Test komonetacyjności do ilościowego określania konkurencyjnych interakcji między izolatami Vibrio fischeri

Lauren Speare; Alecia N. Septer

doi:10.3791/59759

Method Article

Test komonetacyjności do ilościowego określania konkurencyjnych interakcji między izolatami Vibrio fischeri

DOI:

10.3791/59759

⸱

July 22nd, 2019

Lauren Speare¹ , Alecia N. Septer¹

¹Department of Marine Sciences, University of North Carolina, Chapel Hill

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakterie kodują różne mechanizmy do angażowania się w międzybakteryjną rywalizację. W tym miejscu przedstawiamy oparty na kulturze protokół charakteryzujący konkurencyjne interakcje między izolatami bakteryjnymi i ich wpływ na strukturę przestrzenną populacji mieszanej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje oparty na kulturze, komonetyczny test do wykrywania i charakteryzowania konkurencyjnych interakcji między dwiema populacjami bakterii. Metoda ta wykorzystuje stabilne plazmidy, które pozwalają na zróżnicowane znakowanie każdej populacji z odrębnymi zdolnościami w zakresie oporności na antybiotyki i białkami fluorescencyjnymi do selekcji i wizualnej dyskryminacji każdej populacji. W tym miejscu opisujemy przygotowanie i komonetację konkurencyjnych szczepów Vibrio fischeri, obrazowanie mikroskopią fluorescencyjną oraz analizę danych ilościowych. Podejście to jest proste, daje szybkie wyniki i może być wykorzystane do określenia, czy jedna populacja zabija lub hamuje wzrost innej populacji oraz czy konkurencja odbywa się za pośrednictwem dyfuzyjnej cząsteczki, czy też wymaga bezpośredniego kontaktu komórka-komórka. Ponieważ każda populacja bakterii wyraża inne białko fluorescencyjne, test pozwala na przestrzenną dyskryminację konkurujących populacji w obrębie mieszanej kolonii. Chociaż opisane metody są wykonywane na symbiotycznej bakterii V. fischeri w warunkach zoptymalizowanych dla tego gatunku, protokół można dostosować do większości kulturowych izolatów bakteryjnych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt przedstawia metodę opartą na hodowli, która pozwala określić, czy dwa izolaty bakteryjne są zdolne do konkurencyjnych interakcji. Podczas badania populacji mieszanych ważne jest, aby ocenić stopień, w jakim izolaty bakteryjne oddziałują na siebie, w szczególności czy izolaty bezpośrednio konkurują ze sobą poprzez mechanizmy interferencyjne. Konkurencja interferencyjna odnosi się do interakcji, w których jedna populacja bezpośrednio hamuje wzrost lub zabija populację konkurenta¹. Identyfikacja tych interakcji jest ważna, ponieważ mogą one mieć głęboki wpływ na strukturę i funkcję społeczności drobnoustrojów²^,³.

Mechanizmy konkurencji mikrobiologicznej zostały szeroko odkryte w genomach bakterii z różnych środowisk, w tym zarówno bakterii związanych z gospodarzem, jak i wolno żyjących⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹. Opisano różne strategie konkurencji¹⁰^,¹¹, w tym mechanizmy dyfuzyjne, takie jak bakteriobójcze chemikalia^1,¹² i wydzielane peptydy przeciwdrobnoustrojowe¹³, a także mechanizmy zależne od kontaktu, które wymagają kontaktu komórka-komórka, aby przenieść efekt hamujący do komórek docelowych⁹^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸.

Chociaż coinkubacje oparte na kulturach są powszechnie używane w mikrobiologii⁵^,⁸^,¹⁹, ten manuskrypt opisuje, jak wykorzystać test do scharakteryzowania mechanizmu konkurencji, a także sugestie dotyczące dostosowania protokołu do stosowania z innymi gatunkami bakterii. Ponadto metoda ta opisuje wiele podejść do analizy i prezentacji danych, aby odpowiedzieć na różne pytania dotyczące natury interakcji konkurencyjnych. Chociaż opisane tutaj techniki były wcześniej używane do identyfikacji międzybakteryjnego mechanizmu zabijania leżącego u podstaw wewnątrzgatunkowej konkurencji między symbiotycznymi szczepami koizolowanych bakterii Vibrio fischeri¹⁹, są one odpowiednie dla wielu gatunków bakterii, w tym izolatów środowiskowych i ludzkich patogenów, i mogą być wykorzystane do oceny zarówno zależnych od kontaktu, jak i dyfuzyjnych mechanizmów konkurencyjnych. Kroki w protokole mogą wymagać optymalizacji pod kątem innych gatunków bakterii. Biorąc pod uwagę, że coraz więcej systemów modelowych rozszerza swoje badania poza wykorzystanie organizmów izogenicznych, aby objąć różne genotypy¹⁰^,¹⁶^,²⁰^,²¹, metoda ta będzie cennym źródłem informacji dla badaczy chcących zrozumieć, w jaki sposób konkurencja wpływa na systemy wieloszczepowe lub wielogatunkowe.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotuj szczepy do coincubacji

