Artykuł metodologiczny

Przygotowanie ciekłych komórek mikrostudzienkowych na bazie grafenu do transmisyjnej mikroskopii elektronowej in situ

12.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59751

⸱

15 lipca 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Electron Devices (LEB), Department of Electrical, Electronic and Communication Engineering, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 2Fraunhofer Institute for Integrated Systems and Device Technology (IISB), 3Institute of Micro- and Nanostructure Research (IMN) and Center for Nanoanalysis and Electron Microscopy (CENEM), Department of Materials Science and Engineering, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 4Power Electronics (LEE), Department of Electrical, Electronic and Communication Engineering, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokół przygotowania mikrodobitkowych komórek płynnych z grafenem do mikroskopii elektronowej in situ nanokryształów złota z roztworu prekursorowego HAuCl4. Ponadto przedstawiono procedurę analizy w celu ilościowego określenia obserwowanego trawienia i dynamiki wzrostu.

Streszczenie

Wytwarzanie i przygotowanie mikrodowinowych komórek płynnych (GSMLC) z grafenem do mikroskopii elektronowej in situ jest przedstawione w protokole krokowym. Wszechstronność GSMLC została zademonstrowana w kontekście badań nad wytrawianiem i dynamiką wzrostu nanostruktur złota z roztworu prekursora HAuCl4. GSMLC łączą w sobie zalety konwencjonalnych ogniw płynnych na bazie krzemu i grafenu, oferując powtarzalne głębokości odwiertów wraz z łatwą produkcją ogniw i obsługą badanej próbki. GSMLC są wytwarzane na pojedynczym podłożu krzemowym, co drastycznie zmniejsza złożoność procesu produkcyjnego w porównaniu z konstrukcjami płynnych ogniw opartych na dwóch płytkach. W tym przypadku nie są wymagane żadne etapy procesu klejenia ani wyrównywania. Co więcej, zamkniętą objętość cieczy można dostosować do odpowiednich wymagań eksperymentalnych, po prostu dostosowując grubość warstwy azotku krzemu. Umożliwia to znaczne zmniejszenie wybrzuszeń okien w próżni mikroskopu elektronowego. Na koniec przedstawiono najnowszą ocenę ilościową śledzenia pojedynczych cząstek i tworzenia dendrytów w eksperymentach z komórkami płynnymi przy użyciu wyłącznie oprogramowania open source.

Wprowadzenie

Nowoczesne materiałoznawstwo, chemia i biologia komórki wymagają głębokiego zrozumienia leżących u podstaw dynamicznych procesów i efektów w skali submikronowej. Pomimo potęgi zaawansowanych technik mikroskopii optycznej, takich jak mikroskopia fluorescencyjna z wymuszoną emisją i zubożeniem1, techniki bezpośredniego obrazowania w celu uzyskania dostępu do szczegółowych morfologii wymagają mikroskopii elektronowej. W szczególności wykazano, że transmisyjna mikroskopia elektronowa (S)TEM in situ (skaningowa) dostarcza cennych informacji na temat dynamiki procesu poprzez hermetyzację cieczy w dedykowanych, szczelnych próżniowo komórkach2. Różne eksperymenty, takie jak ilościowe badania kinetyki powstawania nanostruktur i termodynamiki3,4,5,6, obrazowanie próbek biologicznych7,8,9,10 oraz badania mechanizmów związanych z magazynowaniem energii11,12 wraz z kompleksowymi badaniami dynamiki procesu korozji13 lub fizyka nanopęcherzyków14,15,16 odkryły wiele zjawisk za pomocą (S)TEM, które nie były dostępne przy użyciu standardowych technik mikroskopowych.

W ciągu ostatniej dekady ustanowiono dwa główne podejścia do realizacji in situ płynnych komórek TEM (LCTEM). W pierwszym podejściu ciecz jest zamknięta we wnęce między dwiema membranami Si3N4 wytwarzanymi w technologii procesu Si17, podczas gdy w drugim małe kieszenie cieczy są tworzone między dwoma arkuszami grafenu lub tlenku grafenu10,18. Zademonstrowano obsługę zarówno ogniw płynnych na bazie krzemu (SiLC), jak i ogniw płynnych na bazie grafenu (GLC)19,20,21. Chociaż oba podejścia uległy znaczącym ulepszeniom22,23,24,25, nadal brakuje im kombinacji odpowiednich zalet. Ogólnie rzecz biorąc, istnieje kompromis między hermetyzacją próbki w często niezdefiniowanych kieszeniach grafenowych o małej objętości cieczy, która umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości18, a dobrze zdefiniowanymi objętościami komórek, co skutkuje grubszymi membranami i warstwami cieczy, które zapewniają środowisko bliższe naturalnej sytuacji w bulk liquid26 kosztem resolution2. Co więcej, niektóre eksperymenty opierają się na przepływie cieczy26,27, który został zrealizowany tylko w architekturach SiLC i wymaga dedykowanego uchwytu TEM28.

Tutaj prezentujemy produkcję i obsługę podejścia opartego na płynnych ogniwach do wysokowydajnego LCTEM in situ za pomocą statycznych mikrodowiertowych komórek płynnych (GSMLC) z grafenem do analiz TEM. Szkic GSMLC znajduje się w Rysunek 1. Udowodniono, że GSMLC są w stanie umożliwić uzyskanie wyników transmisyjnej mikroskopii elektronowej in situ o wysokiej rozdzielczości (HRTEM) 6 i są również wykonalne dla skaningowej mikroskopii elektronowej in situ29. Ich rama oparta na technologii krzemu pozwala na masową produkcję komórek o powtarzalnym kształcie z dostosowaną grubością cieczy i wyjątkowo cienkimi membranami z jednej płytki. Membrana grafenowa pokrywająca te komórki łagodzi również zakłócenia wywołane wiązką elektronów8,30,31, ponieważ wiązka elektronów przechodzi najpierw przez górną membranę grafenową. Płaska topografia komórek pozwala na stosowanie uzupełniających się metod analizy, takich jak spektroskopia rentgenowska z dyspersją energii (EDXS)6 bez żadnych efektów zacienienia wynikających z samej komórki cieczowej, umożliwiając różnorodne eksperymenty mikroskopii elektronowej in situ z wykorzystaniem płynnych komórek.

