Artykuł metodologiczny

Ocena interakcji białko-białko przy użyciu techniki trawienia na błonie

DOI:

10.3791/59733

⸱

19 lipca 2019

 ,  ,  ,  , 
1Division of Biological Chemistry, Department of Molecular Biology, Showa University School of Pharmacy, 2Department of Biochemistry, Showa University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół techniki trawienia na błonie do przygotowania próbek do spektrometrii mas. Technika ta ułatwia wygodną analizę oddziaływań białko-białko.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liczne białka wewnątrzkomórkowe fizycznie oddziałują na siebie zgodnie z ich wewnątrzkomórkowymi i zewnątrzkomórkowymi warunkami. Rzeczywiście, funkcje komórkowe w dużej mierze zależą od wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko. Dlatego badania nad tymi interakcjami są niezbędne do ułatwienia zrozumienia procesów fizjologicznych. Współstrącanie powiązanych białek, a następnie analiza za pomocą spektrometrii mas (MS), umożliwia identyfikację nowych interakcji białkowych. W tym badaniu przedstawiliśmy szczegółowe informacje na temat nowej techniki analizy immunoprecypitacji z chromatografią cieczową (LC)-MS / MS w połączeniu z trawieniem na błonie w celu analizy interakcji białko-białko. Technika ta jest odpowiednia dla surowych leków immunoprecypitacyjnych i może poprawić wydajność analiz proteomicznych. Oznaczone białka rekombinowane wytrącono przy użyciu specyficznych przeciwciał; Następnie immunoprecypitanty osuszone na kawałkach membrany z polifluorku winylidenu poddano redukcyjnej alkilacji. Po trypsynizacji strawione reszty białkowe analizowano za pomocą LC-MS/MS. Korzystając z tej techniki, byliśmy w stanie zidentyfikować kilka potencjalnych białek powiązanych. W związku z tym metoda ta jest wygodna i przydatna do charakteryzowania nowych interakcji białko-białko.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż białka odgrywają istotną rolę w organizmach żywych, są one nieustannie syntetyzowane, przetwarzane i degradowane w środowisku wewnątrzkomórkowym. Co więcej, białka wewnątrzkomórkowe często oddziałują fizycznie i biochemicznie, co wpływa na funkcję jednego lub obu1,2,3. Na przykład bezpośrednie wiązanie homologu białka związanego ze spliceosomami CWC22 z eukariotycznym czynnikiem inicjacji translacji 4A3 (eIF4A3) jest niezbędne do złożenia kompleksu złączy eksonowych4. W związku z tym, mutant eIF4A3, który nie ma powinowactwa do CWC22, nie ułatwia splicingu mRNA sterowanego kompleksem złącza eksonowego4. W związku z tym badanie interakcji białek ma kluczowe znaczenie dla precyzyjnego zrozumienia regulacji fizjologicznej, a także funkcji komórkowych.

Ostatnie osiągnięcia w spektrometrii mas (MS) zostały zastosowane do kompleksowej analizy interakcji białko-białko. Na przykład współprecypitacja białek endogennych lub egzogennie wprowadzonych białek znakowanych wraz z powiązanymi z nimi białkami, a następnie analiza MS, umożliwia identyfikację nowych interakcji białkowych5. Jednak jednym z głównych wąskich gardeł w analizie stwardnienia rozsianego/stwardnienia rozsianego jest słaby odzysk próbek białek po tryptycznym trawieniu. Do przeprowadzania analiz proteomicznych na lizatach komórkowych stosuje się na ogół techniki trawienia w żelu i na błonie w celu przygotowania próbek MS/MS. Wcześniej porównaliśmy procedurę trawienia w żelu z techniką trawienia na błonie6 i wykazaliśmy, że ta ostatnia wiązała się z lepszym pokryciem sekwencji. Membrana z polifluorku winylidenu (PVDF) może być odpowiednia do tego celu, ponieważ jest mechanicznie wytrzymała i odporna na wysokie stężenia rozpuszczalników organicznych7,8, umożliwiając enzymatyczne trawienie unieruchomionych białek w obecności 80% acetonitrylu9. Co więcej, unieruchomienie błony może indukować zmiany konformacyjne w białkach docelowych, prowadząc do poprawy wydajności trawienia tryptycznego10. W związku z tym w tym artykule opisaliśmy zastosowanie analizy interakcji białek metodą immunoprecypitacji-LC/MS/MS przy użyciu techniki trawienia na błonie. Ta prosta metoda ułatwia wygodną analizę oddziaływań białko-białko nawet w niespecjalistycznych laboratoriach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Immunoprecypitacja

UWAGA: Użyliśmy buforu do lizy bez dodecylosiarczanu sodu (SDS) i elucji cytrynianu, jak opisano w poniższych sekcjach. Jednak zastosowanie alternatywnej techniki immunoprecypitacji we własnym zakresie może być również stosowane do przygotowania próbek LC-MS/MS.

