Niedrogie zadanie kojarzenia zapachu i nagrody do testów uczenia się i pamięci

Podsumowanie

Zadanie związane z uczeniem się asocjacyjnym zostało wykorzystane do zbadania różnicowego wpływu manipulacji fizjologicznej na pamięć długotrwałą i krótkotrwałą.

Streszczenie

Solidne i proste paradygmaty behawioralne pamięci asocjacyjnej są kluczowe dla badaczy zainteresowanych komórkowymi i molekularnymi mechanizmami pamięci. W tym artykule opisano skuteczny i tani protokół behawioralny myszy do badania wpływu manipulacji fizjologicznych (takich jak infuzja środków farmakologicznych) na szybkość uczenia się i czas trwania pamięci zapachowo-nagrodowej. Reprezentatywne wyniki uzyskano w badaniu oceniającym różnicującą rolę aktywności receptora kinazy tyrozynowej w pamięci krótkotrwałej (STM) i długotrwałej (LTM). Samce myszy zostały uwarunkowane do kojarzenia nagrody (granulki cukru) z jednym z dwóch zapachów, a ich pamięć o związku została przetestowana 2 lub 48 godzin później. Bezpośrednio przed treningiem do opuszki węchowej (OB) podano inhibitor receptora kinazy tyrozynowej (Trk) lub wlewy nośnika. Chociaż nie stwierdzono wpływu infuzji na szybkość uczenia się, blokada receptorów Trk w OB selektywnie upośledzała LTM (48 godzin), a nie pamięć krótkotrwałą (STM; 2 h). Upośledzenie LTM przypisano zmniejszonej selektywności zapachowej mierzonej długością czasu kopania. Kulminacja wyników tego eksperymentu wykazała, że aktywacja receptora Trk w OB jest kluczem do konsolidacji pamięci węchowej.

Wprowadzenie

Mechanizmy tworzenia pamięci asocjacyjnej były wcześniej badane głównie na podstawie jednopróbnych badań nad warunkowaniem strachu. Jednak wiele przyziemnych zadań ma zazwyczaj bardziej złożone wzorce pozyskiwania i opiera się na powtarzających się spotkaniach. Celem tego protokołu jest zapewnienie opłacalnego paradygmatu behawioralnego gryzoni, który jest wykorzystywany do zrozumienia komórkowych i molekularnych mechanizmów wielopróbowego uczenia się i pamięci apetytywnej.

Uczenie się zapachu, które jest zależne od głównej opuszki węchowej (OB), dostarcza kilku korzyści do badania wielopróbnej pamięci pożądawczej. Po pierwsze, wspomnienia zależne od OB mają różny czas trwania (STM, LTM i pamięć średniotrwała¹) i opierają się na tym samym molekularnym^2,3 i mechanizmie strukturalnym, jak w innych częściach mózgu, w tym neuromodulacji⁴, długotrwałe wzmocnienie⁵, oraz adult neurogenesis^6,7,8. Po drugie, w przeciwieństwie do regionów wyższego rzędu, takich jak hipokamp, wspomnienia zależne od OB pozwalają na obserwację bardziej bezpośredniej zgodności między manipulacjami eksperymentatora środowiskiem percepcyjnym a zmianami w obwodach neuronalnych odpowiedzialnych za uczenie się^8,9,10,11. W tym artykule szczegółowo omówiono paradygmat asocjacyjnego uczenia się i pamięci zależny od OB, który można wykorzystać do badania ogólnych mechanizmów molekularnych i strukturalnych. Został opracowany, aby umożliwić naukowcom dostęp do zalet uczenia się węchowego w celu badania komórkowych i molekularnych mechanizmów pamięci.

W naszej ostatniej publikacji³, opisany tutaj protokół został wykorzystany do wykazania, że konsolidacja uczenia się zapachu apetytywnego jest zależna od aktywacji receptora Trk w obrębie OB. W poniższym protokole omówiono również obszary, w których paradygmat behawioralny można dostosować do różnych potrzeb eksperymentalnych.

W sumie w tym badaniu wykorzystano 27 dorosłych samców myszy CD-1, które miały 8 tygodni w momencie kaniulacji. Aby zapoznać się z dokładnymi rozkładami grup i zastosowaniem zestawu zapachów, zobacz sekcję metod w naszej poprzedniej publikacji³. Samce myszy były używane w celu uniknięcia dużych wahań poziomu estrogenu, ponieważ poprzednie badania¹² wykazały, że pamięć węchowa jest wzmocniona przez zwiększony poziom estrogenu. Myszy te były zawsze trzymane w odwróconym cyklu światła/ciemności o godzinie 12:12 i miały dostęp do wody. Podczas eksperymentów behawioralnych diety myszy zostały ograniczone, aby utrzymać je na poziomie ~90% ich masy wolnego karmienia. Ograniczanie diety rozpoczęło się 3 dni przed rozpoczęciem eksperymentu behawioralnego. Jak zostanie opisane poniżej, ta sama grupa myszy ma różne zestawy zapachów w celu osiągnięcia odpowiednich poziomów mocy statystycznej przy jednoczesnym zminimalizowaniu wykorzystania przez zwierzęta. Sekcja analizy statystycznej pokazuje, jak uwzględnić losową wariancję, która może zostać wprowadzona przez to.

