Artykuł metodologiczny

Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

DOI:

10.3791/59750

⸱

20 lipca 2019

 , 
1Neural Circuits Research Group, Korea Brain Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organelle komórkowe, takie jak mitochondria i retikulum endoplazmatyczne (ER), tworzą sieć do wykonywania różnych funkcji. Te wysoce zakrzywione struktury są składane w różne kształty, tworząc dynamiczną sieć w zależności od warunków komórkowych. Wizualizację tej sieci między mitochondriami a ER podjęto przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości i mikroskopii świetlnej; jednak ograniczona rozdzielczość jest niewystarczająca do szczegółowej obserwacji błon między mitochondriami a ER. Transmisyjna mikroskopia elektronowa zapewnia dobry kontrast błonowy i rozdzielczość w skali nanometrowej do obserwacji organelli komórkowych; jednak jest to wyjątkowo czasochłonne przy ocenie trójwymiarowej (3D) struktury wysoce zakrzywionych organelli. Dlatego obserwowaliśmy morfologię mitochondriów i ER za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej (CLEM) i technik objętościowej mikroskopii elektronowej przy użyciu wzmocnionej peroksydazy askorbinianowej 2 i barwienia peroksydazą chrzanową. Do obserwacji struktury 3D zastosowano metodę barwienia en bloc, ultracienkie cięcie seryjne (tomografia matrycowa) i objętościową mikroskopię elektronową. W tym protokole sugerujemy połączenie CLEM i mikroskopii elektronowej 3D w celu przeprowadzenia szczegółowych badań strukturalnych mitochondriów i ER.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria i retikulum endoplazmatyczne (ER) są organellami komórkowymi związanymi z błoną. Ich połączenie jest niezbędne do ich funkcjonowania, a białka związane z ich siecią zostały opisane1. Odległość między mitochondriami a ER została opisana jako około 100 nm przy użyciu mikroskopii świetlnej2; jednak ostatnie badania mikroskopii superrozdzielczej3 i mikroskopii elektronowej (EM)4 wykazały, że jest ona znacznie mniejsza, przy około 10-25 nm. Rozdzielczość osiągnięta w mikroskopii superrozdzielczej jest niższa niż w przypadku EM i konieczne jest specyficzne znakowanie. EM jest odpowiednią techniką do uzyskania wystarczająco wysokiego kontrastu w rozdzielczości do badań strukturalnych połączeń między mitochondriami a ER. Wadą jest jednak ograniczona informacja o osi z, ponieważ cienkie sekcje muszą być około 60 nm lub cieńsze w przypadku konwencjonalnej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Aby uzyskać wystarczające obrazowanie w osi Z, można użyć trójwymiarowej mikroskopii elektronowej (3DEM)5. Wiąże się to jednak z przygotowaniem setek cienkich odcinków szeregowych całych ogniw, co jest bardzo trudną pracą, którą opanowało tylko kilku wykwalifikowanych technologów. Te cienkie skrawki są zbierane na kruchych, jednootworowych, pokrytych folią formvar siatkach TEM. Jeśli film pęknie na jednym pasku, obrazowanie seryjne i rekonstrukcja objętości nie są możliwe. Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa z powierzchnią blokową (SBEM) jest popularną techniką dla 3DEM, która wykorzystuje destrukcyjne cięcie en bloc wewnątrz komory próżniowej skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) za pomocą noża diamentowego (Dik-SBEM) lub skupionej wiązki jonów (FIB-SEM)6. Ponieważ jednak techniki te nie są dostępne we wszystkich obiektach, sugerujemy tomografię macierzową7 z wykorzystaniem sekcji szeregowych i SEM. W tomografii matrycowej seryjne odcinki wycięte za pomocą ultramikrotomu są przenoszone na szklane szkiełko nakrywkowe zamiast na siatkę TEM i wizualizowane za pomocą mikroskopii świetlnej i SEM8. Aby wzmocnić sygnał do obrazowania elektronów z rozproszeniem wstecznym (BSE), wykorzystaliśmy protokół barwienia en bloc EM wykorzystujący komórki utrwalone tetratlenkiem osmu (OsO4) z osmiofilowym tiokarbohydrazydem (TCH)9, co umożliwiło nam uzyskanie obrazów bez podwójnego barwienia po osadzeniu.

