Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie pierwiastka aluminiowego zawierającego minigeny do analizy kolistych RNA

7.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59760

⸱

10 marca 2020

 ,  ,  , 
1Institute for Molecular and Cellular Biochemistry, University of Kentucky

W tym artykule

Podsumowanie

Klonujemy i analizujemy geny reporterowe generujące koliste RNA. Te geny reporterowe są większe niż konstrukty do analizy splicingu liniowego i zawierają elementy Alu. Aby zbadać koliste RNA, konstrukty są transfekowane do komórek, a otrzymany RNA jest analizowany za pomocą RT-PCR po usunięciu liniowego RNA.

Streszczenie

Oprócz liniowych mRNA, wiele genów eukariotycznych generuje koliste RNA. Większość kolistych RNA jest generowana przez połączenie miejsca splicingu 5' z miejscem splicingu 3' w górę w obrębie pre-mRNA, w procesie zwanym splicingiem wstecznym. Ta cyrkularyzacja jest prawdopodobnie wspomagana przez drugorzędowe struktury w pre-mRNA, które zbliżają miejsca splicingu do siebie. Uważa się, że w ludzkich genach pierwiastki Alu promują te drugorzędowe struktury RNA, ponieważ pierwiastki Alu są obfite i wykazują komplementarność zasad ze sobą, gdy są obecne w przeciwnych kierunkach w pre-mRNA. W tym miejscu opisujemy generowanie i analizę dużego pierwiastka Alu zawierającego geny reporterowe, które tworzą koliste RNA. Dzięki optymalizacji protokołów klonowania można wygenerować geny reporterowe o długości wstawienia do 20 kb. Ich analiza w eksperymentach kotransfekcji pozwala na identyfikację czynników regulacyjnych. W ten sposób metoda ta może zidentyfikować sekwencje RNA i składniki komórkowe zaangażowane w tworzenie kolistego RNA.

Wprowadzenie

Okrągłe RNA
Okrągłe RNA (circRNA) to kowalencyjnie zamknięte jednoniciowe RNA, które ulegają ekspresji w większości organizmów. Są one generowane przez połączenie podrzędnego miejsca łączenia 5' z miejscem łączenia 3' w górę w procesie zwanym spawaniem wstecznym (Rysunek 1A)1. Sekwencje w pre-mRNA, które wykazują komplementarność zasady już od 30-40 nt, doprowadzają miejsca splicingu wstecznego do prawidłowego wyrównania do tworzenia circRNA2. U ludzi elementy Alu1, reprezentujące około 11% genomu3, tworzą rozległe dwuniciowe struktury RNA w pre-mRNA ze względu na ich samokomplementarność4,5 i w ten sposób promują tworzenie circRNAs1.

Obecnie opisano trzy główne funkcje circRNA. Niektóre circRNA wiążą mikroRNA (miRNA) i poprzez sekwestrację działają jak gąbki miRNA6. CircRNA są zaangażowane w regulację transkrypcji i potranskrypcyjną, poprzez konkurencję z liniowym splicingiem7 lub modulacją aktywności czynnika transkrypcyjnego8. Wreszcie, circRNA zawierają krótkie, otwarte ramki odczytu, a badania potwierdzające zasadność pokazują, że można je przetłumaczyć9,10. Jednak funkcja większości circRNA pozostaje enigmatyczna. Większość kolistych RNA została wykryta przy użyciu metod sekwencjonowania nowej generacji11. Szczegółowe analizy poszczególnych genów przy użyciu ukierunkowanych metod RT-PCR ujawniają, że duża liczba kolistych RNA pozostaje do odkrycia12.

Wykorzystanie genów reporterowych do analizy przetwarzania pre-mRNA
Analiza mRNA pochodzącego z konstruktów reporterowych DNA transfekowanych do komórek jest dobrze ugruntowaną metodą badania alternatywnego splicingu pre-mRNA, który można zastosować do kolistych RNA. Ogólnie rzecz biorąc, alternatywny egzon, otaczające go introny i konstytutywne egzony są amplifikowane i klonowane do eukariotycznego wektora ekspresji. Często introny są skracane. Konstrukty są transfekowane do komórek eukariotycznych i zwykle analizowane za pomocą RT-PCR13,14. Podejście to jest szeroko stosowane do mapowania regulacyjnych miejsc splicingu i czynników transakcyjnych w eksperymentach z kotransfekcją13,15,16,17,18. Ponadto wygenerowanie minigenów wyrażających białka pozwoliło na badania przesiewowe substancji, które zmieniają alternatywny splicing19,20.

