Opisujemy tutaj metody czułego i dokładnego oznaczania zmian 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny (8-oxodGuo), 1,N 6-etheno-2'-deoksyadenozyny (1,N 6-dAdo) i 1,N 2-etheno-2'-deoksyguanozyny (1,N 2-dGuo) w DNA. Metody te zastosowano do oceny wpływu drobnego pyłu zawieszonego (PM2,5) w tkankach (płuca, wątroba i nerki) narażonych myszy A/J.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Kwantyfikacja trzech zmian DNA za pomocą spektrometrii mas i ocena ich poziomów w tkankach myszy narażonych na działanie drobnego pyłu zawieszonego w otoczeniu
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Addukty DNA i utlenione zasady DNA są przykładami uszkodzeń DNA, które są użytecznymi biomarkerami do oceny toksyczności substancji, które są elektrofilowe, generują reaktywne elektrofile podczas biotransformacji lub wywołują stres oksydacyjny. Wśród utlenionych zasad nukleinowych najlepiej przebadaną jest 8-okso-7,8-dihydroguanina (8-oxoGua) lub 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyna (8-oxodGuo), biomarker oksydacyjnie indukowanego uszkodzenia zasad w DNA. Aldehydy i aldehydy epoksydowe powstające w procesie peroksydacji lipidów są cząsteczkami elektrofilowymi zdolnymi do tworzenia mutagennych egzocyklicznych adduktów DNA, takich jak addukty eteno 1,N 2-etheno-2'-deoksyguanozyna (1,N 2-εdGuo) i 1,N 6-eteno-2'-deoksyadenozyna (1,N6-εdAdo), które zostały zasugerowane jako potencjalne biomarkery w patofizjologii stanu zapalnego. Selektywne i czułe metody ich oznaczania ilościowego w DNA są niezbędne do opracowania strategii prewencyjnych mających na celu spowolnienie tempa mutacji komórek i rozwoju chorób przewlekłych (np. raka, chorób neurodegeneracyjnych). Spośród czułych metod dostępnych do ich wykrywania (wysokosprawna chromatografia cieczowa sprzężona z detektorami elektrochemicznej lub tandemowej spektrometrii mas, test kometowy, testy immunologiczne, 32P-posttaging), najbardziej selektywne są metody oparte na wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas (HPLC-ESI-MS/MS). Selektywność jest istotną zaletą podczas analizy złożonych próbek biologicznych, a HPLC-ESI-MS/MS rozwinął się jako złoty standard kwantyfikacji zmodyfikowanych nukleozydów w matrycach biologicznych, takich jak DNA, mocz, osocze i ślina. Zastosowanie izotopowo znakowanych wzorców wewnętrznych zwiększa przewagę w postaci poprawek na ubytki cząsteczek podczas etapów hydrolizy DNA i wzbogacania analitu, a także na różnice w jonizacji analitu między próbkami. Pomaga również w identyfikacji prawidłowego piku chromatograficznego, gdy występuje więcej niż jeden pik.
Prezentujemy tutaj sprawdzone, czułe, dokładne i precyzyjne metody HPLC-ESI-MS/MS, które zostały z powodzeniem zastosowane do oznaczania ilościowego 8-oxodGuo, 1,N 6-dAdo i 1,N 2-dGuo w DNA płuc, wątroby i nerek myszy A/J do oceny skutków ekspozycji na PM2.5 w otoczeniu.
Wprowadzenie
Niektóre reaktywne formy tlenu (ROS) są zdolne do utleniania wiązań podwójnych węgla w zasadach DNA oraz niektórych atomów węgla w fragmencie deoxyrybozy, co prowadzi do powstawania utlenionych zasad i pęknięć nici DNA1. Jako cząsteczka o ładunku ujemnym, bogata w atomy azotu i tlenu, DNA jest również celem grup elektrofilowych, które reagują kowalencyjnie z miejscami nukleofilowymi (azotem i tlenem), tworząc produkty nazywane adduktami DNA2. Zatem addukty DNA i utlenione zasady DNA są przykładami uszkodzeń DNA, które stanowią przydatne biomarkery w ocenie toksyczności substancji elektrofilowych, substancji generujących ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Czterotygodniowe samce myszy szczepu A/J, wolne od swoistych patogenów, pozyskano z Centrum Hodowli Zwierząt Laboratoryjnych Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) w Rio de Janeiro w Brazylii; zwierzęta traktowano zgodnie z wytycznymi Komisji Etycznej Wydziału Medycyny Uniwersytetu w São Paulo (protokół no 1310/09).
1. Pobieranie tkanek myszy
- Zanurz zwierzę w narkozie, stosując ksylazynę i ketaminę. W przypadku myszy o masie ciała 30 g wstrzyknij doprzewnow brzusznie roztwór (nie więcej niż 2 mL) zawierający 2,63 mg ketaminy i 0,38 mg ksylazyny.