Wybierz odpowiedni szczep referencyjny, który będzie służył jako cel konkurencji bakteryjnej podczas testu koinkubacji. Zobacz Dyskusję, aby zapoznać się z najlepszymi praktykami dotyczącymi wyboru odkształcenia odniesienia i tego, jak odkształcenie referencyjne wpłynie na wyniki. W tym protokole szczep V. fischeri ES114 będzie służył jako szczep referencyjny.
Określenie, które metody selekcji i przesiewowe zostaną użyte do rozróżnienia izolatów w kopolimeracji
1. Zazwyczaj przekształca się szczepy ze stabilnymi plazmidami zawierającymi różne geny oporności na antybiotyki (np. kanamycynę lub chloramfenikol), aby wybrać dla każdego szczepu, a także geny kodujące różne białka fluorescencyjne (np. GFP lub RFP) w celu wizualnego rozróżnienia typów szczepów w kokulturze.
  nuta: Wymagane jest użycie stabilnych plazmidów, ponieważ jeśli szczep straci plazmid w przypadku braku selekcji, to liczby tego szczepu będą niedoszacowane po określeniu ilościowym i nie będą wizualnie wykrywalne za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
2. Oznakowano skomonetyzowane szczepy V. fischeri w taki sposób, że jeden szczep zawiera plazmid pVSV102, który wyraża zielone białko fluorescencyjne (GFP) i oporność na antybiotyk kanamycynę (Kan^R), a drugi szczep zawiera plazmid pVSV208, który wyraża białko czerwonej fluorescencji (dsRed) i odporność na antybiotyk chloramfenikol (Cm^R)²².
  nuta: Inne selekcje różnicowe mogą być użyte do rozróżnienia szczepów monetarnych. Zobacz Dyskusja, aby zapoznać się z dodatkowymi metodami.
3. Uwzględnij następującą kontrolę podczas początkowej optymalizacji testu coincubation, aby upewnić się, że wybór jest solidny. Umieść każdy szczep, który jest różnie oznaczony na płytkach agarowych zawierających antybiotyk, który powinien być selektywny przeciwko niemu (tj. szczep płytki 1 na pożywce, która wybiera szczep 2 i odwrotnie).
Dwa dni przed testem koinkubacji, szczep referencyjny smugowy pVSV102, szczep referencyjny pVSV208 i każdy konkurencyjny szczep pVSV208 o temperaturze -80 °C umieszcza się na płytkach agarowych LBS zawierających odpowiedni antybiotyk (np. 100 μg/ml kanamycyny lub 2 μg/ml chloramfenikolu) i inkubować przez noc w temperaturze 24 °C. Selekcja antybiotyków jest wymagana, aby upewnić się, że wszystkie komórki zawierają plazmid na początku eksperymentu.
Na jeden dzień przed badaniem należy pobrać i ponownie umieścić cztery pojedyncze kolonie każdego typu szczepu (kontrpróby biologiczne) na świeżych płytkach agarowych LBS z odpowiednim antybiotykiem i inkubować przez noc w temperaturze 24 °C.
nuta: Ten krok może wymagać optymalizacji dla innych gatunków bakterii, ponieważ dłuższe lub krótsze czasy inkubacji mogą być wymagane do uzyskania wystarczającej liczby komórek w zależności od tempa wzrostu organizmu będącego przedmiotem zainteresowania.