Protokół

1. Wytwarzanie szablonów komórek płynnych na bazie mikrostudzienek

  1. Usuń pozostałości organiczne i natywne warstwy tlenków z monokrystalicznej, domieszkowanej borem (1 – 30) Ωcm (1) – 30) mm płytki krzemowej o grubości 175 μm i średnicy 100 mm (100). Zastosuj etap utleniania zH2O2i TMAH, a następnie zanurz HF w 1-5% roztworze HF.
  2. Tlenkować termicznie płytkę w atmosferze suchego tlenu w temperaturze 800 °C, aby wytworzyć warstwę tlenku o grubości 11 nm (Rysunek 2a). 3% Dichloreten (DCE) służy do wiązania zanieczyszczeń metalicznych.
  3. Osadzać stechiometryczną warstwę Si3N4 za pomocą niskociśnieniowego chemicznego osadzania z fazy gazowej (LPCVD). Grubość warstwy Si3N4 określa głębokość studni. Wybierz wartość odpowiednią dla planowanego eksperymentu (np. 500 nm) (Rysunek 2b).
  4. Zdefiniuj boczną geometrię studni, strukturyzując przednią stronę za pomocą fotolitografii i reaktywnego trawienia jonowego (RIE) ( Rysunek 2c). Odpowiednimi wymiarami są na przykład okrągłe konstrukcje o promieniu 2,5 μm ułożone w sześciokątne układy. Ostrożnie wybierz odległość studni (na przykład 5 μm), aby uniknąć niestabilności konstrukcji.
  5. Umieść kolejne 20 nm stechiometrycznego Si3N4 za pomocą LPCVD, który tworzy dolną błonę płynnej komórki (Rysunek 2d). Postępuj zgodnie z procedurą opisaną powyżej (patrz krok 1.3).
  6. Użyj drugiego kroku fotolitografii/RIE, aby ustrukturyzować tył, który później definiuje wymiary geometryczne ramy LC i jej okien TEM (Rysunek 2e) (Średnica ramy: 3 mm).
  7. Poprzez mikroobróbkę masową w 20% KOH w temperaturze 60 °C, usuń Si w zdefiniowanym obszarze i utwórz wolnostojącą membranę Si3N4 (Rysunek 2f).
  8. Usuń resztki jonów metalu w końcowym etapie czyszczenia za pomocą 10% roztworu HCl i wody dejonizowanej (DI).

2. Transfer grafenu na siatki TEM

  1. Zwilż tkankę, na której umieszcza się komercyjnie pozyskany kilkuwarstwowy (6 – 8) grafen CVD na PMMA. Zanurz grafen pokryty PMMA na szalce Petriego wypełnionej wodą DI (Rysunek 3a).
    UWAGA: Liczbę warstw grafenu można określić za pomocą możliwych technik32,33.
  2. Umieść warstwę grafenu na bibule filtracyjnej i pokrój ją na kawałki odpowiednie do pokrycia wszystkich wyprodukowanych studzienek (np. 4 mm²) (Rysunek 3b).
  3. Ponownie zanurz wycięte kawałki na szalce Petriego (Rysunek 3c).
  4. Użyj siatki TEM pokrytej warstwą nośną z dziurawego węgla, aby wyłowić wyprodukowane kawałki z wody DI. Aby to zrobić, ostrożnie zanurz siatkę w wodzie i złap grafen unoszący się na powierzchni. Przytrzymaj siatkę pęsetą antykapilarną (Rysunek 3d,e).
    UWAGA: Zadbaj o to, aby miejsce grafenu stosu grafen-PMMA pozostawało na wierzchu podczas całej procedury. W przeciwnym razie późniejsze usunięcie PMMA spowoduje usunięcie warstwy grafenu.
  5. Pozostaw prześcieradła do wyschnięcia na kilka godzin.
  6. Usunąć warstwę ochronną PMMA w kąpieli acetonowej na 30 minut i kolejno dodawać kolejne etapy czyszczenia, zanurzając w etanolu i wodzie demineralizowanej bez suszenia próbki pomiędzy nimi. Użyj płaskiego naczynia (np. szalki Petriego), aby uprościć późniejsze przenoszenie próbki.
  7. Następnie suszyć próbkę przez 30 minut w warunkach otoczenia.

3. Przygotowanie próbki

  1. Przygotuj próbkę do włączenia do GSMLC. W tym celu należy przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 1 mM, rozpuszczając 196,915 mg kryształów HAuCl4·3H2O w 0,5 l wody DI.
  2. Pobrać żądaną ilość próbki z roztworu podstawowego. Tutaj stosuje się 0,5 μl. Można to zrobić za pomocą strzykawki lub pipety Eppendorf.

