Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie neurosfer z mieszanych pierwotnych neuronów hipokampa i kory mózgowej wyizolowanych z zarodka szczura E14-E16 Sprague Dawley

8.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59800

⸱

31 sierpnia 2019

 ,  ,  ,  , 
1Organic and Medicinal Chemistry Division, CSIR-Indian Institute of Chemical Biology, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół spontanicznego generowania neurosfer wzbogaconych w neurony progenitorowe neuronów o dużej gęstości. Podczas tego samego eksperymentu, gdy neurony są powlekane o mniejszej gęstości, protokół powoduje również przedłużone hodowle pierwotnych neuronów szczurów.

Streszczenie

Pierwotna hodowla neuronów jest podstawową techniką w dziedzinie neuronauki. Aby uzyskać głębszy mechanistyczny wgląd w mózg, niezbędne jest posiadanie solidnego modelu in vitro, który można wykorzystać do różnych badań neurobiologicznych. Chociaż pierwotne hodowle neuronów (tj. długoterminowe kultury hipokampa) dostarczyły naukowcom modeli, nie reprezentują one jeszcze w pełni złożoności sieci mózgowej. W ślad za tymi ograniczeniami pojawił się nowy model wykorzystujący neurosfery, który jest bardziej podobny do tkanki mózgowej. Niniejszy protokół opisuje posiewanie o wysokiej i niskiej gęstości mieszanych neuronów korowych i hipokampa wyizolowanych z zarodka embrionalnych szczurów Sprague Dawley w dniach 14-16. Pozwala to na generowanie neurosfer i długoterminowej hodowli neuronów pierwotnych jako dwóch niezależnych platform do prowadzenia dalszych badań. Proces ten jest niezwykle prosty i opłacalny, ponieważ minimalizuje kilka etapów i odczynników, które wcześniej uważano za niezbędne do hodowli neuronów. Jest to solidny protokół z minimalnymi wymaganiami, który można wykonać z osiągalnymi wynikami i dalej wykorzystywać w różnych badaniach związanych z neuronauką.

Wprowadzenie

Mózg to skomplikowane obwody komórek neuronalnych i nieneuronalnych. Naukowcy od lat starają się uzyskać wgląd w tę skomplikowaną maszynerię. Aby tego dokonać, neuronaukowcy początkowo uciekali się do różnych przekształconych linii komórkowych opartych na nerwach do badań. Jednak niezdolność tych klonalnych linii komórkowych do tworzenia silnych połączeń synaptycznych i właściwych aksonów lub dendrytów przeniosła zainteresowanie naukowe na pierwotne hodowle neuronów1,2. Najbardziej ekscytującym aspektem hodowli neuronów pierwotnych jest to, że stwarza ona możliwość obserwowania i manipulowania żywymi neuronami3. Co więcej, jest mniej złożony w porównaniu z tkanką nerwową, co czyni go idealnym kandydatem do badania funkcji i transportu różnych białek neuronalnych. Ostatnio kilka osiągnięć w dziedzinie mikroskopii, genomiki i proteomiki stworzyło nowe możliwości dla neurobiologów w zakresie wykorzystania kultur neuronów4.

Hodowle pierwotne pozwoliły neurobiologom na zbadanie molekularnych mechanizmów stojących za rozwojem neuronalnym, analizę różnych ścieżek sygnalizacji neuronalnej i rozwinięcie bardziej spójnego zrozumienia synapsy. Chociaż wiele metod opisywało hodowle neuronów pierwotnych (głównie pochodzenia hipokampowego5,6,7), nadal potrzebny jest ujednolicony protokół z chemicznie zdefiniowanym podłożem, które umożliwia długotrwałą hodowlę neuronów. Najczęściej jednak obserwuje się neurony o niskiej gęstości, które nie są w stanie przetrwać przez długi czas, prawdopodobnie z powodu braku wsparcia troficznego8, które jest dostarczane przez sąsiednie neurony i komórki glejowe. Niektóre metody sugerują nawet kokulturację pierwotnych neuronów z komórkami glejowymi, w których komórki glejowe są używane jako warstwa zasilająca9. Jednak komórki glejowe stwarzają wiele problemów ze względu na ich przerost, który czasami zastępuje wzrost neuronów10. W związku z tym, biorąc pod uwagę powyższe problemy, wymagany jest prostszy i bardziej opłacalny protokół pierwotnej hodowli neuronowej, który może być stosowany zarówno przez neurobiologów, jak i neurochemików do badań.

