Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja trzech zmian DNA za pomocą spektrometrii mas i ocena ich poziomów w tkankach myszy narażonych na działanie drobnego pyłu zawieszonego w otoczeniu

8.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59734

⸱

29 maja 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, 2Departamento de Farmacociências, Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre, 3Laboratório de Poluição Atmosfêrica Experimental - LIM05, Hospital das Clínicas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, 4Instituto de Estudos Avançados, Universidade de São Paulo, 5Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy tutaj metody czułego i dokładnego oznaczania zmian 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny (8-oxodGuo), 1,N 6-etheno-2'-deoksyadenozyny (1,N 6-dAdo) i 1,N 2-etheno-2'-deoksyguanozyny (1,N 2-dGuo) w DNA. Metody te zastosowano do oceny wpływu drobnego pyłu zawieszonego (PM2,5) w tkankach (płuca, wątroba i nerki) narażonych myszy A/J.

Streszczenie

Addukty DNA i utlenione zasady DNA są przykładami uszkodzeń DNA, które są użytecznymi biomarkerami do oceny toksyczności substancji, które są elektrofilowe, generują reaktywne elektrofile podczas biotransformacji lub wywołują stres oksydacyjny. Wśród utlenionych zasad nukleinowych najlepiej przebadaną jest 8-okso-7,8-dihydroguanina (8-oxoGua) lub 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyna (8-oxodGuo), biomarker oksydacyjnie indukowanego uszkodzenia zasad w DNA. Aldehydy i aldehydy epoksydowe powstające w procesie peroksydacji lipidów są cząsteczkami elektrofilowymi zdolnymi do tworzenia mutagennych egzocyklicznych adduktów DNA, takich jak addukty eteno 1,N 2-etheno-2'-deoksyguanozyna (1,N 2-εdGuo) i 1,N 6-eteno-2'-deoksyadenozyna (1,N6-εdAdo), które zostały zasugerowane jako potencjalne biomarkery w patofizjologii stanu zapalnego. Selektywne i czułe metody ich oznaczania ilościowego w DNA są niezbędne do opracowania strategii prewencyjnych mających na celu spowolnienie tempa mutacji komórek i rozwoju chorób przewlekłych (np. raka, chorób neurodegeneracyjnych). Spośród czułych metod dostępnych do ich wykrywania (wysokosprawna chromatografia cieczowa sprzężona z detektorami elektrochemicznej lub tandemowej spektrometrii mas, test kometowy, testy immunologiczne, 32P-posttaging), najbardziej selektywne są metody oparte na wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas (HPLC-ESI-MS/MS). Selektywność jest istotną zaletą podczas analizy złożonych próbek biologicznych, a HPLC-ESI-MS/MS rozwinął się jako złoty standard kwantyfikacji zmodyfikowanych nukleozydów w matrycach biologicznych, takich jak DNA, mocz, osocze i ślina. Zastosowanie izotopowo znakowanych wzorców wewnętrznych zwiększa przewagę w postaci poprawek na ubytki cząsteczek podczas etapów hydrolizy DNA i wzbogacania analitu, a także na różnice w jonizacji analitu między próbkami. Pomaga również w identyfikacji prawidłowego piku chromatograficznego, gdy występuje więcej niż jeden pik.

Prezentujemy tutaj sprawdzone, czułe, dokładne i precyzyjne metody HPLC-ESI-MS/MS, które zostały z powodzeniem zastosowane do oznaczania ilościowego 8-oxodGuo, 1,N 6-dAdo i 1,N 2-dGuo w DNA płuc, wątroby i nerek myszy A/J do oceny skutków ekspozycji na PM2.5 w otoczeniu.

Wprowadzenie

Niektóre reaktywne formy tlenu (ROS) są zdolne do utleniania wiązań podwójnych węgla w zasadach DNA oraz niektórych atomów węgla w fragmencie deoxyrybozy, co prowadzi do powstawania utlenionych zasad i pęknięć nici DNA1. Jako cząsteczka o ładunku ujemnym, bogata w atomy azotu i tlenu, DNA jest również celem grup elektrofilowych, które reagują kowalencyjnie z miejscami nukleofilowymi (azotem i tlenem), tworząc produkty nazywane adduktami DNA2. Zatem addukty DNA i utlenione zasady DNA są przykładami uszkodzeń DNA, które stanowią przydatne biomarkery w ocenie toksyczności substancji elektrofilowych, substancji generujących reaktywne elektrofile w procesie biotransformacji lub indukujących stres oksydacyjny1,2. Chociaż zmodyfikowane zasady DNA mogą być usuwane z DNA poprzez naprawę przez wycinanie zasad lub nukleotydów (BER lub NER), wywołanie nierównowagi między powstawaniem a usuwaniem uszkodzeń DNA na korzyść tych pierwszych prowadzi do stopniowego wzrostu ich poziomu w DNA w czasie3. Skutkiem tego jest zwiększenie częstości mutacji DNA, obniżenie ekspresji genów oraz zmniejszenie aktywności białek2,4,5,6,7, co są to efekty ściśle powiązane z rozwojem chorób. Mutacje DNA mogą wpływać na różnorodne funkcje komórkowe, takie jak sygnalizacja komórkowa, cykl komórkowy, integralność genomu, stabilność telomerów, epigenom, struktura chromatyny, splicing RNA, homeostaza białkowa, metabolizm, apoptoza i różnicowanie komórek8,9. Strategie mające na celu spowolnienie tempa mutacji komórkowych i rozwoju chorób przewlekłych (np. nowotworów, chorób neurodegeneracyjnych) opierają się na wiedzy o źródłach mutacji, wśród których znajdują się uszkodzenia DNA i ich przyczyny.

Nadmiar endogennie generowanych reaktywnych form tlenu (ROS), powstający w wyniku ekspozycji na zanieczyszczenia, uporczywego stanu zapalnego, patofizjologii chorób (np. cukrzycy) itp., stanowi istotną przyczynę uszkodzeń biomolekuł, w tym uszkodzeń DNA i lipidów1. Przykładowo, wysoce reaktywny rodnik hydroksylowy (OH), powstający w wyniku redukcji H2O2 przez jony metali przejściowych (Fe2+, Cu+), utlenia zasady DNA, część cukrową DNA oraz wielonienasycone kwasy tłuszczowe z szybkością kontrolowaną dyfuzyjnie10. spośród 80 już scharakteryzowanych utlenionych nukleobaz3, najdokładniej zbadaną jest 8-okso-7,8-dihydroguanina (8-oxoGua) lub 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyna (8-oxodGuo, Rysunek 1), czyli uszkodzenie zdolne do indukcji transwersji GT w komórkach ssaków10,11. Powstaje ona w wyniku jednoelektronowego utleniania guaniny lub ataku rodnika hydroksylowego bądź tlenu singletowego na guaninę w DNA1. Wielonienasycone kwasy tłuszczowe są innymi ważnymi celami wysoce reaktywnych utleniaczy, takich jak •OH, które inicjują proces peroksydacji lipidów1,12. Prowadzi to do powstania hydroperoksydów kwasów tłuszczowych, które mogą rozkładać się do elektrofilowych aldehydów i epoksyaldehydów, takich jak malondialdehyd, 4-hydroksy-2-nonenal, 2,4-decadienal, 4,5-epoksy-(2E)-decenal, heksenal, akroleina, krotonaldehyd, które są w stanie tworzyć mutagenne egzocykliczne addukty DNA, takie jak addukty malondialdehydowe, propanowe lub etenowe1,12,13. Zasugerowano, że addukty etenowe 1,N2-eteno-2'-deoksyguanozyna (1,N2-εdGuo, Rysunek 1) oraz 1,N6-eteno-2'-deoksyadenozyna (1,N6-εdAdo, Rysunek 1) mogą służyć jako potencjalne biomarkery w patofizjologii stanu zapalnego14,15.

