Biogeneza spliceosomalnych snRNA to złożony proces obejmujący różne kompartmenty komórkowe. W tym przypadku zastosowaliśmy mikroiniekcję znakowanych fluorescencyjnie snRNA w celu monitorowania ich transportu wewnątrz komórki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza lokalizacji spliceosomalnego snRNA w ludzkich komórkach hela za pomocą mikroiniekcji
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Biogeneza spliceosomalnych snRNA to złożony proces obejmujący zarówno fazę jądrową, jak i cytoplazmatyczną, a ostatni etap zachodzi w przedziale jądrowym zwanym ciałem Cajala. Jednak sekwencje, które kierują lokalizację snRNA w tej subjądrowej strukturze, nie były znane do niedawna. Aby określić sekwencje ważne dla akumulacji snRNA w ciałach Cajal, zastosowaliśmy mikroiniekcję znakowanych fluorescencyjnie snRNA, a następnie ich lokalizację wewnątrz komórek. Najpierw przygotowaliśmy mutanty delecji snRNA, zsyntetyzowaliśmy matryce DNA do transkrypcji in vitro i dokonaliśmy transkrypcji snRNA w obecności UTP sprzężonego z Alexa488. Znakowane snRNA zmieszano z 70 kDa-dekstranem sprzężonym z TRITC i mikrowstrzyknięto do jądra lub cytoplazmy ludzkich komórek HeLa. Komórki inkubowano przez 1 godzinę i utrwalano, a cewkę markera ciała Cajala uwidoczniono za pomocą immunofluorescencji pośredniej, podczas gdy snRNA i dekstran, który służy jako marker wstrzyknięcia jądrowego lub cytoplazmatycznego, obserwowano bezpośrednio za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Metoda ta pozwala na skuteczne i szybkie testowanie, w jaki sposób różne sekwencje wpływają na lokalizację RNA wewnątrz komórek. Tutaj pokazujemy znaczenie sekwencji wiążącej Sm dla efektywnej lokalizacji snRNA w ciele Cajala.
Wprowadzenie
Splicing RNA jest jednym z kluczowych etapów ekspresji genów, który jest katalizowany przez duży kompleks rybonukleoproteinowy zwany spliceosomem. W sumie ponad 150 białek i 5 małych jądrowych RNA (snRNA) jest zintegrowanych ze spliceosomem na różnych etapach szlaku splicingu. SnRNA U1, U2, U4, U5 i U6 uczestniczą w splicingu głównych intronów GU-AG. Te snRNA dołączają do spliceosomu jako wstępnie uformowane małe jądrowe cząstki rybonukleoproteiny (snRNP), które zawierają snRNA, siedem białek Sm związanych z snRNA (lub białka Like-Sm, które łączą się z snRNA U6) i 1-12 białek specyficznych dla każdego snRNP.
Składanie snRNP obejmuje etapy c....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie snRNA do mikroiniekcji
- Przygotuj matrycę DNA zawierającą pełnowymiarową lub skróconą/zmutowaną wersję snRNA metodą PCR, stosując następujące ustawienia PCR: 98 °C przez 60 s, 98 °C przez 15 s, 68 °C przez 30 s, 72 °C przez 1 min, 98 °C przez 15 s przez 35x i 72 °C przez 5 min.
- Starter forward musi zawierać sekwencję promotora do transkrypcji in vitro tuż przed pierwszym transkrybowanym nukleotydem. Amplifikuj sekwencję snRNA U2 za pomocą startera do przodu zawierającego promotor T7 i startera odwrotnego, który kończy się ostatnim transkrybowanym nukleotydem (szczegóły w Tabeli materiałów).
- Zsyntetyzuj s....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby monitorować lokalizację snRNA oraz rolę miejsca wiązania Sm w kierowaniu do ciałek Cajala, przygotowano matrycę DNA zawierającą promotor T7 oraz pełnowartościowe U2 snRNA lub U2 snRNA pozbawione siedmiu nukleotydów (AUUUUUG) tworzących miejsce wiązania Sm. cząsteczki snRNA poddano transkrypcji in vitro, wyizolowano i zmieszano z dekstranem-70kDa sprzężonym z TRITC. Mieszaninę zawierającą transkrybowane in vitro snRNA mikroinjektowano do jądra lub cytoplazmy komórek HeLa.