4. Wczytywanie GSMLC

  1. Przepłucz sfabrykowany płynny szablon komórkowy acetonem i etanolem.
  2. Zastosuj plazmę otoczenia O2/N2 (20%/80%) przez 5 minut, aby zwiększyć zwilżalność membrany.
  3. Dozować 0,5 μl roztworu próbki na matrycę lub warstwę grafenu. Zapewnij płynną procedurę pracy, aby zminimalizować zmiany stężenia spowodowane parowaniem.
  4. Umieść siatkę TEM na mikrowzorzystej warstwie Si3N4 tak, aby grafen był skierowany w stronę szablonu. Dociśnij pokrytą grafenem siatkę TEM do szablonu. Uważaj, aby nie zniszczyć dolnej membrany Si3N4.
  5. Usuń nadmiar roztworu za pomocą chusteczki, aby przyspieszyć wysychanie komórek, a tym samym złagodzić zmiany stężenia (Rysunek 4a). Po ok. 2 – 3 minutach oddziaływanie grafen-Si3N4 van-der-Waalsa wystarczająco uszczelnia ogniwo cieczowe (Rysunek 4b). Alternatywnie pozostaw komórkę do całkowitego wyschnięcia bez usuwania nadmiaru roztworu. Ten ostatni oferuje wyższy wskaźnik sukcesu w przetwarzaniu komórek. Oczekuje się jednak, że zmiany stężenia w roztworze próbki wynikające z parowania będą bardziej dotkliwe przy zastosowaniu tego podejścia.
    UWAGA: Pomyślny proces suszenia można zweryfikować za pomocą zmiany kontrastu na obrzeżach (porównaj Rysunek 4a,b).
  6. Ostrożnie wyjmij siatkę TEM za pomocą pęsety, wciskając końcówkę pęsety między kratkę a ramkę GSMLC.
    UWAGA: Wysypkowe ruchy mogą spowodować uszkodzenie leżącej poniżej błony. Aby zmniejszyć uszkodzenia spowodowane siłą tnącą, zacznij od miejsca siatki równolegle do mniejszej krawędzi okna.
  7. Sprawdź, czy co najmniej jedna membrana GSMLC jest nadal nienaruszona za pomocą mikroskopii optycznej (Rysunek 4c). Gdyby wszystkie membrany zostały zerwane, LCTEM byłby niemożliwy
    8. .

5. Obrazowanie TEM i analiza wideo

  1. Załadować próbkę do (S)TEM bezpośrednio po przygotowaniu za pomocą standardowego uchwytu TEM.
    UWAGA: Jak podano w przypadku GLCs19, GSMLC mogą z czasem wyschnąć. Dlatego czas między załadowaniem a obrazowaniem powinien być zminimalizowany.
  2. Zobrazuj próbkę za pomocą odpowiedniej techniki obrazowania, w zależności zarówno od próbki, jak i mikroskopu. W tym przypadku wykorzystywane jest urządzenie (S)TEM pracujące przy napięciu przyspieszenia 300 kV. Użyj niskiej dawki, aby zminimalizować artefakty wywołane wiązką i krótkiego czasu ekspozycji, aby uniknąć rozmycia związanego z ruchem34. W przypadku długotrwałych eksperymentów należy zablokować wiązkę, aby zmniejszyć uszkodzenia spowodowane promieniowaniem.
    UWAGA: Ze względu na lepszą rozdzielczość czasową, TEM ma być preferowany zamiast STEM w analizach kinetycznych34 i reduced ion reduction35. STEM jest jednak preferowany do badania grubych warstw cieczy i pierwiastków o wysokiej zawartości Z ze względu na wyższą rozdzielczość przestrzenną w grubych próbkach34,35.
  3. Metoda segmentacji obrazu
    1. Użyj odpowiedniej platformy przetwarzania obrazu, aby wyodrębnić interesujące Cię funkcje. Do śledzenia i analizy cząstek należy użyć dystrybucji ImageJ o otwartym kodzie źródłowym FIJI36.
    2. Wykorzystaj funkcję Analizuj cząstki, aby uzyskać precyzyjne informacje (obszar rzutowany, barycentrum) każdej cząstki w każdej klatce.
      UWAGA: Ta funkcja wymaga obrazów binarnych.
    3. Połącz cząsteczki między ramkami za pomocą wtyczki TrackMate37. Domyślnie TrackMate szuka jasnych cząstek na ciemnym tle, więc odwróć obrazy (w przypadku BF-TEM) przed uruchomieniem TrackMate.
    4. Połącz wyniki TrackMate i Analyze Particles za pomocą odpowiedniego skryptu wykorzystującego ekosystem open source oparty na Pythonie SciPy38,39.
    5. Użyj FIJI, aby wyodrębnić precyzyjne kontury bardziej złożonych struktur, takich jak dendryty. W tym przypadku można również zastosować analizę cząstek (patrz wstawka z Rysunek 6a).
      UWAGA: Ręczna analiza interesujących nas obiektów może być wykonalna.

Wyniki

Po załadowaniu komórki pomyślny transfer grafenu objawia się innym odcieniem wgłębień obserwowanych pod mikroskopem optycznym. Jest to widoczne na przykład na prawej membranie na Rysunku 3c. Jak wspomniano, kluczowe jest ostrożne usunięcie siatki TEM, aby nie przerwać cienkiej warstwy Si3N4. W przypadku przerwania membrany w mikroskopie optycznym wyraźnie widoczne są prześwitujące i zakrzywione pozostałości, co pokazano na dwóch lewych membranach na Rysunku 3c. Dzięki wielu obszarom obserwacyjnym w zastosowanej konstrukcji GSMLC, z komórki można korzystać tak długo, jak przynajmniej jedna membrana pozostaje nienaruszona. Przerwane membrany mogą służyć do ustawiania TEM bez narażania próbki na działanie wiązki elektronów.

Prawidłową enkapsulację roztworu próbki można zweryfikować podczas mikroskopii elektronowej. Rycina 5 przedstawia poszczególne mikrografie z Filmu uzupełniającego 1, w których statystycznie oceniono rozpuszczanie zbioru nanocząstek i wzrost struktury dendrytycznej w GSMLC. Poza ruchem obrazu wywołanym dryftem widoczne są niewielkie, indywidualne ortogonalne ruchy cząstek, co wskazuje na obecność cząstek w roztworze. Co więcej, powszechność rozpuszczania cząstek dowodzi zachodzenia mokrej reakcji chemicznej, która nie byłaby możliwa bez skutecznego zamknięcia cieczy. Innymi typowymi oznakami zamkniętych cieczy są tworzenie się pęcherzyków wywołane wiązką elektronów19 lub ruch cząstek. Sama obecność cząstek Au w komórkach z grafenu nie wskazuje jednoznacznie na środowisko ciekłe, ponieważ cząstki te mogłyby również pochodzić z redukcji HAuCl4 indukowanej przez grafen40. W celu weryfikacji środowiska ciekłego można również przeprowadzić kwantyfikację pików tlenu zamkniętej cieczy za pomocą spektroskopii strat energii elektronów (EELS)41.