Dodatkowo, marker mitochondrialny SCO1 (białko 1 zespołu oksydazy cytochromu c) – peroksydaza askorbinianowa 2 (APEX2)10 znacznik molekularny został użyty do wizualizacji mitochondriów na poziomie EM. APEX2 wynosi około 28 kDa i pochodzi z peroksydazy askorbinianu sojowego11. Został on opracowany w celu pokazania szczegółowej lokalizacji określonych białek na poziomie EM w taki sam sposób, w jaki białko znakowane zieloną fluorescencją jest używane w mikroskopii świetlnej. APEX2 przekształca 3,3'-diaminobenzydynę (DAB) w nierozpuszczalny polimer osmiofilowy w miejscu znacznika w obecności kofaktora nadtlenku wodoru (H2O2). APEX2 może być stosowany jako alternatywa dla tradycyjnego znakowania przeciwciał w EM, z lokalizacją białka na całej głębokości komórki. Innymi słowy, białko znakowane APEX2 może być wizualizowane przez specyficzną osmikację11 bez znakowania immunogold i przenikania po ultra-kriosekcji. Peroksydaza chrzanowa (HRP) jest również wrażliwym znacznikiem, który katalizuje zależną odH2O2polimeryzację DAB do zlokalizowanego osadu, zapewniając kontrast EM po leczeniu OsO 4. Sekwencja docelowego peptydu ER HRP-KDEL (lys-asp-glu-leu)12 została zastosowana do wizualizacji ER w całej komórce. Aby ocenić nasz protokół wykorzystania znaczników genetycznych i barwienia en bloc ze zredukowanym osmem i TCH (metoda rOTO), wykorzystując jednocześnie efekt osmikacji, porównaliśmy kontrast błony z użyciem i bez użycia każdego znacznika genetycznego w barwieniu rOTO en bloc. Chociaż 3DEM z tomografią matrycową i barwienie DAB za pomocą APEX i HRP zostały wykorzystane odpowiednio do innych celów, nasz protokół jest wyjątkowy, ponieważ połączyliśmy tomografię matrycową do barwienia 3DEM i DAB do znakowania mitochondriów i ER. W szczególności pokazaliśmy pięć komórek z genami znakowanymi przez APEX i bez nich w tej samej sekcji, co pomogło w zbadaniu wpływu modyfikacji genetycznej na komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa z wzorzystą siatkową miską hodowlaną i transfekcją komórek za pomocą wektora plazmidowego SCO1-APEX2 i HRP-KDEL

  1. Wysiewaj 1 x 105 HEK293T komórek, umieszczając je w 35-milimetrowych szklanych naczyniach hodowlanych z siatką w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 w temperaturze 37 °C w zmodyfikowanej pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 100 U/ml penicyliny i 100 U/ml streptomycyny.
  2. Dzień po wysianiu komórek, gdy osiągną one 50%-60% konflufluencji, należy wprowadzić do komórek plazmid SCO1-APEX210 i HRP-KDEL12 za pomocą odczynnika do transfekcji zgodnie z instrukcją producenta (SCO1-APEX2 cDNA 0,5 μg + HRP-KDEL plazmidowe DNA 0,5 μg na 3 μL odczynnika do transfekcji).

2. Mikroskopia świetlna komórek rosnących na wzorzystych szalkach hodowlanych i barwienie DAB dla APEX2 i HRP

  1. Po 16-24 godzinach od transfekcji usunąć wszystkie podłoża hodowlane i natychmiast dodać 250 μl ciepłego (30-37 °C) roztworu utrwalającego (Tabela 1) poprzez delikatne pipetowanie. Natychmiast usunąć roztwór utrwalający i zastąpić go 1,5 ml świeżego roztworu utrwalającego. Inkubować na lodzie przez 60 minut, a następnie przemywać trzykrotnie przez 10 minut każdy w 1 ml lodowatego 0,1 M buforu kakodylanu sodu (Tabela 1).
    UWAGA: Opary aldehydów są niezwykle toksyczne. Wszystkie prace należy wykonywać pod wentylowanym wyciągiem.
  2. Dodać 1 ml zimnego (0-4 °C) 20 ml roztworu glicyny i inkubować przez 10 minut na lodzie, a następnie trzy płukania po 5 minut każde w 1 ml zimnego 0,1 M buforu kakodylanu sodu.
  3. Przygotuj świeży 1x roztwór DAB (3,33 ml 0,3 M roztworu kakodylanu + 10 μL 30% H2O2 + 5,67 ml zimnej wody + 1 ml 10 x roztwór DAB).
  4. Dodać 500 μl świeżo przygotowanego roztworu 1x DAB (krok 2.3) i inkubować na lodzie przez około 5-45 minut, aż pod mikroskopem światła odwróconego pojawi się jasnobrązowe zabarwienie (Rysunek 1A).
  5. Delikatnie usunąć roztwór DAB i spłukać trzykrotnie 1 ml zimnego 0,1 M buforu kakodylanu sodu przez 10 minut każdy.
  6. Użyj mikroskopu odwróconego z kontrastem fazowym (lub mikroskopu światła jasnego pola), aby zobrazować barwienie DAB przy powiększeniu 100x lub większym. Użyj markera, aby zaznaczyć spód szklanki, w której znajduje się obszar zainteresowania (ROI) (Rysunek 1B,C).

