Opisany tutaj jest protokół bezpośredniego znakowania immunologicznego martwiczych włókien mięśniowych w kriosekcjach mięśni. Komórki martwicze są przepuszczalne dla białek surowicy, w tym immunoglobuliny G (IgG). Ujawnienie wychwytu IgG przez włókna mięśniowe umożliwia identyfikację i ilościowe określenie włókien mięśniowych, które ulegają martwicy niezależnie od stanu mięśni.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Znakowanie immunologiczne zwyrodnienia włókien mięśniowych w biopsjach mięśni
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Martwica włókien mięśniowych (mionecrosis) odgrywa kluczową rolę w patogenezie wielu schorzeń mięśniowych, w tym dystrofii mięśniowych. Oczekuje się, że opcje terapeutyczne dotyczące przyczyn patogenezy dystrofii mięśniowej złagodzą zwyrodnienie mięśni. Dlatego potrzebna jest metoda oznaczania i ilościowego określania zakresu śmierci komórek w biopsjach mięśni. Konwencjonalne metody obserwacji zwyrodnienia włókien mięśniowych in situ są albo słabo ilościowe, albo polegają na wstrzykiwaniu niezbędnych barwników. W tym artykule opisano protokół immunofluorescencji, który barwi nekrotyczne włókna mięśniowe poprzez celowanie w wychwyt immunoglobuliny G (IgG) przez włókna mięśniowe. Metoda wychwytu IgG opiera się na cechach komórek charakteryzujących martwiczą śmierć, w tym 1) utracie integralności błony plazmatycznej z uwolnieniem wzorców molekularnych związanych z uszkodzeniem oraz 2) wychwytie białek plazmatycznych. W przekrojach mysich koimmunoznakowanie włókien mięśniowych, białek macierzy zewnątrzkomórkowej i mysich IgG umożliwia czystą i prostą identyfikację włókien mięśniowych o losie martwiczym. Ta prosta metoda nadaje się do analizy ilościowej i ma zastosowanie do wszystkich gatunków, w tym próbek ludzkich, i nie wymaga wstrzykiwania barwnika żywotnego. Barwienie martwiczych włókien mięśniowych przez wychwyt IgG można również połączyć z innymi koimmunoznakami.
Wprowadzenie
Mięśnie szkieletowe prążkowane składają się głównie z włókien mięśniowych (włókien mięśniowych), które są odpowiedzialne za charakterystyczną funkcję dobrowolnego kurczenia się. Komórki te są wielojądrowymi, postmitotycznymi strukturami, które wspierają stres mechaniczny występujący podczas skurczu. Stabilność strukturalna błony włókien mięśniowych (sarcolemmy) i jej macierzy zewnątrzkomórkowej ma kluczowe znaczenie dla homeostazy tkanek. Komórki satelitarne stanowią główną populację progenitorów mięśni w dojrzałych mięśniach szkieletowych i istnieją w stanie spoczynku w zdrowych mięśniach. Po śmierci włókien mięśniowych regeneracja mięśni jest wspierana przez komórki satelitarne zgodnie z programem miogennym, który obejmuje aktywację komórek satelitarnych, proliferację, różnicowanie i fuzję, aby ostatecznie utworzyć nowe wielojądrowe włókna mięśniowe.
Utrata włókien mięśniowych może wystąpić w wielu stanach mięśniowych, w tym w urazach mechanicznych, urazach niedokrwienno-reperfuzyjnych lub dystrofiach mięśniowych, i jest związana z martwiczą morfologią martwych komórek1,2. Śmierć martwicza charakteryzuje się szybką przepuszczalnością błony plazmatycznej i uwalnianiem zawartości komórki w kompartmencie zewnątrzkomórkowym3. Może to wynikać albo z nieuregulowanego procesu obejmującego brak prawidłowej sygnalizacji komórkowej (tj. przypadkowej martwicy), albo z zaaranżowanego szlaku wewnątrzkomórkowego (tj. Regulowanej martwicy). W przypadku włókien mięśniowych zarówno procesy regulated4, jak i unregulated5 mogą prowadzić do martwicy. Typową konsekwencją mionecrozy jest uwolnienie wzorców cząsteczek związanych z uszkodzeniem, aktywujących silną reakcję zapalną6. Obecność makrofagów obserwuje się po około 48 i 72 godzinach od urazu7. Oprócz ich roli w usuwaniu martwiczych szczątków, są one również ważne w regeneracji mięśni8,9.