Metoda została zastosowana do okrągłych RNA. Obecnie w literaturze opisano co najmniej 12 szkieletów minigenowych, które podsumowano w tabeli 1. Z wyjątkiem systemu ekspresji opartego na tRNA21,22, wszystkie są zależne od promotorów polimerazy II. W tym miejscu opisujemy metodę generowania ludzkich minigenów reporterowych w celu określenia czynników cis i transakcyjnych zaangażowanych w generowanie kolistych RNA. Przegląd metody wykorzystującej sekwencje opublikowanego genu reporterowego 23 jest pokazany w Rysunek 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Projektowanie konstrukcji

  1. Użyj przeglądarki genomu UCSC24, aby zidentyfikować powtarzające się elementy niezbędne do tworzenia kolistego RNA i włączyć je do konstruktów. Co ważne, startery do amplifikacji muszą znajdować się poza powtarzającymi się elementami.
  2. Wklej kolistą sekwencję RNA (rysunek uzupełniający 1 to sekwencja testowa) do https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start i wybierz odpowiedni organizm. Prześlij sekwencję i przejdź do widoku przeglądarki, pomniejsz 1,5x lub w razie potrzeby (Rysunek 2A).
    UWAGA: Sekwencja wyszukiwania pojawia się w górnym wierszu (Rysunek 2A, 1). W zależności od kolejności eksonów w kolistym RNA, BLAT nie połączy wszystkich eksonów. W tym przykładzie ekson 12 (Rysunek 2A, 4) nie jest połączony z 11 (Rysunek 2A, 2, 3), ponieważ ekson 12 znajduje się przed eksonem 11 w kolistej sekwencji RNA (Rysunek uzupełniający 1). Powtarzające się elementy znajdują się na ścieżce "repeat masker", oznaczonej polami, gdzie kolor od czarnego do szarego oznacza zachowanie ewolucyjne (Rysunek 2A, 5).
  3. Najedź kursorem na powtarzające się elementy, aby zidentyfikować ich podtyp w ruchomym oknie. Pierwiastki aluminiowe znajdują się w linii SINE (short interspersed nuclear element). Użyj przycisku "domyślne ścieżki" pod oknem, aby zresetować przeglądarkę, jeśli uzyskany zostanie inny obraz niż Rysunek 2.
    UWAGA: Najechanie kursorem na eksony na wyświetlaczu genów generuje okno z numerami eksonów, które są generowane komputerowo. Numery te nie odpowiadają numeracji eksonów ustalonej w literaturze, a także zmieniają się między izoformami.