2. Szczepy bakteryjne Coincubate

Przygotowanie każdego szczepu bakteryjnego do inkubacji (Rysunek 1A)
1. Za pomocą sterylnej wykałaczki zeskrob komórki z płytki agarowej (wielkości ziarna ryżu) i ponownie zawieś komórki w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml bulionu LBS. Rozbij grudki komórek, wciskając je w bok rurki i energicznie pipetując w górę iw dół.
2. Zakryj rurkę i wiruj przez 1-2 s. Jeśli grudki komórek są nadal widoczne, kontynuuj wirowanie lub pipetowanie w górę i w dół, aż próbka będzie wizualnie jednolita.
3. Powtórzyć kroki 2.1.1-2.1.2 dla wszystkich próbek.
Zmierzyć i zapisać gęstość optyczną przy długości fali 600 nm (OD₆₀₀) dla wszystkich próbek. Próbki prawdopodobnie będą musiały zostać rozcieńczone do dziesięciu razy przy użyciu bulionu LBS, aby uzyskać dokładny pomiar OD. Znormalizuj każdą próbkę do żądanego OD₆₀₀. Szczepy są zwykle normalizowane do OD₆₀₀ ~ 1,0, co przekłada się na ~10⁶ bakterii / ml dla V. fischeri.
nuta: Ten etap może wymagać optymalizacji dla różnych gatunków bakterii, ponieważ gęstość komórek inokulum wpływa na wyniki komonety w zależności od mechanizmu konkurencji. Zobacz dyskusję na temat optymalizacji.
Równoczesne szczepy (Rysunek 1B, C)
1. Wymieszaj szczep referencyjny i szczep konkurencyjny w stosunku 1:1 (v/v), dodając 100 μl każdego szczepu (znormalizowanego do OD 1,0) do znakowanej 1,5 ml probówki wirówkowej. Jako kontrolę, zmieszaj odkształcenie odniesienia z różnie oznaczoną wersją samego siebie (szczep referencyjny pVSV102 + szczep referencyjny pVSV208). Ta kontrola jest wymagana do późniejszej analizy statystycznej w celu określenia, czy obecność szczepu konkurencyjnego wpływa na wzrost szczepu referencyjnego. Wirować kulturę mieszanego szczepu przez 1-2 s.
  nuta: Ten krok może wymagać optymalizacji, ponieważ współczynnik początkowy może znacząco wpłynąć na wyniki i może wymagać dostosowania. Zobacz dyskusję na temat optymalizacji.
2. Powtórzyć krok 2.3.1 dla każdej kontrpróby biologicznej. Po wykonaniu tego etapu powinno być w sumie osiem probówek ze szczepami mieszanymi: cztery kontrpróby biologiczne z różnie znakowanymi szczepami referencyjnymi (kontrola) i cztery kontrpróby biologiczne z różnie znakowanymi szczepami referencyjnymi i konkurencyjnymi (eksperymentalne).
3. Umieścić 10 μl każdej mieszaniny kontrolnej i doświadczalnej na płytkach Petriego zawierających agar LBS; te plamki hodowlane zostaną użyte do mikroskopii fluorescencyjnej po inkubacji.
4. Pozostawić plamki do całkowitego wyschnięcia na stole do momentu, aż cały płyn zostanie wchłonięty przez agar i inkubować płytki Petriego w temperaturze 24 °C przez 24 godziny. Szczepy V. fischeri oznaczone pVSV102 i pVSV208 potrzebują co najmniej 15 godzin, aby osiągnąć wystarczająco wysoką gęstość komórek, aby uwidocznić odpowiednio GFP i RFP na poziomie populacji za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego. W tym przypadku stosujemy 24-godzinną inkubację do obrazowania mieszanych plam.
  nuta: Ważne jest, aby używać talerzy, które nie są zbyt wilgotne ani zbyt suche. Jeśli płytki są zbyt wilgotne, plamy coincubation nie zostaną wchłonięte przez płytkę agarową; Unikaj używania talerzy wylanych tego samego dnia. Jeśli płytki są zbyt suche, na powierzchni agaru mogą tworzyć się małe fale lub pęknięcia, powodując nieregularny kształt plam kubaturowych.
5. Używając tych samych zawiesin bakteryjnych, co w kroku 2.3.3, umieścić 10 μl każdej mieszaniny kontrolnej i doświadczalnej na 24-dołkowych płytkach zawierających 1 ml agaru LBS na basenik. Podobnie jak w kroku 2.3.3, upewnij się, że agar w 24-dołkowych płytkach ma odpowiednią wilgotność. Pozostawić plamki do całkowitego wyschnięcia i inkubować w temperaturze 24 °C przez 5 godzin. Te miejsca hodowlane zostaną wykorzystane do ilościowego określenia jednostek tworzących kolonie (CFU) dla każdego szczepu na koniec eksperymentu.
  nuta: Wykrywanie zawiesin bakteryjnych do wzrostu w poszczególnych studzienkach pozwala na łatwiejsze ponowne zawieszenie w końcowym punkcie czasowym. Ten krok można wykonać przy użyciu kwadratowych sterylnych kawałków filtra, co jest bardziej ekonomicznym podejściem do stosowania płytek 24-dołkowych. Kwadratowe sterylne kawałki filtra można umieścić na płytce agarowej i 10 μl każdej mieszaniny doświadczalnej można nanieść na te filtry, a nie na płytki 24-dołkowe. Po upływie czasu coincubation filtry można przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml, a miejsce coincubation można ponownie zawiesić przez wirowanie lub pipetowanie w górę iw dół. 5-godzinny czas inkubacji jest wystarczający do wykrycia zabijania międzybakteryjnego między izolatami V. fischeri¹⁹, jednak ten czas inkubacji może wymagać skrócenia lub wydłużenia w przypadku innych gatunków lub mechanizmów konkurencyjnych. Zobacz dyskusję, aby uzyskać więcej informacji.