Struktury chemiczne zmodyfikowanych nukleozydów; schemat 8-oxo-dG, 1,N²-etheno-dG, 1,N⁶-etheno-dA.
Rycina 1. Struktury chemiczne uszkodzeń DNA ilościowo określonych w niniejszym badaniu. dR = 2´-dezoksyryboza. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Oliveira et al.34. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Badania przeprowadzone na początku lat 80. XX wieku umożliwiły czułą detekcję 8-oxodGuo za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z detekcją elektrochemiczną (HPLC-ECD). Ilościowe oznaczenie 8-oxodGuo metodą HPLC-ECD w kilku systemach biologicznych poddanych warunkom utleniającym doprowadziło do uznania 8-oxodGuo za biomarker uszkodzeń zasad w DNA indukowanych utlenianiem1,16. Chociaż metoda HPLC-ECD jest niezawodna i pozwala na oznaczanie 8-oxodGuo w niskim zakresie fmol17, pomiary te opierają się na dokładności czasu retencji analitytu w celu jego identyfikacji oraz na rozdzielczości chromatograficznej w celu uniknięcia interferencji z innymi składnikami próbki. Ponieważ detekcja elektrochemiczna wymaga zastosowania soli (np. fosforanu potasu, octanu sodu) w fazie ruchomej, utrzymanie odpowiednich warunków analitycznych wiąże się z koniecznością rutynowego czyszczenia kolumny i sprzętu.

Alternatywnie, zastosowanie bakteryjnego enzymu naprawy DNA, formamidopirymidynowej glikozylazy DNA (FPG), a następnie ludzkiej 8-oksoguaninowej glikozylazy 1 (hOGG1), do wykrywania i usuwania 8-oxoGua z DNA, pojawiło się jako sposób na indukcję miejsc alkaliolabilnych w DNA. Miejsca alkaliolabilne są przekształcane w pęknięcia nici DNA, co umożliwia bardzo czułą pośrednią kwantyfikację 8-oxoGua za pomocą alkalicznej elektroforezy pojedynczych komórek w żelu („test kometowy”). Głównymi zaletami tego rodzaju analizy są wysoka czułość oraz możliwość przeprowadzenia badań bez konieczności ekstrakcji DNA z komórek. Metoda ta pozwala na oznaczenie najniższych poziomów stacjonarnych 8-oxoGua w DNA, zazwyczaj 7-10 razy niższych niż poziomy uzyskiwane metodami bioanalitycznymi opartymi na HPLC. Jest to jednak pomiar pośredni 8-oxoGua, a do głównych wad należą brak swoistości lub nieznana wydajność stosowanych enzymów naprawczych1,16,18.

Analizy immunochemiczne stanowią inny zestaw metod stosowanych do wykrywania 8-oxoGua1 oraz egzozyklicznych adduktów DNA, takich jak 1,N6-dAdo i 1,N2-dGuo12. Pomimo wysokiej czułości, wadą stosowania przeciwciał do wykrywania uszkodzeń DNA jest brak specyficzności wynikający z reakcji krzyżowej z innymi składnikami próbek biologicznych, w tym z normalnymi zasadami DNA1,12. Egzozykliczne addukty DNA, w tym 1,N6-dAdo i 1,N2-dGuo, mogą być również wykrywane i oznaczane ilościowo za pomocą wysoce czułych testów z wykorzystaniem znakowania po syntezie 32P-postlabeling12. Wysoka czułość metody 32P-postlabeling umożliwia zastosowanie bardzo małych ilości DNA (np. 10 µg) w celu wykrycia około 1 adduktu na 1010 normalnych zasad19. Jednakże niektórymi wadami są stosowanie substancji radioaktywnych, brak specyficzności chemicznej oraz niska dokładność19,20.

Wspólnym ograniczeniem cytowanych powyżej metod jest niska selektywność lub swoistość w detekcji pożądanych cząsteczek. W tym kontekście HPLC sprzężone z tandemową spektrometrią mas z jonizacją elektrosprayową (HPLC-ESI-MS/MS oraz HPLC-MS3) stało się złotym standardem w oznaczaniu ilościowym zmodyfikowanych nukleozydów w matrycach biologicznych, takich jak DNA, mocz, osocze i ślina1,19,20. Zaletami metod HPLC-ESI-MS/MS są czułość (zazwyczaj w niskim zakresie fmol) oraz wysoka swoistość zapewniona przez i) rozdział chromatograficzny, ii) charakterystyczny i znany wzór fragmentacji cząsteczek w komorze kolizyjnej spektrometru mas oraz iii) precyzyjny pomiar wybranego stosunku masy do ładunku (m/z) w trybie monitorowania wielu reakcji (MRM)1,19. Zastosowanie izotopowo znakowanych standardów wewnętrznych daje dodatkową korzyść w postaci korekty strat cząsteczek podczas hydrolizy DNA i etapów wzbogacania analitytu, a także różnic w jonizacji analitytu pomiędzy próbkami. Pomaga to również w identyfikacji właściwego piku chromatograficznego w przypadku wystąpienia więcej niż jednego piku1,12,19,20.

W celu oznaczania ilościowego 8-oxodGuo, 1,N6-dAdo oraz 1,N2-dGuo w DNA wyekstrahowanym z różnych próbek biologicznych zastosowano kilka metod opartych na HPLC-ESI-MS/MS12,15,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29. Cząstki drobne (PM2.5) przenoszą związki organiczne i nieorganiczne, takie jak wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA), nitro-WWA, aldehydy, ketony, kwasy karboksylowe, chinoliny, metale i jony rozpuszczalne w wodzie, które mogą wywoływać stan zapalny i stres oksydacyjny – warunki sprzyjające uszkodzeniom biomolekuł i rozwojowi chorób30,31,32,33. Przedstawiamy tutaj zwalidowane metody HPLC-ESI-MS/MS, które z sukcesem zastosowano do oznaczania ilościowego 8-oxodGuo, 1,N6-dAdo oraz 1,N2-dGuo w DNA płuc, wątroby i nerek myszy A/J w celu oceny skutków ekspozycji na PM2.5 w powietrzu zewnętrznym34.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Czterotygodniowe samce myszy szczepu A/J, wolne od swoistych patogenów, pozyskano z Centrum Hodowli Zwierząt Laboratoryjnych Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) w Rio de Janeiro w Brazylii; zwierzęta traktowano zgodnie z wytycznymi Komisji Etycznej Wydziału Medycyny Uniwersytetu w São Paulo (protokół no 1310/09).