Protokół

Poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi IACUC w Earlham College dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Kaniulacja opuszki węchowej

UWAGA: Te operacje nie wymagają sterylnej techniki, ponieważ nie wymagają wykonywania dużych nacięć. Każda instytucja może jednak różnić się swoimi wymaganiami. Jeśli eksperymentatorzy przeprowadzają tę operację na szczepach myszy z obniżoną odpornością, konieczne mogą być dodatkowe rozważania. Ogólnie rzecz biorąc, eksperymentatorzy są zachęcani do omówienia tego protokołu z weterynarzem i zespołem zajmującym się opieką nad zwierzętami przed użyciem oraz do czyszczenia i dezynfekcji wszystkich narzędzi między każdą operacją.

1. Podczas ustawiania namocz kaniule i w małej zlewce lub szalce Petriego zawierającej 32% chlorheksydyny, aby je zdezynfekować.
2. Znieczulij myszy gazowym 4% izofluranem w czystym tlenie i zabezpiecz w aparacie stereotaktycznym. Podczas operacji upewnij się, że myszy są utrzymywane w znieczuleniu izofluranowym o stężeniu 1,5-2% podawanym przez stożek nosowy. Monitoruj oddech przez cały czas trwania operacji. Użyj maści do oczu, aby zapobiec suchości oczu podczas znieczulenia.
3. Po tym, jak mysz jest zabezpieczona i nie reaguje już na mocne uszczypnięcie tylnej stopy, użyj 32% chlorheksydyny do pocierania czubka głowy w celu oczyszczenia powierzchni nacięcia.
4. Następnie natrzyj czubek głowy w kierunku rostralnym do doogonowym lidokainą (znieczulenie miejscowe).
5. Dociśnij mocno, aby wykonać pojedyncze nacięcie wzdłuż linii środkowej czystym ostrzem skalpela.
6. Za pomocą wiertła dołączonego do stereotaktyki wywierć dwa otwory nad opuszkami węchowymi dla kaniuli prowadzącej (26 G) używając współrzędnych AP +5,0 mm, ML +/- 0,75 mm w stosunku do bregmy.
7. Wywierć dwa otwory nad formacją móżdżku.
   UWAGA: Położenie tych nie musi być precyzyjne, upewnij się, że są symetryczne wzdłuż linii środkowej.
8. Umieść w dwóch otworach nad formacją móżdżku i użyj kleju tkankowego, aby przymocować te do czaszki.
9. Użyj stereotaktycznego, aby włożyć kaniulę prowadzącą (26 G) do otworów wywierconych nad opuszkami węchowymi (krok 1.6). Opuść kaniulę DV o 1,0 mm.
10. Wymieszaj cement dentystyczny na szalce Petriego. Użyj małej metalowej miarki, aby powoli ułożyć cement dentystyczny wokół kaniuli. Pozostaw do wyschnięcia na 5 sekund. Następnie zdejmij ramiona urządzenia stereotaktycznego, uważając, aby nie wyciągnąć kaniuli prowadzącej w tym procesie. Kontynuuj układanie cementu dentystycznego na całym nacięciu, aż utworzy się mała nasadka (patrz Rysunek 1A).
11. W tym miejscu umieść atrapy zatyczek w kaniuli prowadzącej, aby zapobiec zablokowaniu.
12. Bezpośrednio po zabiegu wstrzyknąć ketoprofen (0,2 mg/kg) i sól fizjologiczną (200 μl) w celu zmniejszenia bólu i nawodnienia. Zapewnij myszom zmiękczony pokarm lub hydrożel po operacji. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyskają przytomności, aby utrzymać leżący mostek.
    UWAGA: Od tego momentu myszy są również trzymane pojedynczo.
13. Wstrzykiwać sól fizjologiczną (200 μl) i ketoprofen (0,2 mg/kg) raz dziennie przez dwa dni po zabiegu.
14. Przez 2 dni i do 5 dni (w razie potrzeby) po operacji waż myszy i monitoruj ich wagę. Jeśli waga nie powróci do poziomu sprzed operacji w ciągu dwóch lub trzech dni, skonsultuj się z weterynarzem w sprawie odpowiedniej metody karmienia.
15. Pozwól myszom dojść do siebie przez co najmniej 7 dni przed rozpoczęciem treningu behawioralnego.

