicznych przeciwko antygenom wewnątrzkomórkowym. Kinaza tyrozynowa receptora Mer ma kluczowe znaczenie dla pochłaniania makrofagów i skutecznego usuwania komórek apoptotycznych¹⁴. W śledzionie myszy Mer ulega ekspresji głównie w strefie brzeżnej i namacalnym ciele makrofagów¹³.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje podstawową metodę indukowania apoptozy komórek i demonstruje sposoby pomiaru procesu i skuteczności efferocytozy. Protokoły te można łatwo dostosować do badania efferocytozy przez inne typy komórek w pochłanianiu komórek apoptotycznych różnego pochodzenia.

Protokół

Eksperymentalne myszy były hodowane i utrzymywane w naszej kolonii myszy. Wszystkie prace na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu w Cincinnati.

1. Przygotowanie apoptotycznych tymocytów oznaczonych znakiem CFSE

1. Poddaj eutanazji dwie naiwne myszy C57 / B6 przez wdychanie CO₂ przez 10 minut i przeprowadź sekcję w celu otwarcia jamy klatki piersiowej, usuń (wyciągnij) grasicę za pomocą zakrzywionych kleszczy z cienką końcówką na szalkę Petriego do hodowli tkankowej zawierającej 10 ml pożywki RPMI1640.
2. Zawiesinę jednokomórkową należy uzyskać, mieląc całą grasicę na dwóch matowych końcach szkiełek mikroskopowych, a następnie przefiltrować zawiesinę przez sitko o wielkości 100 μm.
3. Zebrać 10 ml zawiesiny grasicy do probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy sile 300 x g przez 5 minut.
4. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić w 40 ml 1x PBS i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
5. Wirować przy 300 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
6. Zawiesić w 20 ml 1x PBS w probówce 50 ml jako zawiesinę jednokomórkową z maksymalnie 2 x 10⁸ komórek (jeśli więcej niż 2 x 10⁸ komórek, ponownie zawieś resztę komórek w innych 20 ml 1 x PBS w innej probówce 50 ml).
7. Przygotować 5 μM CFSE w równej objętości (20 ml) 1x PBS w oddzielnej probówce o pojemności 50 ml, pipetując 40 μl roztworu podstawowego CFSE (2,5 mM) do 20 ml 1x PBS i dobrze wymieszać, odwracając probówkę 2 - 3 razy.
8. Dodaj 20 ml CFSE z kroku 1.7 do 20 ml zawiesiny komórek z kroku 1.6 (końcowe stężenie CFSE wynosi teraz 2,5 μM).
   UWAGA: Na każde 20 ml zawiesiny komórek potrzebne jest 20 ml probówki CFSE.
9. Odwrócić komórkę i probówkę z mieszaniną CFSE 2-3 razy i inkubować mieszaninę w ciemności w temperaturze pokojowej przez maksymalnie 2 minuty, a następnie zatrzymać reakcję przez dodanie 10 ml inaktywowanej termicznie surowicy końskiej.
10. Odwirować mieszaninę probówek o pojemności 50 ml przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Jeśli oznakowanie CFSE się powiedzie, granulki komórek staną się jasnożółte.
11. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 40 ml 1x PBS i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
12. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
13. Ponownie przemyć osad komórkowy 40 ml RPMI1640 podłoża.
14. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą pożywki do hodowli tkankowej RPMI1640 (RPMI1640, 20 mM HEPES, 10% FBS (inaktywowany termicznie), 20 mM glutaminy i 1x Pen/Strep) w stężeniu 7 x 10⁶ komórek/ml w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm.
    UWAGA: Jeśli uzyska się więcej komórek, potrzebne będzie oddzielne naczynie do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm.
15. Dodać staurosporynę do hodowli zawiesiny komórkowej o końcowym stężeniu 1 μM i hodować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych zasilanym 5% CO₂ .

2. Przygotowanie makrofagów otrzewnowych

1. Wstrzyknąć dwóm myszom C57B6 (lub dowolnym myszom manipulowanym genami w laboratorium) dootrzewnowo 1 ml 3% dojrzałego tioglikolanu w dniu 0.
2. Poddaj myszy eutanazji w 5 dniu, jak w kroku 1.1, odetnij i obierz skórę brzucha, pozostawiając nienaruszoną otrzewną. Przepłukać jamę otrzewnej, szybko wtłaczając 10 ml buforu do przemywania (RPMI1640, 2% FBS, 0,04% EDTA) do jamy otrzewnej za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml dołączonej do igły 18 G.
3. Powoli pobrać bufor do przemywania za pomocą tej samej igły/strzykawki i zebrać bufor do płukania do probówki o pojemności 50 ml (szczegóły w artykule laboratorium Janssen¹⁵).
4. Przemyć zgłębnik otrzewnowy dwukrotnie 1x PBS, ponownie zawiesić makrofagi otrzewnej w pożywce do hodowli tkankowych RPMI1640 gęstości 2 x 10⁶ komórek/ml i podwielokrotności 500 μl do każdej studzienki płytki 24-dołkowej. Pozostawić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych na 2 godziny.
5. Usunąć pływające komórki, dwukrotnie odsysając i zastępując 500 μl świeżej pożywki hodowlanej.
6. Opcjonalnie dodać inhibitor tyrozyny receptora TAM, RXDX-106, w stężeniach wskazanych na rysunku do każdej studzienki kultury makrofagów i inkubować przez kolejne 2 godziny.