1. Pobieranie tkanek myszy

  1. Zanurz zwierzę w narkozie, stosując ksylazynę i ketaminę. W przypadku myszy o masie ciała 30 g wstrzyknij doprzewnow brzusznie roztwór (nie więcej niż 2 mL) zawierający 2,63 mg ketaminy i 0,38 mg ksylazyny.
  2. Pobierz krew (0,5 - 1,5 mL) do analiz uzupełniających (np. aktywności enzymów przeciwutleniających, poziomu malondialdehydu).
  3. Wygol włosy na brzuchu od miednicy do wyrostka mieczowatego. Wykonaj nacięcie w pionowej linii środkowej w obszarze ogolonem. Wykonaj nacięcia w poziomych liniach bocznych, aby odsłonić narządy jamy brzusznej.
  4. Przetnij aortę brzuszną, aby doprowadzić do eksangwinacji i uśmiercić zwierzę.
  5. Pobierz interesujące tkanki (w tym przypadku wątrobę, nerki i płuca).
    1. Aby usunąć wątrobę, przetnij żyłę główną dolną oraz żyłę wrotną wątroby.
    2. Aby usunąć nerki, przetnij żyły i tętnice nerkowe.
    3. Aby usunąć płuca, wykonaj nacięcie w końcach przepony i obwodowo blisko ściany klatki piersiowej. Przełam obojczyki, otwierając nożyczki wewnątrz klatki piersiowej. Przetnij kość mostka od wyrostka mieczowatego w kierunku tchawicy, aby odsłonić płuca i serce.
      1. Przytrzymaj płuco pęsetą, przetnij tchawicę oraz więzadła wokół płuc. Ostrożnie usuń blok płuc wraz z sercem. Aby oddzielić płuca od bloku, przytrzymaj serce pęsetą i przetnij wszystkie naczynia u jego podstawy.
  6. Natychmiast przemyj wyizolowane tkanki zimnym roztworem soli fizjologicznej (0,9% NaCl), przenieś do probówek kriogenicznych i niezwłocznie zanurz probówki w ciekłym azocie. Po zakończeniu prac przechowuj probówki w temperaturze -80 °C.
    ​OSTRZEŻENIE: Ciekły azot w bezpośrednim kontakcie ze skórą, błonami śluzowymi lub oczami powoduje oparzenia. Stosuj odpowiednie środki ochrony indywidualnej, aby uniknąć kontaktu. Pracuj w wentylowanym laboratorium, aby zapobiec uduszeniu oparami ciekłego azotu.

2. Ekstrakcja DNA

Uwaga: Metoda ekstrakcji DNA została zmodyfikowana na podstawie pracy Loureiro et al. (2009)35, aby umożliwić analizę badanych tutaj zmian.

  1. Przenieść probówki zawierające tkanki na suchy lód.
  2. Używając płytki do hodowli umieszczonej na lodzie jako podstawy, wyciąć skalpelem fragment tkanki. Odważyć 1 g do natychmiastowego użycia. Pozostałą tkankę należy przechowywać na suchym lodzie do czasu powrotu do przechowywania w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Należy unikać rozmrażania pozostałej tkanki, aby zapobiec powstawaniu artefaktów w przypadku konieczności powtórzenia analiz.
  3. Do każdego 1 g tkanki w zakręcanych probówkach o pojemności 50 mL dodać 10 mL komercyjnego roztworu do lizy komórek zawierającego 0.5 mM deferoksaminy i przechowywać na lodzie.
    UWAGA: Dodać deferoksaminę do objętości roztworu przeznaczonego do natychmiastowego użycia. Na każde 100 mL roztworu dodać 0.0328 g soli mezylanu deferoksaminy.
  4. Zhomogenizować tkanki za pomocą homogenizatora do tkanek, aż do uzyskania jednorodnego roztworu bez fragmentów tkanki. Podczas homogenizacji utrzymywać probówkę w niskiej temperaturze (na lodzie). Używać niskiej prędkości, aby uniknąć nagrzewania.
  5. Do każdej zhomogenizowanej próbki dodać 150 µL roztworu proteinazy K (20 mg/mL). Wymieszać zawartość probówek poprzez odwracanie i inkubować w temperaturze pokojowej przez noc.
  6. Dodać 40 µL roztworu rybonukleazy A (15 mg/mL), wymieszać przez odwracanie i inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 2 h.
    UWAGA: Roztwór rybonukleazy A należy przygotować w buforze octanu sodu 10 mM, pH 5.2, aby uniknąć wytrącania. Przed użyciem podgrzać roztwór w temperaturze 100 °C przez 15 min, aby uzyskać roztwór wolny od doksyrybonukleazy.
  7. Dodać 5 mL komercyjnego roztworu do wytrącania białek, intensywnie wymieszać w wirówce typu vortex i wirować przy 2,000 x g, 4 °C, przez 10 minut.
  8. Przenieść nadsączniki do zakręcanych probówek o pojemności 50 mL zawierających 10 mL zimnego izopropanolu. Delikatnie odwracać probówki kilka razy, aż do zaobserwowania wytrąconego DNA.
    UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać, przechowując probówki w temperaturze -20 °C.
  9. Zebrać wytrącone DNA za pomocą pipety Pasteura zamkniętej na końcu. Przenieść je do probówek zawierających 4 mL buforu Tris 10 mM, 1 mM deferoksaminy, pH 7.0.
  10. Po całkowitym rozpuszczeniu DNA w powyższym roztworze (nie używać vortexa), dodać 4 mL roztworu chloroformu zawierającego 4% alkoholu izoamylowego.
  11. Odwrócić probówki 10 razy w celu homogenizacji, wirować przy 2,000 x g, 4 °C, przez 10 minut, aby rozdzielić dwie fazy, a następnie przenieść fazę górną do nowej probówki.
  12. Powtórzyć kroki 2.10 i 2.11 jeszcze dwa razy.
  13. Dodać 8 mL etanolu absolutnego i 0.4 mL roztworu NaCl 5 M, aby wytrącić DNA.
  14. Ponownie zebrać wytrącone DNA i przenieść je do 3 mL 70% etanolu. Powtórzyć ten krok jeszcze raz.
  15. Ostrożnie usunąć roztwór etanolu i odwrócić probówki zawierające wytrącone DNA na papierze chłonnym, aby usunąć nadmiar roztworu.
  16. Dodać 200 µL roztworu deferoksaminy 0.1 mM, aby rozpuścić DNA. Przechowywać probówki w temperaturze 4 °C do czasu całkowitej rehydratacji DNA (przez noc).
  17. Oznaczyć stężenie DNA poprzez pomiar absorbancji przy 260 nm oraz jego czystość za pomocą stosunku absorbancji 260/280 nm.
    UWAGA: Aby oznaczyć stężenie DNA, przenieść alikwot 10 µL roztworu DNA do 990 µL wody ultrapure (rozcieńczenie 100x). Pomnożyć absorbancję przy 260 nm (powinna być mniejsza niż 1) przez 50 (50 µg/mL to stężenie dwuniciowego DNA, gdy absorbancja roztworu o drodze optycznej 1 cm przy 260 nm wynosi 1) oraz przez zastosowane rozcieńczenie (100x), aby otrzymać stężenie DNA w µg/mL. Jeśli absorbancja przy 260 nm przekracza 1, konieczne są dodatkowe rozcieńczenia. Stosunek absorbancji 260/280 nm powinien być równy lub większy niż 1.8 dla pożądanej czystości DNA, jednak dopuszczalne są wartości około 1.6.

