Rozpoznawanie sekwencji DNA za pomocą prymazy DNA przy użyciu wysokoprzepustowego profilowania prymazów

Summary

Eksperymenty z mikromacierzą wiążącą białka (PBM) w połączeniu z testami biochemicznymi łączą właściwości wiązania i katalityczne primazy DNA, enzymu, który syntetyzuje startery RNA na matrycowym DNA. Metoda ta, określana jako wysokoprzepustowe profilowanie prymasowe (HTPP), może być stosowana do ujawniania wzorców wiązania DNA różnych enzymów.

Abstract

Prymas DNA syntetyzuje krótkie startery RNA, które inicjują syntezę DNA fragmentów Okazaki na opóźnionej nici przez polimerazę DNA podczas replikacji DNA. Wiązanie prokariotycznych prymazów podobnych do DnaG z DNA zachodzi w określonej sekwencji rozpoznawania trinukleotydów. Jest to kluczowy krok w tworzeniu się fragmentów Okazaki. Konwencjonalne narzędzia biochemiczne, które są używane do określania sekwencji rozpoznawania DNA prymazy DNA, dostarczają tylko ograniczonych informacji. Korzystając z wysokoprzepustowego testu wiązania opartego na mikromacierzach i kolejnych analiz biochemicznych, wykazano, że 1) specyficzny kontekst wiązania (sekwencje flankujące miejsce rozpoznania) wpływa na siłę wiązania prymazy DNA z jego matrycowym DNA, oraz 2) silniejsze wiązanie prymazy z DNA daje dłuższe startery RNA, co wskazuje na wyższą procesowość enzymu. Metoda ta łączy PBM i test aktywności prymazy i jest określana jako wysokoprzepustowe profilowanie prymasów (HTPP) i umożliwia scharakteryzowanie rozpoznawania specyficznych sekwencji przez prymazę DNA w niespotykanym dotąd czasie i skalowalności.

Introduction

HTPP wykorzystuje technologię mikromacierzy wiążących DNA w połączeniu z analizą biochemiczną (Rysunek 1) do statystycznej identyfikacji specyficznych cech matryc DNA, które wpływają na aktywność enzymatyczną prymazy DNA. Dlatego HTPP zapewnia platformę technologiczną, która ułatwia skok wiedzy w tej dziedzinie. Klasyczne narzędzia używane do wyznaczania miejsc rozpoznawania prymasowego nie mają możliwości uzyskania ogromnych ilości danych, podczas gdy HTPP ma.

PBM jest techniką rutynowo używaną do określania preferencji wiązania czynników transkrypcyjnych z DNA^1,2; jednak nie nadaje się do wykrywania słabego/przejściowego wiązania białek z DNA. W przeciwieństwie do uniwersalnego PBM, który dostarcza informacji o średniej specyficzności wiązania białek ze wszystkimi możliwymi sekwencjami składającymi się z ośmiu par zasad, HTPP opiera się na bibliotece jednoniciowych matryc DNA zawierających unikalne elementy sekwencji. Takie elementy sekwencji DNA obejmują dziesiątki tysięcy krótkich (kilkadziesiąt pz) sekwencji genomowych, a także obliczeniowo zaprojektowane sekwencje DNA wzbogacone o pewne powtarzalne elementy sekwencji DNA obecne w genomie, które mają różną średnią zawartość GC. Takie wysokoprzepustowe podejście pozwala na określenie, w sposób systematyczny, ilościowy i oparty na hipotezach, właściwości związanych z sekwencją, które są ważne dla wiązania prymazy i jej aktywności enzymatycznej³. W szczególności zidentyfikowano ważny związek między preferencjami wiązania prymazyny-DNA (modulowanymi przez sekwencje DNA flankujące określone miejsca wiązania trinukleotydów) a procesywnością prymów dla tego układu enzymatycznego⁴.

Nowa technologia została zastosowana do ponownego zbadania naszego rozumienia miejsc rozpoznawania prymazów, nawet dla prymazy DNA T7, która została gruntownie zbadana⁵. W szczególności ponowne zbadanie klasycznych koncepcji, takich jak miejsca rozpoznawania DNA prymazy DNA T7 (które zostały określone prawie cztery dekady temu ⁶) przy użyciu mikromacierzy wiążącej białko-DNA (PBM) doprowadziło do bezprecedensowego wglądu w cechy związane z sekwencją flankującą tych miejsc rozpoznawania³. Spodziewano się, że sekwencje flankujące miejsce rozpoznawania trinukleotydów prymazy DNA T7 (5'-GTC-3') będą losowe. Zamiast tego odkryliśmy, że bogate w TG sekwencje flankujące zwiększają szanse prymazy DNA T7 na syntezę dłuższych starterów RNA, co wskazuje na wzrost procesowości.