3. Współhodowla makrofagów otrzewnowych z apoptotycznym tymocytami

1. Zbierz apoptotyczne tymocyty z kroku 1 i przemyj trzy razy RPMI1640 pożywką. Skuteczność indukcji apoptotycznej można zmierzyć na tym etapie za pomocą zestawu Annexin V/7-AAD.
2. Rozmieść 0 - 12 x 10⁶ komórek (w pożywce 500 μl) do każdej studzienki kultur makrofagów z protokołu #2, zgodnie z układem eksperymentalnym (np. patrz rysunek 1). To sprawia, że cała objętość kultury wynosi 1 ml w każdym dołku 24-dołkowej płytki. Dodaj przeciwciało blokujące do kultury bezpośrednio przed dodaniem apoptotycznych tymocytów.
3. Hodować mieszaninę komórek w temperaturze 37 °C przez 4 godziny w inkubatorze do hodowli tkankowych zasilanym 5%_CO2
.
4. Przemyć każdą studzienkę hodowli 1x PBS (zawierającym 500 μM EDTA) dwukrotnie, aby usunąć swobodnie pływające komórki apoptotyczne.
5. Na tym etapie wybarwić makrofagi związane z płytką CD11b-PE.
   1. Makrofagi związane z płytką przemyć raz buforem barwiącym (1x PBS, 1% BSA).
   2. Do każdej studzienki dodać 200 μl buforu barwiącego zawierającego 2 μl CD11b-PE.
   3. Inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
   4. Umyj każdą studzienkę płytki trzykrotnie buforem barwiącym.
   5. Dodać 200 μl buforu barwiącego i przystąpić płytkę do analizy obrazu pod mikroskopem fluorescencyjnym.
6. Alternatywnie, odłączyć makrofagi związane z płytką, dodając 1 ml 1% lidokainy do PBS i inkubując przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
7. Odłączyć makrofagi związane z płytką, powtarzając pipetowanie.
8. Przenieść zawiesinę makrofagów do pojedynczej okrągłodennej probówki FACS o pojemności 5 ml z każdej studzienki 24-dołkowej płytki.
9. Wirować przy 300 x g przez 5 min.
10. Usunąć supernatant i dodać 200 μl buforu barwiącego zawierającego 2 μl CD11b-PE (rozcieńczenie w buforze barwiącym w stosunku 1:200).
11. Zawiesinę komórkową inkubować w buforze barwiącym w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
12. Zawiesinę komórkową przemyć dwukrotnie buforem barwiącym.
13. Dodać 200 μl buforu barwiącego i przystąpić do analizy FACS za pomocą cytometru przepływowego i przeanalizować pod kątem procentowej zawartości makrofagów CFSE.

Wyniki

Analiza procesu pochłaniania apoptotycznych tymocytów przez makrofagi otrzewne. Makrofagi otrzewnowe oraz komórki apoptotyczne przygotowano i poddano współhodowli zgodnie z opisem w protokole. Makrofagi ododerwano i barwiono przeciwciałem anty-CD1b koniugowanym z PE przez 20 min w temperaturze 0°C. Następnie makrofagi przemyto i poddano analizie w cytometrze przepływowym. Jak widać, w prawym dolnym kwadrancie nie występuje żaden makrofag wykazujący pozytywny wynik dla CFSE w przypadku, gdy do hodowli nie...

Dyskusja

Apoptoza to wysoce konserwatywny proces śmierci komórki, który obejmuje wiele kaskad sygnałowych i indukuje ekspresję, wydzielanie i transport białek. Apoptoza jest często związana ze zmianami morfologii komórek¹⁷. Komórki apoptotyczne aktywnie uwalniają cytokiny i chemokiny, które przyciągają fagocyty do migracji do miejsca i inicjują proces pochłaniania, niezwykle złożoną ścieżkę pod ścisłą^kontrolą. Z drugiej strony, martwicza śmierć komórki uwalnia sygnały niebezpieczeńs...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor elizujący	GIBCO	A10492
Aneksyna V/7-AAD	BD Pharmingen	559763
Przeciwciało antymerowe	R& D Systems	BAF591
CD11b-PE (klon M1/70)	BD Pharmingen	553311
CFSE	Invitrogen	C1157
DMSO	Sigma-Aldrich	D-2650
EDTA (0,5 mM)	GIBCO	15575-020
Rurki FACS	BD Biosciences	352017
Szkiełka szronione	Fisher Scientific	12-552-343
Surowica końska (inaktywowana termicznie)	Invitrogen	26050088
Lidokaina	Sigma-Aldrich	L-5647	Przygotuj 1% bufor w 1x PBS
PBS, 1x	Corning	21040CV
RPMI-1640	Corning	10040CV
RXDX-106	Selleck Chemicals	-40783
Staurosprine (100mg)	Fisher Scientific	BP2541-100	Dodaj 214,3 ml DMSO do 100mg, aby uzyskać 1mM roztwór pończochowy
Tioglikolan Medium Brewer Modified	BD Biosciences	243010	Przygotuj 3% bufor tioglikolanowy w 1´ PBS, sterylizowany w autoklawie i przechowywany w ciemności przez 3 miesiące.