2. Wybierz sekwencję, która ma zostać sklonowana w wektorze wyrażenia

  1. Pobierz sekwencję DNA pokazaną w oknie, przechodząc do opcji Wyświetl DNA → górnym wierszu przeglądarki genomu UCSC. W polu Ssequence Formatting Option (Formatowanie sekwencyjne) wybierz opcję Extended Case (Rozszerzone opcje wielkości/koloru).
  2. Wybierz domyślną wielkość liter jako Dolna i wybierz przełącznik wielkości liter dla NCBI refseq. Wybierz podkreślenie, pogrubienie i kursywę dla opcji Repeat Masker. Kliknij przycisk Prześlij. Eksony będą jako wielkie litery, a introny jako małe litery. Sprawdź granice eksonu/intronu.
  3. W tym przykładzie istnieje sekwencja "ccctttacCTTTTT", wskazująca, że przeglądarka pokazuje odwrotne uzupełnienie. W takim przypadku wróć i zaznacz pole odwrotnego dopełnienia, aż zobaczysz prawidłowe obramowania intronu eksonu (agEXONgt), w tym przykładzie AAAAAGgtaaaggg.
  4. Skopiuj plik o prawidłowej orientacji (wewnętrzne eksony są otoczone intronowym ag...gt) do dokumentu edytora tekstu i zaznacz eksony (Rysunek uzupełniający 2).
    UWAGA: W tym przykładzie fragment genomu obejmujący eksony 9-12 ma około 24 kb, a zatem jest zbyt duży, aby można go było amplifikować z genomowego DNA. Dlatego każdy ekson otoczony regionem intronowym o wielkości około 1 kb jest indywidualnie amplifikowany, a te cztery fragmenty są składane w wektor klonowania.
  5. Wybierz fragmenty, które mają być amplifikowane (ekson ± 500 nt intronu). Upewnij się, że intron nie zaczyna się ani nie kończy w powtarzającym się regionie, ponieważ startery w tych regionach nie wzmocnią określonych sekwencji. Wybrane regiony są pokazane w Rysunek 2B, a ich sekwencje są pokazane na rysunku uzupełniającym 3.
    UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, im większe konstrukty, tym trudniejsze będzie klonowanie. Fragmenty mogą być składane albo krok po kroku (tj. ekson 9 jest łączony z wektorem, a w następnym kroku ekson 10 jest wprowadzany do tego konstruktu poprzez klonowanie, aż wszystkie eksony są na swoim miejscu), albo alternatywnie, wszystkie fragmenty są składane jednocześnie. Podejście krokowe zawsze działa, ale wymaga więcej czasu. Jednoczesny montaż nie zawsze się sprawdza i zależy od tego, jak dobrze poszczególne fragmenty mogą być amplifikowane z genomowego DNA oraz od ogólnego rozmiaru konstruktu. Dlatego zwykle zaczynamy od obu podejść jednocześnie.

3. Projektowanie podstaw do klonowania

  1. Użyj narzędzia internetowego (https://nebuilder.neb.com/#!/), aby zaprojektować startery do klonowania. Na przykład wprowadź do tego narzędzia fragmenty 9, 10, 11 i 12 oraz sekwencję wektorową (rysunek uzupełniający 3).
  2. W przypadku sekwencji wektorowej dodaj miejsce insercji jako ostatni nukleotyd, a następnie dodaj fragmenty. Ponieważ numeracja wektorów nie zaczyna się od danego miejsca insercji, miejsce wstawienia w wektorze jest zlokalizowane, a dalsza część jest umieszczana przed sekwencją nadrzędną. W tym przykładzie wstawki zaczynają się bezpośrednio po miejscu HindIII [AAGCTT] i kończą się bezpośrednio po miejscu PmeI [GTTTAAAC] pcDNA3.1. Sekwencja z cccgctgatcag ... ccgtaaaaaggccgc jest wklejana przed pozycją 1 w sekwencji pcDNA3.1 (gttgctggcgtttttcc ...).
  3. Dostosuj startery, jeśli ich temperatury topnienia są oddalone od siebie o więcej niż 4 °C, ponieważ nie będą działać w amplifikacji. Montaż zaprojektowanych fragmentów i sekwencji starterów przedstawiono na rysunku uzupełniającym 4. Podstawy do klonowania można również zaprojektować ręcznie25.

4. Wykrywanie PCR i amplikonów

  1. Standardowa reakcja PCR: Sporządzić mieszaninę reakcyjną o całkowitej objętości 50 μl na reakcję. Poniżej znajduje się przepis na jedną reakcję z użyciem polimerazy 1:
    10 μL 5x buforu reakcyjnego
    1 μl 10 mM dNTPs
    2,5 μl 10 μM Forward Primer
    2,5 μL 10 μM Reverse Primer
    0,5 μl polimerazy 1
    32,5 μl H2O wolnego od nukleaz
    1. Opcjonalnie dodaj 10 μl 5x GC Enhancer, jeśli produkt ma wysoką zawartość GC; przygotuj oddzielną mieszankę zawierającą GC Enhancer, aby przetestować reakcję PCR.
  2. Podwielokrotność 49 μl mieszaniny do probówek PCR na próbkę reakcyjną.
  3. Dodaj 1 μl DNA do PCR, ilość waha się od 10 pg do 1 ng.
  4. Odkręć próbki, aby usunąć pozostałości z boków i umieść je w maszynie do PCR. Używaj tej samej maszyny, a także tych samych miejsc w maszynie podczas optymalizacji warunków PCR.