3. Enzymatyczna hydroliza DNA

  1. Procedura analizy
    1. Analizy 1,N6-εdAdo i 1,N2-εdGuo: Do alikwoty zawierającej 150 µg DNA dodać 7,5 µL buforu 200 mM Tris/MgCl2 (pH 7,4), 1,4 µL roztworu wzorca wewnętrznego zawierającego 250 fmol/µL [15N5]1,N6-εdAdo i [15N5]1,N2-εdGuo oraz 15 jednostek doksyrybonukleazy I. Objętość końcową doprowadzić do 200 µL wodą ultrapure, odejmując objętości enzymów, które zostaną użyte w kroku 3.2.1.
    2. Analizy 8-oxodGuo: Do alikwoty zawierającej 80 µg DNA dodać 3,8 µL buforu 200 mM Tris/MgCl2 (pH 7,4), 2 µL roztworu wzorca wewnętrznego zawierającego 1 000 fmol/µL [15N5]8-oxodGuo oraz 8 jednostek doksyrybonukleazy I. Objętość końcową doprowadzić do 100 µL wodą ultrapure, odejmując objętości enzymów, które zostaną użyte w kroku 3.2.2.
      ​UWAGA: Wzorce wewnętrzne [15N5]1,N6-εdAdo, [15N5]1,N2-εdGuo i [15N5]8-oxodGuo można zsyntetyzować i scharakteryzować zgodnie z opisem35,36,37. Ilości wzorców wewnętrznych w wstrzykiwanych objętościach próbek powinny być takie same, jak w wstrzykiwanych objętościach krzywej kalibracyjnej.
  2. Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    1. Próbki z kroku 3.1: Dodać 0,006 jednostki fosfodiesterazy I z Crotalus atrox i 15 jednostek fosfatazy alkalicznej z błony śluzowej jelita bydlęcego.
    2. Próbki z kroku 3.2: Dodać 0,0032 jednostki fosfodiesterazy I z Crotalus atrox i 8 jednostek fosfatazy alkalicznej z błony śluzowej jelita bydlęcego.
  3. Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  4. Wirować próbki z prędkością 14 000 x g przez 10 minut.
  5. Próbki z kroku 3.2.1: Oddzielić 10 µL każdej próbki do oznaczania ilościowego doksyrybonukleozydów (dAdo, dGuo) metodą HPLC/DAD (krok 9). Pozostałą objętość poddać ekstrakcji do fazy stałej (krok 4).
  6. Próbki z kroku 3.2.2: Przenieść 80 µL supernatantu do fiolek do wstrzykiwania 50 µL (1 000 fmol [15N5]8-oxodGuo) w systemie HPLC-ESI-MS/MS. Pozostałe 20 µL zachować do oznaczania ilościowego dGuo metodą HPLC/DAD (krok 9).

4. Ekstrakcja do fazy stałej dla analiz 1, N6-εdAdo oraz 1, N2-εdGuo

  1. Napełnij kolumny (SPE-C18, 30 mg/mL, 33 µm, 1 mL) po 1 mL następujących roztworów w podanej kolejności: 100% metanol, woda dejonizowana, próbka zhydrolizowanego DNA, woda dejonizowana, 10% metanol, 15% metanol oraz 100% metanol (dozebrany).
    UWAGA: Nie dopuszczaj do wyschnięcia kolumn pomiędzy aplikacjami poszczególnych roztworów. Dodawaj kolejny roztwór natychmiast po całkowitym wprowadzeniu poprzedniego do kolumny.
  2. Wysusz próżniowo ostatnią frakcję elucji (100% metanol) zawierającą addukty.
  3. Bezpośrednio przed analizą HPLC-ESI-MS/MS resuspenduj wysuszone próbki w 83,1 μL wody ultrapure, aby uzyskać 200 fmol każdego standardu wewnętrznego w 50 µL każdej próbki.

5. Przygotowanie krzywych kalibracyjnych

  1. Przygotować co najmniej pięć punktów w zakresie od 300 do 6 000 fmol standardu 8-oxodGuo, z dodatkiem stałej ilości 1 000 fmol [15N5]8-oxodGuo do każdego punktu. Ilości te należy odnieść do objętości wstrzykiwanej próbki.
  2. Przygotować co najmniej pięć punktów w zakresie od 1 do 40 fmol 1,N6-εdAdo oraz 1,N2-εdGuo, z dodatkiem stałych ilości 200 fmol [15N5]1,N6-εdAdo i [15N5]1,N2-εdGuo do każdego punktu. Ilości te należy odnieść do objętości wstrzykiwanej próbki.
  3. Przygotować co najmniej pięć punktów w zakresie od 0,05 do 1 nmol dGuo i dAdo. Ilości te należy odnieść do objętości wstrzykiwanej próbki.

6. Przygotowanie próbek DNA do walidacji metody

  1. Analizy 1,N6-εdAdo oraz 1,N2-εdGuo: Do 100 µg DNA z grasicy cielęcej dodać zmienne ilości 1,N6-εdAdo i 1,N2-εdGuo (np. 1,75, 8,75, 17,5 i 35 fmol) oraz stałe ilości [15N5]1,N6-εdAdo i [15N5]1,N2-εdGuo (350 fmol), a następnie przeprowadzić hydrolizę enzymatyczną zgodnie z opisem w kroku 3. Próbki przetworzyć w czterech powtórzeniach w dwóch różnych dniach. Próbki wykorzystać do oceny dokładności i precyzji metody.
    UWAGA: Końcowa objętość hydrolizatów DNA wyniesie 200 µL (krok 3), z czego 10 µL zostanie pobranych do oznaczania ilościowegot deoksy nukleozydów metodą HPLC/DAD (krok 9). Pozostały roztwór (190 µL) poddać ekstrakcji do fazy stałej (krok 4), a wysuszoną frakcję zawiesić ponownie w 83,1 µL (krok 4.3), z czego 50 µL zostanie wstrzykniętych do systemu HPLC-ESI-MS/MS. Ilości wstrzykniętego 1,N6-εdAdo i 1,N2-εdGuo wyniosą odpowiednio 1, 5, 10 i 20 fmol, przy 200 fmol [15N5]1,N6-εdAdo i [15N5]1,N2-εdGuo w każdej próbce.
  2. Analizy 8-oxodGuo: Do 100 µg DNA z grasicy cielęcej dodać zmienne ilości 8-oxodGuo (np. 734, 1 468, 2 938 i 4 408 fmol) oraz stałą ilość [15N5]8-oxodGuo (2 000 fmol), a następnie przeprowadzić hydrolizę enzymatyczną zgodnie z opisem w kroku 3. Próbki przetworzyć w czterech powtórzeniach w dwóch różnych dniach. Próbki wykorzystać do oceny dokładności i precyzji metody.
    UWAGA: Końcowa objętość hydrolizatów DNA wyniesie 100 µL (krok 3), z czego 50 µL zostanie wstrzykniętych do systemu HPLC-ESI-MS/MS. Ilości wstrzykniętego 8-oxodGuo wyniosą 367, 734, 1469 i 2204 fmol, przy 1 000 fmol [15N5]8-oxodGuo w każdej próbce.
  3. Do ośmiu próbek zawierających 100 µg DNA z grasicy cielęcej dodać 13,125 fmol 1,N6-εdAdo (aby uzyskać 7,5 fmol w objętości wtrysku) oraz 35 fmol 1,N2-εdGuo (aby uzyskać 20 fmol w objętości wtrysku).
    1. Do czterech z próbek dodać standardy wewnętrzne [15N5]1,N6-εdAdo i [15N5]1,N2-εdGuo (200 fmol). Przeprowadzić hydrolizę DNA i ekstrakcję do fazy stałej wszystkich próbek.
    2. Do pozostałych czterech próbek dodać standardy wewnętrzne [15N5]1,N6-εdAdo i [15N5]1,N2-εdGuo (200 fmol).
    3. Próbki wykorzystać do obliczenia odzysku adduktów podczas ekstrakcji do fazy stałej.