2. Zadanie związane z dyskryminacją asocjacyjną

1. Napary
   1. Podawać myszom swoiste dla OB wlewy inhibitora receptora kinazy tyrozynowej, K252a (50 μM; 5% DMSO w soli fizjologicznej) lub nośnika (5% DMSO w soli fizjologicznej) w następujący sposób.
      1. Dostarczyć napar do OB myszy obustronnie. Wstrzyknąć 2,0 μl końcowej objętości na bańkę z szybkością infuzji 0,2 μl/min i 10 min całkowitego czasu infuzji za pomocą podwójnej pompy inżektorowej.
         UWAGA: Czas manipulacji można dostosować w zależności od rodzaju przeprowadzanego badania behawioralnego. Dokładne etapy infuzji są specyficzne dla każdej pompy iniekcyjnej i podane w instrukcji producenta.
      2. Upewnij się, że pozostawiłeś wstrzykiwacze wewnątrz kaniul na około 5 minut po podaniu, aby zahamować przepływ wsteczny i promować dyfuzję. (tj. należy zaplanować łącznie 15 minut na każdą infuzję).
2. Zestawy zapachowe.
   1. Rozcieńczyć wszystkie substancje zapachowe w lekkim oleju mineralnym do ciśnienia parcjalnego 1,0 Pa, stosując wstępnie obliczony stosunek oparty na prężności par (tabela 1).
   2. Użyj 5 oddzielnych par zapachów z tabeli 1 (liczby w tabeli wskazują objętość w μl, aby wymieszać z 50 ml oleju mineralnego na 1,0 Pa).
   3. Aby przygotować pachnący piasek do użycia podczas etapów behawioralnych (sekcja 2.3 i 3), wymieszaj 400 μl środka zapachowego 1,0 Pa z kroku 2.2.2 na każde 100 g piasku do zabawy.
3. Kształtowanie
   UWAGA: Myszy powinny być poddawane kształtowaniu przez okres 10 dni, jak opisano poniżej.
   1. Przynieś myszy do sali zabiegowej i dotykaj nimi przez 10 minut dziennie przez pierwsze dwa dni po rekonwalescencji po operacji.
   2. W dniu 3 umieść szalkę Petriego wypełnioną piaskiem o zapachu (+)-limonenu w klatkach domowych myszy i wypełnioną około 10 granulkami sacharozy, każdy o masie 5 mg.
      UWAGA: Użyj 1,0 Pa (+)-limonenu (zmieszaj 102 μl z 50 ml oleju mineralnego) jako nagrodzony zapach i zwykły olej mineralny (środek rozcieńczający do testowania zapachów) jako zapach nienagrodzony. Zaleca się również wybór monomolekularnych środków zapachowych, ponieważ najprawdopodobniej będą one nowością dla myszy.
   3. Uzupełnij zarówno piasek, jak i granulki w dniu 4.
   4. W dniach 5 i 6 przyzwyczaj myszy do specjalnie zaprojektowanego aparatu behawioralnego, umieszczając je w aparacie i pozwalając im eksplorować przestrzeń (Rysunek 1B,C). Wykonaj urządzenie przy użyciu standardowej klatki domowej i poli (metakrylanu metylu) do skonstruowania dwóch pokryw i czarnej przegrody środkowej. Upewnij się, że zarówno pokrywy, jak i środkowa przegroda są o 1-2 cm większe niż klatka domowa.
   5. Przygotuj jedną szalkę Petriego z piasku o zapachu limonenu, a drugą z piaskiem zawierającym olej mineralny. Po aklimatyzacji zarówno w dniu 5, jak i 6, umieść obie szalki z piaskiem w komorze testowej i wymieszaj 10 granulek sacharozy z naczyniem o zapachu limonenu, aby służyło jako nagroda. Umieść każdą mysz w komorze testowej na 10 minut i pozwól jej swobodnie eksplorować i spożywać granulki nagrody.
   6. W dniu 7 wprowadź myszy do skróconej wersji końcowej procedury testowej, umieszczając naczynia zawierające piasek o zapachu limonenu i oleju mineralnego w aparacie behawioralnym. Tym razem uwzględnij środkową przegrodę.
      1. Umieść pojedynczą nagrodę na piasku o zapachu limonenu i umieść mysz w komorze spoczynkowej.
      2. Po umieszczeniu myszy w komorze spoczynkowej podnieś środkową przegrodę, aby umożliwić myszowi wejście do komory testowej w celu zbadania i wykopania naczyń wypełnionych piaskiem. Umieść mysz z powrotem w komorze spoczynkowej po wyjęciu kulki nagrody lub po upływie 5 minut.
      3. Powtórz ten proces, aby uzyskać łącznie 10 prób dla każdej myszy. Zrównoważ umieszczenie nagrodzonego dania po lewej lub prawej stronie, wykorzystując generator liczb losowych. Nie ma okresów odpoczynku między badaniami.
   7. W dniu 8 powtórz próby z dnia 7, ale także stopniowo zakopuj granulkę coraz głębiej w piasku.
      UWAGA: Większość myszy powinna kopać w poszukiwaniu niewidocznej kulki nagrody do 10. próby w dniu 8.
   8. W dniu 9 zwiększ liczbę prób do 20 prób dla każdej myszy z pełnym, głębokim zakopaniem osadu sacharozy i wprowadzeniem myszy do komory testowej na 1 minutę na próbę. Niech myszy kopią w obu naczyniach, aby zdobyć nagrodę.
   9. W dniu 10 powtórz 20 prób dla każdej myszy, ale jeśli wkopią się w nienagrodzone danie, zanim wkopią się w nagrodzone danie, a następnie rozpocznij następną próbę. Pozwól myszom, które jako pierwsze wkopały się do nagrodzonego (pachnącego limonenem) naczynia, odzyskać granulkę nagrody przed wysłaniem ich z powrotem do komory spoczynkowej.