5. Optymalizacja dla dłuższych fragmentów DNA do użycia różnych polimeraz

  1. temperatura
    1. Zoptymalizuj polimerazę dalekiego zasięgu 2.
      1. Stosować niższą temperaturę denaturacji (polimeraza 1:98 °C, polimeraza 2:94 °C).
      2. Użyj dłuższego czasu denaturacji (polimeraza 1: 10 s, polimeraza 2: 30 s).
      3. Stosować dłuższy czas wyżarzania (polimeraza 1: 30 s, polimeraza 2: 60 s).
      4. Użyj dłuższego czasu przedłużenia (Polimeraza 1: 30 s/kb, Polimeraza 2: 50 s/kb).
      5. Użyj niższej temperatury rozciągania (polimeraza 1: 72 °C, polimeraza 2: 65 °C).
      6. Stosować temperaturę wyżarzania o 5 °C niższą od Tm podkładów.
    2. Zoptymalizuj stężenia podkładu (od 5 do 5 razy większe niż pierwotne stężenie podkładu). Zoptymalizuj stężenia DNA od 10 pg do 50 pg, 100 pg, 1 ng, 5 ng, 10 ng.
    3. Jako przykład programu PCR mającego na celu amplifikację produktu o rozmiarze 15 kb przy użyciu polimerazy 2, należy przeprowadzić początkową denaturację w temperaturze 94 °C przez 30 s, denaturację DNA w temperaturze 94 °C przez 30 s, a następnie wyżarzanie w temperaturze 58 °C przez 30 s i wydłużenie DNA w temperaturze 65 °C przez 12 minut 30 s. Wykonać końcowe przedłużenie w temperaturze 65 °C przez 10 minut z końcowym 4 ° C hold.
      UWAGA: Temperatura wyżarzania (Ta) właściwa dla starterów jest określana na podstawie obliczeń temperatury w wstędze, które są specyficzne dla każdej polimerazy. Czasy rozbudowy mogą się różnić i należy je zoptymalizować, jeśli fragmenty są większe niż 10 kb.
  2. Czasy wydłużenia i stężenia DNA
    1. Dla fragmentów DNA powyżej 6 kb należy stosować dłuższe czasy rozciągania: 1 min na 1 kb. Dłuższe fragmenty powinny zużywać mniej DNA.
    2. Wykonaj rozcieńczenia DNA, aby znaleźć optymalne stężenie DNA do amplifikacji, zwykle 1 pg do 1 ng dla plazmidów lub 1 ng do 1 μg dla genomowego DNA.
      UWAGA: Do większości klonowania należy użyć polimerazy 1, zaprojektowanej przez fuzję domeny wiążącej DNA Sso7d z zastrzeżoną termostabilną polimerazą DNA26. Polimeraza charakteryzuje się niskim poziomem błędów, a ze względu na domenę Sso7d wysoką procesywnością, potrzebną do amplifikacji dużych (10-15 kb) fragmentów genomu. Ze względu na ten duży rozmiar fragmentu, enzymatyczne składanie cząsteczek DNA27 jest używane do insercji do wektorów, ponieważ ta metoda nie wymaga enzymów restrykcyjnych. Amplifikacja fragmentów dłuższych niż 15 kb staje się coraz trudniejsza w przypadku polimerazy 1. Do amplifikacji dużych fragmentów należy użyć polimerazy 2 wykonanej z polimerazy korekcyjnej podobnej do pirokoka połączonej z Sso7d lub zestawu do PCR dalekiego zasięgu, który daje jednak wyższe wskaźniki błędów.

6. Oczyszczanie produktów PCR do klonowania

  1. Połowę produktów PCR należy przeprowadzić na 1% żelach agarozowych zawierających interkalujące barwienie kwasem nukleinowym (np. 1x GelGreen). Wizualizuj poplamione żele na ciemnym transiluminatorze czytnika. To wybarwione DNA nie jest zgodne z rozmiarem.
    UWAGA: GelGreen interkaluje się w DNA, podobnie jak bromek etydyny, ale jest wzbudzany przez światło o długości około 500 nm (cyjan), długości fali, która nie uszkadza DNA, co znacznie poprawia klonowanie.
  2. Równolegle uruchom połowę produktów PCR na 1% żelu, który jest barwiony po przebiegu bromkiem etydyny (Rysunek 3A, B).
  3. Z barwionego żelu należy usunąć pasma o odpowiedniej wielkości (krok 6.1) i wyizolować DNA za pomocą żelu i zestawu do czyszczenia PCR. W odstępstwie od standardowego protokołu, wymyj DNA tylko w 20 μl podwójnie destylowanej wody, ponieważ zwykle stężenia DNA są niskie.
  4. Przed klonowaniem sprawdź wyizolowane DNA w żelu agarozowym pod kątem koncentracji i integralności (Rysunek 3B). Dąż do stosunku wkładki molowej do wektora 2:1. W przypadku stosowania kilku wkładek stosunek wynosi 2:2:2:1.