Aby uzyskać wgląd w kinetykę wzrostu i rozpuszczania cząstek, ważne jest badanie każdej cząstki indywidualnie, zamiast analizować rozwój parametrów średnich42. Kluczowe jest również wykluczenie cząstek znajdujących się na krawędziach klatek, które są rejestrowane przez kamerę tylko częściowo, ponieważ zmiany pozycji takich cząstek związane z efektem dryfu mogłyby zostać błędnie zinterpretowane jako procesy wzrostu lub rozpuszczania. Przypuszcza się, że trawienie jest powodowane przez gatunki utleniające generowane w wyniku radiolizy indukowanej wiązką elektronów43. W celu uzyskania wystarczających statystyk wymagane jest komputerowe śledzenie pojedynczych cząstek. Poprzez oszacowanie wykładnika wzrostu α zmienności promienia równoważnego poszczególnych cząstek w czasie, można uzyskać informacje o podstawowej kinetyce reakcji. W tym celu możliwe jest wprowadzenie promienia równoważnego opartego na rzutowanej powierzchni cząstki, nawet jeśli nie wszystkie cząstki są całkowicie sferyczne6,44. Rysunek 5b przedstawia śledzenie promieni równoważnych w czasie dla sześciu reprezentatywnych cząstek wyróżnionych na Rysunku 5a. Rysunek 5c pokazuje rozkład α na podstawie 73 rozpuszczających się cząstek z niniejszego badania. Uwzględniono jedynie cząstki, w których model allometryczny wyjaśnia spadek promienia w co najmniej 50% (skorygowany współczynnik determinacji).

Ponadto, po około 42 s w tej samej studni przedstawionej na Rysunku 6a szybko wyłania się struktura dendrytyczna. Tworzenie dendrytów jest innym typowym, dobrze udokumentowanym procesem w komórkach ciekłych45,46. Aby ilościowo określić wzrost dendrytów, analizowane są zarysy strukturalne (patrz wstawka na Rysunku 6a). Ewolucja promienia wierzchołka i prędkości w czasie (patrz Rysunek 6b,c) ujawnia oczekiwaną zależność hiperboliczną47 (Rysunek 6d). Wzrost dendrytów jest spowodowany lokalnym przesyconoem jonami Au w wyniku wspomnianego trawienia cząstek. Na Rysunku 5a wyraźnie widać, że cząstki wciąż się rozpuszczają, podczas gdy przesycony układ przechodzi w wzrost dendrytów. Może to być spowodowane lokalnymi wahaniami stężenia zarówno jonów Au, jak i gatunków utleniających w wyniku wysokiej lepkości cieczy w GSMLC, co obserwowano już wcześniej6. Szczegółowa dyskusja nad tym zjawiskiem wykracza jednak poza zakres niniejszej pracy.

