Kompaktowy system stacjonarnej tomografii fotoakustycznej oparty na pulsacyjnych diodach laserowych (PLD-PAT) jest demonstrowany do szybkiego dynamicznego obrazowania in vivo naczyń korowych małych zwierząt.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Kompaktowy system stacjonarnej tomografii fotoakustycznej oparty na pulsacyjnych diodach laserowych (PLD-PAT) jest demonstrowany do szybkiego dynamicznego obrazowania in vivo naczyń korowych małych zwierząt.
Tomografia fotoakustyczna (PA) (PAT) to nowa metoda obrazowania biomedycznego, przydatna w różnych zastosowaniach przedklinicznych i klinicznych. Wykonane na zamówienie przetworniki oparte na okrągłym pierścieniu i konwencjonalne, masywne lasery Nd:YAG/OPO hamują translację systemu PAT do klinik. Ultrakompaktowe impulsowe diody laserowe (PLD) są obecnie wykorzystywane jako alternatywne źródło wzbudzenia w bliskiej podczerwieni do obrazowania PA. Szybkie dynamiczne obrazowanie in vivo zademonstrowano przy użyciu kompaktowego systemu PAT (PLD-PAT) opartego na PLD. W niniejszej pracy przedstawiono wizualizowany protokół eksperymentalny wykorzystujący system PLD-PAT dla komputerów stacjonarnych do dynamicznego obrazowania mózgu in vivo. Protokół opisuje konfigurację systemu PLD-PAT dla komputerów stacjonarnych, przygotowanie zwierzęcia do obrazowania naczyń krwionośnych mózgu oraz procedurę dynamicznej wizualizacji procesu wychwytu i usuwania barwnika zieleni indocyjaninowej (ICG) w unaczynieniu korowym szczura.
Fotoakustyczna tomografia komputerowa (PACT/PAT) to obiecująca nieinwazyjna metoda obrazowania biomedycznego, łącząca bogaty kontrast optyczny z wysoką rozdzielczością ultrasondy1,2,3,4,5. Kiedy nanosekundowy laser impulsowy odkłada energię na pochłaniające światło chromofory obecne w dowolnej tkance biologicznej, lokalna temperatura wzrasta, co prowadzi do termoelastycznego rozszerzania i kurczenia się tkanki, co skutkuje wytwarzaniem fal ciśnienia. Te fale ciśnienia są znane jako fale ultradźwiękowe lub fale fotoakustyczne (PA), które mogą być wykryte przez przetworniki ultradźwiękowe wokół próbki. Wykryte sygnały PA są rekonstruowane przy użyciu różnych algorytmów rekonstrukcji6,7,8,9 w celu wygenerowania przekrojowych obrazów PA. Obrazowanie PA dostarcza informacji strukturalnych i funkcjonalnych od narządów makroskopowych do mikroskopijnych organelli ze względu na zależność długości fali endogennych chromoforów obecnych w ciele10. Obrazowanie PAT jest z powodzeniem stosowane do wykrywania raka piersi1, obrazowanie wartowniczych węzłów chłonnych11, mapowanie oksyhemoglobiny (HbO2), deoksyhemoglobiny (HbR), całkowitego stężenia hemoglobiny (HbT), nasycenia tlenem (SO2)12,13, angiogeneza nowotworów14, obrazowanie całego ciała małych zwierząt15 i inne zastosowania.
Nd:YAG/OPO są konwencjonalnymi źródłami wzbudzenia dla systemów PAT pierwszej generacji, które są szeroko stosowane w społeczności fotoakustycznej do obrazowania małych zwierząt i obrazowania głębokich tkanek16. Lasery te dostarczają impulsy energetyczne o energii ~100 mJ przy niskich częstotliwościach powtarzania ~10-100 Hz. Systemy obrazowania PAT wykorzystujące te kosztowne i nieporęczne lasery nie nadają się do szybkiego obrazowania za pomocą jednoelementowych przetworników ultradźwiękowych (SUT) ze względu na ograniczoną częstotliwość powtarzania impulsów. Hamuje to monitorowanie w czasie rzeczywistym zmian fizjologicznych zachodzących przy dużych prędkościach wewnątrz zwierzęcia. Korzystając z przetworników opartych na matrycach, takich jak matryce liniowe, półokrągłe, kołowe i wolumetryczne ze wzbudzeniem laserowym Nd:YAG, możliwe jest szybkie obrazowanie. Jednak te przetworniki matrycowe są drogie i zapewniają niższą czułość w porównaniu z SU; Jednak szybkość obrazowania jest ograniczona przez niską częstotliwość powtarzania lasera. Najnowocześniejsze jednoimpulsowe systemy PACT z niestandardowym przetwornikiem z pełnym pierścieniem uzyskują dane PA z częstotliwością odświeżania 50 Hz17. Te przetworniki matrycowe wymagają złożonej elektroniki odbiorczej i wzmacniaczy sygnału, co sprawia, że cały system jest droższy i trudniejszy do użytku klinicznego.