Seryjne rozcieńczanie do inokulum początkowego
1. Aby przeprowadzić seryjne rozcieńczanie początkowych mieszanin do coinkubacji, należy obrócić 96-dołkową płytkę pod kątem 90° tak, aby było osiem kolumn i dwanaście rzędów. Każdy wiersz będzie zawierał próbkę nierozcieńczonej mieszaniny w pierwszej kolumnie, po której nastąpi siedem dziesięciokrotnych seryjnych rozcieńczeń w pozostałych studzienkach w rzędzie (Rysunek 2A).
2. Oznacz każdy wiersz identyfikatorem szczepu, numerem kontrpróby i czasem (inokulum początkowe = T0). Oznaczyć płytki agarowe LBS uzupełnionymi odpowiednim antybiotykiem, na którym można zauważyć serię rozcieńczeń. Pamiętaj, aby określić, dla jakiego szczepu wybiera każda tabliczka z antybiotykiem.
3. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 180 μl bulionu LBS do każdej studzienki, pozostawiając pierwszą kolumnę pustą dla nierozcieńczonej mieszaniny do kubacji.
  nuta: Naukowcy mogą zdecydować się na użycie soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do ponownego zawieszenia miejsc coincubation i przeprowadzenia seryjnego rozcieńczania, jeśli pracują ze szczególnie szybko rosnącymi gatunkami bakterii lub konsekwentnie przeprowadzają duże eksperymenty, w których seryjne rozcieńczenia mogą zająć dużo czasu. Stosowanie PBS w takich przypadkach zapobiegnie znacznemu rozrostowi bakterii podczas procesu wykonywania seryjnych rozcieńczeń. Jednak ważne jest, aby być konsekwentnym w kwestii tego, który roztwór jest używany (np. PBS lub LBS) we wszystkich eksperymentach, niezależnie od ich wielkości lub czasu trwania.
4. Za pomocą pipety jednokanałowej o pojemności 200 μl przenieść 100 μl mieszaniny do współinkubacji z probówki do studzienki pierwszej kolumny. Wyrzuć końcówkę i powtórz tę czynność dla wszystkich mieszanin coincubation.
5. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 20 μl z kolumny 1 do kolumny 2 i wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Odrzuć końcówki i powtórz dla każdej kolumny, tak aby pod koniec każdy rząd zawierał dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenie początkowej mieszaniny coincubation.
  nuta: Należy konsekwentnie określać, ile razy rozcieńczenia są pipetowane w górę i w dół. Na przykład, należy wcisnąć uchwyt pipety pięć razy, aby każde rozcieńczenie było spójne w całej serii rozcieńczeń.
6. Za pomocą pipety wielokanałowej wyposażonej w osiem końcówek, odessać 5 μl z każdej studzienki w serii rozcieńczeń (tj. jeden rząd ośmiu studzienek) i umieścić ją na płytce agarowej LBS, która wybiera szczep referencyjny (uzupełniony kanamycyną). Powtórz ten krok, nakrapiając się na płytce, wybierając dla konkurencyjnego szczepu (uzupełnionego chloramfenikolem) (Rysunek 2B). Poczekaj, aż plamy całkowicie wyschną przed umieszczeniem w inkubatorze.
  nuta: Te same końcówki mogą być użyte do wykrycia serii rozcieńczeń kontrpróby na płytkach wybranych dla szczepu referencyjnego i konkurencyjnego, ale muszą być zmieniane między powtórzeniami. Należy unikać dotykania końca końcówki pipety do płytek agarowych LBS, ponieważ może to spowodować powstanie wgłębienia, które może przypominać kolonię bakterii i zniekształcić wyniki podczas liczenia płytek. Jeśli końcówka dotyka płytki, zanotuj i nie uwzględniaj zagłębienia w liczbie kolonii.
Wykonywanie pomiarów końcowych T
1. Po inkubacji miejsc do coincubacji na płytkach 24-dołkowych przez 5 godzin w temperaturze 24 °C, dodać 1 ml bulionu LBS do każdej studzienki i ponownie zawiesić miejsca inkubacji przez pipetowanie w górę i w dół, aż wszystkie komórki zostaną ponownie zawieszone. Należy zachować spójny wigor, z jakim komórki są ponownie zawieszane we wszystkich powtórzeniach. Na przykład należy wcisnąć uchwyt pipety osiem razy, aby całkowicie zawiesić każdą próbkę.
2. Po ponownym zawieszeniu każdego miejsca inkubacji należy przygotować 96-dołkową płytkę do seryjnego rozcieńczania oraz płytki agarowe LBS z odpowiednimi antybiotykami, na których można wykryć rozcieńczenie w taki sam sposób, jak w kroku 2.4.1.
3. Wykonać czynności 2.4.2-2.4.6, aby zakończyć seryjne rozcieńczanie dla końcowych pomiarów T.
  nuta: Ważna kontrola powinna być uwzględniona podczas początkowej optymalizacji testu coincubation. Pod koniec okresu komonety, umieść mieszane szczepy na pożywce zawierającej oba antybiotyki. Żadna ze szczepów nie powinna być w stanie rosnąć, chyba że 1) dojdzie do spontanicznej mutacji lub 2) między szczepami nastąpi wymiana selektywnych markerów.