Schemat mikroszybka z membraną Si₃N₄ i grafenem; przekrój poprzeczny dla analizy cieczy z próbką.
Rycina 1: Schemat GSMLC: Schemat struktury mikrodołowej komórki cieczowej z podłożem grafenowym. Przedrukowano z https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.nanolett.8b03388 6. Dalsze zapytania o zgodę należy kierować do American Chemical Society (ACS). Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Schemat procesu nanofabrykacji krzemu; etapy a-f pokazujące wzorowanie warstw dwutlenku/azotku krzemu.
Rysunek 2: Fabrykacja ramek GSMLC. Schematyczny rysunek procesu fabrykacji ramek GSMLC. (a) Utlenianie wafla Si po czyszczeniu. (b) LPCVD Si3N4. (c) Wzorowanie Si3N4 na stronie przedniej za pomocą fotolitografii i RIE w celu zdefiniowania objętości komórki. (d) Osadzanie Si3N4 w celu utworzenia dolnego okna komórki. (e) Litografia i RIE na stronie tylnej. (f) Mikrobobróbka objętościowa za pomocą KOH w celu utworzenia wolnostojącej membrany z Si3N4 zawierającej mikroszczeliny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces transferu grafenu; z użyciem papieru filtrującego, grafenu/PMMA, siatki TEM oraz pęsety antykapilarnej.
Rysunek 3: Transfer kilkuwarstwowego grafenu CVD z warstwą ochronną PMMA na siatkę TEM. Przedstawiono transfer kilkuwarstwowego grafenu CVD na PMMA na wierzch siatki TEM powlekanej dziurkowanym węglem. (a) Zanurzenie kilkuwarstwowego grafenu CVD na PMMA w czarce Petri wypełnionej wodą DI. (b) Przeniesiony stos grafen/PMMA na papierze filtrującym zostaje pocięty na fragmenty odpowiednie do pokrycia ramek GSMLC. (c) Ponowne zanurzenie pociętego fragmentu grafenu/PMMA. (d) Transfer warstwy grafen/PMMA na siatkę TEM powlekaną dziurkowanym węglem (e) Stos grafen/PMMA po pomyślnym transferze. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza trwałości membrany grafenowej poprzez obrazowanie mikroskopowe; porównanie próbki szczelnej i uszkodzonej.
Rysunek 4: Usunięcie górnej siatki TEM. Proces suszenia obciążonego GSMLC został udokumentowany za pomocą mikroskopu optycznego. (a) Siatka TEM powlekana grafenem została umieszczona na wierzchu GSMLC bezpośrednio po ładowaniu. Warstwa grafenowa jest widoczna jako turkusowy prostokąt pokrywający wszystkie trzy obszary obserwacji. Jej kontury zostały orientacyjnie zaznaczone czarnym prostokątem. (b) Prawie całkowicie przylegająca membrana jest widoczna dzięki zmianie kontrastu między obszarem mokrym (ciemnym, por. (a)) a obszarem przylegającym (turkusowym) po około dwóch minutach. (c) Przedstawiono GSMLC po odjęciu siatki TEM, co ujawnia dwie uszkodzone membrany (lewa i środkowa) oraz jedną membranę z pomyślnie załadowanymi i uszczelnionymi mikroskrutkami (prawa). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wzrost nanocząstek, obrazy z mikroskopii szeregów czasowych z wykresem rozkładu wielkości, analiza statystyczna wykresów.
Rycina 5: Reprezentatywny rozwój promieni nanocząstek. Śledzono rozwój promienia 183 poszczególnych cząstek. (a) Sekwencja obrazów pochodząca z Krótkiego filmu uzupełniającego 1. Wyróżniono sześć reprezentatywnych cząstek. Kolorowe okręgi odpowiadają uzyskanemu promieniowi równoważnemu. (b) Wykres logarytmiczny promieni cząstek. (c) Histogram 73 cząstek, dla których wyznaczono ujemny wykładnik allometryczny α przy użyciu zautomatyzowanej procedury. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia time-lapse nanostruktur wraz z wykresami przedstawiającymi analizę danych średniego promienia wierzchołka i prędkości.
Rysunek 6: Dynamika dendrytów: Przeanalizowano promień wierzchołka pięciu gałęzi dendrytów. Słupki błędów odpowiadają odpowiednim odchyleniom standardowym. (a) Sekwencja obrazów pochodząca z Supplementary Video 1 przedstawiająca powstający dendryt, który staje się widoczny po około 42 s. Wstawka na prawym obrazie pokazuje ewoluujące kontury dendrytu. Tutaj różowe obrysy odpowiadają czasowi 42,09 s, czerwone 42,7 s, a fioletowe 43,3 s. (b) Zmiana (uśrednionego) promienia wierzchołka w czasie. (c) Średnia prędkość wierzchołka przedstawiona w funkcji czasu. (d) Uśredniony promień wierzchołka naniesiony logarytmicznie względem uśrednionej prędkości wierzchołka, co ujawnia zależność hiperboliczną (pomarańczowa krzywa). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Obraz mikroskopowy porowatej nanostruktury do analizy materiałowej; pasek skali 3 µm.
Rycina 7: Obraz SEM załadowanego GSMLC: Przedstawiono reprezentatywny obraz SEM uzyskany w trybie HAADF STEM w SEM załadowanego GSMLC przy niskim napięciu przyspieszającym (29 kV).Oprócz wyraźnych mikrootworów o szerokości 5 µm, widoczne są dwie częściowo nakładające się okrągłe perforowane siatki węglowe (średnica 2 µm) wynikające z opisanego powyżej transferu grafenu. Pierwsza siatka węglowa jest efektem nieudanego transferu grafenu. Wyraźnie widać, że cieniowanie membrany pozostaje w większości stałe nad obszarem otworu, ale lekko ciemnieje w kierunku jego centrum. Świadczy to o słabym, ujemnym wybrzuszeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wideo uzupełniające 1: In situ wideo przedstawiające reprezentatywne wyniki badania TEM w jasnym polu w komórce z cieczą, obrazujące trawienie nanocząsteczek Au i późniejszy wzrost struktury dendrytycznej spowodowany przesyceniem otaczającego roztworu próbki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W przeciwieństwie do dostępnych na rynku ogniw płynnych, wykonane na zamówienie GSMLC mają tę zaletę, że można je zaprojektować tak, aby pasowały do łatwo dostępnych uchwytów TEM i nie wymagają drogiego, dedykowanego uchwytu TEM z płynną komórką.

Zademonstrowana tutaj architektura GSMLC łączy w sobie aspekty SiLC i GLC, które mogą potencjalnie prowadzić do unikalnych korzyści. Z jednej strony SiLC pozwalają na precyzyjne określenie położenia i kształtu komórek, ale wymagają stosunkowo grubych błon Si3N4 w celu zmniejszenia efektu wybrzuszenia, jednocześnie ostatecznie zmniejszając osiągalną rozdzielczość. Z drugiej strony GLC wykazują wyjątkowo cienkie ścianki membrany składające się z grafenu, ale cierpią z powodu losowych rozmiarów i pozycji kieszeni. Łącząc te dwa podejścia membranowe za pomocą GSMLC, można ominąć ograniczenie rozdzielczości spowodowane granicami komórek35. Ponieważ struktura studni jest wytwarzana bezpośrednio w warstwie Si3N4 , rzeczywista membrana Si3N4 może być jeszcze mniejsza niż w SiLC, co upraszcza analizy HRTEM, co zostało już wykazane w GSMLC6. Należy jednak zauważyć, że HRTEM w ogóle jest możliwe również w przypadku SiLC48. Co więcej, duże obszary widzenia mogą być zrealizowane bez poważnych wybrzuszeń okien dzięki małym powierzchniom membrany w poszczególnych komorach na próbki. W ten sposób wzrost grubości związany z wybrzuszeniem35 może być w dużym stopniu wykluczony, jak wykazano w Dukes i wsp.49. Pokazano to na rysunku 7, na którym wyświetlany jest reprezentatywny obraz STEM obciążonego GSMLC pod wysokim kątem pierścieniowym ciemnego pola (HAADF). To zdjęcie zostało uzyskane przy użyciu systemu Dual-beam. Ponieważ jasność obrazu uzyskana w tej konfiguracji jest bezpośrednio związana z grubością próbki, wyraźnie widać, że uszczelnione mikrostudzienki wykazują tylko małe ujemne wybrzuszenia. Kelly i wsp.24 wykazali, że ujemne wybrzuszenie i częściowe wysuszenie studni widoczne na rysunku 7 zależy od średnicy studni. Zmniejszenie średnicy studzienki jest zatem wykonalnym podejściem do dalszej homogenizacji grubości cieczy.