3. Szkolenia i testy

UWAGA: Gdy myszy zaczną niezawodnie kopać w poszukiwaniu niewidocznych, zapachowych granulek nagrody, eksperyment może się rozpocząć.

1. Szkolenie
   UWAGA: Faza szkolenia rozpoczyna się dwa dni po zakończeniu kształtowania i składa się z 20 prób dla każdej myszy. Przed rozpoczęciem treningu należy natychmiast podać dogałkowe wlewy leku/nośnika (szczegółowe informacje na temat infuzji znajdują się w punkcie 2.1) i rozpocząć szkolenie bezpośrednio po infuzji.
   1. Umieść mysz w komorze spoczynkowej.
   2. Umieść dwie miseczki z piaskiem o zapachu nowej pary zapachowej w komorze testowej, gdzie w jednej z naczyń zakopana jest osadka nagrody.
   3. Gdy komora testowa będzie gotowa, podnieś nieprzezroczystą barierę i wprowadź mysz do komory testowej. Natychmiast zwróć mysz do komory spoczynkowej, jeśli mysz pierwsza wkopie nienagrodzone naczynie (zapisz te próby jako "0"). Jeśli mysz jako pierwsza wkopie się w satysfakcjonujący zapach, pozwól jej odzyskać granulkę i zwróć ją do komory spoczynkowej. Zapisz te próby jako "1". Jeśli próba trwa 1 minutę, a mysz nie odzyska nagrody, wyślij mysz z powrotem do komory spoczynkowej.
   4. Umyj i ponownie napełnij naczynia i rozpocznij kolejną próbę. Powtórz to samo dla 20 prób.
2. Testowanie
   UWAGA: Testy pamięci mogą być wykonywane w dowolnym czasie, który interesuje badacza. W tym eksperymencie dwie oddzielne grupy myszy testowano 2 godziny (STM) lub 48 godzin (LTM) po treningu, biorąc pod uwagę zainteresowanie różnicowym wpływem K252a na STM i LTM.
   1. Przeprowadzić badania z wykorzystaniem tych samych zapachów i procedury, jakie opisano dla szkolenia (sekcja 3.1).
      UWAGA: W zależności od pytania badawczego, badacz może potrzebować uwzględnienia grup kontrolnych. Na przykład w opublikowanym wcześniej eksperymencie badano wpływ blokady receptora Trk na konsolidację pamięci³. Dlatego grupie kontrolnej podano K252a przed 48-godzinnymi testami, aby wykazać, że efekty nie były spowodowane zakłóceniami w pobieraniu.
3. Analiza statystyczna
   UWAGA: Składnia SPSS 22.0 dla każdego kroku jest podana jako plik uzupełniający jako przykład.
   1. Przeprowadź analizę statystyczną za pomocą liniowej analizy efektów mieszanych. W przeciwieństwie do ANOVA, liniowe modele efektów mieszanych mogą lepiej uwzględniać efekty losowe i powtarzające się pomiary.
   2. Oblicz miarę zależną: "proporcja poprawna." Przypomnij sobie z 3.1.3, że "1" było przypisane do prób, w których mysz jako pierwsza wkopywała się w nagradzający zapach, a "0" jeśli mysz pierwsza wkopała się w niewdzięczny zapach. Uśredniaj co pięć prób, aby utworzyć cztery bloki próbne (gruźlica; np. blok próbny 1 lub TB1 był średnią z prób 1-5, blok próbny 2 lub TB 2 był średnią z badań 6-10 i tak dalej).
   3. Ustaw zmienne niezależne lub stałe efekty jako grupy narkotyków (K252a lub Vehicle; Sekcja 2.1.1) i bloki próbne (od 3.3.1). W poniższych reprezentatywnych wynikach określono zmienne używane do każdej analizy.
   4. Uwzględnij indywidualne zestawy myszy i zapachów zagnieżdżone w myszy jako "losowe efekty", aby zrekompensować wewnętrzne różnice w zachowaniu myszy i wszelkie efekty używania wielu zestawów zapachów.
   5. Wykonaj transformację logit na proporcji correct.
      UWAGA: Proporcja prawidłowa nie jest ciągłą, niezwiązaną zmienną zależną. Tym samym narusza dwa założenia dotyczące modeli liniowych. W związku z tym wykonywana jest transformacja logitowa.
   6. Użyj szacowanych środków marginalnych do przeprowadzenia testów post hoc na istotnych interakcjach zidentyfikowanych przez pełny model; wielokrotne porównania parami muszą zostać skorygowane w testach post hoc. Zazwyczaj używa się Bonferroni lub Šidák.