3. Przygotowanie próbki do bloku EM

  1. Wykonaj hodowlę komórkową i barwienie DAB zgodnie z opisem w krokach 2.1-2.6.
  2. Po utrwaleniu próbek 1 ml 2% zredukowanego OsO4 przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Opary OsO4 są wysoce toksyczne. Wszystkie prace należy wykonywać pod wentylowanym wyciągiem.
  3. Przygotować nowy roztwór TCH (Tabela 1) w kroku 3.2 i przepuścić przez filtr 0,22 μm.
    UWAGA: Opary TCH są wysoce toksyczne. Wszystkie prace należy wykonywać pod wentylowanym wyciągiem.
  4. Usuń utrwalacz i spłucz trzy razy 1 ml wody destylowanej przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  5. Umieścić komórki w 1 ml wcześniej przygotowanego i przefiltrowanego roztworu TCH na 20 minut w temperaturze pokojowej
  6. Przepłucz komórki trzy razy 1 ml wody destylowanej przez 5 minut każda w temperaturze pokojowej temperatury.
  7. Wystaw komórki po raz drugi na działanie 1 ml 2% tetratlenku osmu w wodzie destylowanej przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Usunąć utrwalacz i płukać trzy razy 1 ml wody destylowanej przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 1 ml 1% octanu uranylu (wodnego) i pozostawić na noc w temperaturze 4 °C w ciemności.
  9. Umyj komórki trzy razy w 1 ml wody destylowanej przez 5 minut w temperaturze pokojowej temperatury.
  10. Roztwór asparaginianu ołowiu Waltona (Tabela 1) podgrzać w piecu w temperaturze 60 °C przez 30 minut.
  11. Wybarwić komórki roztworem asparaginianu ołowiu Waltona, dodając 1 ml wstępnie podgrzanego roztworu asparaginianu ołowiu, a następnie umieścić w piekarniku na 30 minut w temperaturze 60 °C.
  12. Przepłucz komórki trzy razy 1 ml wody destylowanej przez 5 minut każda w temperaturze pokojowej temperatury.
  13. Inkubować w stopniowanej serii 2-mililitrowych podwielokrotności etanolu (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) przez 20 minut każdy w temperaturze pokojowej.
  14. Zdekantować etanol i inkubować przez 30 minut w 1 ml etanolu 3:1: pożywka do zatapiania o niskiej lepkości w temperaturze pokojowej.
  15. Usuń pożywkę i dodaj 1 ml pożywki 1:1 etanolu: mieszaniny o niskiej lepkości. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  16. Usuń pożywkę i dodaj 1 ml pożywki w postaci etanolu o niskiej lepkości w proporcji 1:3. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  17. Usuń pożywkę i dodaj 1 ml pożywki do zatapiania w 100% o niskiej lepkości i inkubuj przez noc.
  18. Zanurzyć próbkę w 100% mieszaninie do zatapiania o niskiej lepkości i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 60 °C.
  19. Przygotuj skrawki o grubości 90 nm za pomocą ultramikrotomu.
  20. Obserwować sieć pod TEM przy napięciu 200 kV.