Wcześniej wykazano.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zastosowaliśmy mikroiniekcję znakowanych fluorescencyjnie snRNA w celu określenia sekwencji ważnych dla lokalizacji snRNA w jądrowych ciałach Cajala. Ze względu na szybkie i dość proste przygotowanie znakowanych RNA (przygotowanie matrycy DNA metodą PCR, a następnie transkrypcja in vitro), metoda ta oferuje skuteczną analizę tego, w jaki sposób różne sekwencje przyczyniają się do lokalizacji RNA. W stosunkowo krótkim czasie byliśmy w stanie przeanalizować dziesięć różnych delecji lub podstawień snRNA U2 (odniesienie
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Czeską Fundację Naukową (18-10035S), Narodowy Program Zrównoważonego Rozwoju I (LO1419), wsparcie instytucjonalne (RVO68378050), Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego (CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) oraz Agencję Grantową Uniwersytetu Karola (GAUK 134516). Wyrażamy również uznanie dla Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Praga, Republika Czeska (wspierane przez granty (Czech-Bioimaging - LM2015062).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP | ThermoFisher | C11403 | Stężenie zapasów 1 mM |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium - wysoka glukoza | Sigma-Aldrich | D5796 | Zawiera 4,5 g⁄ L D-glukoza, czerwień fenolowa i antybiotyki |
| FemtoJet express Injector | Eppendorf | 5247000013 | |
| Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | Igła do mikroiniekcji 0,5 i mikro; m wewnętrznym i 0,7 &mikro; m średnica zewnętrzna |
| Fluoromont G z DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Glikogen | ThermoFisher | AM9510 | Stężenie zapasowe 5 mg/ml |
| Szkiełka nakrywkowe w kratkę | Ibidi | 10817 | Szkiełka nakrywkowe z siatką, brak bezpośredniego doświadczenia z nimi |
| Mikromanipulator InjectMan NI 2 | Eppendorf | 5181000017 | |
| m3-2,2,7G(5')ppp(5')G analog czapki trimetylowej | Jena Bioscience | NU-853-1 | Stężenie zapasów 40 mM |
| Zestaw do transkrypcji MEGAshortscript T7 | Okulary | AM1354 | |
| 12 mm, nr 1 | Paul Marienfeld GmbH | 111520 | Do rutynowych prac |
| Okulary nakrywkowe do mikroskopu 12 mm, nr 1.5 | Paul Marienfeld GmbH | 117520 | Do wysokich rozdzielczość obrazów |
| Mikroskop DeltaVision | GE Healthcare | Do akwizycji obrazu | |
| Mikroskop DMI6000 | Leica | Do mikroiniekcji | |
| Paraformaldehyd 32% roztwór EM klasy EMS | 15714 | Rozpuszczony w RURACH do końcowego stężenia 4% | |
| Fenol:Chloroform 5:1 | Sigma-Aldrich | P1944 | |
| Startery do wzmocnienia U2: Do przodu: 5'-TAATACGACT CACTATAGGGATCGCTTCT CGGCCTTTTGG, Wsteczny: 5´ TGGTG CACCGTTCCTGGAGGT | Sigma-Aldrich | T7 kursywą | |
| Polimeraza DNA Phusion High Fidelity | BioLab | M0530L | |
| RNasin Plus | Promega | N2615 | Stężenie magazynowe 40 mM |
| Izotiocyjanian tetrametylodaminy Dekstran 65-85 kDa | Sigma-Aldrich | T1162 | Rozpuszczony w wodzie, stężenie podstawowe 1 mg / ml |
| Triton-X100 | Serva | 37240 | Rozpuszczony w wodzie, stężenie wyjściowe 10% |
Bibliografia
- Ishikawa, H., et al. Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis. Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).
- Stanek, D. Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