Wyniki

Jak opisano, ten protokół pozwala badaczom ocenić wpływ niektórych manipulacji na uczenie się, STM i LTM. Przykładowe wyniki z Tong et al, 2018³ są przedstawione tutaj. Wyniki potwierdzają hipotezę, że blokada receptora Trk selektywnie hamuje LTM, ale nie uczenie się ani STM.

Rysunek 2A pokazuje schematy treningu, testu STM i testu LTM. Po pierwsze, wykazano, że napary K252a nie wpływały na tempo uczenia się związku zapach-nagroda. Rysunek 2B (Sekcja 3.1) pokazuje tempo uczenia się zarówno K252a, jak i grup pojazdów z treningu. Przeprowadzono analizę statystyczną przy użyciu liniowego modelu mieszanego z dwoma stałymi efektami, grupą leku i blokiem próbnym (TB); Mysz i zestaw zapachów zagnieżdżone w myszy były efektami losowymi. Dane z badań (sekcja 3.2) nie zostały uwzględnione w analizie. Istotny efekt główny zaobserwowano w bloku badania (F(3, 183,692) = 43,735, p < 0,001), ale nie zaobserwowano żadnego wpływu w grupie leku (F(1, 85,685) = 0,132, p = 0,717) i brak istotnej interakcji (F(3, 183,692) = 0,111, p = 0,954). Testy post hoc, z zastosowaniem korekty Šidáka, potwierdziły, że K252a i grupy pojazdów nie różniły się w żadnym z bloków próbnych podczas szkolenia (p > 0,05 dla wszystkich porównań). TB2, TB3 i TB4 były znacznie wyższe niż TB1 we wszystkich porównaniach (p ≤ 0,001 we wszystkich przypadkach), co pokazuje, że obie grupy z powodzeniem nauczyły się związku zapach-nagroda pod koniec 20 prób szkoleniowych.

Następnie, aby zbadać wpływ infuzji na STM i LTM, przeprowadzono tę samą analizę, która zawierała dane z Testów (Sekcja 3.2). Wykazano istotną interakcję między grupą leku a blokiem badania (F(2, 77,558) = 4,043, p = 0,021), bez istotnych głównych skutków grupy leku (F(1, 55,629) = 1,438, p = 0,236) lub bloku próbnego (F(2, 69,979) = 1,360, p = 0,263). W celu szczegółowego zbadania pamięci, porównano post hoc parami z poprawką Šidáka, porównując różnice między ostatnim blokiem próbnym szkolenia (sekcja 3.1) a pierwszym blokiem próbnym testowania (sekcja 3.2) albo 2 (STM), albo 48 godzin (LTM) później. W przypadku myszy, którym podawano podłoże, porównania wykazały zachowanie pamięci asocjacyjnej zarówno po 2, jak i 48 godzinach po treningu (p > 0,05 dla wszystkich porównań z wydajnością treningową). W przypadku myszy z infuzją K252a pierwszy blok próbny 2-godzinnego testu (STM) nie różnił się od ostatniego bloku próbnego treningu (p > 0,05); Jednak ich wydajność pamięci była znacznie niższa po 48 godzinach (p = 0,018). Ponadto pamięć w teście 48-godzinnym była znacznie zmniejszona w porównaniu z pamięcią w teście 2-godzinnym (p = 0,009) oraz z wydajnością grupy pojazdów w teście 48-godzinnym (p = 0,006). Nie było różnicy w STM między myszami z nośnikiem i K252a (p = 0,356). Podsumowując, wyniki pokazują, że hamowanie receptorów Trk przez K252a w opuszce węchowej selektywnie zakłóca długotrwałą, ale nie krótkotrwałą pamięć zapachową (Rysunek 3).

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.

Zestaw zapachowy	Zapach 1	Zapach 2
1	Kwas pentanowy	kwas butanowy
	225,1	63,6
2	sześciokątny	heptanal
	Rozdział 11.1	Pytanie 35,3
3	octan propylu	octan butylu
	3.1	Rozdział 10,9
4	2-oktanon	2-heptanon
	87,4	Klasa 28,7
5	pentanolu	heksanol
	37,2	127,3

Tabela 1: Objętości mieszania dla zestawów zapachowych. Każdy wiersz pokazuje dwa zapachy, które można użyć jako pary dla kroków behawioralnych. Na przykład, aby użyć pierwszego "zestawu zapachowego", przygotuj mieszaniny kwasu pentanowego i butanowego. Liczby w tabeli wskazują objętość w μl, którą należy wymieszać z 50 ml oleju mineralnego o stężeniu 1,0 Pa dla każdego zapachu. Podczas treningu i testów jedna szalka Petriego była pachnąca kwasem pentanowym, a druga kwasem butanowym.