4. Seryjne cięcie i montaż na szkiełkach nakrywkowych pokrytych tlenkiem indu i cyny do obrazowania SEM

  1. Przygotowanie podłoża
    1. Szkiełka nakrywkowe pokryte tlenkiem indu i cyny (ITO) należy czyścić przez delikatne mieszanie w izopropanolu przez 30-60 s.
    2. Usuń szkiełka nakrywkowe, odcedź nadmiar izopropanolu i pozostaw w miejscu wolnym od kurzu do wyschnięcia.
    3. Szkiełka nakrywkowe ze szkła powlekanego ITO należy traktować wyładowaniem jarzeniowym za pomocą powlekarki plazmowej przez 1 min.
      UWAGA: Aktywacja plazmą nadaje powierzchni podłoża właściwości hydrofilowe. Tworzy bardzo cienką warstwę wody na podłożu, aby zapobiec tworzeniu się zmarszczek w sekcjach, gdy sekcja jest przymocowana do podłoża.
    4. Włóż szkiełka nakrywkowe ze szkła powlekanego ITO do uchwytu podłoża i umieść w łódce z nożem.
  2. Przycinanie bloku próbki i cięcie seryjne
    1. Włożyć blok próbki do uchwytu na próbkę ultramikrotomu i umieścić w bloku przycinania.
    2. Użyj żyletki, aby odciąć nadmiar żywicy wokół pozycji docelowej (określonej w kroku 2.6, Rysunek 1D-G). Kształt czoła bloku powinien być trapezowy lub prostokątny. Krawędź natarcia i krawędź spływu muszą być absolutnie równoległe (Rysunek 1H,I).
    3. Umieść uchwyt na próbkę na ramieniu ultramikrotomu i umieść nóż diamentowy w uchwycie noża. Włóż szklane szkiełka nakrywkowe ITO do nośnika taśmy i clamp nośnik za pomocą uchwytu (Rysunek 1J). Umieść nośnik wstążki w łodzi z nożem i napełnij łódkę noża przefiltrowaną wodą destylowaną (Rysunek 1K).
    4. Wyreguluj pozycję nośnika za pomocą suwaka noża, ostrożnie popychając uchwyt uchwytu, aby ustawić krawędź szkła ITO blisko noża (Rysunek 1L).
    5. Po przecięciu odcinka zatrzymaj proces cięcia i powoli odkręć mocującą rurkę i opróżnij łódkę wodną (natężenie przepływu jednej kropli wody na sekundę).
    6. Po zakończeniu procesu zbierania taśmy usuń podłoże za pomocą uchwytu urządzenia zaciskowego i wysusz taśmę (Rysunek 1M).

5. Obrazowanie w SEM i wyrównanie stosu obrazów SEM

  1. Zamontuj szkiełko nakrywkowe z powłoką ITO na aluminiowych króćcach za pomocą lepkiej taśmy węglowej. Uszczelnij powierzchnię szkła i powierzchnię w króćcu lepką taśmą węglową, a następnie pokryj warstwą węgla o grubości 10 nm (rysunek 1N).
  2. Obserwować szkiełko nakrywkowe z powłoką ITO w polu emisyjnym SEM przy niskim napięciu przyspieszenia wynoszącym 5 kV i w odpowiedniej odległości roboczej dla skutecznego zbierania BSE.
  3. Zaimportuj obrazy szeregowe do oprogramowania Image J (Fiji)13 za pomocą opcji stosu wirtualnego. Otwórz nowy TrakEM14 i zaimportuj stos obrazów do TrakEM. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz menu wyrównania.
  4. Następnie wybierz zakres obrazu (od pierwszego do ostatniego obrazu). Zakończ automatyczne wyrównywanie, zapisz wyrównany zestaw danych i wybierz opcję eksportuj, aby skompilować płaski obraz z wybranego zakresu obrazów (od pierwszego do ostatniego obrazu). Na koniec zapisz dane płaskiego obrazu w formacie AVI w menu głównym Image J.
    UWAGA: Film uzupełniający 1 i Film uzupełniający 2 pokazują odpowiednio stos obrazów SEM i stos przyciętych obrazów.