Dystrofie mięśniowe (MD) to niejednorodna grupa patologii, które często wynikają z defektu struktury sarcolemmy. Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest młodzieńczą chorobą sprzężoną z chromosomem X, która dotyka około 1 na 3500 urodzeń mężczyzn na całym świecie10 i jest spowodowana brakiem ekspresji dystrofiny w sarkolemmie. Przewlekłe zwyrodnienie tkanki mięśniowej u chłopców z DMD prowadzi do skrajnego osłabienia mięśni i wczesnej śmiertelności. Stan zapalny wynikający ze śmierci martwiczej zwiększa cytotoksyczność i sprzyja zwłóknieniu mięśni oraz utracie funkcji mięśni11,12. Oczekuje się, że terapie będące obecnie w fazie badań klinicznych ukierunkowane na przyczyny chorób zwyrodnieniowych mięśni, takie jak terapia genowa, złagodzą mionetruzę. Potrzebne są zatem proste techniki dokładnego ilościowego określania zwyrodnienia mięśni.
Kilka metod jest rutynowo stosowanych do monitorowania utraty włókien mięśniowych in vivo. Pomiar aktywności enzymatycznej kinazy kreatynowej (CK) we krwi pozwala na wiarygodne określenie ilościowe trwającej martwicy tkanek mięśniowych i serca. Barwienie in situ hematoksyliną i eozyną (H&E) jest najpopularniejszą obecnie metodą stosowaną w diagnostyce do oceny przebudowy zwyrodnieniowo-regeneracyjnej. Jednak molekularne podstawy znakowania martwych komórek za pomocą H&E pozostają niejasne. Co więcej, modyfikacje kolorów sugerujące śmierć włókien mięśniowych w barwieniu H&E są stosunkowo subtelne i nie ułatwiają wiarygodnej i powtarzalnej kwantyfikacji. Metody ujawniające fragmentację DNA, takie jak końcowe znakowanie końca nacięcia deoksynukleotydylotransferazy dUTP (TUNEL), niedokładnie oznaczają śmierć nekrotyczną 3. Są również słabo przystosowane do monitorowania śmierci komórek syncytialnych, takich jak włókna mięśniowe. Wstrzyknięcie ważnych barwników, takich jak niebieski barwnik Evana (EBD), stanowi użyteczną alternatywę do oceny włókien mięśniowych, które utraciły integralność sarkolemma, ale niekoniecznie jest wygodne w niektórych protokołach eksperymentalnych. Na przykład obecność EBD w próbkach krwi może wpływać na wyniki pomiarów CK, testu kolorymetrycznego. Co więcej, wewnątrzkomórkowy wychwyt EBD sprawia, że koznakowanie immunologiczne jest trudne. W związku z tym interesująca jest alternatywna metoda pozwalająca na bezpośrednie znakowanie włókien mięśniowych ulegających nekrozie.
Mechanizm działania ważnych barwników opiera się na utracie integralności błony plazmatycznej w nekrotycznych włóknach mięśniowych i pasywnym pobieraniu wstrzykniętego barwnika. Podobnie, martwicze włókna mięśniowe wychwytują białka krwi, takie jak albumina, do której EBD ma silne powinowactwo13,14, immunoglobulina G (IgG) i IgM15. Nieprawidłowa obecność białek krwi w mięśniach stanowi zatem dogodne markery mionecrosis in situ. Barwienie tych białek może być alternatywą dla stosowania niezbędnych barwników.