7. Składanie DNA i wykrywanie klonów

UWAGA: Klonowanie odbywa się za pomocą enzymatycznego zestawu do składania DNA, z niewielkimi modyfikacjami. Składanie odbywa się przez 60 minut w temperaturze 50 °C i zazwyczaj do składania używa się dolnego zakresu DNA (reakcja 20-100 fmol/20 μl). Całą mieszaninę reakcyjną dodaje się do kompetentnych chemicznie komórek, a całe komórki wysiewa się na 6 cm płytce agarowej.

  1. Połącz wektor i wstaw w stosunku molowym 1:2 (po 20-500 fmol) w 10 μl wody.
  2. Dodać 10 μl DNA Assembly Master Mix.
  3. Inkubować próbki przez 60 minut w temperaturze 50 °C.
  4. Następnie przekształć kompetentne komórki za pomocą całkowitej reakcji składania. W tym przypadku użyj komórek szczepu 1 E. coli do krótszych konstruktów lub komórek szczepu E. coli 2 do dłuższych lub niestabilnych konstrukcji. Komórki powinny mieć objętość 50 μl.
  5. Rozmrozić komórki na lodzie i dodać 2 μl schłodzonego, złożonego produktu do właściwych komórek. Wymieszaj, delikatnie przesuwając tubkę 4-5 razy. Nie wirować.
  6. Pozostaw mieszaninę na lodzie na 30 minut.
  7. Szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 30 s. Nie mieszać.
  8. Przenieś probówkę z powrotem do lodu na 2 minuty.
  9. Dodać 950 μl pożywki SOC o temperaturze pokojowej do probówki.
  10. Inkubować probówkę reakcyjną w temperaturze 37 °C przez 60 minut. Wstrząsnąć energicznie (300 obr./min).
  11. Podczas inkubacji w temperaturze 37 °C ogrzać płytki selekcyjne odpowiednim antybiotykiem.
  12. Osadzać komórki przez wirowanie (10 000 x g, 30 s) i rozszczepić 1/4 i 3/4 komórek na dwóch płytkach selekcyjnych i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.

8. Walidacja klonów

  1. Do wykrywania należy użyć PCR kolonii, stosując startery PCR obejmujące miejsca składania (Rysunek 1C).
  2. Weź sterylną wykałaczkę i dotknij pojedynczej kolonii bakteryjnej.
  3. Dotknij dna probówki do PCR wykałaczką, w której znajduje się kolonia, a następnie rozłóż wykałaczkę na płytce agarowej z antybiotykiem, inkubuj płytkę z prążkami w temperaturze 37 °C lub pokojowej dla wrażliwych konstrukcji przez noc.
  4. Na probówkę PCR zetkniętą z kolonią nałożyć mieszaninę PCR zawierającą startery wykrywające. Są one zaprojektowane przy użyciu startera 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Program ma możliwość wymuszenia projektowania podkładu w zdefiniowanej sekwencji za pomocą znaków "[ccc]" w celu wyboru podkładów w poprzek złącza montażowego. DNA z dodatnich szczepów jest izolowane i weryfikowane przez sekwencjonowanie.