3. Wizualizacja coincubation za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Zobrazować każde miejsce monetykubacji na agarowych płytkach Petriego LBS z kroków 2.3.3 i 2.3.4 za pomocą mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w detekcję zielonej i czerwonej fluorescencji, które odpowiadają białkom fluorescencyjnym ulegającym ekspresji na stabilnych plazmidach.
Rozpocznij od wykonania zdjęć kontrolnego punktu koinkubacji (szczep odniesienia pVSV102 + szczep referencyjny pVSV208).
1. Dostosuj powiększenie, aby plamka była ostra.
2. Używając odpowiedniego światła wzbudzającego i filtra do obserwacji GFP, dostosuj czas ekspozycji tak, aby wykrywalna była tylko fluorescencja z plamki monety, a wszelka fluorescencja tła z pożywki była niska lub niewidoczna.
3. Zmień światło wzbudzenia i filtr, aby obserwować RFP, dostosowując czas naświetlania, aby zminimalizować tło od medium.
Dla każdego miejsca komonetyfikacji z eksperymentalnych zabiegów należy wykonać obraz szczepu referencyjnego przy użyciu filtra GFP i czasu ekspozycji określonego w kroku 3.2.2.
Zobrazuj konkurencyjny szczep za pomocą filtra RFP, dostosowując czas naświetlania tak, aby fluorescencja była obserwowana tylko z punktu coincubation, a fluorescencja tła z medium była minimalna. Zapisz oba obrazy i nazwij je tak, aby zawierały oba identyfikatory szczepów, liczbę powtórzeń, czas inkubacji, w którym wykonano zdjęcie (np. 24 godziny). Powtórz te czynności dla wszystkich replikacji.
nuta: Może być konieczne dostosowanie czasu komonetyfikacji do różnych plazmidów lub gatunków bakterii. Zobacz dyskusję na temat optymalizacji.