Pierwotna hodowla neuronów jest zasadniczo formą kultury 2D i nie reprezentuje plastyczności, integralności przestrzennej ani heterogeniczności mózgu. Spowodowało to zapotrzebowanie na bardziej wiarygodny model 3D o nazwie neurospheres11,12. Neurosfery stanowią nową platformę dla neurobiologów, bardziej zbliżoną do rzeczywistego brain13. Neurosfery to nieprzylegające skupiska komórek 3D, które są bogate w nerwowe komórki macierzyste (NSC), neuronalne komórki progenitorowe (NPC), neurony i astrocyty. Są doskonałym źródłem do izolacji nerwowych komórek macierzystych i nerwowych komórek progenitorowych, które można wykorzystać do badania różnicowania na różne linie neuronalne i nieneuronalne. Ponownie, zmienność w obrębie kultur neurosfery wytworzonych przy użyciu wcześniej opisanych protokołów stanowi przeszkodę w sformułowaniu ujednoliconego protokołu hodowli neurosfery14.

Ten manuskrypt przedstawia protokół, w którym możliwe jest generowanie zarówno platform 2D, jak i 3D poprzez naprzemienne gęstości posiewu komórek z mieszanej kultury korowej i hipokampa. Zaobserwowano, że w ciągu 7 dni swobodnie unoszące się neurosfery są uzyskiwane z platerowanych neuronów o dużej gęstości wyizolowanych z zarodka szczura E14-E16 Sprague Dawley, które po dalszej hodowli tworzą mosty i połączenia poprzez promieniste rozszerzenia przypominające glej. Podobnie, w neuronach platerowanych o niskiej gęstości, pierwotną hodowlę neuronów, którą można utrzymać przez okres do 30 dni, uzyskuje się poprzez zmianę pożywki podtrzymującej dwa razy w tygodniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Etyki Zwierząt CSIR-Indyjskiego Instytutu Biologii Chemicznej (IICB/AEC/Meeting/Apr/2018/1).

1. Przygotowanie odczynników i pożywek

  1. Roztwór poli-D-lizyny (PDL): przygotować roztwory PDL o stężeniu 0,1 mg/ml w wodzie dejonizowanej i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  2. Pożywka dysocjacyjna: Do 1 l sterylnej, przefiltrowanej wody dejonizowanej połączyć następujące składniki w odpowiednich stężeniach: chlorek sodu (8 mg/ml), chlorek potasu (0,4 mg/ml), fosforan potasu jednozasadowy (0,06 mg/ml), D-glukoza (1 mg/ml), dwuzasadowy fosforan sodu (0,479 mg/ml) i 1 M HEPES [kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy; 10 mM]. Zmieszaj wszystkie składniki, aby ułatwić prawidłowe mieszanie i przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
    UWAGA: Podczas dysocjacji należy używać pożywki dysocjacyjnej w postaci lodowatej, ale w temperaturze pokojowej (RT) do prania i innych celów.
  3. Pożywka galwaniczna: pożywka galwaniczna składa się z następujących elementów: minimalnej ilości podłoża niezbędnego (MEM) Eagle's ze zrównoważonym roztworem soli Earle'a (BSS; 88,4%), D-glukozy (0,6%), surowicy końskiej (10%) i penicyliny/streptomycyny (1%). Połącz składniki w odpowiednich proporcjach i wykonaj procedurę w okapie w sterylnych warunkach.
    UWAGA: Zawsze używaj świeżo przygotowanego podłoża galwanicznego, aby uniknąć degradacji jakiegokolwiek elementu.
  4. Pożywka podtrzymująca: należy przygotować pożywkę podtrzymującą, łącząc w odpowiednich proporcjach: podłoże neuropodstawowe (97%), 0,5 mM uzyskaną komercyjnie próbkę glutaminy, suplement bezsurowicy B27 (2%) oraz penicylinę/streptomycynę (1%). Połącz składniki w odpowiednich proporcjach i wykonaj zabieg w okapie w sterylnych warunkach. Upewnij się, że wszystkie składniki są świeżo przygotowane.

2. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych

  1. Weź okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm i namocz je w 1 M kwasie solnym (HCl) na 4 godziny.
  2. Przenieś szkiełka nakrywkowe do wody destylowanej za pomocą kleszczy i delikatnie zamieszaj, aby całkowicie pozbyć się kwasu.
  3. Umyte szkiełka nakrywkowe przenieść do dodatkowej rundy czyszczenia w zlewce zawierającej 100% etanolu.
  4. Przed użyciem szkiełek nakrywkowych należy je dobrze wysuszyć w kapturze laminarnym, trzymając je na bibułce.

3. Przygotowanie płytek pokrytych poli-D-lizyną do hodowli neuronów

  1. Weź dwie płytki 24-dołkowe: jedną do powlekania o dużej gęstości, a drugą do powlekania o niskiej gęstości. Sterylne saszetki należy otwierać tylko wewnątrz okapu laminarnego.
  2. Przenieść 12 mm sterylnych szklanych szkiełek nakrywkowych do płytek 24-dołkowych.
  3. Wlać 300 μl roztworu PDL (0,1 mg/ml w wodzie dejonizowanej) do każdej studzienki tak, aby całkowicie pokryła powierzchnię szkiełek nakrywkowych.
  4. Owiń płytki folią aluminiową, aby zapobiec wysuszeniu i przechowuj je w inkubatorze CO2 przez noc.
  5. Następnego dnia (przed posiewem) odessać roztwór PDL i dokładnie przemyć 300 μl sterylnej wody dejonizowanej dwa do trzech razy.
  6. Dodać 200 μl świeżo przygotowanego podłoża galwanicznego i umieścić płytki z powrotem w inkubatorze do czasu posiewu.

4. Usunięcie i dekapitacja płodu

UWAGA: Sterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne zapakowane w folię aluminiową w autoklawie w temperaturze 121 °C (15 psi) przez 30 minut. Obejmuje to parę nożyczek z końcami, kleszcze, cienkie kleszcze, dwie cienkie nożyczki i jeden kleszczyk tętniczy na całą procedurę.

  1. Do generowania neuronów i neurosfer użyj szczura Sprague Dawley w ciąży w czasie i oznacz dzień wykrywaniem czopa dopochwowego jako E0,
    UWAGA: Posiew musi być przeprowadzony między E14-E16.
  2. W dniu hodowli umieść sterylną szklaną płytkę Petriego na lodzie i napełnij ją zimnym zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS).
  3. Znieczulić ciężarną szczurę E14-E16 wstrzyknięciem dootrzewnowym (i.p.) 90 mg ketaminy/kg masy ciała i 10 mg ksylazyny/kg, a następnie poświęcić ją poprzez wykonanie zwichnięcia szyjki macicy.
    UWAGA: Szczury mogą być również poddane eutanazji przez przedawkowanie pentobarbitalu lub przedawkowanie ketaminy z ksylazyną lub diazepamem.
  4. Wysterylizuj brzuch matki, rozpylając 70% etanolu i wykonaj nacięcie w kształcie litery V w okolicy brzucha za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek o końcu.
  5. Ostrożnie pobrać woreczki embrionalne na szalkę Petriego z zimnym roztworem HBSS.
    UWAGA: Nie używaj tych samych kleszczy i nożyczek, które zostały właśnie użyte do skóry, ponieważ spowoduje to zanieczyszczenie narządów wewnętrznych. Użyj innego zestawu nożyczek/kleszczy do narządów wewnętrznych.
  6. Wyjmij zarodki z woreczków embrionalnych w świeżym, zimnym HBSS.
  7. Odetnij głowę sterylnymi nożyczkami.