Ich kompaktowy rozmiar, niższe wymagania dotyczące kosztów i wyższa częstotliwość powtarzania impulsów (rząd KHz) sprawiają, że impulsowe diody laserowe (PLD) są bardziej obiecujące do obrazowania w czasie rzeczywistym. Ze względu na te zalety, PLD są aktywnie wykorzystywane jako alternatywne źródło wzbudzenia w systemach PAT drugiej generacji. Systemy PAT oparte na PLD zostały z powodzeniem zademonstrowane pod kątem obrazowania z dużą liczbą klatek na sekundę przy użyciu przetworników matrycowych18, obrazowanie tkanek głębokich i mózgu19,20,21, diagnostyka chorób sercowo-naczyniowych22 oraz diagnostyka reumatologiczna23. Ponieważ SUT są bardzo czułe i tańsze w porównaniu z przetwornikami macierzowymi, są nadal szeroko stosowane do obrazowania PAT. System PLD oparty na światłowodach został zademonstrowany dla obrazowania fantomowego24. Przenośny system PLD-PAT został zademonstrowany wcześniej poprzez zamontowanie PLD wewnątrz skanera PAT25. Za pomocą jednego skanera kołowego SUT obrazowanie fantomowe wykonano w ciągu 3 s czasu skanowania, a obrazowanie mózgu szczura in vivo wykonano w okresie 5 sekund przy użyciu tego systemu PLD-PAT19.
Ponadto, wprowadzono ulepszenia do tego systemu PLD-PAT, aby uczynić go bardziej kompaktowym i stworzyć model pulpitu przy użyciu ośmiu jednoelementowych przetworników ultradźwiękowych (SUTR) opartych na reflektorze akustycznym26,27. W tym przypadku SUT zostały umieszczone w kierunku pionowym, a nie poziomym, za pomocą reflektora akustycznego 90°28. System ten może być stosowany do skanowania z czasem do 0,5 s i głębokości ~3 cm w obrazowaniu tkanek i obrazowaniu mózgu małych zwierząt in vivo. W niniejszej pracy ten stacjonarny system PLD-PAT został wykorzystany do wizualnej demonstracji eksperymentów dotyczących obrazowania mózgu in vivo u małych zwierząt oraz do dynamicznej wizualizacji procesu wchłaniania i usuwania zatwierdzonego przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) barwnika zieleni indocyjaninowej (ICG) w mózgach szczurów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu Technologicznego Nanyang w Singapurze (numer protokołu zwierzęcego ARF-SBS/NIE-A0331).
1. Opis systemu
2. Przygotowanie zwierząt do obrazowania mózgu szczura
UWAGA: Do demonstracji opisanego powyżej systemy desktop PLD-PAT do obrazowania naczyń krwionośnych kory małych zwierząt wykorzystano zdrowe szczury samice (patrz Tabela materiałów).
3. Dynamiczne obrazowanie in vivo procesu pobierania i usuwania ICG z mózgu szczura
4.
UWAGA: 1,25 mg proszku ICG odważono przy użyciu mikrowagi i wymieszano z 5 mL wody destylowanej, aby uzyskać roztwór ICG o stężeniu 323 μM.
5.
UWAGA: Linie A pozyskane podczas czasu skanowania 0,5 s są wykorzystywane do wygenerowania jednego obrazu przekroju poprzecznego. Między poszczególnymi skanowaniami występuje przerwa czasowa wynosząca ~0,4–0,6 s.

Rysunek 1: Schemat biurkowego systemu PLD-PAT. (A) Schemat układu biurkowego PLD-PAT. PLD: impulsowa dioda laserowa, OD: dyfuzor optyczny, SUTR: jednoelementowy przetwornik ultradźwiękowy z reflektorem akustycznym, AM: aparat do znieczulania, CSP: okrągła płyta skanująca, SM: silnik krokowy, LDU: jednostka sterująca laserem, AMP: wzmacniacz, DAQ: karta akwizycji danych. (B) Okrągowy układ ośmiu SUTR wokół centrum skanowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Potencjał opisanego stacjonarnego systemu PLD-PAT do dynamicznego obrazowania mózgu in vivo został zaprezentowany w niniejszym protokole wraz z odpowiednimi wynikami. Zdolność stacjonarnego systemu PLD-PAT do obrazowania o wysokiej prędkości wykazano, przeprowadzając obrazowanie mózgu in vivo u zdrowych samic szczurów. Sygnały PA zbierano za pomocą ośmiu SUTR obracających się o 360° i 45° wokół mózgu szczura przy prędkościach skanowania odpowiednio 4 s i 0,5 s. Rysunek 2A,B
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
W niniejszej pracy przedstawiono protokół wykorzystania desktopowego systemu PLD-PAT do przeprowadzania eksperymentów na małych zwierzętach, takich jak szczury, do obrazowania mózgu in vivo oraz dynamicznego procesu szybkiego wchłaniania i usuwania środków kontrastowych, takich jak ICG. Nieporęczne, drogie systemy OPO-PAT potrzebują kilku minut (2-5 minut), aby uzyskać pojedynczy obraz przekroju poprzecznego in vivo. Kompaktowy, tani, przenośny system PLD-PAT pierwszej generacji zapewnia pojedynczy przekrój poprzeczny ob...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają żadnych istotnych interesów finansowych ani potencjalnych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.