6. Segmentacja mitochondriów i ER na podstawie obrazów seryjnych

  1. Uruchom 3dmod w oprogramowaniu IMOD15 i otwórz pliki obrazów.
  2. W oknie ZaP narysuj kontur mitochondriów i ER za pomocą środkowego przycisku myszy.
  3. Aby zwizualizować podzieloną na segmenty objętość, otwórz okno Widok modelu (film uzupełniający 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 opisuje harmonogram i przepływ pracy dla tego protokołu. Protokół wymaga 7 dni; jednak w zależności od czasu poświęconego na obrazowanie SEM może się to wydłużyć. W przypadku transfekcji komórek należy kontrolować zbieganie się komórek, aby nie pokrywało dna całej płytki siatki (rysunek 1A). Duża gęstość komórek może uniemożliwić identyfikację komórki będącej przedmiotem zainteresowania podczas obserwacji pod mikroskopem świetlnym i elektromagnetycznym. Użyliśmy genetycznie zna...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Określenie lokalizacji komórkowej określonych białek w rozdzielczości nanometrowej za pomocą EM ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia funkcji komórkowych białek. Ogólnie rzecz biorąc, istnieją dwie techniki badania lokalizacji białka docelowego za pomocą EM. Jedną z nich jest technika immunogold, która jest stosowana w EM od 1960 roku, a druga to technika wykorzystująca niedawno opracowane genetycznie kodowane znaczniki16. Tradycyjne techniki immunogold wykorzystywały cząsteczki złota sprzężone z ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez podstawowy program badawczy KBRI przez Korea Brain Research Institute finansowany przez Ministerstwo Nauki i ICT (19-BR-01-08), oraz grant National Research Foundation of Korea (NRF) finansowany przez rząd Korei (MSIT)(No. 2019R1A2C1010634). Plazmidy SCO1-APEX2 i HRP-KDEL zostały udostępnione dzięki uprzejmości Hyun-Woo Rhee (Seoul National University). Dane TEM uzyskano w Brain Research Core Facilities w KBRI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Aldehyd glutarowyEMS16200Do stosowania tylko w dygestoriach
ParaformaldehydEMS19210Do stosowania tylko w dygestoriach
Kakodylan soduEMS12300
Tetratlenek osmu 4 % roztwór wodnyEMS16320Do stosowania tylko w dygestoriach
Epon 812EMS14120EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0,8 ml
Ultra-mikrotom Leica ARTOS 3DLeicaARTOS 3D
Octan uranyluEMS22400Niebezpieczna substancja chemiczna
Cytrynian ołowiuEMS17900
35mm Naczynie nakrywkowe z siatkąMattekP35G-1.5-14-CGRD
Wyładowczy żarówekPelcoeasiGlow
Formvar Siatkamiedziana powlekana węglemTed Pella01805-F
Kwas solnySIGMA258148
Fugene HDPromegaE2311
GlicynaSIGMAG8898
3,3′ -diaminobenzamidyna (DAB)SIGMAD8001Niebezpieczna substancja chemiczna
30% roztwór nadtlenku wodoruMerck107210
Trójwodzian heksacyjanożelazianu(II) potasuSIGMAP3289
0,22 um filtr strzykawkowySartorius16534
TiokarbonylodihydrazydSIGMA223220Stosować tylko w dygestoriach
Wodorotlenek potasuFluka10193426
Kwas L-asparaginowySIGMAA9256
EtanolMerck100983
Transmisyjna mikroskopia elektronowaFEITecnai G2
Szkiełka nakrywkowe powlekane tlenkiem indu i cyny (ITO)SPI06489-ABszkło kruche
IzopropanolFisher BioreagentsBP2618-1
Nóż diamentowyLeicaAT-4
Mikroskopia świetlnaNikonECLipse TS100
Skaningowa mikroskopia elektronowaZeissAuriga

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Krols, M., et al. Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration. Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).
  2. Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians. International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623(2017).
  3. Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (35), 13978-13983 (2012).
  4. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of Cell Biology. 174 (7), 915-921 (2006).
  5. Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).
  6. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  7. Burel, A., et al. A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography. Development. 145 (12), (2018).
  8. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
  9. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). The Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
  10. Lee, S. Y., et al. APEX Fingerprinting Reveals the Subcellular Localization of Proteins of Interest. Cell Reports. 15 (8), 1837-1847 (2016).
  11. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  12. Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons. Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLOS ONE. 7 (6), 38011(2012).
  15. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  16. Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041(2011).
  17. Kijanka, M., et al. A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).
  18. Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX. Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).
  19. Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 7923(2015).
  20. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041(2011).
  21. Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein. PLOS ONE. 8 (5), 64764(2013).
  22. Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).
  23. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  24. Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Siatkowanie mitochondri w i retikulum endoplazmatycznegokorelacyjna mikroskopia wietlna i elektronowawzmocniona askorbinianowa peroksydaza 2barwienie peroksydaz chrzanowmetoda barwienia en blocseryjne ci cie ultracienkietomografia tablicowatransmisyjna mikroskopia elektronowaskaningowa mikroskopia elektronowa

Powiązane artykuły