Inne metody, które mogą być użyte do badania właściwości wiązania DNA przez białka in vitro, to test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA)⁷, ślad DNazy I⁸, powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR)⁹, oraz Southwestern blotting¹⁰. Są to jednak metody niskoprzepustowe, które można zastosować tylko do badania niewielkiej liczby sekwencji DNA. Ponadto precyzja i czułość niektórych z tych technik (np. EMSA) jest niska. Z drugiej strony, selekcja in vitro¹¹ to technika, która podobnie jak PBM może być stosowana do identyfikacji wielu sekwencji wiążących. Jednak sekwencje o niskim powinowactwie są zwykle wykluczane w większości zastosowań selekcji in vitro; W związku z tym podejście to nie jest odpowiednie do uzyskiwania porównawczych danych wiążących dla wszystkich dostępnych sekwencji. Uniwersalny PBM^1,2 jest używany głównie do charakteryzowania specyficzności wiązania czynników transkrypcyjnych od prokariontów i eukariontów, a także specyficznych czynników (np. obecności niektórych ligandów, kofaktorów itp.), które mogą wpływać na tę interakcję¹².

HTPP rozszerza zastosowanie PBM o enzymy przetwarzające DNA, łącząc bezprecedensową moc statystyczną o wysokiej przepustowości z wysoką precyzją, aby dostarczyć informacji o kontekście sekwencji wiązania. Takie dane nie zostały jeszcze uzyskane dla prymasów i pokrewnych enzymów (które mają słabe/przejściowe wiązanie z DNA) ze względu na wyżej wymienione ograniczenia techniczne innych dostępnych technik.

Protocol

1. Projektowanie mikromacierzy

UWAGA: Sondy DNA reprezentują niestandardowe sekwencje 36-nukleotydowe, składające się z miejsca rozpoznania dla prymazy DNA T7 (GTC) znajdującego się pomiędzy dwoma zmiennymi regionami flankującymi, po którym następuje stała sekwencja 24-nukleotydowa przywiązana do szkiełka elementarnego³. Użyliśmy formatu mikromacierzy 4 x 180 000, który umożliwił wykrycie każdej sekwencji DNA w sześciu powtórzeniach, losowo rozmieszczonych na szkiełku.

1. Projektowanie biblioteki DNA dla prymazów ze znanymi sekwencjami rozpoznawczymi
   1. Upewnij się, że każda sekwencja składa się z 60 nukleotydów. Utrzymuj pierwsze 24 nukleotydy na stałym poziomie (do przymocowania do szkiełka podstawowego). Regiony zmienne powinny mieć następującą postać ogólną: (N)₁₆GTC(N)₁₇; gdzie N reprezentuje dowolny pożądany nukleotyd.
   2. Zaprojektuj obszar flankujący w taki sposób, aby odpowiadał na konkretne pytanie naukowe (przykład projektu przedstawiono w poniższym tekście). Obszary flankujące mogą być zaprojektowane tak, aby zawierały określone cechy, takie jak powtarzające się elementy lub określona symetria.
      UWAGA: Stworzyliśmy osiem kategorii różnych sekwencji flankujących złożonych z dwóch lub trzech specyficznych nukleotydów: T i G (grupa 1); T i C (grupa 2); C i A (grupa 3); A i G (grupa 4); G, C i T (grupa 5); C, T i A (grupa 6); G, A i T (grupa 7); G, A i C (grupa 8). Dla każdej grupy zaprojektowano 2000 różnych sekwencji. Każda grupa miała podgrupy sekwencji o różnych typach i różnej liczbie powtórzeń sekwencji.
   3. Dołącz zestaw sekwencji kontroli ujemnej (bez określonego miejsca wiązania)⁴. Obecność takich sekwencji pozwala na walidację występowania specyficznego wiązania w eksperymencie.
2. Projektowanie biblioteki DNA dla prymatów o nieznanych sekwencjach rozpoznających
   1. Jeśli sekwencja rozpoznawania jest nieznana, utwórz bibliotekę DNA, wybierając sekwencje (z lub bez specyficznych cech wymienionych wcześniej) z genomu pożądanego organizmu (bakterii, grzybów itp.).
3. Projekt szkiełka mikromacierzowego
   1. Kup niestandardowe slajdy (np. 4x180K, AMADID #78366) od komercyjnego dostawcy (więcej informacji znajdziesz w Tabeli materiałów). Uporządkuj każdą sekwencję w sześciu powtórzeniach, z których każda powinna być dołączona do losowo wybranego miejsca na szkiełku.