Badania są wspierane przez Krajową Radę Badań Medycznych Ministerstwa Zdrowia Singapuru (NMRC/OFIRG/0005/2016: M4062012). Autorzy pragną podziękować Panu Chow Wai Hoong Bobby'emu za wsparcie warsztatu mechanicznego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zasilacz 12 V | Voltcraft | PPS-11810 | Do dostarczania napięcia roboczego dla PLD |
| Odbłyśnik akustyczny | Olympus | F102 | Odbłyśnik 45 stopni wzmocniony do przetwornika ultradźwiękowego |
| Akrylowy zbiornik na wodę | Warsztat NTU | Wykonane na zamówienie | Służy do utrzymywania wody, która działa jako akustyczne medium sprzęgające między mózgiem zwierzęcia a detektorem |
| Maszyna | anestezjologicznaMedical plus pte ltd | Aparat do znieczulenia bez oddychania z koncentratorem tlenu. | Dostarcza tlen i izofluran zwierzętom |
| Dystrybutor zwierząt | In Vivos Pte Ltd, Singapur | Dystrybutor zwierząt, który dostarcza małe zwierzęta do celów badawczych | |
| Uchwyt na zwierzęta | Warsztat NTU | Wykonany na zamówienie | Służy do trzymania zwierzęcia na brzuchu |
| Maska oddechowa | Warsztat NTU | Wykonany na zamówienie | Używany wraz z uchwytem na zwierzę do dostarczania zwierzęciu mieszaniny znieczulającej |
| Skaner okrągły | Warsztat | NTUSkaner wykonany | na zamówienie wykonany jest z aluminium |
| Karta DAQ (Data Acquisition) | Spectrum | M2i.4932-exp | 16 bit, 30 Ms/s, 8 kanałów, 1 Gs, PCIe |
| Oprogramowanie do pozyskiwania danych | National Instruments Corporation, Austin, TX, USA) | NI LabVIEW 2015 SP1 (32 bit) | Program oparty na LabVIEW opracowany w naszym laboratorium do sterowania silnikiem krokowym i pobierania sygnałów PA z detektora |
| Przetwarzanie danych oprogramowanie | Matlab (Mathworks, Natick, MA, USA) | Matlab R2015b | Kod Matlab opracowany w naszym laboratorium do rekonstrukcji przekrojowych obrazów PA |
| Generator funkcyjny | RIGOL | DG1022 | Do zmiany częstotliwości powtarzania PLD. Zapewni sygnał TTL do synchronizacji DAQ ze wzbudzeniem lasera. |
| Wzmacniacz sygnału o niskim poziomie szumów | Genetron | Wykonany na zamówienie przy użyciu mini-obwodów, ZFL-500LN-BNC | Do odbioru i wzmocnienia sygnału PA z SUTR. Jego zysk wynosi 24 dB. |
| Dyfuzor optyczny | Thorlabs | DG-120 | Służy do ujednolicenia wiązki laserowej |
| Impulsowa dioda laserowa | Quantel, Francja | QD-Q1924-ILO-WATER | Jest to źródło lasera wzbudzającego o specyfikacji długości fali 816 nm, 3,4 mJ na energię impulsu, szerokości impulsu 107 ns, maksymalnej szybkości powtarzania impulsów 2 KHz, wymiary: 13,0 x 7,6 x 5,0 cm |
| Szczury | In Vivos Pte Ltd, Singapur | NTac:SD, Sprague Dawley / SD | Kobieta, waga 100± 10g, szczep szczurów: Sprague Dawley, wiek: 4-5 tygodni |
| Silnik krokowy ze skrzynią biegów | LIN Engineering (Servo Dynamics) | Silnik: CO-5718L-01P-RO, Skrzynia biegów: DPL64/1; Zasilacz PW-100-24 | Do przesuwania uchwytu czujki w geometrii kołowej. Moment obrotowy: 2,08 N-m, Bezwładność wirnika: 2,6 kg-cm2 |
| Żel ultradźwiękowy | Progress/parker acquasonic gel | PA-GEL-CLEA-5000 | Przezroczysty żel ultradźwiękowy |
| Przetwornik ultradźwiękowy | Olympus | V309-SU/ U8423013 | Czujniki ultradźwiękowe stosowane do detekcji fotoakustycznej. Centralna częstotliwość 5 MHz, 0,5 cala |
| Zmienny zasilacz wysokiego napięcia | Elektro-Automatik | EA-PS 8160-04 T | Do zmiany mocy wyjściowej lasera |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.