Używając wychwytu IgG jako markera mionecrosis in situ, ten protokół jest używany do oceny zwyrodnienia mięśni w kości piszczelowej przedniej (TA) myszy z niedoborem dystrofiny mdx. Metoda ta ma znaczące zalety w porównaniu z technikami alternatywnymi: 1) jest powtarzalna i prosta w wykonaniu; 2) nie wymaga żadnego leczenia zwierząt przed pobraniem mięśni, takiego jak wstrzyknięcie krążących barwników życiowych, oraz 3) jak każde konwencjonalne znakowanie immunologiczne, jest zgodne z koznakowaniem.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z ustawodawstwem francuskim i Wspólnoty Europejskiej (numer licencji 11-00010).
1. Przygotowanie gumy tragakanckiej
- W szklanej zlewce rozpuść 6 g proszku tragakantu w 100 ml wody dejonizowanej. Przykryj folią i pozostaw na co najmniej 3 godziny. Od czasu do czasu mieszaj ręcznie metalową szpatułką, ponieważ mieszanina szybko staje się lepka.
- Pozostawić mieszaninę tragakantu w temperaturze 60 °C na noc w łaźni wodnej lub w piekarniku. Ostrożnie uszczelnij zlewkę, aby uniknąć wysuszenia. Wymieszać co najmniej raz przed podaniem.
- Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
2. Zbieranie mięśni
UWAGA: W tym eksperymencie, 4-tygodniowy samiec myszy mdx został złożony w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy. Procedura ta nie wymaga znieczulenia i jest humanitarną metodą uśmiercania zgodnie z lokalnymi przepisami.
- Rozwarstwienie mięśnia piszczelowego przedniego (TA)
- Po ogoleniu nogi myszy połóż mysz na plecach i przypnij stopy do tablicy korkowej za pomocą igieł. Za pomocą precyzyjnych nożyczek (lub skalpela) i kleszczy usuń skórę nogi od stopy do kolana, aby odsłonić całą długość kości piszczelowej i TA.
- Nożyczkami wykonaj nacięcie między kością piszczelową a TA. Ułatwi to oddzielenie TA od kości i zapewni łatwy chwyt epimysium. Za pomocą precyzyjnych kleszczy ostrożnie usuń warstwę epimysium z powierzchni TA.
UWAGA: Na tym etapie TA może być bardziej podatna na wysuszenie, czego należy unikać. - W okolicy kostki odizoluj ścięgno TA od innych ścięgien za pomocą kleszczy. Delikatnie pociągnij ścięgno TA, aby odizolować je od kości piszczelowej i otaczających mięśni.
- Kiedy brzuch TA jest całkowicie oddzielony, przytrzymaj ścięgno tak, aby tylko proksymalna część mięśnia TA była przyczepiona do kolana. Delikatnie przeciąć ścięgno proksymalne jak najbliżej kości kolanowej.
- Umieść TA w gazie, która jest lekko zwilżona solą fizjologiczną, aby uniknąć wysuszenia przed zamrożeniem mięśnia.
- Wstępnie schłodzić 70-100 ml izopentanu w zlewce z tworzywa sztucznego lub politetrafluoroetylenu, częściowo zanurzając ją w ciekłym azocie. Pozostawić do ostygnięcia, aż izopentan na dnie zlewki stanie się białym ciałem stałym.
- Na okrągłym kawałku korka (20 mm x 11 mm x 8 mm) umieść ~0,5 ml gumy tragakantowej. Ostrożnie oznacz wstępnie drugą stronę korka, aby biopsja mogła być prawidłowo zidentyfikowana po etapie zamrażania.
- Osadź TA w dziąśle za pomocą kleszczy, dystalne ścięgno do góry. Aby umożliwić odpowiednie przekroje mięśnia, trzymaj mięsień tak, aby jego oś była prostopadła do powierzchni korka. Jakość kriosekcji poprawi się, jeśli biopsja nie będzie całkowicie osadzona w dziąśle. Pozwól, aby co najmniej połowa TA (strona ścięgna) była odsłonięta przez dziąsło.
- Szybko zanurz korek z osadzonym mięśniem w niezamrożonej, zimnej warstwie izopentanu. Należy pamiętać, że korek będzie unosił się w ciekłym izopentanie. Trzymaj próbkę do góry nogami, ponieważ mięsień musi być zanurzony w izopentanie. Pozostawić próbki w izopentanie na około 2 minuty, aby umożliwić całkowite zamrożenie.