Ze względu na kształt kieszeni równowagowej GLC, grubość cieczy jest również silnie zależna od miejsca35. SiLC są zgodne z konstrukcją dwóch membran pochodzących z różnych płytek Si. Zastąpienie górnej membrany Si3N4 grafenem upraszcza wytwarzanie ogniw cieczowych. Oznacza to, że można uniknąć ewentualnego rozwarstwienia dwóch połączonych płytek krzemowych podczas kolejnych etapów trawienia na mokro i pominąć wyrównanie dwóch kawałków płytki podczas ładowania ogniwa. Płaska powierzchnia po jednej stronie tej architektury ogniwa umożliwia komplementarne metody analizy in situ , takie jak analiza EDXS próbki6, która jest ograniczona w konwencjonalnych architekturach SiLC przez efekty zacienienia na stromych krawędziach Si50.

Uszczelnianie wstępnie wzorzystych mikrostudzienek grafenem zarówno na dole, jak i na górze odwiertu zostało zademonstrowane przed24,25. Zastosowanie dwóch membran grafenowych może zwiększyć osiągalną rozdzielczość. Dwukrotny transfer grafenu jeszcze bardziej skomplikowałby jednak proces przygotowania; Zwłaszcza, że okazało się, że jest to najbardziej wrażliwy etap przygotowań (patrz poniżej). Co więcej, oczekuje się, że omówione powyżej wybrzuszenie membrany będzie jeszcze bardziej krytyczne w przypadku dwóch membran grafenowych, ponieważ grafen jest znacznie bardziej elastyczny niż warstwa Si3N4. W tych architekturach mikrostudzienki zostały skonstruowane przy użyciu sekwencyjnego mielenia skupionej wiązki jonów (FIB). Chociaż okazało się, że takie podejście daje wysokiej jakości wyniki, mielenie FIB jest skomplikowaną i kosztowną techniką produkcji komórek. Wykorzystanie masowo równoległych technik tworzenia wzorów pojedynczych ujęć, które są już standardem w dzisiejszym przemyśle półprzewodnikowym, takich jak nanoimprint lub fotolitografia, ma jednak tę główną zaletę, że jest szybkie, tanie i skalowalne do masowej produkcji.

Należy zauważyć, że przedstawione tutaj podejście nie pozwala na działanie przepływu cieczy, co jest osiągalne przez inne konstrukcje28. Ponieważ obciążenie i objętość cieczy są porównywalne dla GSMLC i GLC, można uniknąć zanieczyszczenia wysokiej próżni spowodowanego pęknięciem membrany19. Eliminuje to konieczność kłopotliwej kontroli uszczelnienia. Chociaż zalety SiLC i GLC zostały połączone, wady obu podejść są nadal obecne w GSMLC. Produkcja ogniw wymaga infrastruktury clean room dla technologii krzemowej, która niekoniecznie jest obecna w laboratoriach TEM. Ponadto ładowanie płynów nie jest trywialne. Wymaga dedykowanego szkolenia, podobnie jak ogniwa grafenowe. Dotyczy to jednak również systemów dostępnych na rynku. W tym przypadku najbardziej wrażliwym etapem przygotowania jest usunięcie siatki TEM po transferze grafenu, ponieważ pochopne ruchy lub drżenie mogą spowodować zerwanie warstwy Si3N4 . Nadmiarowe okna membranowe zwiększają jednak szanse na zachowanie co najmniej jednego obszaru membrany. W konsekwencji wydajność (ilość sprawnych chipów GSMLC) osiągnięta przez wyszkolonego eksperymentatora wynosi 3 na46, a zatem przekracza tę osiągniętą z ogniwami na bazie grafenu (od jednego do dwóch z czterech)19.

Podobnie jak w przypadku GLC, enkapsulacja cieczy w GSMLC opiera się na oddziaływaniach van-der-Waals18. W związku z tym zanieczyszczenie interfejsem może obniżyć wskaźnik powodzenia w przetwarzaniu GSMLC19. Ponadto, w zależności od stałej Hamakera dla fazy ciekłej, która ma być zamknięta w kapsułkach, charakterystyka zwilżania podczas procedury załadunku (a tym samym osiągalna wydajność) może się różnić51, a zatem przygotowanie może być skomplikowane. Z naszego doświadczenia wynika, że dzieje się tak na przykład, gdy obecne są gatunki amfifilne.

Architektura GSMLC umożliwia elastyczną konfigurację głębokości odwiertów, co pozwala na dostosowanie do różnych warunków eksperymentalnych. Ponadto architektura nadaje się do badań tomografii elektronowej w szerokim zakresie kąta nachylenia ±75 °, co pozwoliłoby również na tomografię elektronową in situ 52. W związku z tym za pomocą GSMLC można również przeprowadzić tomografię in situ i pośmiertną próbki w cieczy.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Tilo Schmutzlerowi za przygotowanie roztworu HAuCl4. Ponadto dziękujemy R. Christianowi Martensowi za korektę. Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe ze strony Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG) za pośrednictwem Grupy Badawczo-Szkoleniowej GRK 1896 "Mikroskopia in situ z elektronami, promieniami rentgenowskimi i sondami skanującymi" oraz za pośrednictwem Klastra Doskonałości EXC 315/2 EAM "Inżynieria materiałów zaawansowanych".