2. Eksperyment z wiązaniem DNA prymusu

UWAGA: Dzień przed (lub co najmniej 2 godziny przed) PBM, przygotuj roztwór blokujący [2% w/v odtłuszczonego mleka w buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS)] i wymieszaj go na mieszadle magnetycznym. Przed użyciem przefiltrować roztwór filtrem 0,45 μM. Aby wykryć wiązanie prymazy z niciami DNA, należy wykonać kilka kroków w następującej kolejności.

1. Procedura blokowania
   1. Wstępnie zwilż szkiełko do mikromacierzy w słoiku Coplin 0,01% v/v Triton X-100 w PBS (5 minut przy 125 obr./min na rotatorze laboratoryjnym).
   2. Krótko umyj szkiełko uszczelki (zwane również szkiełkiem nakrywkowym) wodą i etanolem i wysusz sprężonym powietrzem.
   3. Zamontuj dolną część stalowej komory hybrydyzacyjnej (komora PBM) z suwakiem uszczelki skierowanym do góry (etykieta handlowa skierowana do góry). Więcej informacji na temat montażu można znaleźć w Tabeli materiałów.
   4. Roztwór blokujący pipety (2% w/v odtłuszczonego mleka w PBS) do każdej komory.
   5. Wyjmij szkiełko z mikromacierzy ze słoika Coplin, a następnie osusz stronę niezawierającą DNA (DNA powinno znajdować się po tej samej stronie co etykieta firmy) i krawędzie za pomocą drobnej ściereczki. Powoli umieść mikromacierz na suwaku uszczelki, unikając pęcherzyków powietrza (etykieta firmowa skierowana w dół). Natychmiast zmontuj i dokręć stalową aparaturę komory hybrydyzacyjnej. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT).
   6. Napełnij jedno naczynie do barwienia (naczynie "PBS") 800 ml świeżego PBS. Napełnij drugie naczynie do barwienia (naczynie "WASH") 800 ml świeżo przygotowanego 0.5% v/v Tween-20 w PBS.
   7. Odkręć komorę PBM i wyjmij "kanapkę" z szkiełkiem nakrywkowym do mikromatrycy, uważając, aby nie naruszyć uszczelki. Zdemontuj go pod wodą w naczyniu do mycia, umieszczając kleszcze między szkiełkiem a szkiełkiem nakrywkowym.
   8. Potrząśnij szkiełkiem z mikromacierzą pod wodą i szybko przenieś do słoika z koplinu.
   9. Umyć raz 0,1% v/v Tween-20 w PBS (5 min przy 125 obr./min na rotatorze laboratoryjnym).
   10. Umyć raz 0,01% v/v Triton X-100 w PBS (2 min przy 125 obr./min na rotatorze laboratoryjnym).
   11. Szybko przenieś szkiełko do słoika Coplin zawierającego PBS.
2. Białkami
   1. Zamontuj komorę PBM zgodnie z wcześniejszym opisem (kroki 2.1.2–2.1.3).
   2. Mieszanina wiążąca białka pipety zawierająca 5 μM prymazy DNA T7, 30 mM Tris-HCl pH 7,5, 6,5 mM MgCl₂, 30 mM K-glutaminianu, 6 mM ditiotreitolu (DTT), trifosforan rybonukleozydu 65 μM (rNTP), 2% w/v odtłuszczonego mleka, 100 ng/μL albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 50 ng/μL DNA jąder łososia i 0,02% v/v Triton X-100 (TX-100) do każdej komory szkiełka uszczelniającego (bez dotykania gumowych boków i bez wprowadzania bąbelki).
   3. Krótko przepłukać szkiełko do mikromacierzy, zanurzając je w naczyniu PBS, które usuwa nadmiar detergentu z powierzchni szkiełek. Przetrzyj powierzchnie szkiełka niebędące DNA drobną ściereczką.
   4. Powoli opuść suwak mikromacierzy (skierowany w dół) na suwak uszczelki, uważając, aby zapobiec wyciekom z jednej komory do drugiej. Natychmiast zmontować i dokręcić aparaturę komorową PBM bez wprowadzania pęcherzyków. Jeśli pojawią się bąbelki, można je usunąć, delikatnie stukając stalową komorą o twardą powierzchnię.
   5. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
3. Przyłączanie przeciwciał fluorescencyjnych
   1. Odkręć komorę PBM i wyjmij "kanapkę" z szkiełkiem nakrywkowym do mikromatrycy, uważając, aby nie naruszyć uszczelki. Zdemontuj pod wodą w naczyniu WASH za pomocą kleszczy. Potrząśnij zjeżdżalnią pod wodą i szybko przenieś do słoika Coplin zawierającego PBS.
   2. Zamontuj komorę PBM z suwakiem uszczelki zgodnie z wcześniejszym opisem (kroki 2.1.2–2.1.3).
   3. Dodaj przeciwciało anty-his sprzężone z Alexa 488 (10 ng / μL w buforze wiążącym) do szkiełka uszczelki.
   4. Krótko przepłucz szkiełko, zanurzając je w naczyniu PBS jak poprzednio, a następnie powoli wyjmij szkiełko z PBS, wytrzyj powierzchnię niezawierającą DNA i umieść ją skierowaną w dół na szkiełku uszczelniającym.
   5. Inkubuj 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności (sonda fluorescencyjna jest wrażliwa na światło), aby zmniejszyć fotowybielanie.
   6. Zdemontuj komorę PBM i szkiełko nakrywkowe jak poprzednio, wyjmując szkiełko nakrywkowe pod wodą w naczyniu do mycia.
   7. Krótko opłucz szkiełka, zanurzając je w naczyniu PBS. Osuszyć szkiełka sprężonym powietrzem. Przechowuj w ciemności w pudełku na slajdy, aż będzie gotowy do skanowania.
4. Skanowanie szkiełka z mikromacierzą
   1. Zeskanuj chip za pomocą skanera mikromacierzowego (patrz Tabela materiałów) o wzbudzeniu 495 nm i emisji 519 nm i zbierz medianę intensywności fluorescencji.