5. Usunięcie mózgu i rozwarstwienie kory mózgowej za pomocą hipokampa

  1. Przed rozpoczęciem napełnij sterylne szalki Petriego o średnicy 90 mm zimnym, sterylnym HBSS.
  2. Przenieś głowy w sterylnych naczyniach za pomocą sterylnych, tępo zakończonych kleszczy opatrunkowych.
  3. Pod mikroskopem stereoskopowym przytrzymaj głowę od okolicy pyska sterylnymi, ząbkowanymi kleszczami i usuń mózg, rozcinając skórę i czaszkę.
  4. Zebrać wszystkie zarodki mózgowe w ten sam sposób w roztworze HBSS.
  5. Usuń wszystkie opony mózgowe z półkul i śródmózgowia, trzymając pień mózgu.
  6. Ostrożnie usuń nienaruszone półkule przypominające kapelusze grzybów, które zawierają hipokamp i korę.
  7. Zbierz półkule zawierające korę i nienaruszony hipokamp w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml pożywki dysocjującej.

6. Dysocjacja tkanki korowej i hipokampa na pojedyncze neurony

  1. Pozwól pobranym tkankom ustabilizować się i odessać pożywkę dysocjacyjną, pozostawiając w niej 5%-10% pożywki.
  2. Dodać 10 ml świeżej pożywki dysocjacyjnej do tkanki i powtórzyć krok 6.1 dwa razy.
  3. Dodać 4,5 ml pożywki dysocjacyjnej i 0,5 ml 0,25% (1x) roztworu EDTA trypsyny (tetraoctanu etylenodiaminy).
  4. Utrzymywać tkankę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 20 minut, aby mogło przebiegać trawienie.
  5. Odessać pożywkę i dodać kolejno 10 ml pożywki dysocjacyjnej i galwanicznej do strawionych tkanek.
  6. Pozwól, aby strawione tkanki uspokoiły się i odessaj pożywkę dysocjacyjną. Dodać 2,5 ml podłoża galwanicznego i wlać na dno sterylnego naczynia o średnicy 90 mm.
  7. Roztarć strawione tkanki w narożnej podstawie naczynia za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 000 μl, aby zająć minimalną objętość.
  8. Otrzymaną zawiesinę komórek przepuścić przez sitko do komórek o wielkości 70 μm, z wyłączeniem wszelkich kawałków tkanki.
  9. Określ gęstość żywotnych komórek za pomocą metody wykluczania barwnika błękitu trypanowego i policz liczbę komórek w automatycznym liczniku komórek.
    1. W przypadku metody wykluczania barwnika błękitu trypanowego należy pobrać 10 μl zawiesiny komórek i 10 μl 0,4% barwie błękitu trypanowego, dokładnie wymieszać i dodać 10 μl mieszaniny do jednej z dwóch zamkniętych komór jednorazowych szkiełek komorowych.
    2. Włóż szkiełko zawierające mieszaninę do licznika celi i uzyskaj odczyt.
      UWAGA: Metoda wykluczania barwnika błękitu trypanowego opiera się na zasadzie, że żywe komórki (ze względu na ich nienaruszone błony) wykluczą barwnik błękitu trypanowego, a zatem pokażą wyraźną cytoplazmę, w porównaniu z komórką niezdolną do życia, która łatwo wchłonie błękit trypanowy i pojawi się na niebiesko w kolorze15.
  10. Rozcieńczyć liczbę otrzymanych komórek na płytce 1,5 x 105 komórek/ml dla wysokiej gęstości i 20 000 komórek/ml dla niskiej gęstości w dwóch oddzielnych probówkach zawierających po 30 ml każdej pożywki galwanicznej.
  11. Odessać uprzednio dodane podłoże galwaniczne z każdej studzienki i umieścić na płytce 500 μl komórek rozproszonych w pożywce galwanicznej w każdym dołku.