Rycina 1: Umieszczenie kaniulacji i aparatura behawioralna. (A) Pokazuje względne położenie kaniuli, nasadki z cementu dentystycznego i do głowy myszy. Należy pamiętać, że igły kaniuli sięgają do dwóch opuszki węchowych, sam cokół jest osadzony w nasadce z cementu dentystycznego. umieszcza się w dwóch otworach wywierconych w czaszce nad formacją móżdżku. nie dotykają samego mózgu, ale działają jak kotwica ogonowa dla nasadki z cementu dentystycznego. Rysunek przedstawia względny rozmiar do wykonania cementowej czapy. (B) Pokazuje zmontowany aparat behawioralny. Korpus to typowa klatka domowa dla myszy. Pokrywy z otworami na powietrze zostały wykonane z pleksi. Przegroda środkowa jest również wykonana z czarnej pleksi. Pokrywy powinny być wykonane z wystarczająco ciężkiej pleksi, aby mogły działać jako trakt dla środkowej przegrody, która ma być podnoszona i odkładana podczas prób. (C) Pokazuje jedną stronę aparatu behawioralnego. Zwróć uwagę, że środkowa przegroda jest nieco wyższa niż klatka, co ułatwia podnoszenie. Szalki Petriego z piasku można umieścić wzdłuż krawędzi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Projekt badania i wyniki uczenia się. (A) Przedstawia schemat projektu badania. Należy zauważyć, że grupy STM i LTM były niezależne (tj. różne grupy myszy). Symbole na początku klocków wskazują czas, w którym zostały podane napary. (B) Pokazuje proporcje poprawne dla prób 1-20 podczas treningu. Wyniki wskazują, że K252a i grupy pojazdów nie różniły się pod względem szybkości uczenia się (nachylenia linii). Słupki błędów reprezentowały błąd standardowy średniej (SEM). Gwiazdki wykazują znaczny wzrost proporcji prawidłowej w porównaniu z TB1 zarówno dla kohort nośnika, jak i K252a (p ≤ 0,001 dla wszystkich porównań). Ten rysunek został zaadaptowany z Tong et al. 2018 za zgodą³. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Zróżnicowany wpływ blokady receptora Trk na STM i LTM. Pokazuje proporcje poprawne dla Bloku Próbnego 4 Szkolenia i Bloku Próbnego 1 zarówno Testów STM, jak i LTM. Oznacza to, że liniowy model mieszany służy do porównania proporcji prawidłowej podczas ostatniego bloku próbnego fazy treningu (Rysunek 2; Trening-TB4) do osób podczas pierwszych bloków próbnych (Testowanie-TB1) krótkotrwałego (test 2-godzinny) i długoterminowego (test 48-godzinny) testu pamięci. Liniowy model mieszany miał dwa stałe efekty: grupa leków i blok próbny (Training-TB4, STM-TB1, LTM-TB1). Losowe efekty to mysz i zapach zagnieżdżone w myszy. Porównania post hoc wykazały, że myszy K252a miały znacznie upośledzony LTM (porównanie z treningiem TB4; p = 0,018), ale nie STM (p > 0,05). Wydajność LTM myszy z infuzją K252a była również znacznie niższa niż STM myszy z K252a (p = 0,009) i niższa niż LTM myszy z nośnikiem (p = 0,006). Słupki błędów reprezentowały SEM. Ten rysunek został zaadaptowany z Tong et al. 2018 za zgodą³. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający: Składnia używana do analizy statystycznej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Jednopróbne warunkowanie strachu jest potężnym protokołem behawioralnym do badania molekularnej i komórkowej dynamiki pamięci, ale większość naturalnego uczenia się jest przyrostowa i najlepiej modelowana za pomocą paradygmatu takiego jak ten opisany powyżej. Hamowanie receptorów Trk w OB zapobiegło konsolidacji pamięci węchowej w wielopróbowym, apetytywnym paradygmacie uczenia się, jak wykazano wcześniej przez naszą grupę³. Odkrycie otwiera nowe możliwości badań nad zróżnicowanym czasem działania mechanizmów molekularnych, takich jak neurotrofiny, w uczeniu się apetytywnym i awersyjnym.