9. Analiza kolistych genów reporterowych wykazujących ekspresję RNA

  1. Do analizy transfekcja genów reporterowych do komórek eukariotycznych. Tutaj użyj ogniw HEK293 (ATTC #CRL-1573), ponieważ zapewniają one wysoką wydajność transfekcji. Aby obniżyć koszty, stosuj roztwory PEI (polietylenoiminy).
  2. W przypadku roztworu PEI rozpuścić liniowy chlorowodorek polietylenoiminy (PEI) w stężeniu 1 mg/ml w wodzie o niskim pH, pH 2. Doprowadzić pH do 7 za pomocą NaOH. Sterylny filtr z filtrami 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Podziel komórki na sześć dołków (około 150 000 komórek na dołek) i pozwól im rosnąć przez noc w 10% FBS w pożywkach DMEM.
  4. Podwielokrotność 1 μg genu reporterowego w sterylnej probówce i dodać 200 μl sterylnego, przefiltrowanego 150 mM NaCl. Wymieszaj z DNA przez wirowanie.
  5. Dodaj roztwór PEI do tej mieszanki i odwiruj, krótko odwiruj, aby zebrać próbki na dnie probówki. Stosować proporcje 1 μg DNA na 3 μl PEI.
  6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie dodać bezpośrednio do komórek HEK 293.
  7. Inkubować komórki HEK293 w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.
  8. Wyizoluj RNA do RT-PCR za pomocą zestawu do izolacji RNA.

10. Leczenie RNazą R w celu usunięcia liniowych RNA

  1. Użyj 10 μg całkowitego RNA w probówce wolnej od RNaz.
  2. Dodaj 10 μL 10x buforu RNazy R (0,2 M Tris-HCl (pH 8,0), 1 M KCl, 1 mM MgCl2) do RNA.
  3. Dodaj RNazę R do RNA (1 μl = 20U).
  4. Dodać 1 μl błękitu glikolowego do RNA i doprowadzić objętość do 100 μl sterylną wodą.
  5. Próbki inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  6. Dodać 100 μl fenolu/chloroformu i wirować przez 1 min.
  7. Wirować przy 21 000 x g przez 1 minutę w celu rozdzielenia faz.
  8. Pobrać supernatant (faza wodna) i dodać 1 objętość (około 80 μl chloroformu).
  9. Wirować przez 1 minutę, a następnie wirować przez 1 minutę w celu oddzielenia faz.
  10. Pobrać sklarowany osad, dodać 1:10 obj. KAc i 2,5 obj. etanolu i wytrącić w temperaturze -20 °C przez 1-4 godziny. Wirować w temperaturze 4 °C przez 30 min na pełnych obrotach (21 000 x g). Na dole będzie mała niebieska kulka.
  11. Usunąć sklarowany osad i przemyć 80% etanolem. Pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 5 minut w temperaturze pokojowej i rozpuść w 10 μl wody.

11. Analiza RT-PCR

  1. Użyj 1 μg RNA na reakcję RT.
  2. Przygotować mieszaninę reakcyjną o końcowej całkowitej objętości 20 μl na reakcję. Do jednej reakcji użyj 1 μl 10 mM dNTP, 1 μl 0,1 M ditiotreitolu (DTT), 4 μl 5x buforu pierwszej nici i 0,5 μl odwrotnej transkryptazy.
  3. Podwielokrotność 6,5 μl mieszaniny reakcyjnej do nowych probówek do PCR.
  4. Wymieszaj do 5 podkładów w jednej mieszance. Jednak niektóre startery mogą błędnie łączyć się z innymi starterami w PCR (Rysunek 5). Sekwencje starterów przedstawiono w Tabeli 2. Rutynowo używamy specyficznych dla genu starterów połączeń eksonowych, ale możliwe jest również torowanie za pomocą losowych heksamerów.
  5. Dodaj 1 μl 10 μM odwróconego startera do żądanej probówki reakcyjnej RT.
  6. Dodać 1 μg RNA do probówki reakcyjnej PCR.
  7. Dodać H2O bez RNaz do całkowitej objętości 20 μL.
  8. Zakręć probówki, aby usunąć pozostałości z boku probówek i umieść je w termocyklerze.
  9. Uruchomić reakcję RT w termocyklerze w temperaturze 50 °C na 50 minut.
  10. Przechowywać RT cDNA w temperaturze -20 °C lub przejść do reakcji PCR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Geny reporterowe pozwalają na określenie czynników regulacyjnych wpływających na tworzenie kolistego RNA. Jednak geny reporterowe są duże i zawierają elementy repetytywne, co często powoduje niestabilność konstruktów DNA. Ze względu na ich duży rozmiar często konieczne jest usunięcie części intronów, co osiąga się poprzez amplifikację fragmentów genomowych zawierających eksony i mniejsze flankujące części intronowe. Fragmenty DNA te są składane enzymatycznie, co umożliwia konstrukcję bez użycia enzymów restrykcyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ogólnie rzecz biorąc, koliste RNA mają niską obfitość1, co komplikuje badanie ich funkcji i powstawania. Podobnie jak w przypadku liniowych RNA13, zastosowanie minigenów reporterowych pozwala na identyfikację czynników cis i transakcyjnych, które regulują tworzenie kolistych RNA. W związku z tym podejście to generuje hipotezy, które można dalej testować przy użyciu genów endogennych.