- Pobierz krew (0,5 - 1,5 mL) do analiz uzupełniających (np. aktywności ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Średnie stężenia DNA (± SD) uzyskane z wątroby myszy (~ 1 g tkanki), płuc (~ 0,2 g tkanki) i nerek (~ 0,4 g tkanki) wynosiły odpowiednio 5 068 ± 2 615, 4 369 ± 1 021 oraz 3 223 ± 723 µg/mL w końcowej objętości 200 µL. Na Rysunku 3 przedstawiono reprezentatywny chromatogram oczyszczonego DNA uzyskany metodą HPLC-DAD. Obecność czterech 2'-deoksynukleozydów, wolnych od rybonukleozydów RNA, które eluentują bezpośrednio przed odpowiadającymi im 2'-deoksynukleozyda.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Głównym problemem stwierdzonym w analizach 8-oksodGuo metodami HPLC jest możliwa indukcja jego powstawania podczas procedur ekstrakcji DNA, hydrolizy DNA i koncentracji hydrolizatów DNA22,38. W celu zminimalizowania problemu tworzenia się artefaktów 8-oksodGuo, zaleca się dodawanie deferoksaminy do wszystkich roztworów do ekstrakcji, przechowywania i hydrolizy DNA, stosowanie metody chaotropowej jodku sodu i unikanie fenolu w ekstrakcji DNA, a także stosowanie il.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, Proc. 2012/22190-3 i 2012/08616-8), CNPq (Proc. 454214/2014-6 i 429184/2016-6), CAPES, PRPUSP (Pró-Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo), INCT INAIRA (MCT/CNPq/FNDCT/CAPES/FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), INCT Redoxoma (FAPESP/CNPq/CAPES; Proc. 573530/2008-4), NAP Redoxoma (PRPUSP; Proc. 2011.1.9352.1.8) i CEPID Redoxoma (FAPESP; Proc. 2013/07937-8). T. F. Oliveira i A. A. F. Oliveira otrzymali stypendia FAPESP (Proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) i CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior). M. H. G. Medeiros, P. Di Mascio, P. H. N. Saldiva i A....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| [15N5]-2'-deoksyadenozyna | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-3895-25 | |
| [15N5]-2'-deoksyguanozyna | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-3899-CA-10 | |
| acetonitryl | Carlo Erba Odczynniki | 412413000 | |
| alkaliczne fosfataza z błony śluzowej jelit bydlęcych | Sigma | P5521 | |
| octan amonu | Merck | 101116 | |
| grasica cielęca DNA | Sigma | D1501 | |
| roztwór do lizy komórek | QIAGEN | 158908 | |
| chloroform | Carlo Erba Odczynniki | 412653 | |
| deferoksamina | Sigma | D9533 | |
| deoksyrybonukleaza I (DNaza I) | Bio Basic Inc | DD0649 | |
| etanol | Carlo Erba Odczynniki | 414542 | |
| kwas mrówkowy | Sigma-Aldrich | F0507 | |
| System HPLC-ESI-MS/MS HPLC | : Agilent 1200 series ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments | HPLC: pompa dwubiegunowa (G1312B), pompa izokratyczna (G1310A), piec kolumnowy z kolumnowym zaworem przełączającym (G1316B), detektor matrycy diodowej (G1315C), automatyczny sampler (G1367C). ESI-MS/MS: Liniowy kwadrupolowy spektrometr masowy z pułapką jonową, model 4000 QTRAP. | |
| System HPLC/DAD | Shimadzu | Dwie pompy (LC-20AT), detektor matrycy fotodiodowej (DAD-20AV), automatyczny wtryskiwacz (Proeminence SIL-20AC), piec kolumnowy (CTO-10AS/VP) | |
| Kolumna HPLC (średnica wewnętrzna 50 x 2,0 mm, 2,5 i mikro; m, C18) | Kolumna HPLC Phenomenex | 00B-4446-B0 | |
| (średnica wewnętrzna 150 x 2,0 mm, 3,0 i mikro; m, C18) | Kolumna HPLC Phenomenex | 00F-4251-B0 | |
| (średnica wewnętrzna 250 x 4,6 mm, 5,0 i mikro; m, C18) | Phenomenex | 00G-4252-E0 | |
| HPLC C18 wkład ochronny (średnica wewnętrzna 4,0 x 3,0 mm) | Phenomenex | AJO-4287 | |
| alkohol izoamylowy | Sigma-Aldrich | M32658 | |
| alkohol izopropylowy (izopropanol) | Carlo Erba Odczynniki | A412790010 | |
| ketaminy | Ceva | Nazwa handlowa: Dopalen | |
| chlorek magnezu | Carlo Erba Odczynniki | 349377 | |
| chlorek magnezu | Sigma | M2393 | |
| metanol | Carlo Erba Odczynniki | L022909K7 | |
| fosfodiesterazy I z Crotalus atrox | Sigma | P4506 | |
| roztwór do wytrącania białek | QIAGEN | 158912 | |
| proteinaza K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| rybonukleaza A | Sigma | R5000 | |
| sód chlorek | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| SPE-C18 (Strata-X) | Phenomenex | 8B-S100-TAK | |
| tris(hydroksymetylo)-aminometan | Carlo Erba Odczynniki | 489983 | |
| ksylazyna | Syntec do Brasil | Nazwa handlowa: Xilazin |
Bibliografia
- Cadet, J., Davies, K. J. A., Medeiros, M. H. G., Di Mascio, P., Wagner, J. R. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radical Biology and Medicine. 107, 13-34 (2017).
- Barnes, J. L., Zubair, M., John, K., Poirier, M. C., Martin, F. L. Carcinogens a....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