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetonVWR Chemicals50488858VLSI
dejonizowanawłasnej produkcji
Pęseta antykapilarna DumontCarl Roth GmbH + Co. KGLH72.10203-N5AC-PO Etanol ze stopu dumoxel
VWR Chemicals85651.360VLSI
FIJI to tylko ImageJFIJI.scwersji 1.51
Gold Quantifoil, Amorficzny węgiel Siatki TEMPlano GmbHS173-8R 2/2 Au 300 mesh
HAuCl4 · 3 kryształ H2OAlfa Aesar36400.065 g
Jupyter NotebookProject JupyterVersion 5.7.2
Matplotlib-PackageJohn Hunter, Darren Dale, Eric Firing, Michael Droettboom i zespół programistów MatplotlibWersja 3.0.2
NumPy-PackageProgramiści NumPyWersja 1.15.4
Pandas-PackageAQR Capital Management, LLC, Lambda Foundry, Inc. i PyData Development TeamWersja 0.23.4
PythonPython Software FoundationWersja 3.7
Scipy-PackageDeweloperzy SciPyWersja 1.1.0
Seaborn-PackageMichael WaskomWersja 0.9.0
Si wafelSiegert Wafer GmbHCienki krzem (100) wafel 175 +/-5 i mikro; m, 4", typ P, domieszkowany borem (1-30 Ohm cm), dwustronnie polerowany
uchwyt TEM z pojedynczym przechyłemPhilipsUpewnij się, że ogniwo pasuje
do transmisyjnego mikroskopu elektronowegoPhilipsCM 30 (S)TEM300 kV
Triwialny grafen transferowyACS MateriałTTG60011pokryty PMMA, 6 -- 8 ML
Woda