3. Analiza danych z mikromacierzy

UWAGA: Wszystkie dane zostały przetworzone za pomocą niestandardowych skryptów w MATLAB.

1. Wykonaj początkowe przetwarzanie danych PBM przy użyciu wartości p testu sumy rang Wilcoxona, jak opisano wcześniej⁴.
2. Do dalszej analizy należy wykorzystać medianę intensywności wiązania dla każdej sekwencji DNA.
3. Następnie, korzystając z jednoczynnikowych wartości p ANOVA, porównaj istotność statystyczną zaobserwowanych różnic w intensywności wiązania prymasyz-DNA uzyskanych dla różnych grup sond DNA, jak wyjaśniono powyżej w sekcji projektowania biblioteki DNA³.

4. Synteza RNA sterowana przez matrycę katalizowana przez prymazę DNA T7

1. Przygotowanie denaturującego żelu poliakryloamidowego
   1. Aby przygotować 100 ml mieszaniny żelu, połącz 62,5 ml 40% bisakryloamidu akryloamidu (19:1), 42 g mocznika, 1,1 g zasady Tris (2-amino-2-(hydroksymetylo)-1,3-propanodiolu), 0,55 g kwasu borowego i 0,4 ml 0,5 M roztworu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).
   2. Podzielić mieszaninę na 14 ml porcji (ilość potrzebna na jeden żel o wymiarach 16,5 cm x 26 cm x 0,03 cm) i chronić je przed światłem w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
   3. Aby przygotować jeden denaturujący żel poliakrylamidowy, należy dodać 4 μl TEMED i 40 μl 10% w/v nadsiarczanu amonu do 14 ml wcześniej przygotowanej mieszaniny, odlać go i pozostawić do polimeryzacji na co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej. Żel można przechowywać przez jeden dzień w temperaturze 4 °C.
2. Przygotowanie próbki
   UWAGA: Odczynniki, mieszaninę reakcyjną i próbki należy przechowywać na lodzie.
   1. Aby przygotować mieszaninę reakcyjną wymaganą do dziesięciu reakcji, połącz 11 μL 5x aktywnego buforu (200 mM Tris-HCl, pH = 7,5; 50 mM ditiotreitol, 250 mM glutaminianu potasu, 50 mM MgCl₂), 5,5 μL mieszaniny 2,5 mM trifosforanu nukleotydów (NTP) i 5,5 μl znakowanego radioaktywnie rybonukleotydu [np. ATP, (α-32P) 3000 Ci/mmol].
      UWAGA: Wszystkie ilości zostały zwiększone o 10% ze względu na możliwe błędy pipetowania. Rybonukleotydy znakowane radioaktywnie należy rozcieńczyć zgodnie z siłą sygnału radioaktywnego (początkowe rozcieńczenie wynosi zwykle 1:10 lub więcej).
   2. Przenieść 2 μl mieszaniny reakcyjnej do dziesięciu probówek PCR.
   3. Dodaj 1 μl 100 μM matrycy DNA do odpowiedniej probówki PCR i odwiruj.
   4. Dodaj 2 μl 16 μM prymazy DNA T7, odwiruj, delikatnie wymieszaj i ponownie odwiruj.
   5. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
   6. Zatrzymaj reakcję, dodając 5 μl roztworu hartującego (95% formamidu, 20 mM EDTA, 0,05% w/v cyjanolu ksylenowego i błękitu bromofenolowego), wymieszaj i odwiruj.
3. Separacja produktów RNA za pomocą elektroforezy poprzez denaturację żelu poliakrylamidowego i późniejsza detekcja sygnału
   1. Uruchom żel przez 1 godzinę (10 mA, 600 V) w 1x buforze TBE (90 mM Tris-boran, 2 mM EDTA).
   2. Załadować do 2 μl każdej próbki i przeprowadzić elektroforezę (20 mA, 1100 V) w 1x buforze TBE (90 mM Tris-boran, 2 mM EDTA).
   3. Suszyć żel przez 2 godziny w temperaturze 80 °C w próżni
   .
   4. Wystawić płytkę obrazowania luminoforowego na działanie radioaktywnego żelu przez kilka godzin do nocy, w zależności od siły sygnału radioaktywnego.
   5. Nagrać sygnał (luminescencja fotostymulowana) za pomocą luminowizora (patrz Tabela Materiałów).