7. Analiza 8-oxodGuo metodą HPLC-ESI-MS/MS

  1. Po wprowadzeniu standardu 8-oxodGuo do urządzenia, ustaw parametry ESI-MS/MS dla optymalnej detekcji wzorca jego fragmentacji metodą monitorowania wielu reakcji (MRM): m/z 284 [M+H]+ → m/z 168 [M - 2'-deoxyribose + H]+.
    1. Zastosuj te same parametry do detekcji [15N5]8-oxodGuo: m/z 289 [M+H]+m/z → 173 [M - 2'-deoxyribose + H]+.
      UWAGA: Należy użyć urządzenia o parametrach równoważnych lub lepszych niż urządzenie wykorzystane w tej pracy (patrz: Tabela Materiałów). Parametry ESI-MS/MS ustawiono zgodnie z opisem w Tabeli 1.
  2. Przefiltruj (używając membran porowatych 0,22 µm) i odgazuj (za pomocą sonikatora) wszystkie rozpuszczalniki HPLC na bazie wody.
  3. Zastosuj następujące warunki chromatograficzne dla analiz, konfigurując system zgodnie z Rysunkiem 2.
    UWAGA: Kolumna A jest połączona z pompą binarną. Jej eluent jest kierowany do detekcji UV i do odpadów w pierwszych 16 min oraz od 32 do 46 min chromatografii, jak pokazano na Rysunku 2A. Jest to kolumna, z której próbka jest eluowana bezpośrednio po wtrysku. Kolumna B jest połączona z pompą izokratyczną i spektrometrem mas. Odbiera ona eluent z kolumny A tylko w przedziale 16–32 min, gdy zawór jest przełączony w pozycję pokazaną na Rysunku 2B. Przełączanie zaworu umożliwia połączenie dwóch kolumn, które są eluowane gradientem pompy binarnej. Konfiguracja przedstawiona na Rysunku 2B pozwala na dalszą separację i zawężenie piku. Dodatkowo do spektrometru mas dociera tylko interesująca nas frakcja chromatograficzna, co poprawia czułość i selektywność.
    1. Eluuj kolumnę C18 (kolumna A na Rysunku 2) o wymiarach 50 x 2,0 mm i.d., 2,5 µm, sprzężoną z zabezpieczającą wkładką C18 (4,0 x 3,0 mm i.d.), stosując gradient z 0,1% kwasu mrowianego (rozpuszczalnik A) i metanolu zawierającego 0,1% kwasu mrowianego (rozpuszczalnik B) przy przepływie 150 µL/min i temperaturze 25 °C.
      1. Zastosuj następujący program gradientu dla pompy binarnej: od 0 do 25 min, 0–15% rozpuszczalnika B; 25 do 28 min, 15–80% rozpuszczalnika B; 28 do 31 min, 80% rozpuszczalnika B; 31 do 33 min, 80–0% rozpuszczalnika B; 33 do 46 min, 0% rozpuszczalnika B.
      2. Użyj zaworu przełączającego, aby skierować eluent z pierwszych 16 min do odpadów, a frakcję z 16–32 min do drugiej kolumny (150 x 2,0 mm i.d., 3,0 µm, C18, kolumna B na Rysunku 2) połączonej ze źródłem ESI i kondycjonowanej przez pompę izokratyczną roztworem 15% metanolu w wodzie zawierającym 0,1% kwasu mrowianego (150 µL/min).
        UWAGA: Przed zastosowaniem programu zaworu przełączającego z punktu 7.3.1.2 sprawdź, czy standard 8-oxodGuo eluuje z pierwszej kolumny po 16 min. Ważne jest zamknięcie zaworu w 32 min, aby wykorzystać gradient pompy binarnej do eluowania 8-oxodGuo z drugiej kolumny i uzyskać ostry pik chromatograficzny. Uszkodzenie 8-oxodGuo eluuje z drugiej kolumny w około 36 min. Mogą wystąpić różnice w czasie retencji analitytu w zależności od użytej kolumny i urządzenia. Konieczne mogą być modyfikacje programu gradientu rozpuszczalników HPLC.

Schemat układu HPLC z API 4000 QTrap, pompy izokratyczne/binarne do analizy związków.
Rysunek 2. System dwóch kolumn stosowany w analizach 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny (8-oxodGuo). A) Konfiguracja stosowana w pierwszych 16 min oraz od 32 do 46 min chromatografii; B) Konfiguracja stosowana w przedziale 16 - 32 min, umożliwiająca dalszą separację i zwężenie piku w kolumnie B przed elucją do źródła ESI spektrometru masowego. Rysunek został przedrukowany z pracy Oliveira i wsp.34. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

8. Analiza HPLC-ESI-MS/MS 1, N 6 -εdAdo oraz 1, N 2 -εdGuo

  1. Po wprowadzeniu standardów 1,N6-εdAdo i 1,N2-εdGuo do urządzenia, należy ustawić parametry ESI-MS/MS w celu optymalnego wykrywania wzorców ich fragmentacji za pomocą monitorowania wielu reakcji (MRM): m/z 276 [M+H]+ → m/z 160 [M 2'-deoxyribose + H]+ dla detekcji 1,N6-εdAdo oraz m/z 292 [M+H]+ → m/z 176 [M - 2'-deoxyribose + H]+ dla detekcji 1,N2-εdGuo.
    1. Te same parametry należy zastosować do detekcji [15N5]1,N6-εdAdo (m/z 281 [M+H]+ m/z → 165 [M - 2'-deoxyribose + H]+) oraz [15N5]1,N2-εdGuo (m/z 297 [M+H]+ → m/z 181 [M - 2'-deoxyribose + H]+). Parametry ESI-MS/MS należy ustawić zgodnie z opisem w Tabeli 1.
Parametry ESI-MS/MS8-oxodGuoAddukty etenowe
Gaz osłonowy (Curtain Gas)20 psi20 psi
Gaz nebulizujący5550
Gaz źródła jonów50 psi40 psi
Gaz dysocjacji indukowanej zderzeniowoMediumMedium
Napięcie rozpylania jonów50004500
Temperatura sondy ESI450450
Potencjał deklastrowania31 V, 8-oxodGuo41 V, 1,N6-εdAdo
31 V, [15N5]8-oxodGuo41 V, [15N5]1,N6-εdAdo
45 V, 1,N2-εdGuo
45V, [15N5]1,N2-εdGuo
Energia zderzenia23 eV, 8-oxodGuo25 eV, 1,N6-εdAdo
23 eV, [15N5]8-oxodGuo25 eV, [15N5]1,N6-εdAdo
27 eV, 1,N2-εdGuo
27 eV, [15N5]1,N2-εdGuo
Potencjał wyjścia z komory zderzeniowej16 V, 8-oxodGuo,8 V, 1,N6-εdAdo
16 V, [15N5]8-oxodGuo8 V, [15N5]1,N6-εdAdo
16 V, 1,N2-εdGuo
16 V, [15N5]1,N2-εdGuo
Potencjał wejściowy10 V10 V

Tabela 1. Parametry użyte w urządzeniu ESI-MS/MS do detekcji uszkodzeń DNA. Tabela ta została zmodyfikowana na podstawie pracy Oliveira i wsp.34.