  1. Transfekcja komórek hodowlanych z wektorami kodującymi sam znacznik epitopu lub białko fuzyjne. Aby uzyskać reprezentatywne dane, przenieś komórki J774 (1 x 106) z wektorami kodującymi samo białko zielonej fluorescencji (GFP) lub Capn6 (gen kalpainy-6) z fuzją GFP za pomocą liposomów kationowych.
  2. Sprzężone przeciwciało z kulkami magnetycznymi.
    1. W tym celu należy zmieszać przeciwciało anty-GFP (2 μL/reakcję) z kulkami magnetycznymi (25 μL/reakcję) w 500 μL buforu fosforanu cytrynianu (24,5 mM kwasu cytrynowego, 51,7 mM dwuzasadowego fosforanu sodu; pH 5,0) w probówce o pojemności 1,5 ml.
    2. Obracaj mieszaninę z prędkością 50 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie trzykrotnie przemyć kulki sprzężone z IgG buforem fosforanowo-cytrynianowym zawierającym 0,1% monolaurynianu polioksyetylenosorbitolu (20).
  3. Poddać lizie transfekowane komórki przy użyciu odpowiedniego buforu do lizy. W celu uzyskania reprezentatywnych danych poddać transfekowane komórki lizie przez 30 minut na lodzie w 400 μl buforu do lizy (50 mM Tris-HCl; pH 7,5, 120 mM NaCl, 0,5% eteru poli(oksyetelenowego) oktylofenylowego) zawierającego 40 μmol/l fluorku fenylometylosulfonylu, 50 μg/ml leupeptyny, 50 μg/ml aprotyniny, 200 μmol/l ortowanadanu sodu, i 1 mM kwasu tetraoctowego glikolu etylenowego (EGTA) w probówkach o pojemności 1,5 ml 24 godziny po transfekcji.
  4. Oczyścić lizat przez odwirowanie przy 15 000 x g przez 5 minut i zebrać supernatant.
  5. Wstępnie oczyścić lizat. Dodaj nieoznakowane kulki magnetyczne (25 μl/reakcję) do probówki o pojemności 1,5 ml. Przemyć kulki trzykrotnie 500 μl buforu fosforanowo-cytrynianowego. Po usunięciu buforu fosforanu cytrynianu w końcowym płukaniu, dodać lizat komórkowy na kulki magnetyczne. Obracaj mieszaninę za pomocą rotatora z prędkością 50 obr./min przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 5 minut w celu separacji magnetycznej i zbierz lizat komórkowy. Zaleca się stosowanie stojaka magnetycznego wyznaczonego przez producenta.
  7. Zwiąż docelowe białka ze sprzężonymi kulkami. Umieść kulki sprzężone z immunoglobuliną (Ig)G na stojaku magnetycznym na 5 minut w celu separacji magnetycznej, wyrzuć bufor cytrynianu, a następnie dodaj lizat komórkowy do oddzielonych kulek.
  8. Obracaj mieszaninę z prędkością 50 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  9. Oddzielić białka docelowe od wolnych białek niebędących celem. Przemyć kulki trzykrotnie za pomocą 500 μl buforu fosforanowo-cytrynianowego zawierającego 0,1% monolaurynianu polioksyetylenosorbitolu (20). Po ostatnim płukaniu dodać 30 μl buforu cytrynianowego (pH 2-3) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu wymycia docelowych białek.
    UWAGA: Jeśli rekonwalescencja po immunoprecypitacji jest niewystarczająca, zastosowanie alternatywnych znaczników epitopów, takich jak FLAG lub HIS, może poprawić skuteczność. Jeżeli skuteczność elucji jest niewystarczająca, zastosowanie innych eluantów, takich jak roztwór na bazie karty charakterystyki, może poprawić wydajność.

2. Trawienie białek na błonie

UWAGA: Używanie materiałów i sprzętu bez białek jest konieczne, aby uniknąć zanieczyszczenia białkami egzogennymi. Ponadto zaleca się, aby operator nosił maskę chirurgiczną i rękawice, aby uniknąć zanieczyszczenia ludzkimi białkami.