UWAGA: Od tego etapu TA musi pozostać zamrożona do kriosekcji. Przechowuj mięśnie w suchym lodzie przed długotrwałym przechowywaniem w zamrażarce w temperaturze -80 °C.
3. Kriosekcja
- Ustawić temperaturę kriostatu na -25 °C. Utrzymuj temperaturę obiektu na poziomie około -20 °C. Zamocuj przedmiot w kriostacie za pomocą środka o optymalnej temperaturze cięcia (OCT). Przytnij mięsień, aż dotrze do mięśnia brzucha, a następnie wytnij odcinki 7−10 μm.
UWAGA: Stabilizacja temperatury obiektu wymaga co najmniej 10 minut. - Szklane szkiełka należy przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) używane do pobierania kriosekcji. Zbierz co najmniej dwie sekcje na każdym slajdzie. Sekcje mięśni automatycznie przykleją się i rozmrozi w kontakcie z ciepłym szkiełkiem. Zdejmij suwak i trzymaj go w pozycji RT.
- Pozostaw sekcje do wyschnięcia przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej w przewiewnym środowisku.
- Kriosekcje należy przechowywać na szkiełkach podstawowych w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
4. Znakowanie immunologiczne
- Rozmrażanie szkiełków w temperaturze pokojowej przez co najmniej 15 minut w wentylowanym środowisku.
- Wyznacz obszar sekcji za pomocą hydrofobowego pisaka. Pozostaw barierę hydrofobową do wyschnięcia.
- Utrwal tkankę 2% paraformaldehydem przez 10 minut w wilgotnej komorze.
- Przemyć sekcje solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) 2x po 5 minut każda.
- Zablokuj sekcje mięśniowe 10% surowicą kozią rozcieńczoną w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.
- Inkubować skrawki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (lub przez noc w temperaturze 4 °C) w wilgotnej komorze z przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w 5% surowicy koziej. W celu prostego znakowania wychwytu IgG we włóknach mięśniowych, inkubuj tylko skrawki z przeciwciałem królika przeciwko mysiej pan-lamininie.
UWAGA: Inne antygeny macierzy zewnątrzkomórkowej mogą być celem ataku, o ile zapewniają wyraźne znakowanie otaczającej macierzy zewnątrzkomórkowej włókien mięśniowych. Markery regeneracji mięśni, stanu zapalnego lub innych parametrów można łączyć, o ile przeciwciała nie są podwyższone u gospodarza myszy. Mikroskop używany do analizy powinien zawierać dodatkowy kolor fluorescencyjny. - Umyj sekcje PBS 3x przez 5 minut każda.
- Inkubować skrawki z czerwonym fluorescencyjnym przeciwciałem poliklonalnym kozy przeciwko króliczemu IgG H&L i zielonym fluorescencyjnym kozim poliklonalnym przeciwciałem drugorzędowym przeciwko mysim IgG H&L. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 minut w wilgotnej komorze.
- Myć PBS 3x przez 10 min każdy.
- Umieścić skrawki w fluorescencyjnym podłożu montażowym zawierającym 100 ng/ml 4′,6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI) i przykryć każde szkiełko szkiełkiem nakrywkowym.