  1. Przefiltruj (używając membran porowatych 0,22 µm) i odgazuj (używając sonikatora) wszystkie rozpuszczalniki HPLC na bazie wody.
  2. Do analiz zastosuj następujące warunki chromatograficzne.
    1. Wykonać elucję z kolumny C18 (150 x 2,0 mm i.d., 3,0 µm) połączonej z wkładem zabezpieczającym C18 (4,0 x 3,0 mm i.d.) przy użyciu gradientu 5 mM octanu amonu, pH 6,6 (rozpuszczalnik A) i acetonitrylu (rozpuszczalnik B), przy przepływie 130 µL/min i temperaturze 25 °C.
      1. Dla pompy binarnej zastosuj następujący program gradientowy: od 0 do 10 min, 0% rozpuszczalnika B; 10 do 39 min, 0 - 20% rozpuszczalnika B; 39 do 41 min, 20 - 75% rozpuszczalnika B; 41 do 46 min, 75% rozpuszczalnika B; 46 do 47 min, 75 - 0% rozpuszczalnika B; 47 do 60 min, 0% rozpuszczalnika B.
      2. Użyj zaworu przełączającego, aby skierować eluent z pierwszych 35 min do odpadu, a frakcję z 35 - 42 min do źródła ESI. Upewnij się, że standardy adduktów eluują z kolumny w wyznaczonym przedziale (35 - 42 min). W razie potrzeby wprowadź korekty.

9. Oznaczanie ilościowe normalnych 2'-deoksyrybonukleozydów metodą HPLC-UV

  1. Należy użyć sprzętu podobnego do tego wykorzystanego w niniejszej pracy (patrz Tabela materiałów).
  2. Kolumnę C18 o wymiarach 250 mm x 4,6 mm i.d., 5 µm, połączoną z kolumnetką zabezpieczającą C18 (4,0 x 3,0 mm i.d.), eluować gradientem 0,1% kwasu mrówkowego i metanolu.
    1. Zastosować następujący program gradientu: od 0 do 25 min, od 0 do 18% metanolu; od 25 do 27 min, od 18 do 0% metanolu; od 27 do 37 min, 0% metanolu, przy szybkości przepływu 1 mL/min i temperaturze 30 °C.
    2. Wstrzyknąć 5 µL każdej próbki przeznaczonej do oznaczania ilości 2'-deoksynukleozydów.
    3. Detektor DAD ustawić na 260 nm w celu całkowania pików dGuo i dAdo.

10. Ilościowe oznaczenie uszkodzeń DNA

  1. Wykonaj całkowanie pików dla 8-oxodGuo, [15N5]8-oxodGuo, 1,N6-εdAdo, [15N5]1,N6-εdAdo, 1,N2-εdGuo oraz [15N5]1,N2-εdGuo z analiz HPLC-ESI-MS/MS.
    1. Oblicz stosunki powierzchni dla 8-oxodGuo/[15N5]8-oxodGuo, 1,N6-εdAdo/[15N5]1,N6-εdAdo oraz 1,N2-εdGuo/[15N5]1,N2-εdGuo dla krzywych kalibracyjnych i próbek.
    2. Wykreśl krzywe kalibracyjne, przyjmując stosunki powierzchni uzyskane w kroku 10.1.1 na osi y oraz ilości analitów obecnych w każdym punkcie na osi x.
    3. Oblicz ilości (fmol) zmian w każdej wstrzykniętej próbce, korzystając ze stosunków obliczonych w kroku 10.1.1 i krzywych kalibracyjnych z kroku 10.1.2.
  2. Wykonaj całkowanie pików dla dGuo i dAdo z analiz HPLC-UV.
    1. Wykreśl krzywe kalibracyjne, przyjmując powierzchnie uzyskane w kroku 10.2 na osi y oraz ilości analitów obecnych w każdym punkcie na osi x.
    2. Oblicz ilości (nmol) dGuo i dAdo w każdej wstrzykniętej próbce, korzystając z powierzchni uzyskanych w kroku 10.2 i krzywych kalibracyjnych z kroku 10.2.1.
  3. Oblicz ilości (nmol) dGuo i dAdo obecnych w każdej próbce wstrzykniętej do systemu HPLC-ESI-MS/MS, przyjmując, że ilości obliczone w kroku 10.2.2 znajdują się w objętości próbki 5 µL, podczas gdy do systemu HPLC-ESI-MS/MS wstrzyknięto 50 µL.
    UWAGA: Aby obliczyć ilość dGuo w próbkach wykorzystanych do analizy 8-oxodGuo, należy pomnożyć ilość (nmol/µL) uzyskaną w kroku 10.2.2 przez 50. Aby obliczyć ilości dAdo i dGuo w próbkach wykorzystanych do analiz 1,N6-εdAdo i 1,N2-εdGuo, należy uwzględnić etap zagęszczania po ekstrakcji do fazy stałej. Objętość 50 µL wstrzyknięta do systemu HPLC-ESI-MS/MS odpowiada 114,32 µL oryginalnej próbki. Ilości (nmol/µL) uzyskane w kroku 10.2.2 należy pomnożyć przez 114,32, aby otrzymać prawidłowe wartości.
  4. Oblicz ułamki molowe 8-oxodGuo/dGuo, 1,N6-εdAdo/dAdo, 1,N2-εdGuo/dGuo. Stosunki te (fmol zmiany/nmol normalnego deoksynukleozydu) określają liczbę zmian na 106 normalnych dGuo lub dAdo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Średnie stężenia DNA (± SD) uzyskane z wątroby myszy (~ 1 g tkanki), płuc (~ 0,2 g tkanki) i nerek (~ 0,4 g tkanki) wynosiły odpowiednio 5 068 ± 2 615, 4 369 ± 1 021 oraz 3 223 ± 723 µg/mL w końcowej objętości 200 µL. Na Rysunku 3 przedstawiono reprezentatywny chromatogram oczyszczonego DNA uzyskany metodą HPLC-DAD. Obecność czterech 2'-deoksynukleozydów, wolnych od rybonukleozydów RNA, które eluentują bezpośrednio przed odpowiadającymi im 2'-deoksynukleozyda...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Głównym problemem stwierdzonym w analizach 8-oksodGuo metodami HPLC jest możliwa indukcja jego powstawania podczas procedur ekstrakcji DNA, hydrolizy DNA i koncentracji hydrolizatów DNA22,38. W celu zminimalizowania problemu tworzenia się artefaktów 8-oksodGuo, zaleca się dodawanie deferoksaminy do wszystkich roztworów do ekstrakcji, przechowywania i hydrolizy DNA, stosowanie metody chaotropowej jodku sodu i unikanie fenolu w ekstrakcji DNA, a także stosowanie il...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, Proc. 2012/22190-3 i 2012/08616-8), CNPq (Proc. 454214/2014-6 i 429184/2016-6), CAPES, PRPUSP (Pró-Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo), INCT INAIRA (MCT/CNPq/FNDCT/CAPES/FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), INCT Redoxoma (FAPESP/CNPq/CAPES; Proc. 573530/2008-4), NAP Redoxoma (PRPUSP; Proc. 2011.1.9352.1.8) i CEPID Redoxoma (FAPESP; Proc. 2013/07937-8). T. F. Oliveira i A. A. F. Oliveira otrzymali stypendia FAPESP (Proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) i CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior). M. H. G. Medeiros, P. Di Mascio, P. H. N. Saldiva i A. P. M. Loureiro otrzymali stypendia CNPq.