  1. Pokrój membrany PVDF na kawałki o wymiarach 3 mm x 3 mm za pomocą nożyczek chirurgicznych, które zostały przetarte metanolem i wysuszone bezpośrednio przed użyciem.
  2. Dodaj 2–5 μl etanolu na kawałki membrany PVDF na czystej folii aluminiowej.
  3. Przed całkowitym wyschnięciem dodaj eluant (po 2–5 μl, 4–6 sztuk na próbkę) na hydrofilowe membrany PVDF, a następnie wysusz membrany na powietrzu, aż powierzchnia membrany stanie się matowa. Wysuszone membrany można przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Przenieś wszystkie membrany do plastikowych probówek o pojemności 1,5 ml, dodaj 20–30 μl etanolu, aby membrany stały się hydrofilowe, a następnie usuń etanol za pomocą pipety.
  5. Zanim membrana całkowicie wyschnie, dodać 200 μl roztworu reakcyjnego na bazie ditiotreitolu (DTT) (80 mM NH4HCO3, 10 mM DTT i 20% acetonitrylu) i inkubować w temperaturze 56 °C przez 1 godzinę.
  6. Zastąp roztwór reakcyjny 300 μl roztworu jodoacetamidu (80 mM NH4HCO3, 55 mM jodoacetamidu i 20% acetonitrylu) i inkubuj przez 45 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  7. Przemyć membrany dwukrotnie 1 ml wody destylowanej i raz 1 ml 2% acetonitrylu przez mieszanie wirowe przez >10 s.
  8. Rozpuścić liofilizowaną trypsynę klasy MS (tabela materiałów) bezpośrednio w roztworze reakcyjnym (30 mM NH4HCO3 zawierającym 70% acetonitrylu). Dodać 100 μl roztworu reakcyjnego zawierającego 1 μg trypsyny (tabela materiałów) (30 mM NH4HCO3 zawierającego 70% acetonitrylu) i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  9. Przenieść roztwór reakcyjny zawierający trawienie tryptyczne do czystej probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety.
  10. Dodać 100 μl roztworu do przemywania (70% acetonitrylu/1% kwasu trifluorooctowego) do membrany i inkubować w temperaturze 60 °C przez 2 godziny. Zebrać roztwór do przemywania i wymieszać go z roztworem reakcyjnym. Dodaj kolejne 100 μl roztworu myjącego do membrany i poddaj ją sonikacji przez 10 minut. Następnie zebrać roztwór do przemywania i wymieszać z roztworem reakcyjnym.
  11. Przykryj probówkę kawałkiem folii laboratoryjnej i wykonaj kilka małych otworów igłą. Wysuszyć roztwór za pomocą koncentratora próżniowego.
  12. Pozostałość rozpuścić w 10 μl 0,2% kwasu mrówkowego. Po odwirowaniu (12 000 × g, 3 min w temperaturze pokojowej) przenieść supernatant do probówki z próbką.
    UWAGA: Pranie jest krytycznym etapem tej sekcji. Podczas trawienia białek na błonie, płukanie błon zawierających unieruchomione białka po redukcji i alkilacji wodą destylowaną, a następnie 2% acetonitrylem, przez ponad 10 sekund każde, ma kluczowe znaczenie dla usunięcia odczynników.