Najważniejszym krokiem jest zaprojektowanie genu reporterowego....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez AZ180075 grantowe Departamentu Obrony Departamentu Obrony. Stefan Stamm dziękuje Jacqueline Noonan Endowment. Anna Pawluchin była wspierana przez DAAD, niemiecki program wymiany akademickiej, Justin R. Welden został laureatem nagrody Maxa Stecklera University of Kentucky.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(PEI) ChlorowodorekPolysciences24765-1
Narzędzie konstrukcyjneNEBhttps://nebuilder.neb.com/#!/
Dark Reader Transilluminator.Clare Chemical Research
Enzymatyczny zestaw do montażu DNANEBE2621S
Zestaw do czyszczenia żelu i PCRPromegaA9282
Glyco BlueThermo FisherAM9516
pcDNA3.1 miejsce klonowaniaMiejscepoliklonowaniahttps://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf
Polimeraza 1NEBM0491LQ5 Polimeraza DNA
Polimeraza 2Biorad1725310Polimeraza dalekiego zasięgu (NEB), iproof (BioRad)
Polimeraza 2Qiagen206402Zestaw polimerazy dalekiego zasięgu Qiagen
z odwrotną transkryptaząThermo Fisher18080044
Life Technologies12183025Ambion firmy Life Technologies
RNAzywa RLucigenRNR07250Epicentrum/Lucigen
Stabilne kompetentne komórkiNEBC3040HStabilne komórki NEB
Standardowe bakterie klonująceNEBC2988JNEB5-alpha kompetentne
narzędzie internetowe do projektowania podkładówNEBhttps://nebuilder.neb.com/#!/
Internetowe obliczenia temperaturyNEBhttps://tmcalculator.neb.com/#!/main
Zestaw do izolacji RNA