Niektóre rysunki i tabele zawarte w tej pracy zostały pierwotnie opublikowane w Oliveira A.A.F. et al. Genotoksyczne i epigenotoksyczne efekty u myszy narażonych na stężony pył zawieszony (PM2.5) z miasta São Paulo, Brazylia. Toksykologia cząstek i włókien. 15, 40 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
[15N5]-2'-deoksyadenozynaCambridge Isotope LaboratoriesNLM-3895-25
[15N5]-2'-deoksyguanozynaCambridge Isotope LaboratoriesNLM-3899-CA-10
acetonitrylCarlo Erba Odczynniki412413000
alkaliczne fosfataza z błony śluzowej jelit bydlęcychSigmaP5521
octan amonuMerck101116
grasica cielęca DNASigmaD1501
roztwór do lizy komórekQIAGEN158908
chloroformCarlo Erba Odczynniki412653
deferoksaminaSigmaD9533
deoksyrybonukleaza I (DNaza I)Bio Basic IncDD0649
etanolCarlo Erba Odczynniki414542
kwas mrówkowySigma-AldrichF0507
System HPLC-ESI-MS/MS HPLC: Agilent 1200 series                      ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex InstrumentsHPLC: pompa dwubiegunowa (G1312B), pompa izokratyczna (G1310A), piec kolumnowy z kolumnowym zaworem przełączającym (G1316B), detektor matrycy diodowej (G1315C), automatyczny sampler (G1367C).                                                                                                                      ESI-MS/MS: Liniowy kwadrupolowy spektrometr masowy z pułapką jonową, model 4000 QTRAP.
System HPLC/DADShimadzuDwie pompy (LC-20AT), detektor matrycy fotodiodowej (DAD-20AV), automatyczny wtryskiwacz (Proeminence SIL-20AC), piec kolumnowy (CTO-10AS/VP)
Kolumna HPLC (średnica wewnętrzna 50 x 2,0 mm, 2,5 i mikro; m, C18)Kolumna HPLC Phenomenex00B-4446-B0
(średnica wewnętrzna 150 x 2,0 mm, 3,0 i mikro; m, C18)Kolumna HPLC Phenomenex00F-4251-B0
(średnica wewnętrzna 250 x 4,6 mm, 5,0 i mikro; m, C18)Phenomenex00G-4252-E0
HPLC C18 wkład ochronny (średnica wewnętrzna 4,0 x 3,0 mm)PhenomenexAJO-4287
alkohol izoamylowySigma-AldrichM32658
alkohol izopropylowy (izopropanol)Carlo Erba OdczynnikiA412790010
ketaminyCevaNazwa handlowa: Dopalen
chlorek magnezuCarlo Erba Odczynniki349377
chlorek magnezuSigmaM2393
metanolCarlo Erba OdczynnikiL022909K7
fosfodiesterazy I z Crotalus atroxSigmaP4506
roztwór do wytrącania białekQIAGEN158912
proteinaza KSigma-AldrichP2308
rybonukleaza ASigmaR5000
sód chlorekSigma-AldrichS9625
SPE-C18 (Strata-X)Phenomenex8B-S100-TAK
tris(hydroksymetylo)-aminometanCarlo Erba Odczynniki489983
ksylazynaSyntec do BrasilNazwa handlowa: Xilazin