  12. Następnie należy umieścić płytki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 4 godziny.
  13. Zbadaj komórki pod kątem przylegania pod mikroskopem 4 godziny po posiewie.
  14. Jeżeli komórki na obu płytkach są prawidłowo przylegające, zastąpić pożywkę w każdej studzience 500 μl świeżej pożywki podtrzymującej i inkubować w temperaturze 37 °C.
  15. Hoduj te neurony hodowane w niskiej gęstości przez 30 dni, zmieniając pożywkę konserwacyjną 2 razy w tygodniu.
  16. Hoduj neurosfery uzyskane z platerowanych neuronów o dużej gęstości w tym samym podłożu podtrzymującym, przenosząc je na ultra-niskie płytki przyłączeniowe.
  17. Scharakteryzuj neurony i neurosfery, barwiąc je immunologicznie ważnymi markerami. W przypadku immunocytochemii najpierw utrwal komórki/neurosfery za pomocą 4% formaldehydu przez 30 minut na samej płytce, a następnie przeniknij komórki 0,1% niejonowym detergentem przez 10 minut.
  18. Dodać pierwszorzędowe przeciwciała zarówno dla neuronów (anty-Tuj1, GFAP, O4, tau), jak i neurosfer (anty-Nestin, GFAP, Tuj1) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w stężeniach 1:300 i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C16.
    UWAGA: Tuj1 (klasa III β-tubulina) i tau są dodatnimi markerami dla pierwotnych neuronów, podczas gdy GFAP (glejowe białko fibrylarne kwasowe) i O4 (marker oligodendrocytów) są ujemnymi markerami dla neuronów pierwotnych17,18. W przypadku neurosfer Tuj1, GFAP i Nestin służą jako markery dodatnie19,20.
  19. Następnego dnia przemyć komórki PBS raz lub dwa razy i dodać odpowiednie przeciwciała drugorzędowe do PBS w stężeniach 1:600 w temperaturze pokojowej przez 2 godziny
    UWAGA: Przeciwciała drugorzędowe przeciwko myszom lub królikom są wybierane w zależności od gatunku gospodarza dodanego przeciwciała pierwszorzędowego. Należy pamiętać, że przeciwciała drugorzędowe muszą być sprzężone z pochodnymi fluorescencji odpowiednimi do celów mikroskopii fluorescencyjnej.
  20. Ponownie umyj komórki PBS raz lub dwa razy.
    1. Przeprowadzić barwienie jądrowe komórek za pomocą Hoechst 33258 (1 mg/ml roztwór podstawowy w wodzie dejonizowanej). Przygotować 0,1% roztwór Hoechsta w PBS z roztworu podstawowego i dodać go do komórek.
    2. Inkubować komórki z 0,1% roztworem Hoechsta przez 30 minut, a następnie ponownie przemyć PBS.
  21. Dodać 20 μl PBS (lub podłoża montażowego) na szkiełko podstawowe i powoli zamontować szkiełko nakrywkowe zawierające wybarwione komórki na powierzchni szkiełka zawierającego PBS. Uszczelnić brzegi szkiełka nakrywkowego ftalanem dibutylu i polistyrenem ksylenem (DPX).
  22. Wykonaj obrazowanie utrwalonych komórek pod mikroskopem przy powiększeniu 10x i 40x.