Artykuł metodologiczny

Zastosowanie mikrorentgenowskiej tomografii komputerowej z preparatem kwasu fosfowolframowego do wizualizacji ludzkiej tkanki włóknisto-mięśniowej

DOI:

10.3791/59752

⸱

5 września 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Yonsei University College of Medicine, 2Department of Anesthesiology and Pain Medicine, Anesthesia and Pain Research Institute, Yonsei University College of Medicine, 3Surgical Anatomy Education Centre at the Yonsei University College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrorentgenowska tomografia komputerowa jest skuteczna w uzyskiwaniu trójwymiarowych informacji z nieuszkodzonych próbek ludzkich, ale ma ograniczoną skuteczność w obserwacji tkanek miękkich. Zastosowanie środka kontrastowego z kwasem fosfowolframowym może rozwiązać ten problem. Zastosowaliśmy ten środek kontrastowy do badania delikatnych tkanek włóknisto-mięśniowych człowieka (więzadło okrężne zatrzymujące więzadło).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ręczna analiza i obserwacja histologiczna są powszechnymi metodami używanymi do badania tkanek ludzkich. Jednak ręczna sekcja może uszkodzić delikatne struktury, podczas gdy przetwarzanie i obserwacja histologiczna dostarczają ograniczonych informacji dzięki obrazowaniu przekrojowemu. Mikrorentgenowska tomografia komputerowa (microCT) jest skutecznym narzędziem do uzyskiwania trójwymiarowych informacji bez uszkadzania próbek. Wykazuje jednak ograniczoną skuteczność w różnicowaniu części tkanek miękkich. Stosowanie środków wzmacniających kontrast, takich jak kwas fosfowolframowy (PTA), może rozwiązać ten problem poprzez poprawę kontrastu tkanek miękkich. Wdrożyliśmy mikrotomografię komputerową z PTA do zbadania więzadła podtrzymującego ludzki mięsień okrężny (ORL), które jest delikatną strukturą w okolicy oczodołu. W tej metodzie zebrane próbki utrwala się w formalinie, odwadniają w seryjnych roztworach etanolu i barwią roztworem PTA. Po barwieniu wykonywane jest badanie mikrotomografią komputerową, rekonstrukcja 3D i analiza. Za pomocą tej metody można wyraźnie uwidocznić skórę, więzadła i mięśnie. Wielkość próbki i czas barwienia są podstawowymi cechami tej metody. Odpowiednia grubość próbki wynosiła około 5–7 mm, powyżej której proces był spowolniony, a optymalny czas trwania wynosił 5–7 dni, poniżej których sporadycznie pojawiał się pusty otwór w obszarze centralnym. Aby zachować położenie i kierunek małych kawałków podczas cięcia, zaleca się szycie w tym samym obszarze każdej części. Ponadto konieczne są wstępne analizy budowy anatomicznej, aby prawidłowo zidentyfikować każdy element. Parafilm może być stosowany w celu zapobieżenia wysuszeniu, ale należy zachować ostrożność, aby zapobiec zniekształceniu próbki. Nasza wielokierunkowa obserwacja wykazała, że ORL składa się z wielowarstwowej siatki ciągłych płytek, a nie z włókien nitkowatych, jak informowaliśmy wcześniej. Wyniki te sugerują, że mikrotomografia komputerowa z PTA jest przydatna do badania określonych przedziałów w złożonych strukturach tkanki ludzkiej. Może być pomocny w analizach tkanek nowotworowych, tkanek nerwowych i różnych narządów, takich jak serce i wątroba.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ręczna analiza i obserwacja histologiczna są zazwyczaj używane do badania tkanek ludzkich, takich jak mięśnie i tkanki łączne. Jednak ręczna sekcja może łatwo uszkodzić delikatne struktury, a obserwacja histologiczna dostarcza ograniczonych informacji o płaskich powierzchniach przekroju poprzecznego1,2. Dlatego potrzebne są ulepszone metody, aby dokładniej i skuteczniej badać tkanki.

Konwencjonalna tomografia komputerowa (CT) jest powszechnie stosowana w praktyce klinicznej, ale brakuje jej zdolności do rozróżniania małych struktur2,3. Mikro tomografia rentgenowska (microCT) jest skutecznym narzędziem do uzyskiwania trójwymiarowych (3D) informacji o małych strukturach z próbek, bez ich niszczenia. Jednak mikrotomografia komputerowa ma ograniczone zastosowania, ponieważ tylko gęste tkanki mogą być wyraźnie uwidocznione; Nie można go używać do różnicowania tkanek miękkich. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, można zastosować środki barwiące. Środki wzmacniające kontrast, takie jak kwas fosfowolframowy (PTA), kwas fosfomolibdenowy i jod Lugola, poprawiają współczynnik kontrastu tkanek miękkich podczas skanowania4,5. Kilka badań porównujących te czynniki sugeruje, że PTA wykazuje dobrą wydajność i jest łatwy w obsłudze6,7,8.