4. Analiza danych

Obliczanie jtkowników dla każdej kontroli i leczenia doświadczalnego w każdym punkcie czasowym (początek T i punkt końcowy T)
1. Gdy kolonie są widoczne na seryjnych płytkach rozcieńczających (np. 24 h w temperaturze 24 °C dla V. fischeri), zidentyfikuj współczynnik rozcieńczenia, w którym można policzyć poszczególne kolonie, które nie rosły razem w duże, wielokolonijne skupiska (Rysunek 2B). Dla każdej kontrpróby należy policzyć i zapisać liczbę poszczególnych kolonii w danym rozcieńczeniu. Ta liczba reprezentuje jednostki CFU dla tej replikacji.
2. Przelicz jtkowniki jtk dla rozcieńczenia na całkowite jtk dla każdego szczepu w komonetku, korzystając z poniższego wzoru:
  [ CFU ÷ (współczynnik rozcieńczenia x objętość miejsca rozcieńczenia)] x objętość nierozcieńczonej próbki = całkowita liczba jtk
  Przykład: T0: [(6 jtk) ÷ (10^-6 x 0,005 ml)] x [0,01 mL] = 1,2E7 całkowite CFU szczepu 1 w mieszanym miejscu na początku eksperymentu
  T5: [(4 CFUs) ÷ (10^-3 x 0,005 mL)] x [1,0 mL] = 8,0E5 całkowite CFU szczepu 1 w miejscu mieszanym po 5 godzinach kokubacji
  Wartości CFU dla każdego szczepu w każdym punkcie czasowym są danymi surowymi, które można wykorzystać do kilku różnych analiz i testów statystycznych (patrz sekcja 4.2 poniżej).
Wykonaj następujące transformacje danych, aby określić, czy szczep konkurenta konkuruje ze szczepem referencyjnym, poprzez: (i) określenie, czy proporcja odkształcenia odniesienia zmniejsza się w obecności szczepu konkurenta, lub (ii) obliczenie logarytmu względnego wskaźnika konkurencyjności (RCI). Analizy te przekształcają surowe dane w wskaźniki i mogą być przydatne do określenia konkurencyjnego wyniku interakcji, ale nie mogą określić mechanizmu konkurencji (tj. zabijania kontra hamowania wzrostu).
1. Obliczanie proporcji każdego szczepu dla każdego punktu czasowego podczas kokubacji
  1. Przelicz dane CFU na proporcję każdego szczepu w leczeniu. Dla odkształcenia odniesienia (RS) w T0 podzielić łączne jtk dla odkształcenia odniesienia w T0 przez sumę całkowitych jtk dla odkształcenia odniesienia i konkurenta (CS) w T0:
    RS_T0 CFU ÷ (RS_T0 CFUs + CS_T0 CFUs) = Proporcja odkształcenia odniesienia przy T0,
    Wykonaj to samo obliczenie, aby określić proporcję szczepu konkurenta przy T0:
    CS_T0 CFU ÷ (RS_T0 CFU + CS_T0 CFUs) = Proporcja szczepu konkurencji przy T0
    Powtórzyć ten proces dla każdego punktu czasowego i powtórzyć zarówno dla traktowania eksperymentalnego, jak i dla traktowania kontrolnego (różnicowo znakowana kokubacja szczepu referencyjnego).
  2. Wykres przedstawiający średnią proporcję każdego typu szczepu w T0 i T5 na skumulowanym wykresie słupkowym (Rysunek 3A).
  3. Upewnij się, że uzyskano pożądany stosunek początkowy odkształceń. W przypadku komonet, w których szczepy były początkowo mieszane 1:1, każdy typ szczepu powinien obejmować ~0,5 populacji w T0 i nie powinien różnić się statystycznie od siebie za pomocą testu t-Studenta (P > 0,05). Jeśli proporcja jednego szczepu jest znacznie większa niż drugiego szczepu w T0, należy powtarzać eksperyment, aż do osiągnięcia stosunku początkowego 1:1.
  4. Określ, czy szczep konkurencyjny obejmuje znacznie większą część populacji po 5 godzinach. Wykonaj test t-Studenta, porównując proporcje każdego szczepu w eksperymentalnym leczeniu w T0 i T5. Jeśli proporcja szczepu konkurencyjnego różni się znacząco od proporcji szczepu referencyjnego w T5 (P < 0,05), wynik ten sugeruje, że mogła wystąpić konkurencja szczepów. Przejdź do kroku 4.2.1.5.
  5. Aby określić, czy obecność szczepu konkurencyjnego zmniejszyła proporcję szczepu referencyjnego po 5 godzinach, należy wykonać test t Studenta, porównując proporcję szczepu referencyjnego w grupie kontrolnej z proporcją szczepu referencyjnego w badaniu eksperymentalnym (szczep referencyjny v szczep konkurencyjny).
    UWAGA: Jeśli proporcja szczepu referencyjnego jest statystycznie niższa w badaniu eksperymentalnym w stosunku do kontroli (P < 0,05), to szczep konkurencyjny znacznie zmniejszył udział szczepu referencyjnego po 5 godzinach i wyprzedził szczep referencyjny.
2. Obliczanie wartości logarytmu RCI dla każdego zabiegu (w tym kontroli)
  nuta: Względny indeks konkurencji (RCI) to pojedyncza wartość, która porównuje, w jaki sposób stosunek końcowy typów odkształceń różni się od stosunku początkowego. Wartość RCI jest przekształcana logarytmicznie w taki sposób, że wartość logarytmu RCI większa od zera wskazuje, że odkształcenie konkurenta (CS) pokonało odkształcenie odniesienia (RS), wartość logarytmu RCI mniejsza od zera wskazuje, że szczep referencyjny pokonał szczep konkurenta, a wartość logarytmu RCI równa zero wskazuje, że żaden szczep nie został pokonany.
  1. Obliczyć wartości logarytmu RCI dla każdej kontroli i leczenia eksperymentalnego, stosując następujące równanie:
    Log [(CS_T5 CFU ÷ RS_T5 CFUs) ÷ (CS_T0 CFU ÷ RS_T0 CFUs)] = log RCI
  2. Wykres wartości RCI dziennika za pomocą oddzielonego wykresu pudełkowo-wąsowego, na którym dane są przedstawiane w kierunku poziomym (Rysunek 3B).
  3. Określ, czy każda terapia różniła się znacząco od zera, wykonując test t studenta, porównując wartości logarytmu RCI każdego leczenia (w tym kontroli) z zestawem danych porównującym tę samą liczbę powtórzeń, wszystkie o wartości zerowej. Jeśli wartości logarytmu RCI dla eksperymentalnego leczenia są statystycznie większe od zera (P < 0,05), oznacza to, że konkurencyjny szczep pokonał szczep referencyjny.