Eksperyment ten składał się z dwóch krytycznych części: (1) kaniulacji i (2) zadania dyskryminacji asocjacyjnej (podzielonej na kształtowanie, szkolenie i testowanie). Eksperymentatorzy mogą dostosować ten protokół do swojego konkretnego pytania badawczego. Na przykład, byliśmy przede wszystkim zainteresowani OB i ten ustalony protokół może być łatwo zastosowany w innych badaniach OB. Dla eksperymentatorów z innymi regionami zainteresowania ważne będzie walidacja miejsc infuzji w badaniu pilotażowym. Eksperymentatorzy mogą być również zmuszeni do rozważenia szybkości dyfuzji, penetracji przestrzennej i czasu trwania bioaktywności tego, co zaparzają.

Etapy kształtowania nakreślone w protokole były szeroko stosowane przez autorów tego protokołu. Przestrzeganie ich zgodnie z opisem wydaje się być ważne, aby myszy nauczyły się zadania w odpowiednim czasie. Korzystając z innych osi czasu, autorzy zaobserwowali większą zmienność wśród myszy w ich znajomości zadania, a to oznaczało dodatkowe szkolenie, aby wszystkie myszy spełniły kryterium testowania z eksperymentalnymi zapachami. W przypadku szkoleń i testów, badacz ma elastyczność, w zależności od swoich zainteresowań badawczych, w zakresie liczby prób, stężenia eksperymentalnych zapachów i podobieństwa zapachów do siebie. Jak opisaliśmy, zalecamy stosowanie wielu zestawów zapachów, jeśli to możliwe, w celu zmniejszenia liczby zwierząt wykorzystywanych w eksperymencie. Zapoznaj się z sekcją Analiza statystyczna, aby uzyskać wskazówki dotyczące sposobu uwzględniania użycia wielu zestawów zleceń w analizie końcowej. Zasadniczo podobieństwo pary zapachów można zmieniać, aby dostosować trudność dyskryminacji. We wcześniej opublikowanym badaniu z naszej grupy³ pary zapachowe składają się z dwóch substancji zapachowych z tej samej grupy funkcyjnej, ale różniących się od siebie jedną długością węgla. Dyskryminacje te są trudniejsze niż pary, które różnią się dwiema lub więcej długościami węgla, ale łatwiejsze niż enancjomery (np. (+)-limonen i (-)-limonen). Substancje zapachowe z różnych grup funkcyjnych bardzo różnią się percepcyjnie. Cleland i wsp.¹³ omawiają więcej wariantów bodźców i ich wpływ na określone parametry uczenia się.

Jednym z głównych ograniczeń tego protokołu jest to, że zajmuje on znacznie więcej czasu w porównaniu z automatycznymi zadaniami uczenia asocjacyjnego, w których wiele zwierząt może być testowanych równolegle. W przypadku danego testu jednemu badaczowi zajęłoby to co najmniej 20 minut, aby ukończyć 20 prób dla jednej myszy. Jednak to właśnie ten brak automatyzacji oznacza, że protokół jest bardziej dostępny finansowo, co jest priorytetem dla wielu instytucji. Co ważne, w przypadku tego eksperymentu stwierdzono, że protokół ten jest wysoce wykonalny i skuteczny w szkoleniu badaczy studiów licencjackich zainteresowanych neuronauką behawioralną. W szczególności studenci ci rozwijają silne umiejętności obchodzenia się ze zwierzętami, oprócz zwykłych korzyści płynących z udziału w badaniach.