Więzadło podtrzymujące orbicularis (ORL) to delikatna struktura wokół orbity, która może być łatwo uszkodzona podczas konwencjonalnej obserwacji9. Zbadaliśmy i z powodzeniem uzyskaliśmy informacje 3D na temat tej struktury za pomocą mikrotomografii komputerowej z PTA jako środkiem kontrastowym. Metoda ta może być stosowana do badań na innych tkankach ludzkich, takich jak serce i wątroba, z odpowiednimi modyfikacjami10,11,12.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie zwłoki wykorzystane w tym badaniu zostały legalnie przekazane do Centrum Edukacji Anatomii Chirurgicznej w Yonsei University College of Medicine.

1. Pobieranie próbek

  1. Narysuj linię nacięcia na zwłokach kolorowym ołówkiem, aby wskazać obszar cięcia do pobrania próbki. Sprawdź, czy narysowana linia nacięcia rozciąga się przyśrodkowo do obręczy przyśrodkowej, bocznie do kantu bocznego, wyżej do górnej granicy dolnej powieki i niżej do 1 cm poniżej linii od krawędzi oczodołu.
    UWAGA: Weź pod uwagę wielkość próbki w oparciu o maksymalny rozmiar skanowania sprzętu do mikrotomografii komputerowej (nasz sprzęt może uzyskać obraz o maksymalnym wymiarze obiektu 7 × 7 cm). Tutaj pobrano próbkę o szerokości około 1 cm, długości 3 cm i wadze 1,25 g z regionu ORL.
  2. Przetnij ostrzem tkanki twarzy wzdłuż linii nacięcia. Upewnij się, że cięcie jest głębokie, tak aby końcówka ostrza dotykała kości. Próbka musi obejmować skórę, tkankę podskórną, mięśnie, tłuszcz i okostną.
  3. Natychmiast utrwal próbkę w 10% formalinie i przechowuj ją przez 5 do 7 dni w temperaturze pokojowej (Rysunek 1A).
    UWAGA: Do tego badania można wykorzystać zarówno zabalsamowane, jak i świeże zwłoki. Jednak roztwór utrwalający zwłoki może nieznacznie różnić się od roztworu stosowanego w eksperymencie biologicznym. Dlatego sugerujemy ponowne utrwalenie próbki 10% formaliną nawet po pobraniu próbki z zabalsamowanych zwłok.

2. Przygotowanie do barwienia

  1. Po utrwaleniu pokrój próbkę na 3 części (o grubości 5–7 mm). Podczas tego procesu nie trać położenia i kierunku każdego elementu.
    UWAGA: Używany przez nas skaner microCT może pokryć maksymalny rozmiar 7 cm³, ale roztwór PTA nie może skutecznie przeniknąć do próbki, jeśli jest zbyt gruby.
  2. Zszyj nadboczną stronę każdego kawałka za pomocą igły i czarnej nici, tak aby można było później sprawdzić kierunek próbki.
  3. Odwodnić próbkę w serii 30%, 50% i 70% roztworów etanolu przez 1 dzień każdy.
  4. Umieść próbkę w 70% etanolu do momentu zabarwienia.

3. Przygotowanie PTA

  1. Proces barwienia PTA należy rozpocząć na 1 tydzień przed zaplanowanym badaniem mikrotomografią komputerową.
  2. Przygotuj 210 ml 70% roztworu etanolu i dodaj do niego 2,1 g mocy PTA. Dobrze wymieszaj za pomocą shakera przy 55-60 obr.
    UWAGA: Stężenie roztworu PTA powinno wynosić 1% w etanolu.
  3. Przygotuj trzy plastikowe pojemniki o pojemności 70 ml na każdy pokrojony kawałek. Napełnij pojemniki roztworem PTA. Namocz próbki w pojemnikach i umieść je na wytrząsarce, aby uzyskać skuteczną penetrację. Pozostaw próbki na 5–7 dni (Rysunek 1B).
  4. Po zakończeniu barwienia należy przechowywać próbkę w 70% etanolu, aby przygotować się do skanowania.
    UWAGA: Barwione próbki można przechowywać przez kilka miesięcy, ale zaleca się jak najszybsze zeskanowanie próbek, aby zapewnić pełne zabarwienie.