Bibliografia

  1. Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
  2. Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
  3. Deininger, P. Alu elements: know the SINEs. Genome Biology. 12 (12), 236(2011).
  4. Bazak, L., Levanon, E. Y., Eisenberg, E. Genome-wide analysis of Alu editability. Nucleic Acids Research. 42 (11), 6876-6884 (2014).
  5. Levanon, E. Y., et al. Systematic identification of abundant A-to-I editing sites in the human transcriptome. Nature Biotechnology. 22 (8), 1001-1005 (2004).
  6. Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
  7. Kelly, S., Greenman, C., Cook, P. R., Papantonis, A. Exon Skipping Is Correlated with Exon Circularization. Journal of Molecular Biology. 427 (15), 2414-2417 (2015).
  8. Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
  9. Yang, Y., et al. Extensive translation of circular RNAs driven by N(6)-methyladenosine. Cell Research. 27 (6), 626-641 (2017).
  10. Abe, N., et al. Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells. Scientific Reports. 5, 16435(2015).
  11. Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLOS Genetics. 9 (9), 1003777(2013).
  12. Ottesen, E. W., Luo, D., Seo, J., Singh, N. N., Singh, R. N. Human Survival Motor Neuron genes generate a vast repertoire of circular RNAs. Nucleic Acids Research. 47 (6), 2884-2905 (2019).
  13. Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4, 383-394 (1999).
  14. Mardon, H. J., Sebastio, G., Baralle, F. E. A role for exon sequences in alternative splicing of the human fibronectin gene. Nucleic Acids Research. 15, 7725-7733 (1987).
  15. Gaildrat, P., et al. Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants. Methods in Molecular Biology. 653, 249-257 (2010).
  16. Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
  17. Baralle, D., Baralle, M. Splicing in action: assessing disease causing sequence changes. Journal of Medical Genetics. 42 (10), 737-748 (2005).
  18. Percifield, R., Murphy, D., Stoilov, P. Medium throughput analysis of alternative splicing by fluorescently labeled RT-PCR. Methods in Molecular Biology. 1126, 299-313 (2014).
  19. Stoilov, P., Lin, C. H., Damoiseaux, R., Nikolic, J., Black, D. L. A high-throughput screening strategy identifies cardiotonic steroids as alternative splicing modulators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11218-11223 (2008).
  20. Shen, M., et al. Pyrvinium pamoate changes alternative splicing of the serotonin receptor 2C by influencing its RNA structure. Nucleic Acids Research. 41 (6), 3819-3832 (2013).
  21. Noto, J. J., Schmidt, C. A., Matera, A. G. Engineering and expressing circular RNAs via tRNA splicing. RNA Biology. , 1-7 (2017).
  22. Schmidt, C. A., Noto, J. J., Filonov, G. S., Matera, A. G. A Method for Expressing and Imaging Abundant, Stable, Circular RNAs In Vivo Using tRNA Splicing. Methods in Enzymology. 572, 215-236 (2016).
  23. Welden, J. R., van Doorn, J., Nelson, P. T., Stamm, S. The human MAPT locus generates circular RNAs. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , 2753-2760 (2018).
  24. Casper, J., et al. The UCSC Genome Browser database: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 762-769 (2018).
  25. Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1alpha promoter using Gibson assembly. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  26. Wang, Y., et al. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro. Nucleic Acids Research. 32 (3), 1197-1207 (2004).
  27. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  28. Conn, S. J., et al. The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs. Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).
  29. Jeck, W. R., Sharpless, N. E. Detecting and characterizing circular RNAs. Nature Biotechnology. 32 (5), 453-461 (2014).
  30. Pamudurti, N. R., et al. Translation of CircRNAs. Molecular Cell. 66 (1), 9-21 (2017).
  31. Kramer, M. C., et al. Combinatorial control of Drosophila circular RNA expression by intronic repeats, hnRNPs, and SR proteins. Genes & Development. 29 (20), 2168-2182 (2015).
  32. Starke, S., et al. Exon circularization requires canonical splice signals. Cell Reports. 10 (1), 103-111 (2015).
  33. Suzuki, H., Tsukahara, T. A view of pre-mRNA splicing from RNase R resistant RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 9331-9342 (2014).
  34. Zhang, X. O., et al. Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs. Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).
  35. Liang, D., Wilusz, J. E. Short intronic repeat sequences facilitate circular RNA production. Genes & Development. 28 (20), 2233-2247 (2014).
  36. Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nature Reviews Neuroscience. 17 (1), 5-21 (2016).
  37. Fejes-Toth, K., et al. Post-transcriptional processing generates a diversity of 5'-modified long and short RNAs. Nature. 457 (7232), 1028-1032 (2009).
  38. Gao, Q. S., et al. Complex regulation of tau exon 10, whose missplicing causes frontotemporal dementia. Journal of Neurochemistry. 74 (2), 490-500 (2000).
  39. Hartmann, A. M., et al. Regulation of alternative splicing of human tau exon 10 by phosphorylation of splicing factors. Molecular and Cellular Neuroscience. 18 (1), 80-90 (2001).
  40. Wang, Y., Wang, Z. Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs. RNA. 21 (2), 172-179 (2015).
  41. Yang, Y., Wang, Z. Constructing GFP-Based Reporter to Study Back Splicing and Translation of Circular RNA. Methods in Molecular Biology. 1724, 107-118 (2018).
  42. Zheng, Q., et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature Communications. 7, 11215(2016).
  43. Jia, W., Xu, B., Wu, J. Circular RNA expression profiles of mouse ovaries during postnatal development and the function of circular RNA epidermal growth factor receptor in granulosa cells. Metabolism. 85, 192-204 (2018).
  44. Liang, D., et al. The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting. Molecular Cell. 68 (5), 940-954 (2017).
  45. Legnini, I., et al. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis. Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).
  46. Li, X., et al. Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection. Molecular Cell. 67 (2), 214-227 (2017).
  47. Zhang, Y., et al. The Biogenesis of Nascent Circular RNAs. Cell Reports. 15 (3), 611-624 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powstawanie kolistego RNAanaliza elementów Aluklonowanie minigenówoptymalizacja PCRenzymatyczny montaż DNAizolacja RNAamplifikacja RT-PCRtraktowanie RNazą Rkoliste RNA białka tauzależność od czynników splicingu
Wykorzystanie pierwiastka aluminiowego zawierającego minigeny do analizy kolistych RNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.