3. Analiza LC–jonizacja elektronatryskowa (ESI)-MS/MS

  1. Aktywuj instrument ESI-MS/MS (Tabela materiałów) sprzężony z systemem nano-LC HPLC (Tabela materiałów). Połącz kolumnę wstępną (Tabela materiałów) i kolumnę analityczną (Tabela materiałów).
  2. Przed analizą należy skalibrować spektrometr masowy przy użyciu tryptycznych trawień albuminy surowicy bydlęcej rozpuszczonej w 0,2% kwasie mrówkowym, który dostarcza standardowych peptydów.
  3. Analizuj próbki w trybie jonów dodatnich i w zakresie masowym 400–1 250 m/z, a następnie uzyskaj do 10 widm MS/MS (100 ms każde) o zakresie masowym 100–1600 m/z i gradientzie liniowym 2%–80% acetonitrylu i 0,2% kwasu mrówkowego przez 80 minut przy natężeniu przepływu 300 nL/min.
  4. Przeanalizuj dane wyjściowe za pomocą oprogramowania do identyfikacji białek (Tabela materiałów) w celu zidentyfikowania potencjalnych białek stowarzyszonych. W celu pozytywnej identyfikacji białka kandydującego wymagane jest wykrycie co najmniej jednego fragmentu peptydu o wysokiej wierności (> 95% wierności).
  5. Pomiń białka, które są podobnie wytrącone w lizatach eksprymujących GFP (transfekcja wektora wyrażającego sam znacznik GFP) z listy białek kandydujących.
    UWAGA: Jeśli w analizie bazy danych zostanie zidentyfikowanych kilka białek, modyfikacja warunków akwizycji MS/MS (np. zmiana czasu z 100 ms każde na 50 ms każdy) może zwiększyć liczbę zidentyfikowanych białek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Za pomocą wyżej opisanej procedury, immunoprecypitanty zostały przeanalizowane za pomocą LC-MS/MS (Rysunek 1). Po wykluczeniu białek pochodzących z egzogennego pochodzenia (białka innych gatunków i IgG), 17 białek zidentyfikowano w immunoprecypitantach związanych z kalpainą-6 (Tabela 1), a 15 białek zidentyfikowano w immunoprecypitantach związanych z GFP (Tabela 2). Spośród białek związanych z kalpainą-6 i GFP, 11 zidentyfiko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wcześniej opisaliśmy analizę oksydacyjnych modyfikacji apolipoproteiny B-100 w utlenionej lipoproteinie o niskiej gęstości przy użyciu LC-MS / MS poprzedzonej techniką trawienia na błonie6. W niniejszym badaniu połączyliśmy tę technikę z immunoprecypitacją i zidentyfikowaliśmy kilka białek związanych z kalpainą-6. Ta nowatorska technika stanowi wygodną metodę badań przesiewowych pod kątem potencjalnych białek stowarzyszonych. Calpain-6 jest nieproteolitycznym członkiem rodziny proteolitycznej kalp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było częściowo wspierane przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki KAKENHI Grant numer 17K09869 (do AM), Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki KAKENHI Grant numer 15K09418 (do TM), grant badawczy od Kanehara Ichiro Medical Science Foundation oraz grant badawczy od Suzuken Memorial Foundation (wszystkie dla TM).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetonitrylWako014-00386
Kwas cytrynowyWako030-05525
DiNAKYA Tech Co.Wysokosprawna chromatografia cieczowa nanoflow
DiNa AIKYA Tech Co.Wysokosprawna chromatografia cieczowa nanoflow wyposażona w autosampler
DTTNacalai tesque14112-94
Dynabeads białko GThermo Fisher Scientific10003D
Kwas mrówkowyWako066-00461
HiQ Sil C18W-3KYA Tech Co.E03-100-1000,10 mmID * 100 mm
L JodoacetamidWako095-02151
Lipofectamina 3000Thermo Fisher ScientificL3000008
Living Colors Przeciwciało monoklonalne AV (JL-8)Clontech632380
NaClWako191-01665
NH4HCO3Wako018-21742
Nonidet P-40SigmaN6507poli(oksyetelen) eter oktylofenylowy (n = 9)
peptydstandard KYA Tech Co.tBSA-04tryptyczne trawienie albuminy surowicy bydlęcej
w fiolce PPKYA Tech Co.03100Splastikowa probówka na próbkę
Inhibitor proteazy CooctailOprogramowanie SigmaP8465
ProteinPilotOprogramowanie Sciex5034057do identyfikacji białek
Stopień sekwencjonowania Zmodyfikowana trypsynaPromegaV5111trypsyna
Ortowanadan soduSigmaS6508
Fosforan sodu dwuzasadowy dwuwodnySigma71643
TFAWako206-10731
kolumna syfonowaKYA Tech Co.A03-05-0010,5 mm ID * 1 mm L
System TripleTOF 5600Sciex4466015Hybrydowy kwadrupolowy tandemowy spektrometr masowy czasu przelotu
TrisWako207-06275
Tween-20Wako160-21211

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. Co-translational protein folding: progress and methods. Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).
  2. Miyazaki, T., Miyazaki, A. Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79(2017).
  3. Miyazaki, T., Miyazaki, A. Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).
  4. Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly. Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).
  5. Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).
  6. Obama, T., et al. Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS. Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).
  7. Matsudaira, P. Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).
  8. Yamaguchi, M., et al. High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).
  9. Iwamatsu, A. S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing. Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).
  10. Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems. Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).
  11. Miyazaki, T., Miyazaki, A. Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).
  12. Miyazaki, T., et al. Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).
  13. Tonami, K., et al. Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1. Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).
  14. Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. Protein elongation, co-translational folding and targeting. Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).
  15. Bunai, K., et al. Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile. Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Immunoprecypitacja LC MS MSmembrana PVDFtrawienie trypsynkulki magnetycznespektrometria masanaliza proteomicznasurowe immunoprecypitatyalkilacja redukcyjna

Powiązane artykuły