4. Badanie mikrotomografem komputerowym

  1. Owiń próbkę parafilmem, aby zapobiec wysuszeniu. Nie owijaj próbek zbyt ciasno, ponieważ może to prowadzić do deformacji.
  2. Otwórz skaner i umieść próbkę na tacy (Rysunek 2).
  3. Ustaw parametry skanowania w następujący sposób: napięcie źródła (kV) = 70, prąd źródła (μA) = 114, filtr Al = 0,5 mm, rozmiar piksela obrazu (μm²) = 20, piksele = 2240 × 2240, ekspozycja (ms) = 500, krok obrotu (deg) = 0,3,
    UWAGA: Parametry mogą być modyfikowane w zależności od użytych próbek i/lub skanerów.
  4. Rozpocznij skanowanie.
    UWAGA: Skanowanie trwa od 30 do 60 minut, w zależności od zamierzonej rozdzielczości i szybkości skanera.

5. Rekonstrukcja i optymalizacja danych

  1. Uruchom oprogramowanie do rekonstrukcji. Wybierz pozycję Otwórz zestaw danych w menu Akcje, aby uruchomić zeskanowane pliki.
  2. Wybierz zakładkę Ustawienia w oknie Rekonstrukcja. Ustaw parametry w następujący sposób: Redukcja artefaktów pierścienia = 7, Korekcja utwardzenia belki (%) = 40,
    UWAGA: Parametry można modyfikować w zależności od próbki.
  3. Rozpocznij odbudowę, wybierając opcję Rozpocznij na karcie Start. Ostateczne dane zostaną zapisane w wyznaczonym folderze.
  4. Uruchom oprogramowanie do zmiany rozmiaru plików. Wybierz pozycję Zestaw danych źródłowych, aby uruchomić zrekonstruowane pliki.
  5. Wybierz jpg na karcie Docelowy zestaw danych.
  6. Wybierz opcję Zmiana rozmiaru 1/2 z opcją Jakość Bez interpolacji (szybko).
  7. Ustaw suwak na 100 (najwyższy) na karcie Kompresja obrazu. Rozpocznij konwersję.
    UWAGA: Opcja zmiany rozmiaru ma na celu uniknięcie spowolnienia prędkości komputera podczas renderowania 3D; Może to jednak spowodować niższą rozdzielczość przy rozległej zmianie rozmiaru. Sugerujemy zmianę rozmiaru o połowę, aby uzyskać akceptowalną rozdzielczość z lepszą obsługą.

6. 3D rekonstrukcja

  1. Uruchom oprogramowanie do renderowania objętości 3D.
  2. Wybierz pozycję Akcje > Załaduj dane woluminu, aby uruchomić zestaw danych.
  3. Dostosuj poziom jasności i kontrastu, modyfikując funkcję przenoszenia kształtu na histogramie w zakładce Edytor funkcji transferu.
  4. Wybierz Opcje > Oświetlenie.
  5. Wybierz ikony Cienie i Oświetlenie powierzchni. Efekty te zapewniają realistyczny ton modelowania.
  6. Znajdź najlepszy widok, przesuwając (kliknij i przeciągnij), obracając (kliknij prawym przyciskiem myszy i przeciągnij) oraz powiększając lub pomniejszając (przewijając) model.
  7. Przesuń płaszczyznę (shift + kliknięcie i przeciągnij w kierunku wewnętrznym), aby wyświetlić obrazy przekrojów (Rysunek 3).
  8. Włącz ikonę światła. Dostosuj pasek sygnalizacji oświetlenia i znajdź najlepsze oświetlenie do oglądania. Następnie wyłącz ikonę i zamknij kartę Oświetlenie.
  9. Wybierz Opcje> Pokaż pole przycinania>, aby ukryć pole dla końcowego obrazu.
  10. Wybierz opcję Akcje > Zapisz obraz, aby zapisać obraz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegółowa rekonstrukcja ORL została osiągnięta za pomocą mikrotomografii komputerowej z preparacją PTA (Rysunek 4). Wyraźnie zaobserwowano strukturę mięśniowo-więzadłową rozciągającą się ukośnie między skórą właściwą a okostną (Ryc. 4A). W widoku koronalnym (Rysunek 4B) ilość i złożoność włókien wzrastała poprzecznie. W widoku poziomym (Rysunek 4C) zaobserwowano skomplikowaną siatkę z formacją arboryzowaną. Zaobserwowaliśmy kształt charakte...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wdrożyliśmy mikrotomografię komputerową z preparatem PTA w badaniu tkanek miękkich człowieka. Krótko mówiąc, próbki są zbierane i utrwalane w formalinie przez kilka dni, a następnie odwadniane w seryjnych roztworach etanolu. Umieszczenie próbki w roztworze PTA bezpośrednio po utrwaleniu formaliny może spowodować pękanie tkanek z powodu szybkiego odwodnienia. Dlatego przed barwieniem PTA konieczne jest seryjne odwodnienie. Następnie próbki barwi się roztworem PTA przez około tydzień. Następnie można wykonać skan MicroCT, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez grant badawczy Yonsei University College of Medicine (6-2018-0099). Autorzy dziękują ludziom, którzy bardzo hojnie przekazali swoje ciała na rzecz Yonsei University College of Medicine. Jesteśmy wdzięczni Jun Ho Kimowi i Jong Ho Bangowi za ich wsparcie techniczne (pracownikom Centrum Edukacji Anatomii Chirurgicznej w Yonsei University College of Medicine). Jesteśmy również wdzięczni firmie Genoss Co., Ltd. za wysokiej jakości system skanowania mikrotomografią komputerową wykorzystany w tych badaniach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
12 Kwas fosforowy wolframowy(VI)kwas n-hydrat
Kwas fosforowy		Junsei84220-0410PTA w proszku
CTvoxBrukerver 2.7Oprogramowanie do zwiadu 3D
NreconBrukerver 1.7.0.4Oprogramowanie do rekonstrukcji
SkyscanBruker 1173Skaner MicroCT
TconvBrukerver 2.0Plik oprogramowanie do zmiany rozmiaru