    nuta: Kontrola nie powinna być statystycznie różna od zera (P > 0,05), ponieważ różnie znakowane szczepy referencyjne są izogeniczne.
  4. Wykonaj test t-Studenta, aby określić, czy wartości logarytmu RCI dla leczenia eksperymentalnego były znacznie większe niż w grupie kontrolnej (P < 0,05). Jeśli wartości logarytmu RCI z eksperymentalnego traktowania są statystycznie większe niż z badania kontrolnego, oznacza to, że konkurencyjny szczep pokonał szczep referencyjny.
Wykonaj następującą analizę statystyczną, aby określić mechanizm, dzięki któremu szczep konkurencyjny konkuruje ze szczepem referencyjnym: (i) przeanalizuj surowe całkowite dane CFU lub (ii) zbadaj procentowy odzysk szczepu referencyjnego. Analizy te mogą być bardziej kłopotliwe do przeglądania w porównaniu z tymi z kroku 4.2, ale określą, czy szczep konkurencyjny konkuruje ze szczepem referencyjnym, wyrastając z niego, hamując wzrost szczepu referencyjnego, czy też aktywnie eliminując szczep referencyjny.
1. Analizowanie surowych całkowitych danych CFU
  1. Wykres surowych całkowitych danych CFU dla obu szczepów za pomocą wykresu punktowego z przeplotem, gdzie powtórzenia są pokazane jako indywidualne punkty danych (Rysunek 4A). Wyświetl dane na skali logarytmicznej i dodaj poziomą linię wskazującą średnie T0 CFU dla obu szczepów.
  2. Aby określić, czy obecność konkurencyjnego szczepu negatywnie wpłynęła na szczep referencyjny, należy wykonać test t Studenta, porównując CFU szczepu referencyjnego dla leczenia kontrolnego i eksperymentalnego w T5. Jeżeli CFU szczepu referencyjnego w badaniu eksperymentalnym są statystycznie niższe niż w grupie kontrolnej (P < 0,05), wówczas obecność szczepu konkurencyjnego istotnie wpłynęła na szczep referencyjny.
  3. Aby ustalić, czy obecność szczepu konkurencyjnego zahamowała wzrost lub wyeliminowała szczep referencyjny, należy wykonać test t Studenta, porównując szczepy referencyjne CFU w T0 i T5 dla leczenia kontrolnego i eksperymentalnego.
    nuta: W przypadku braku konkurenta, szczep referencyjny powinien wykazywać znaczny wzrost CFU przy porównaniu T0 i T5 dla leczenia kontrolnego. Analizując leczenie eksperymentalne, jeśli szczep referencyjny CFU w T5 nie różni się statystycznie w porównaniu z T0 (P > 0,05), to szczep konkurencyjny hamował wzrost szczepu referencyjnego. Jeśli szczep referencyjny T5 CFU jest znacznie niższy niż T0 CFU (P < 0,05), oznacza to, że szczep konkurencyjny zabił szczep odniesienia.
2. Obliczanie procentowego odzysku odkształcenia odniesienia
  1. Przekształć całkowite dane CFU dla odkształcenia odniesienia (RS) w dane procentowe odzysku, korzystając z poniższego równania:
  2. (RS_T5 CFU ÷ RS_T0 CFUs) x 100 = % odzysku odkształcenia odniesienia
  3. Wyświetl procentowy odzysk odkształcenia referencyjnego za pomocą oddzielnego wykresu słupkowego, gdzie każdy słupek reprezentuje leczenie kontrolne lub eksperymentalne (Rysunek 4B). Dodaj linię przerywaną w punkcie y = 100, aby wskazać 100% odtworzenia odkształcenia referencyjnego (bez wzrostu lub spadku odkształcenia referencyjnego CFU od 0 h do 5 h).
  4. Aby określić, czy szczep konkurencyjny negatywnie wpłynął na szczep referencyjny, należy wykonać test t Studenta porównujący procentowy odzysk szczepu referencyjnego dla leczenia kontrolnego z leczeniem eksperymentalnym. Jeśli procentowy odzysk jest znacznie mniejszy niż w grupie kontrolnej (P < 0,05), oznacza to, że szczep konkurencyjny negatywnie wpłynął na szczep odniesienia.
  5. Aby określić, czy szczep konkurencyjny hamował wzrost szczepu referencyjnego, czy go eliminował, należy wykonać test t Studenta porównujący procentowy odzysk szczepu referencyjnego dla leczenia eksperymentalnego i zestaw danych z taką samą liczbą powtórzeń, wszystkie o wartości 100,
    nuta: Jeśli eksperymentalne leczenie nie różni się statystycznie od 100 (P > 0,05), oznacza to, że konkurencyjny szczep hamował wzrost szczepu referencyjnego. Jeśli procentowy odzysk szczepu referencyjnego w eksperymentalnym leczeniu jest znacznie niższy niż 100 (P < 0,05), oznacza to, że szczep konkurencyjny zabił szczep referencyjny.
3. Interpretacja obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej
  1. Po wykonaniu obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej określ, czy każdy szczep jest widocznie wykrywalny w miejscu monety. W przypadku koinkubacji kontrolnej (odkształcenie referencyjne pVSV102 + odkształcenie referencyjne pVSV208) zarówno GFP, jak i RFP powinny być widoczne z jednego miejsca monetykubacji. Jeśli tak nie jest, należy ponownie przeprowadzić eksperyment, upewniając się, że szczepy są odpowiednio oznakowane i połączone na płytkach wolnych od antybiotyków.
  2. Dla każdego eksperymentalnego miejsca do coinkubacji sprawdź możliwe wyniki.
    nuta: Jeśli szczep konkurenta jest widoczny, ale szczep referencyjny nie jest wykrywany, sugeruje to, że szczep konkurencyjny zabił lub zahamował wzrost szczepu referencyjnego. Jeśli oba szczepy są obecne i równomiernie wymieszane (GFP i RFP obecne w całym miejscu komonety), dane te sugerują, że konkurencyjny szczep nie konkuruje ze szczepem referencyjnym i oba szczepy współistnieją. Jeśli oba szczepy są obecne, ale są przestrzennie oddzielone (mikrokolonie GFP lub RFP są obecne w całym miejscu inkubacji), sugeruje to, że szczep referencyjny i szczep konkurencyjny mogą angażować się w interakcje konkurencyjne i mogą być wymagane modyfikacje szczepu referencyjnego lub początkowego współczynnika monety. Zobacz dyskusję, aby uzyskać więcej informacji.