Bibliografia

  1. Cadet, J., Davies, K. J. A., Medeiros, M. H. G., Di Mascio, P., Wagner, J. R. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radical Biology and Medicine. 107, 13-34 (2017).
  2. Barnes, J. L., Zubair, M., John, K., Poirier, M. C., Martin, F. L. Carcinogens and DNA damage. Biochemical Society Transactions. 46, 1213-1224 (2018).
  3. Cadet, J., Davies, K. J. A. Oxidative DNA damage & repair: An introduction. Free Radical Biology and Medicine. 107, 2-12 (2017).
  4. Cao, H., Jiang, Y., Wang, Y. Stereospecific synthesis and characterization of oligodeoxyribonucleotides containing an N2-(1-carboxyethyl)-2'-deoxyguanosine. Journal of the American Chemical Society. 129, 12123-12130 (2007).
  5. Breyer, V., et al. Analysis and biological relevance of advanced glycation end-products of DNA in eukaryotic cells. The FEBS Journal. 275, 914-925 (2008).
  6. Tamae, D., Lim, P., Wuenschell, G. E., Termini, J. Mutagenesis and repair induced by the DNA advanced glycation end product N2-1-(carboxyethyl)-2'-deoxyguanosine in human cells. Biochemistry. 50, 2321-2329 (2011).
  7. Hecht, S. S. Lung carcinogenesis by tobacco smoke. International Journal of Cancer. 131, 2724-2732 (2012).
  8. Garraway, L. A., Lander, E. S. Lessons from the cancer genome. Cell. 153, 17-37 (2013).
  9. Ong, T. P., Loureiro, A. P. M. Nutritional interventions in age-related genetic and epigenetic instability and cancer. Anti-ageing nutrients: Evidence-based prevention of age-associated diseases. , John Wiley & Sons. UK. (2015).
  10. Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Cooke, M. S. Oxidative DNA damage and disease: induction, repair and significance. Mutation Research. 567, 1-61 (2004).
  11. Moriya, M. Single-stranded shuttle phagemid for mutagenesis studies in mammalian cells: 8-oxoguanine in DNA induces targeted GC → TA transversions in simian kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1122-1126 (1993).
  12. Medeiros, M. H. G. Exocyclic DNA adducts as biomarkers of lipid oxidation and predictors of disease. Challenges in developing sensitive and specific methods for clinical studies. Chemical Research in Toxicology. 22, 419-425 (2009).
  13. Guéraud, F. 4-Hydroxynonenal metabolites and adducts in pre-carcinogenic conditions and cancer. Free Radical Biology and Medicine. 111, 196-208 (2017).
  14. Nair, U., Bartsch, H., Nair, J. Lipid peroxidation-induced DNA damage in cancer-prone inflammatory diseases: A review of published adduct types and levels in humans. Free Radical Biology and Medicine. 43, 1109-1120 (2007).
  15. Pang, B., et al. Lipid peroxidation dominates the chemistry of DNA adduct formation in a mouse model of inflammation. Carcinogenesis. 28, 1807-1813 (2007).
  16. Møller, P., et al. Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in cellular DNA and urine. Free Radical Research. 46, 541-553 (2012).
  17. Hofer, T., Moller, L. Optimization of the workup procedure for the analysis of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine with electrochemicaldetection. Chemical Research in Toxicology. 15, 426-432 (2002).
  18. Collins, A., El Yamani, N., Dusinska, M. Sensitive detection of DNA oxidation damage induced by nanomaterials. Free Radical Biology and Medicine. , 69-76 (2017).
  19. Zubel, T., Buerkle, A., Mangerich, A. Mass spectrometric analysis of sulfur mustard-induced biomolecular adducts: Are DNA adducts suitable biomarkers of exposure? Toxicology Letters. 293, 21-30 (2018).
  20. Tretyakova, N., Goggin, M., Sangaraju, D., Janis, G. Quantitation of DNA adducts by stable isotope dilution mass spectrometry. Chemical Research in Toxicology. 25, 2007-2035 (2012).
  21. Churchwell, M. I., Beland, F. A., Doerge, D. R. Quantification of multiple DNA adducts formed through oxidative stress using liquid chromatography and electrospray tandem mass spectrometry. Chemical Research in Toxicology. 15, 1295-1301 (2002).
  22. Chao, M. R., Yen, C. C., Hu, C. W. Prevention of artifactual oxidation in determination of cellular 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine by isotope-dilution LC-MS/MS with automated solid-phase extraction. Free Radical Biology and Medicine. 44, 464-473 (2008).
  23. Danielsen, P. H., et al. Oxidative stress, inflammation, and DNA damage in rats after intratracheal instillation or oral exposure to ambient air and wood smoke particulate matter. Toxicological Sciences. 118, 574-585 (2010).
  24. Danielsen, P. H., et al. Oxidative stress, DNA damage, and inflammation induced by ambient air and wood smoke particulate matter in human A549 and THP-1 cell lines. Chemical Research in Toxicology. 24, 168-184 (2011).
  25. Garcia, C. C. M., et al. [13C2]-Acetaldehyde promotes unequivocal formation of 1,N2-propano-2'-deoxyguanosine in human cells. Journal of the American Chemical Society. 133, 9140-9143 (2011).
  26. Angeli, J. P. F., et al. Lipid hydroperoxide-induced and hemoglobin-enhanced oxidative damage to colon cancer cells. Free Radical Biology and Medicine. 51, 503-515 (2011).
  27. Yu, Y., et al. Comprehensive assessment of oxidatively induced modifications of DNA in a rat model of human Wilson's disease. Molecular and Cellular Proteomics. 15, 810-817 (2016).
  28. Torres-Cuevas, I., Aupi, M., Asensi, M. A., Vento, M., Ortega, Á, Escobar, J. 7,8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine/2'-deoxiguanosine ratio determined in hydrolysates of brain DNA by ultrachromatrography coupled to tandem mass spectrometry. Talanta. 170, 97-102 (2017).
  29. Wu, D., et al. Detection of 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) as a biomarker of oxidative damage in peripheral leukocyte DNA by UHPLC-MS/MS. Journal of Chromatography B. 1064, 1-6 (2017).
  30. IARC. Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans: Outdoor Air Pollution. 109, IARC. Lyon, France. (2016).
  31. De Martinis, B. S., Kado, N. Y., Carvalho, L. R. F., Okamoto, R. A., Gundel, L. A. Genotoxicity of fractionated organic material in airborne particles from São. Mutation Research. 446, 83-94 (1999).
  32. Karlsson, H. L., Nygren, J., Möller, L. Genotoxicity of airborne particulate matter: The role of cell-particle interaction and of substances with adduct-forming and oxidizing capacity. Mutation Research. 565, 1-10 (2004).
  33. Bell, M. L., Dominici, F., Ebisu, K., Zeger, S. L., Samet, J. M. Spatial and temporal variation in PM2.5 chemical composition in the United States for health effects studies. Environmental Health Perspectives. 115, 989-995 (2007).
  34. Oliveira, A. A. F., et al. Genotoxic and epigenotoxic effects in mice exposed to concentrated ambient fine particulate matter (PM2.5) from São Paulo city, Brazil. Particle and Fibre Toxicology. 15, 40(2018).
  35. Loureiro, A. P. M., Zhang, W., Kassie, F., Zhang, S., Villalta, P. W., Wang, M., Hecht, S. S. Mass spectrometric analysis of a cyclic 7,8-butanoguanine adduct of N-nitrosopyrrolidine: comparison to other N-nitrosopyrrolidine adducts in rat hepatic DNA. Chemical Research in Toxicology. 22, 1728-1735 (2009).
  36. Loureiro, A. P. M., Marques, S. A., Garcia, C. C. M., Di Mascio, P., Medeiros, M. H. G. Development of an on-line liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry assay to quantitatively determine 1,N2-etheno-2'-deoxyguanosine in DNA. Chemical Research in Toxicology. 15, 1302-1308 (2002).
  37. Mangal, D., et al. Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2′-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress. Chemical Research in Toxicology. 22, 788-797 (2009).
  38. ESCODD (European Standards Committee on Oxidative DNA Damage). Comparative analysis of baseline 8-oxo-7,8-dihydroguanine in mammalian cell DNA, by different methods in different laboratories: an approach to consensus. Carcinogenesis. 23, 2129-2133 (2002).
  39. Helbock, H. J., et al. DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical detection assay of 8-oxo-deoxyguanosine and 8-oxo-guanine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 288-293 (1998).
  40. Risom, L., et al. Oxidative DNA damage and defence gene expression in the mouse lung after short-term exposure to diesel exhaust particles by inhalation. Carcinogenesis. 24, 1847-1852 (2003).
  41. Risom, L., et al. Repeated inhalations of diesel exhaust particles and oxidatively damaged DNA in young oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) deficient mice. Free Radical Research. 41, 172-181 (2007).
  42. Tsurudome, Y., et al. Changes in levels of 8-hydroxyguanine in DNA, its repair and OGG1 mRNA in rat lungs after intratracheal administration of diesel exhaust particles. Carcinogenesis. 20, 1573-1576 (1999).
  43. Marie-Desvergne, C., Maître, A., Bouchard, M., Ravanat, J. L., Viau, C. Evaluation of DNA adducts, DNA and RNA oxidative lesions, and 3-hydroxybenzo(a)pyrene as biomarkers of DNA damage in lung following intravenous injection of the parent compound in rats. Chemical Research in Toxicology. 23, 1207-1214 (2010).
  44. Iwai, K., et al. Early oxidative DNA damages and late development of lung cancer in diesel exhaust-exposed rats. Environmental Research. 84, 255-264 (2000).
  45. Ichinose, T., et al. Lung carcinogenesis and formation of 8-hydroxy-deoxyguanosine in mice by diesel exhaust particles. Carcinogenesis. 18, 185-192 (1997).
  46. Schmerold, I., Niedermu, H. Levels of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in cellular DNA from 12 tissues of young and old Sprague Dawley rats. Experimental Gerontology. 36, 1375-1386 (2001).
  47. Garcia, C. C. M., Freitas, F. P., Di Mascio, P., Medeiros, M. H. G. Ultrasensitive simultaneous quantification of 1,N2-etheno-2'-deoxyguanosine and 1,N2-propano-2'-deoxyguanosine in DNA by an online liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry assay. Chemical Research in Toxicology. 23, 1245-1255 (2010).
  48. Godshalk, R., et al. Comparison of multiple DNA adduct types in tumor adjacent human lung tissue: effect of cigarette smoking. Carcinogenesis. 23, 2081-2086 (2002).
  49. Dechakhamphu, S., et al. Lipid peroxidation and etheno DNA adducts in white blood cells of liver fluke-infected patients: protection by plasma alpha-tocopherol and praziquantel. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 310-318 (2010).
  50. Arab, K., et al. Typical signature of DNA damage in white blood cells: a pilot study on etheno adducts in Danish mother-newborn child pairs. Carcinogenesis. 30, 282-285 (2009).
  51. Nair, J., et al. High dietary omega-6 polyunsaturated fatty acids drastically increase the formation of etheno-DNA base adducts in white blood cells of female subjects. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 6, 597-601 (1997).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

HPLC ESI MS MSilo ciowe oznaczanie uszkodze DNAbiomarkery stresu oksydacyjnegoanaliza addukt w etenowychdetekcja 8 Oxo dGizolacja DNA z tkanekekstrakcja w fazie sta ejizotopowe standardy wewn trzneekspozycja na py zawieszony PM25 w powietrzuobliczanie u amka molowego uszkodze
Kwantyfikacja trzech zmian DNA za pomocą spektrometrii mas i ocena ich poziomów w tkankach myszy narażonych na działanie drobnego pyłu zawieszonego w otoczeniu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.