Naukowcy, którzy są zainteresowani przyjęciem tego paradygmatu, mogą różnić się kilkoma parametrami. Najwidoczniej farmakologiczne manipulacje mechanizmami są różnorodne, a ten protokół behawioralny może być stosowany z technikami chemogenetycznymi lub różnymi innymi sposobami manipulowania szlakami molekularnymi i komórkowymi (np. Optogenetyka). Sam paradygmat można dostosować, aby różnił się rodzajem testowanego uczenia się i pamięci. Na przykład naukowcy mogą dostosować podobieństwo dwóch prezentowanych zapachów, aby kontrolować tempo uczenia się. W naszym badaniu³ pary zapachowe składają się z dwóch substancji zapachowych należących do tej samej grupy funkcyjnej, ale różniących się od siebie jedną długością węgla. Dyskryminacje te są trudniejsze niż pary, które różnią się dwiema lub więcej długościami węgla, ale łatwiejsze niż enancjomery (np. (+)-limonen i (-)-limonen). Substancje zapachowe z różnych grup funkcyjnych bardzo różnią się percepcyjnie. Cleland i wsp.¹³ omawiają więcej wariantów bodźców i ich wpływ na określone parametry uczenia się, konkludując, że bardziej podobne zapachy są trudniejsze do rozróżnienia i dlatego nauka zajmuje więcej czasu¹⁴. Manipulacje te wpłynęłyby również na siłę wspomnień. Idąc tym tropem, naukowcy mogą być zainteresowani testowaniem pamięci w różnych punktach czasowych po nauczeniu się. Na przykład w dwóch badaniach ^15,16 analizowano rolę BDNF w utrzymywaniu się LTM w jednopróbnym zadaniu uczenia awersyjnego. BDNF jest ligandem TrkB. Badania wykazały, że infuzja oligonukleotydów anty-BDNF w hipokampie 12 godzin po nauce blokowała LTM 7 dni później, ale nie 2 dni później. Badanie to pokazuje, że skala czasowa mechanizmów molekularnych po początkowym uczeniu się odgrywa interesującą i jeszcze niepoznaną rolę w LTM. W niniejszym artykule opisano protokół behawioralny, który pozwoliłby na zbadanie tych skal czasowych. Inne parametry, które mogą być interesujące dla przyszłych zastosowań, obejmują używany model myszy. Na przykład, interesujące byłoby zastąpienie samców myszy (które mają znacznie lepiej zbadaną neurobiologię)¹⁷ samicami myszy w przyszłych badaniach w celu zbadania różnic w tempie uczenia się, STM i LTM, ponieważ samice ssaków mają wyższą wrażliwość i selektywność na zapachy niż samce ssaków¹⁸. Oczywiście modele chorób gryzoni mogą być również skutecznie wykorzystywane za pomocą tego protokołu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Podwójna kaniula prowadząca	PlasticsOne	C235GS-5-1.5/SPC	Na zamówienie
(-)-limonen	Sigma-Aldrich	218367-50G
(+)-limonen	Sigma-Aldrich	183164-100ML
2-hetanon	Sigma-Aldrich	537683
2-oktanon	Sigma-Aldrich	O4709
5mg granulat sacharozy	Przetestuj dietę	1811560	rozmiarze niestandardowym. Używany do przyznawania nagród
Kwas butanowy	Sigma-Aldrich	B103500
octan butylu	Sigma-Aldrich	402842
Cement dentystyczny w proszku (koralowy)	Systemy AM	525000
Rozpuszczalnik do cementu dentystycznego	AM Systems	526000
Zespół podwójnego złącza	PlasticsOne	C232C
Podwójny manekin kaniula	PlasticsOne	C235DCS-5/SPC manekin dbl	Na zamówienie
Podwójny wtryskiwacz	PlasticsOne	C235IS-5/SPC	Na zamówienie
	Drill Kopf Instruments	Model 1474 High Speed Stereotaxic Drill	To wiertło wymaga dodatkowego elementu "adaptera", aby pasował do niektórych wierteł. Radzimy sobie z tym problemem, owijając wiertło taśmą laboratoryjną, aby zwiększyć obwód wiertła, aby pasowało. Może to nie być opcja w przypadku operacji wymagających sterylnej techniki.
Maść			Zakup w lokalnej aptece
Oprogramowanie ilustracyjne z rysunku 1	BioRender
heptanal	Sigma-Aldrich	W254002
hexanal	Sigma-Aldrich	115606
hexanol	Sigma-Aldrich	H13303
Pompa infuzyjna model 11	Aparat Harvarda	4169D	Używane pompy dostępne za pośrednictwem American Instrument Exchange
Isoflurane	Santa Cruz Animal Health	sc-363629Rx	Recepta weterynaryjna potrzebna do zamówienia
K252a	Sigma-Aldrich	K2015	Zmieszany do 50uM w DMSO (5%)
Ketoprofen	Allivet	25920	Recepta weterynaryjna potrzebna do zamówienia
Lidokaina	Aspercreme		Zakupiony w Amazon
montażowe	PlasticsOne	00-96 X 3/32
Maska anestezjologiczna na mysz	Kopf Instruments	Model 907 Maska anestezjologiczna na mysz	Używana ze stereotaktyką, aby umożliwić tlen i znieczulenie, gdy mysz jest w stereotax
Adapter do nosa myszy	Kopf Instruments	Model 926 Adapter myszy	Używany ze stereotaktyką, aby umożliwić zabezpieczenie głowy myszy.
Novalsan	Jeffers	41375
Kwas pentanowy	Sigma-Aldrich	240370
pentanol	Sigma-Aldrich	138975
szklane dna szalek Petriego	VWR	10754-804
Poliwęglan Spody	Ancare	N10PCSEC	Użyj normalnych klatek mieszkaniowych i dopasuj szynę pośrodku, aby działała jako tor dla nieprzezroczysta przegroda z pleksi
octan propylu	Sigma-Aldrich	537438
Quikrete Premium Play Sand			Kup w lokalnym sklepie z narzędziami
Igły	Saline	N/A	Sterylna sól fizjologiczna do mieszania leków
Aparat stereotaktyczny	Kopf Instruments	Model 902 Stereotaktyczny instrument
testowy	Ancare	N10PCSEC	Nasze komory testowe są modyfikowane przy użyciu zwykłej klatki do obudowy myszy. Rękopis szczegółowo opisuje, co zostało zrobione.
Klej do tkanek Vetbond	3M		zakupiony w Amazon