Bibliografia

  1. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780(1994).
  2. Ross, F. M. Liquid Cell Electron Microscopy. , Cambridge University Press. (2016).
  3. Alloyeau, D., et al. Unravelling kinetic and thermodynamic effects on the growth of gold nanoplates by liquid transmission electron microscopy. Nano Letters. 15 (4), 2574-2581 (2015).
  4. Tao, J., Nielsen, M. H., Yoreo, J. J. de Nucleation and phase transformation pathways in electrolyte solutions investigated by in situ microscopy techniques. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 34, 74-88 (2018).
  5. Jin, B., Sushko, M. L., Liu, Z., Jin, C., Tang, R. In Situ Liquid Cell TEM Reveals Bridge-Induced Contact and Fusion of Au Nanocrystals in Aqueous Solution. Nano Letters. 18 (10), 6551-6556 (2018).
  6. Hutzler, A., et al. Unravelling the mechanisms of gold-silver core-shell nanostructure formation by in situ TEM using an advanced liquid cell design. Nano Letters. 18 (11), 7222-7229 (2018).
  7. Moser, T. H., et al. The role of electron irradiation history in liquid cell transmission electron microscopy. Science Advances. 4 (4), eaaq1202(2018).
  8. Keskin, S., Jonge, N. de Reduced Radiation Damage in Transmission Electron Microscopy of Proteins in Graphene Liquid Cells. Nano Letters. 18 (12), 7435-7440 (2018).
  9. Firlar, E., et al. Investigation of the magnetosome biomineralization in magnetotactic bacteria using graphene liquid cell - transmission electron microscopy. Nanoscale. 11 (2), 698-705 (2019).
  10. Mohanty, N., Fahrenholtz, M., Nagaraja, A., Boyle, D., Berry, V. Impermeable graphenic encasement of bacteria. Nano letters. 11 (3), 1270-1275 (2011).
  11. Gu, M., et al. Demonstration of an electrochemical liquid cell for operando transmission electron microscopy observation of the lithiation/delithiation behavior of Si nanowire battery anodes. Nano Letters. 13 (12), 6106-6112 (2013).
  12. Lutz, L., et al. Operando Monitoring of the Solution-Mediated Discharge and Charge Processes in a Na-O2 Battery Using Liquid-Electrochemical Transmission Electron Microscopy. Nano Letters. 18 (2), 1280-1289 (2018).
  13. Chee, S. W., et al. Studying localized corrosion using liquid cell transmission electron microscopy. Chemical Communications. 51 (1), Cambridge, England. 168-171 (2015).
  14. Grogan, J. M., Schneider, N. M., Ross, F. M., Bau, H. H. Bubble and pattern formation in liquid induced by an electron beam. Nano Letters. 14 (1), 359-364 (2014).
  15. Tomo, Y., Li, Q. -Y., Ikuta, T., Takata, Y., Takahashi, K. Unexpected Homogeneous Bubble Nucleation Near a Solid-Liquid Interface. The Journal of Physical Chemistry. 122 (50), 28712-28716 (2018).
  16. Shin, D., et al. Growth dynamics and gas transport mechanism of nanobubbles in graphene liquid cells. Nature Communications. 6, 6068(2015).
  17. Zheng, H., Claridge, S. A., Minor, A. M., Alivisatos, A. P., Dahmen, U. Nanocrystal diffusion in a liquid thin film observed by in situ transmission electron microscopy. Nano Letters. 9 (6), 2460-2465 (2009).
  18. Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), New York, N.Y. 61-64 (2012).
  19. Hauwiller, M. R., Ondry, J. C., Alivisatos, A. P. Using Graphene Liquid Cell Transmission Electron Microscopy to Study in Situ Nanocrystal Etching. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
  20. Niu, K. -Y., Liao, H. -G., Zheng, H. Revealing dynamic processes of materials in liquids using liquid cell transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (70), (2012).
  21. Textor, M., de Jonge, N. Strategies for Preparing Graphene Liquid Cells for Transmission Electron Microscopy. Nano letters. 18 (6), 3313-3321 (2018).
  22. Huang, T. -W., et al. Self-aligned wet-cell for hydrated microbiology observation in TEM. Lab on a chip. 12 (2), 340-347 (2012).
  23. Dukes, M. J., Moering, J., Damiano, J. Optimization of Liquid Cell Transmission Electron Microscopy for Energy Dispersive X-Ray Spectroscopy. Microscopy and Microanalysis. 24 (S1), 304-305 (2018).
  24. Kelly, D. J., et al. Nanometer Resolution Elemental Mapping in Graphene-Based TEM Liquid Cells. Nano letters. 18 (2), 1168-1174 (2018).
  25. Rasool, H., Dunn, G., Fathalizadeh, A., Zettl, A. Graphene-sealed Si/SiN cavities for high-resolution in situ electron microscopy of nano-confined solutions. Physica Status Solidi (b). 253 (12), 2351-2354 (2016).
  26. Kröger, R., Verch, A. Liquid Cell Transmission Electron Microscopy and the Impact of Confinement on the Precipitation from Supersaturated Solutions. Minerals. 8 (1), 21(2018).
  27. Stawski, T. M., et al. "On demand" triggered crystallization of CaCO3 from solute precursor species stabilized by the water-in-oil microemulsion. Physical Chemistry Chemical Physics. 20 (20), 13825-13835 (2018).
  28. Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. Transmission electron microscopy with a liquid flow cell. Journal of Microscopy. 242 (2), 117-123 (2011).
  29. Hutzler, A., Branscheid, R., Jank, M. P. M., Frey, L., Spiecker, E. Graphene-supported microwell liquid cell for in situ studies in TEM and SEM European Microscopy Congress 2016: Proceedings. , Wiley-VCH Verlag GmbH. Weinheim, Germany. 209-210 (2016).
  30. Jiang, N. Note on in situ (scanning) transmission electron microscopy study of liquid samples. Ultramicroscopy. 179, 81-83 (2017).
  31. Cho, H., et al. The Use of Graphene and Its Derivatives for Liquid-Phase Transmission Electron Microscopy of Radiation-Sensitive Specimens. Nano Letters. 17 (1), 414-420 (2017).
  32. Hutzler, A., et al. Large-Area Layer Counting of Two-Dimensional Materials Evaluating the Wavelength Shift in Visible-Reflectance Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry C. 123 (14), 9192-9201 (2019).
  33. Hutzler, A., Matthus, C. D., Rommel, M., Frey, L. Generalized approach to design multi-layer stacks for enhanced optical detectability of ultrathin layers. Applied Physics Letters. 110 (2), 21909(2017).
  34. Zhu, G., Reiner, H., Cölfen, H., de Yoreo, J. J. Addressing some of the technical challenges associated with liquid phase S/TEM studies of particle nucleation, growth and assembly. Micron. 118, 35-42 (2019).
  35. de Jonge, N., Houben, L., Dunin-Borkowski, R. E., Ross, F. M. Resolution and aberration correction in liquid cell transmission electron microscopy. Nature Reviews Materials. 4 (1), 61(2019).
  36. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676(2012).
  37. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  38. Oliphant, T. E. Python for Scientific Computing. Computing in Science & Engineering. 9 (3), 10-20 (2007).
  39. Millman, K. J., Aivazis, M. Python for Scientists and Engineers. Computing in Science & Engineering. 13 (2), 9-12 (2011).
  40. Zaniewski, A. M., Trimble, C. J., Nemanich, R. J. Modifying the chemistry of graphene with substrate selection: A study of gold nanoparticle formation. Applied Physics Letters. 106 (12), 123104(2015).
  41. Holtz, M. E., Yu, Y., Gao, J., Abruña, H. D., Muller, D. A. In situ electron energy-loss spectroscopy in liquids. Microscopy and Microanalysis. 19 (4), 1027-1035 (2013).
  42. Wang, M., Park, C., Woehl, T. J. Quantifying the Nucleation and Growth Kinetics of Electron Beam Nanochemistry with Liquid Cell Scanning Transmission Electron Microscopy. Chemistry of Materials. 30 (21), 7727-7736 (2018).
  43. Woehl, T. J., Abellan, P. Defining the radiation chemistry during liquid cell electron microscopy to enable visualization of nanomaterial growth and degradation dynamics. Journal of Microscopy. 265 (2), 135-147 (2017).
  44. Ngo, T., Yang, H. Toward Ending the Guessing Game: Study of the Formation of Nanostructures Using In Situ Liquid Transmission Electron Microscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 6 (24), 5051-5061 (2015).
  45. Kraus, T., de Jonge, N. Dendritic gold nanowire growth observed in liquid with transmission electron microscopy. Langmuir. 29 (26), 8427-8432 (2013).
  46. Hauwiller, M. R., et al. Dynamics of Nanoscale Dendrite Formation in Solution Growth Revealed Through in Situ Liquid Cell Electron Microscopy. Nano Letters. 18 (10), 6427-6433 (2018).
  47. Glicksman, M. E. Dendritic Growth. Handbook of Crystal Growth. Nishinga, T., Kuech, T. F., Rudolph, P. , Elsevier. Amsterdam. 669-722 (2015).
  48. Li, D., et al. Direction-specific interactions control crystal growth by oriented attachment. Science. 336 (6084), 1014-1018 (2012).
  49. Dukes, M. J., et al. Improved microchip design and application for in situ transmission electron microscopy of macromolecules. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 338-345 (2014).
  50. Zaluzec, N. J., Burke, M. G., Haigh, S. J., Kulzick, M. A. X-ray energy-dispersive spectrometry during in situ liquid cell studies using an analytical electron microscope. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 323-329 (2014).
  51. Bonn, D., Eggers, J., Indekeu, J., Meunier, J., Rolley, E. Wetting and spreading. Reviews of Modern Physics. 81 (2), 739(2009).
  52. Karakulina, O. M., Demortière, A., Dachraoui, W., Abakumov, A. M., Hadermann, J. In Situ Electron Diffraction Tomography Using a Liquid-Electrochemical Transmission Electron Microscopy Cell for Crystal Structure Determination of Cathode Materials for Li-Ion batteries. Nano Letters. , (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Elektronia in situwytwarzanie celi z cieczprzygotowanie siatek TEMmembrana z azotku krzemutrawienie nanostruktur z otaanaliza ledzenia cz stekbadanie formowania si dendryt wotwarto r d owe przetwarzanie obraz wtransmisyjna elektronowa mikroskopia skaningowa
Przygotowanie ciekłych komórek mikrostudzienkowych na bazie grafenu do transmisyjnej mikroskopii elektronowej in situ
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.