5. Określanie, czy interakcja jest zależna od kontaktu

UWAGA: Jeśli stwierdzisz, że jeden szczep zabija lub hamuje szczep referencyjny, interakcja może być dyfuzyjna lub zależna od kontaktu. Aby określić, czy interakcja jest zależna od kontaktu komórka-komórka, wykonaj test komonetacy, jak opisano powyżej dla kroków 1-2 z następującymi modyfikacjami.

Wykonaj kroki 1.1-2.2.
Po znormalizowaniu szczepów należy je fizycznie oddzielić za pomocą filtra nitrocelulozowego o wielkości porów 0,22 μm. Taka wielkość porów pozwala na dyfuzję środków przeciwdrobnoustrojowych i małych cząsteczek, ale zapobiega fizycznemu kontaktowi między komórkami V. fischeri.
nuta: Jeśli interakcja jest zależna od kontaktu komórka-komórka, oddzielenie szczepu referencyjnego od szczepu konkurencyjnego za pomocą filtra powinno znieść fenotyp zabijający lub hamujący, a szczep referencyjny nie powinien mieć obniżonych CFU. Jeśli interakcja nie jest zależna od kontaktu komórka-komórka i jest mechanizmem dyfuzyjnym, oddzielenie szczepów nie powinno uniemożliwić konkurencyjnemu szczepowi zabicia szczepu referencyjnego.
1. Umieść 5 μl szczepu referencyjnego na środku filtra i umieść 5 μl konkurencyjnego szczepu na środku innego filtra. Umieść filtr zawierający szczep referencyjny na powierzchni płytki agarowej LBS. Umieść filtr zawierający szczep konkurencji bezpośrednio na filtrze ze szczepem referencyjnym.
  nuta: Każdy szczep jest wykrywany na filtrach, a nie na dolnym odkształceniu bezpośrednio na płytce agarowej, dzięki czemu szczepy można łatwiej umieszczać bezpośrednio jeden na drugim.
2. Jeśli istnieje obawa, że szczepy nie są ułożone bezpośrednio jeden na drugim, należy zmniejszyć objętość inokulum szczepu referencyjnego zauważonego na filtrze. Zapewni to, że obszar referencyjnego punktu odkształcenia będzie mniejszy i całkowicie powyżej lub poniżej szczepu konkurenta. Zmieniaj naprzemiennie, który szczep znajduje się na górze i na dole, aby uwzględnić różnice w dyfuzji składników odżywczych z podłoża agarowego.
3. Aby upewnić się, że filtr pozwala na dyfuzję małych cząsteczek, należy zastosować zabieg kontrolny, w którym szczep referencyjny jest nanoszony na filtr, a antybiotyk, na który jest wrażliwy (chloramfenikol), jest nanoszony na drugi. Ułóż filtry bezpośrednio jeden na drugim i umieść na płycie agarowej LBS. Antybiotyk powinien być w stanie dyfundować przez filtr i powinien zabijać szczep referencyjny.
Inkubować płytki z filtrami w temperaturze 24 °C przez 5 godzin. Nie odwracaj płytki agarowej podczas inkubacji, aby uniknąć przesuwania filtrów.
Wykonać seryjne rozcieńczenia inokulum wyjściowego zgodnie z krokiem 2.4.
Wykonywanie pomiarów końcowych T
1. Za pomocą sterylnej pęsety przenieś każdy zestaw filtrów do 50 ml probówki Falcon zawierającej 5 ml bulionu LBS. Upewnij się, że filtry są fizycznie oddzielone w probówce, aby umożliwić pełne ponowne zawieszenie każdego typu szczepu.
2. Ponownie zawiesić odkształcenia z filtrów, pipetując w górę i w dół, aż filtry oczyszczą się ze wszystkich komórek. Użyj pęsety, aby obrócić filtry i usunąć materiał komórkowy z obu stron. Sterylizuj pęsetę etanolem między próbkami.
3. Przeprowadzić rozcieńczanie szeregowe dla T final zgodnie z krokiem 2.5. Obliczając całkowitą liczbę jtk dla T final, należy skorygować "całkowitą objętość nierozcieńczonej próbki" z 1 ml do 5 ml.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W celu oceny konkurencyjnych interakcji między populacjami bakterii, opracowano i zoptymalizowano protokół testu coincubation dla V. fischeri. Metoda ta wykorzystuje stabilne plazmidy, które kodują geny oporności na antybiotyki i białka fluorescencyjne, co pozwala na selekcję różnicową i wizualną dyskryminację każdego szczepu. Analizując dane zebrane z testu coincubation, można zidentyfikować konkurencyjny wynik interakcji i mechanizm interakcji. Na przykład przeprowadzono następ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany powyżej test komonetyzacyjnej stanowi potężną metodę wykrywania konkurencji międzybakteryjnej. Podejście to pozwoliło na identyfikację konkurencji wewnątrzgatunkowej wśród izolatów V. fischeri i scharakteryzowanie mechanizmu konkurencji¹⁹. Chociaż opisana metoda została zoptymalizowana pod kątem bakterii morskiej V. fischeri, można ją łatwo zmodyfikować, aby uwzględnić inne gatunki bakterii, w tym izolaty kliniczne i środowiskowe. Ważne jest, aby zauważyć, że mechanizmy k...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować recenzentom za ich pomocne opinie. A.N.S. było wspierane przez Fundację Gordona i Betty Moore poprzez Grant GBMF 255.03 dla Fundacji Badań Nauk Przyrodniczych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Probówki do mikrowirówek 1,5 ml	Fisher	05-408-129
10 μ Pipeta
100 μ Pipeta
300 μ Pipeta
10 μ L pipeta
20 μ L pipeta
200 μ Pipeta
1 000 μ L pipeta
24-dołkowa płytki	Fisher	07-200-84	sterylna z pokrywką
Płytki 96-dołkowe	VWR	10062-900	sterylne z pokrywką
Kalkulator
Chloramfenikol	Sigma	C0378	zapas (20 mg/ml w etanolu); końcowe stężenie w pożywkach (2 μ g / mL LBS)
Fluorescencyjny mikroskop preparacyjny z kamerą i oprogramowaniem
Kleszcze	Fisher	08-880
Siarczan Kanamycyny	Fisher	BP906-5	zapas (100 mg/ml w wodzie, sterylizacja filtra); końcowe stężenie w pożywkach (1 μ g/mL LBS)
Membrana nitrocelulozowa (FS MCE, 25MM, NS)	Fisher	SA1J788H5	0,22 μ m membrana nitrocelulozowa (PK 100)
Płytki Petriego	Fisher	FB0875713	sterylne z pokrywką
Spektrofotometr
Kuwety półmikro	VWR	97000-586
TipOne 0,1-10 μ L system startowy	USA Scientific	1111-3500	10 stojaków
TipOne 200 μ L system startowy	USA Scientific	1111-500	10 stojaków
TipOne 1000 μ L system startowy	USA Scientific	1111-2520	10 stojaków
Vortex
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
LBS media
1 M Tris Buffer (pH ~7,5)			50 ml 1 M bufor podstawowy (62 ml HCl, 938 ml wody DI, 121 g bazy Trizma)
Agar Technical	Fisher	DF0812-17-9	15 g (Dodaj tylko do talerzy)
Woda			950 ml
Chlorek sodu	Fisher	S640-3	20 g
Trypton	Fisher	BP97265	10 g
Ekstrakt drożdżowy	Fisher	BP9727-2	5 g

wielokanałowa Lwielokanałowa Lwielokanałowa Ljednokanałowajednokanałowajednokanałowa Ljednokanałowado obrazowania DI

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).
Dörr, N. C. D., Blockesh, M. Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).
Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).
Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2. PloS One. 8 (4), e61086(2013).
Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).
Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068(2010).
Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export. MBio. 4 (4), (2013).
García-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins. Elife. 6, 24869(2017).
Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).
Cornforth, D. M., Foster, K. R. Antibiotics and the art of bacterial war. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).
Shank, E. A., Kolter, R. New developments in microbial interspecies signaling. Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).
Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo. MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).
Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage. Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).
Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards? Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).
Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins. Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).
Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon. Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).
Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).
Speare, L., et al. Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).
Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae. Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).
Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).
Sana, T. G., et al. The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).
Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae. PLoS. 9 (8), e0004031(2015).
Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains. PloS One. 4 (8), e6734(2009).
Ishikawa, T., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).
Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).
Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).
Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer. Science. 347 (6217), 63-67 (2015).
Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).
Huang, Y., et al. Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis. Frontiers in microbiology. 8, 528(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Test komonetacyjności do ilościowego określania konkurencyjnych interakcji między izolatami Vibrio fischeri

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles