Analiza lokalizacji spliceosomalnego snRNA w ludzkich komórkach hela za pomocą mikroiniekcji

Podsumowanie

Biogeneza spliceosomalnych snRNA to złożony proces obejmujący różne kompartmenty komórkowe. W tym przypadku zastosowaliśmy mikroiniekcję znakowanych fluorescencyjnie snRNA w celu monitorowania ich transportu wewnątrz komórki.

Streszczenie

Biogeneza spliceosomalnych snRNA to złożony proces obejmujący zarówno fazę jądrową, jak i cytoplazmatyczną, a ostatni etap zachodzi w przedziale jądrowym zwanym ciałem Cajala. Jednak sekwencje, które kierują lokalizację snRNA w tej subjądrowej strukturze, nie były znane do niedawna. Aby określić sekwencje ważne dla akumulacji snRNA w ciałach Cajal, zastosowaliśmy mikroiniekcję znakowanych fluorescencyjnie snRNA, a następnie ich lokalizację wewnątrz komórek. Najpierw przygotowaliśmy mutanty delecji snRNA, zsyntetyzowaliśmy matryce DNA do transkrypcji in vitro i dokonaliśmy transkrypcji snRNA w obecności UTP sprzężonego z Alexa488. Znakowane snRNA zmieszano z 70 kDa-dekstranem sprzężonym z TRITC i mikrowstrzyknięto do jądra lub cytoplazmy ludzkich komórek HeLa. Komórki inkubowano przez 1 godzinę i utrwalano, a cewkę markera ciała Cajala uwidoczniono za pomocą immunofluorescencji pośredniej, podczas gdy snRNA i dekstran, który służy jako marker wstrzyknięcia jądrowego lub cytoplazmatycznego, obserwowano bezpośrednio za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Metoda ta pozwala na skuteczne i szybkie testowanie, w jaki sposób różne sekwencje wpływają na lokalizację RNA wewnątrz komórek. Tutaj pokazujemy znaczenie sekwencji wiążącej Sm dla efektywnej lokalizacji snRNA w ciele Cajala.

Wprowadzenie

Splicing RNA jest jednym z kluczowych etapów ekspresji genów, który jest katalizowany przez duży kompleks rybonukleoproteinowy zwany spliceosomem. W sumie ponad 150 białek i 5 małych jądrowych RNA (snRNA) jest zintegrowanych ze spliceosomem na różnych etapach szlaku splicingu. SnRNA U1, U2, U4, U5 i U6 uczestniczą w splicingu głównych intronów GU-AG. Te snRNA dołączają do spliceosomu jako wstępnie uformowane małe jądrowe cząstki rybonukleoproteiny (snRNP), które zawierają snRNA, siedem białek Sm związanych z snRNA (lub białka Like-Sm, które łączą się z snRNA U6) i 1-12 białek specyficznych dla każdego snRNP.

Składanie snRNP obejmuje etapy cytoplazmatyczne i jądrowe. Nowo transkrybowane snRNA jest eksportowane do cytoplazmy, gdzie uzyskuje pierścień złożony z siedmiu białek Sm. Pierścień Sm służy następnie jako sygnał do ponownego importu snRNA z powrotem do jądra. Wadliwe snRNA, które nie łączą się z białkami Sm, są zatrzymywane w cytoplasm¹. Nowo importowane snRNP pojawiają się najpierw w ciele Cajala, gdzie spotykają się z białkami specyficznymi dla snRNP i kończą dojrzewanie (przegląd w referencji^2,3). Niedawno wykazaliśmy, że hamowanie końcowych etapów dojrzewania powoduje sekwestrację niedojrzałych snRNP w ciałach Cajala^4,5. Zaproponowaliśmy model, w którym końcowe dojrzewanie snRNP odbywa się pod kontrolą jakości, która monitoruje dodawanie białek specyficznych dla snRNP i tworzenie aktywnych snRNP. Jednak molekularne szczegóły dotyczące tego, w jaki sposób komórki rozróżniają prawidłowo złożone dojrzałe i nieprawidłowe niedojrzałe cząstki, pozostają nieuchwytne.

Aby określić sekwencje snRNA, które są niezbędne do celowania i akumulacji snRNA w jądrowych ciałach Cajala, zdecydowaliśmy się zastosować mikroiniekcję fluorescencyjnie znakowanych snRNA. Mikroiniekcja była metodą z wyboru, ponieważ: 1) nie wymaga dodatkowego znacznika sekwencji, aby odróżnić syntetyczne snRNA od ich endogennych odpowiedników, co jest szczególnie ważne w przypadku krótkich RNA z niewielką przestrzenią na wprowadzenie dodatkowej sekwencji znacznika; 2) umożliwia analizę sekwencji, które są ważne dla biogenezy. Na przykład sekwencja Sm jest niezbędna do złożenia pierścienia Sm i ponownego importu do klasy nucleus6. Kiedy snRNA ulegają ekspresji w komórce, snRNA pozbawione sekwencji Sm są degradowane w cytoplazmie i nie docierają do jądra i ciał Cajala⁷. Jednak snRNA bez sekwencji Sm mogą być bezpośrednio mikrowstrzykiwane do jądra, a tym samym badana jest potencjalna rola sekwencji Sm w lokalizacji ciała Cajala.

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę mikroiniekcji, którą zastosowaliśmy do określenia sekwencji snRNA niezbędnych do skierowania snRNA do ciała Cajala⁵. Wykazaliśmy, że miejsca wiązania Sm i SMN są razem niezbędne i wystarczające do lokalizacji nie tylko snRNA, ale różnych krótkich niekodujących RNA w ciele Cajala. Opierając się na mikroiniekcji, a także innych dowodach, zaproponowaliśmy, że pierścień Sm zamontowany w miejscu wiązania Sm jest sygnałem lokalizacji ciała Cajala.

Protokół

1. Przygotowanie snRNA do mikroiniekcji

1. Przygotuj matrycę DNA zawierającą pełnowymiarową lub skróconą/zmutowaną wersję snRNA metodą PCR, stosując następujące ustawienia PCR: 98 °C przez 60 s, 98 °C przez 15 s, 68 °C przez 30 s, 72 °C przez 1 min, 98 °C przez 15 s przez 35x i 72 °C przez 5 min.
2. Starter forward musi zawierać sekwencję promotora do transkrypcji in vitro tuż przed pierwszym transkrybowanym nukleotydem. Amplifikuj sekwencję snRNA U2 za pomocą startera do przodu zawierającego promotor T7 i startera odwrotnego, który kończy się ostatnim transkrybowanym nukleotydem (szczegóły w Tabeli materiałów).
3. Zsyntetyzuj snRNA za pomocą zestawu do syntezy krótkiego RNA (szczegółowe informacje znajduje się w tabeli materiałów) zawierającego polimerazę RNA T7. Do mieszaniny reakcyjnej dodać 1 mM ATP, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0,8 mM UTP, 0,2 mM UTP-Alexa488, 1,8 mM analogu kapu trimetyloguanozyny (m3^2,2,7G(5')ppp(5')G), 1 μL inhibitora RNA i 500-700 ng matrycy DNA do mieszaniny reakcyjnej i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
4. Dodać 1 μl (2U) DNazy do reakcji i inkubować przez dodatkowe 15 minut w temperaturze 37 °C.
5. Wyizolować snRNA przez ekstrakcję kwasowym fenolem/chloroformem. Usuń górną fazę wodną i dodaj 1/10 pierwotnej objętości 3 M octanu sodu (pH = 5,2), 3 μl glikogenu dla lepszej wizualizacji granulek i 2,5 objętości 100% etanolu. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze -80 °C, wirować przez 10 minut przy 14 000 x g i temperaturze 4 °C.
6. Umyj granulat 70% etanolem i rozpuść w 12 μl wody wolnej od nukleaz. Typowa wydajność RNA wynosiła około 600 ng/μL. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
7. Monitorowanie integralności transkrybowanych snRNA in vitro za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
8. Przed mikroiniekcją rozcieńczyć RNA do końcowego stężenia 200 ng/μL w wodzie zawierającej 10 μg/μL dextran-TRITC 70 kDa.

2. Komórki

1. Przed użyciem szkiełka nakrywkowe należy potraktować 1 M HCl przez 1 godzinę, dokładnie umyć w wodzie destylowanej i przechowywać w 100% etanolu. Kwaśne leczenie wspomaga adhezję komórek, aby zapobiec łuszczeniu się komórek podczas lub po wstrzyknięciu. W celu łatwiejszej identyfikacji wstrzykniętych komórek należy użyć szkiełka nakrywkowego z siatką.
2. Wysiewaj HeLa lub inne przylegające komórki 1 dzień przed mikroiniekcją na 12 mm szkiełkach nakrywkowych (nr 1 lub nr 1,5), aby osiągnąć 50% zbieżności w momencie mikroiniekcji.

3. Wtrysk

UWAGA: Komórki HeLa zostały mikrowstrzyknięte do zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium firmy Dulbecco (D-MEM, 4,5 g/L D-glukozy zawierającej czerwień fenolową i antybiotyki). Iniekcję wykonywano za pomocą iniektora i mikromanipulatora wyposażonego w sterylną igłę (szczegóły w Tabeli Materiałów). Cały system mikroskopowy/mikromanipulacyjny był wstępnie podgrzewany do temperatury 37 °C przez co najmniej 4 godziny, aby zapobiec wahaniom poszczególnych części mikroskopu i mikrowtryskiwacza.

1. Umieścić szalkę Petriego (30 mm) zawierającą 2 ml pożywki hodowlanej ze szkiełkiem nakrywkowym pośrodku do uchwytu mikroskopu. Załaduj 3 μl mieszaniny snRNA do igły za pomocą mikroładowarki. Umieścić igłę w uchwycie mikrowstrzykiwacza pod kątem 45° w stosunku do powierzchni szalki Petriego.
2. Aby znaleźć igłę, użyj obiektywu długodystansowego 10x. Najpierw ustaw prędkość COARSE na wtryskiwaczu i opuść igłę, aż dotknie pożywki hodowlanej. Za pomocą lornetki mikroskopowej znajdź jasny punkt, czyli miejsce, w którym igła dotyka pożywki hodowlanej.
3. Zmień prędkość na FINE i dalej obniżaj igłę, patrząc w mikroskop, aż zaobserwujesz końcówkę igły. Przesuń igłę na środek pola widzenia i przełącz się na obiektyw dalekiego zasięgu 40x.
4. Po zmianie celu zaznacz komórkę i przesuń igłę nad tę komórkę. Ustaw ciśnienie i czas kontaktu komórkowego (patrz Wskazówki i rozwiązywanie problemów w dyskusji).
5. Przesuń igłę w dół do komórki, a następnie ustaw dolną granicę na mikromanipulatorze. Należy uważać, aby nie przesunąć igły poniżej ogniwa.
6. Po ustawieniu dolnego limitu należy przesunąć igłę z powrotem nad kuwetę i nacisnąć przycisk wstrzykiwania na joysticku wtryskiwacza. Igła automatycznie przesuwa się wewnątrz komórki do miejsca, w którym ustalany jest limit i wstrzykuje mieszaninę RNA.
7. Aby zakończyć, naciśnij przycisk MENU na wtryskiwaczu i wyjmij igłę z uchwytu. Następnie odłącz rurkę od wtryskiwacza przed wyłączeniem wtryskiwacza i mikromanipulatora.

4. Utrwalanie i barwienie komórek

1. Po mikroiniekcji należy umieścić komórki z powrotem w inkubatorze z użyciem CO₂ i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
2. Po inkubacji przepłukać komórki trzykrotnie buforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS) w temperaturze pokojowej, utrwalić na 20 minut 4% paraformaldehydem w 0,1 M RURACH o pH 6,9 i przemyć trzykrotnie PBS o temperaturze pokojowej. Jeśli analizowana jest tylko lokalizacja snRNA, krótko przepłucz komórki w wodzie i zamontuj w pożywce montażowej z DAPI.
3. W przypadku dodatkowej lokalizacji białka należy przepuszczać komórki za pomocą 0,5% Triton-X100 w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po trzech płukaniach PBS inkubować komórki z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi, a po końcowym płukaniu w PBS i krótkim płukaniu w wodzie, zamontować w pożywce montażowej z DAPI.

5. Mikroskopia

1. Jeśli nie zostaną zobrazowane natychmiast po zamontowaniu, przechowuj szkiełka w temperaturze 4 °C do czasu obrazowania.
2. Uzyskuj obrazy za pomocą wysokiej klasy mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw immersyjny (60X lub 100x/1,4NA).
3. Po zidentyfikowaniu mikrowstrzykniętych komórek należy zebrać stos 20 przekrojów z odstępami co 200 nm na próbkę i poddać go matematycznej dekonwolucji. Następnie zaprezentowano maksymalne rzuty lub poszczególne stosy z.
4. Aby określić ilościowo sygnał fluorescencyjny, narysuj obszar zainteresowania (ROI) wokół ciała Cajala zidentyfikowanego przez barwienie immunologiczne cewki. Zmierz intensywność sygnału snRNA w ROI zdefiniowanym przez cewkę. Następnie określ intensywność fluorescencji snRNA w ROI losowo umieszczonym w nukleoplazmie i oblicz stosunek sygnału RNA w ciele Cajala i nukleoplazmie.

Wyniki

Aby monitorować lokalizację snRNA oraz rolę miejsca wiązania Sm w kierowaniu do ciałek Cajala, przygotowano matrycę DNA zawierającą promotor T7 oraz pełnowartościowe U2 snRNA lub U2 snRNA pozbawione siedmiu nukleotydów (AUUUUUG) tworzących miejsce wiązania Sm. cząsteczki snRNA poddano transkrypcji in vitro, wyizolowano i zmieszano z dekstranem-70kDa sprzężonym z TRITC. Mieszaninę zawierającą transkrybowane in vitro snRNA mikroinjektowano do jądra lub cytoplazmy komórek HeLa.

Wcześniej wykazano...

Dyskusja

Zastosowaliśmy mikroiniekcję znakowanych fluorescencyjnie snRNA w celu określenia sekwencji ważnych dla lokalizacji snRNA w jądrowych ciałach Cajala. Ze względu na szybkie i dość proste przygotowanie znakowanych RNA (przygotowanie matrycy DNA metodą PCR, a następnie transkrypcja in vitro), metoda ta oferuje skuteczną analizę tego, w jaki sposób różne sekwencje przyczyniają się do lokalizacji RNA. W stosunkowo krótkim czasie byliśmy w stanie przeanalizować dziesięć różnych delecji lub podstawień snRNA U2 (odniesienie

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP	ThermoFisher	C11403	Stężenie zapasów 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium - wysoka glukoza	Sigma-Aldrich	D5796	Zawiera 4,5 g⁄ L D-glukoza, czerwień fenolowa i antybiotyki
FemtoJet express Injector	Eppendorf	5247000013
Femtotips II	Eppendorf	930000043	Igła do mikroiniekcji 0,5 i mikro; m wewnętrznym i 0,7 &mikro; m średnica zewnętrzna
Fluoromont G z DAPI	SouthernBiotech	0100-20
Glikogen	ThermoFisher	AM9510	Stężenie zapasowe 5 mg/ml
Szkiełka nakrywkowe w kratkę	Ibidi	10817	Szkiełka nakrywkowe z siatką, brak bezpośredniego doświadczenia z nimi
Mikromanipulator InjectMan NI 2	Eppendorf	5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G analog czapki trimetylowej	Jena Bioscience	NU-853-1	Stężenie zapasów 40 mM
Zestaw do transkrypcji MEGAshortscript T7	Okulary	AM1354
12 mm, nr 1	Paul Marienfeld GmbH	111520	Do rutynowych prac
Okulary nakrywkowe do mikroskopu 12 mm, nr 1.5	Paul Marienfeld GmbH	117520	Do wysokich rozdzielczość obrazów
Mikroskop DeltaVision	GE Healthcare		Do akwizycji obrazu
Mikroskop DMI6000	Leica		Do mikroiniekcji
Paraformaldehyd 32% roztwór EM klasy EMS		15714	Rozpuszczony w RURACH do końcowego stężenia 4%
Fenol:Chloroform 5:1	Sigma-Aldrich	P1944
Startery do wzmocnienia U2: Do przodu: 5'-TAATACGACT CACTATAGGGATCGCTTCT CGGCCTTTTGG, Wsteczny: 5´ TGGTG CACCGTTCCTGGAGGT	Sigma-Aldrich		T7 kursywą
Polimeraza DNA Phusion High Fidelity	BioLab	M0530L
RNasin Plus	Promega	N2615	Stężenie magazynowe 40 mM
Izotiocyjanian tetrametylodaminy Dekstran 65-85 kDa	Sigma-Aldrich	T1162	Rozpuszczony w wodzie, stężenie podstawowe 1 mg / ml
Triton-X100	Serva	37240	Rozpuszczony w wodzie, stężenie wyjściowe 10%

nakrywkowe do mikroskopu ThermoFisher Sekwencja promotora