- Pozostawić do wyschnięcia na noc w temperaturze 4 °C przed obrazowaniem.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Włókna mięśniowe są otoczone macierzą zewnątrzkomórkową zawierającą lamininę. Czerwone barwienie wyznacza obwód włókien mięśniowych i umożliwia ich identyfikację. IgG jest przedstawione na zielono. Jądra komórkowe są barwione DAPI i w mikroskopie widoczne są jako niebieskie. Tutaj jednak jądra przedstawiono w kolorze białym (Rysunek 1). W przestrzeni zewnątrzkomórkowej spodziewana jest słaba immunoreaktywność IgG, która może wzrosnąć w przypadku stanu zapalne...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Martwica włókien mięśniowych jest częstą konsekwencją traumatycznych ćwiczeń w normalnych mięśniach. Jest to dobrze kompensowane przez potężną zdolność regeneracyjną lokalnych mięśni progenitorowych. Jednak w kilku stanach mięśni, takich jak MD, zdolność regeneracyjna komórek satelitarnych jest zagrożona przez przewlekłą mionetruzę i nadmierne zwłóknienie. Ostatnie odkrycia pokazują, że włókna mięśniowe mogą obumierać w wyniku nekroptozy, regulowanej formy martwicy. Mówiąc dokładniej, hamowanie nekroptozy może stać się n...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Association Française contre les Myopathies z programem Translamuscle. Autorzy dziękują dr Perli Reyes-Fernandez i dr Matthew Borokowi za uważne zapoznanie się z rękopisem.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Okrągłe krążki korkowe | Pyramid Innovation | R30001-E | Nie zapomnij wyraźnie oznaczyć korka, aby można było określić ID próbki po zamrożeniu |
| Kriostat | Leica | CM3050 sn34 | Kriosekcja mięśni powinna być wykonywana w zakresie od -20 do -25 stopni Celsjusza. Grubość: 7-10 mikrometrów. |
| Dakopen | Dako | S2002 | Hydrofobowa bariera wokół sekcji mięśniowych. Zapobiega dyspersji pożywki podczas inkubacji |
| Kleszcze | FST | 91117-10 | / |
| Goat przeciwciało anty-mysie IgG (H+L), Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFischer Scientific | A-11029 | Rozcieńczenie: 1/500 |
| Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFischer Scientific | A32740 | Rozcieńczenie: 1/500 |
| Surowica kozia | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Na etapie blokowania użyć 10% rozcieńczenia w PBS. Do inkubacji przeciwciał należy użyć 5% rozcieńczenia w |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 78-78-4 | . Należy schłodzić w zlewce umieszczonej w ciekłym azocie. |
| Mysz mdx | Jackson Laboratory | C57BL / 10ScSn-Dmdmdx / J | Myszy Mdx są zmutowane dla genu dystrofiny. Od trzeciego tygodnia życia mięśnie charakteryzują się przewlekłym zwyrodnieniem |
| Mikroskop | Zeiss | Imager.D1 | / |
| OCT | Cellpath | KMA-0100-00A Matryca | do zatapiania |
| PFA (paraformaldehyd) | ThermoFischer Scientific | 28908 | Służy do utrwalania kriosekcji (można zastosować 2% lub 4% PFA) |
| PBS | Eurobio | CS3PBS00-01 | Podłoże rozcieńczające do znakowanie immunologiczne |
| Nożyczki precyzyjne | FST | fst 14001-12 i fst 14001-14 | Używane do zbierania mięśni |
| Przeciwciało królika przeciwko mysi pan-Laminin | Sigma Aldrich | L9393 | Rozcieńczenie: 1/1000 |
| Tragacanth | Sigma Aldrich | G1128 | Podwielokrotności do utrzymania na poziomie +4° Z |
Bibliografia
- Carpenter, S., Karpati, G. Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired. Brain. 102 (1), 147-161 (1979).
- Cornelio, F., Dones, I. Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data. Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differerentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Morgan, J. E., et al. Necroptosis mediates myofiber death in dystrophin-deficient mice. Nature Communications. 9 (1), 3655(2018).
- Moens, P., Baatsen, P. H., Marechal, G. Increased susceptibility of EDL muscles from mdx mice to damage induced by contractions with stretch. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (4), 446-451 (1993).
- Tidball, J. G., Villalta, S. A. Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration. American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 298 (5), R1173-R1187 (2010).
- Riederer, I., et al. Slowing down differentiation of engrafted human myoblasts into immunodeficient mice correlates with increased proliferation and migration. Molecular Therapy. 20 (1), 146-154 (2012).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. Journal of Experimental Medicine. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Bencze, M., et al. Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation. Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).
- Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK). European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).
- Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle. Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).
- Rosenberg, A. S., et al. Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscular Disorders. 22 (1), 34-42 (2012).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience. 9. 385, (2015).
- Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).
- Pastoret, C., Sebille, A. Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse. Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).
- Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