Results

Ten postęp technologiczny w mapowaniu miejsc wiązania prymasów pozwala na uzyskanie właściwości wiązania DNA, które są trudne, jeśli nie niemożliwe, do zaobserwowania przy użyciu klasycznych narzędzi. Co ważniejsze, HTPP umożliwia ponowne przyjrzenie się tradycyjnemu rozumieniu miejsc wiązania prymazy. W szczególności HTPP ujawnia specyficzność wiązania oprócz znanych sekwencji rozpoznawania 5'-GTC-3', co prowadzi do zmian w czynnościach funkcjonalnych prymazy DNA T7. Mianowicie, zidentyf...

Discussion

Metoda PBM jest szeroko stosowana do badania właściwości wiązania czynników transkrypcyjnych i może być również stosowana do enzymów przetwarzających DNA, takich jak prymaza DNA, które wiążą się z DNA o niskim powinowactwie. Wymagane są jednak pewne modyfikacje procedur eksperymentalnych. Eksperyment z mikromacierzą składa się z kilku etapów: zaprojektowania biblioteki DNA, przygotowania chipa, wiązania celu białkowego, znakowania fluorescencyjnego i skanowania. Łagodne etapy mycia mają kluczowe znaczenie, ponieważ długi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% roztwór akryloamidu i bisakryloamidu (19:1)	Merck	1006401000
95% formamid	Sigma-Aldrich	F9037-100ML
Alexa 488-sprzężone przeciwciało anty-he	Qiagen	35310
Nadsiarczan amonu (APS)	Sigma-Aldrich	A3678-100G
ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol	Perkin Elmer
Kwas borowy, granulowany	Glentham Life Sciences	GE4425
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Roche	10735094001
Błękit bromofenolowy	Sigma-Aldrich	B0126-25G
Słoik
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-25G
DNA mikromacierz	Agilent		4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Acros Organics	AC118430010
Fujifilm FLA-5100 luminowizator	FUJIFILM Life Science
Stojak do barwienia szkiełek	Thermo Scientific	12869995	Jeśli używanych jest kilka szkiełek
Rotator	laboratoryjnyThermo Scientific	88880025
Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	63064-500G
Komora do hybrydyzacji mikromacierzy	Agilent	G2534A	https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf
Skaner mikromacierzy (GenePix 4400A)	Urządzenia molekularne
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
Glutaminian potasu	Alfa Aesar	A172232
Mieszanka roztworów rybonukleotydów (rNTPs)	New England BioLabs	N0466S Jądra
łososia DNA	Sigma-Aldrich	D1626-1G
Odtłuszczone mleko w proszku	Sigma-Aldrich	70166-500G
Naczynie barwiące	Thermo Scientific
Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)	Bio-Rad	1610800
Tris zasada (2-Amino-2-(hydroksymetylo)-1,3-propanodiol)	Sigma-Aldrich	93362-500G
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML
Mocznik	Sigma-Aldrich	U6504-1KG
Cyjanol ksylenowy	Alfa Aesar	B21530