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nierenberger, M., Remond, Y., Ahzi, S., Choquet, P. Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins. Comptes Rendus Biologies. 338 (7), 425-433 (2015).
  2. Vymazalová, K., Vargová, L., Zikmund, T., Kaiser, J. The possibilities of studying human embryos and foetuses using micro-CT: a technical note. Anatomical Science International. 92 (2), 299-303 (2017).
  3. Tesařová, M., et al. Use of micro computed-tomography and 3D printing for reverse engineering of mouse embryo nasal capsule. Journal of Instrumentation. 11 (3), 1-11 (2016).
  4. Nemetschek, T., Riedl, H., Jonak, R. Topochemistry of the binding of phosphotungstic acid to collagen. Journal of Molecular Biology. 133 (1), 67-83 (1979).
  5. Rao, R. N., Fallman, P. M., Falls, D. G., Meloan, S. N. A comparative study of PAS-phosphotungstic acid-Diamine Supra Blue FGL and immunological reactions for type I collagen. Histochemistry. 91 (4), 283-289 (1989).
  6. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9 (11), (2009).
  7. Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  8. Nieminen, H. J., et al. Determining collagen distribution in articular cartilage using contrastenhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 23 (9), 1613-1621 (2015).
  9. Kwon, O. J., Kwon, H., Choi, Y., Cho, T., Yang, H. Three-dimensional structure of the orbicularis retaining ligament: an anatomical study using micro computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 17042(2018).
  10. Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLoS One. 12 (2), e0170597(2017).
  11. Zikmund, T., et al. High-contrast differentiation resolution 3D imaging of rodent brain by X-ray computed microtomography. Journal of Instrumentation. 13 (2), 1-12 (2018).
  12. Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974(2015).
  13. Nieminen, H. J., et al. 3D histopathological grading of osteochondral tissue using contrast-enhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 26 (8), 1118-1126 (2018).
  14. Greef, D. D., Buytaert, J. A. N., Aerts, J. R. M., Hoorebeke, L. V., Dierick, M., Dirckx, J. Details of Human Middle Ear Morphology Based on Micro-CT Imaging of Phosphotungstic Acid Stained Samples. Journal of Morphology. 276 (9), 1025-1046 (2015).
  15. Sutter, S., et al. Contrast-Enhanced Microtomographic Characterisation of Vessels in Native Bone and Engineered Vascularised Grafts Using Ink-Gelatin Perfusion and Phosphotungstic Acid. Contrast Media & Molecular Imaging. 2017, (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wi zad o utrzymuj ce mi sie okr nykontrast tkanek mi kkichrekonstrukcja 3Dbarwienie preparatuochrona Parafilmemobserwacja wielokierunkowawizualizacja tkanek

Powiązane artykuły