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym protokole opisano prostą strategię uzyskiwania zmiennych gęstości wysiewu komórek na dwóch różnych platformach do przesiewiania neuronów. Rysunek 1A,B przedstawia adhezję komórek po 4 h od wysiewu neuronów w wariantach o wysokiej i niskiej gęstości, odpowiednio. Po stwierdzeniu prawidłowej adhezji neuronów, jak pokazano na Rysunku 1, medium do wysiewu w każdym z dołków zastąpiono medium utrzymującym,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje, w jaki sposób poprzez zmianę gęstości posiewu komórek neuronów pierwotnych uzyskuje się dwie zmienne platformy neuronalne. Chociaż jest to prosta metoda, każdy krok musi być skrupulatnie wykonany, aby osiągnąć pożądane rezultaty. Inne wcześniejsze metody opisywały długoterminowe pierwotne hodowle neuronów lub hodowle neurosfery. Większość protokołów hodowli neuronów pierwotnych obejmowała hodowlę neuronów hipokampa przez 3-5 tygodni, ale większość z nich zakończyła się niepowodzeniem, ponieważ neuro...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy obiektowi dla zwierząt CSIR-IICB. G. D. dziękuje ICMR, J. K. i V. G. dziękują DST Inspire, a D. M. dziękuje DBT, Indie za ich stypendia. S. G. uprzejmie dziękuje SERB (EMR/2015/002230) India za udzielenie wsparcia finansowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Anti-GFAPAbcamAB7260
Anti-NestinAbcamAB92391
Anti-O4MilliporeMAB345
Anti-TauAbcamAB76128
Anti-Tuj1MilliporeMAB1637
B27 Suplement bez surowicy Gibco17504-044
Cell CounterLife technologieCountess II FL
EppendorfGalaxy 170 R
D-glukoza SDFCL38450-K05
EtanolMerck Millipore100983
Mikroskop fluorescencyjnyOlympusIX83 Model
FormaldehydSigma Aldrich47608
Suplement GlutaMax-IGibco35050-061
GtXMs IgG FluorMilliporeAP1814
GtXMs IgG (H + L)MilliporeAP124C
HEPESSRL16826
Hoechst 33258Calbiochem382061
Serum dla koni HiMediaRM10674
Kwas solnyRankemH0100
Kaptur laminarnyBioBaseBBS-V1800
MEM Eagle' s z Earle'em' s BSS Mikroskop Sigma AldrichM-2279
DewinterModel
Neurobasel Medium Gibco21103-049
Wyroby z tworzyw sztucznych (płytka 24-dołkowa, sitka do komórek i płytki o niskiej przyczepności)BD Falcon353047, 352350 i 3471
90 mm Szalki Petribase'aHimedia PW001
Penicylina/Streptomycyna Gibco15140-122
Poli-D-lizynaMiliporaA.003.E
Chlorek potasu Fisher ScientificBP366-500
Fosforan potasu jednozasadowy MerckMI6M562401
Chlorek sodu Qualigem15918
Fosforan sodu dwuzasadowy MerckMI6M562328
StereomicrosopeDewinterZoomstar Model
Triton-X 100SRL2020130
Roztwór błękitu trypanowegoGibco15250-061
0,25 % Trypsyna-EDTAGibco25200-072
Inkubator CO2 Victory

Bibliografia

  1. Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
  2. Masters, J. R. W. Cell line misidentification: the beginning of the end. Nature Reviews Cancer. 10 (6), 441-448 (2010).
  3. Banker, G. Culturing Nerve Cells, 2nd edition. , 339-370 (1998).
  4. Geschwind, D. H., Konopka, G. Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology. Nature. 461 (7266), 908-915 (2009).
  5. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1, 2406-2415 (2006).
  6. Lu, Z. M., Piechowicz, M., Qiu, S. F. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visual Experiments. 109, e53797(2016).
  7. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-Term Culture of Rat Hippocampal Neurons at Low Density in Serum-Free Medium: Combination of the Sandwich Culture Technique with the Three-Dimensional Nanofibrous Hydrogel PuraMatrix. PLoS ONE. 9 (7), e102703(2014).
  8. Banker, G. A. Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture. Science. 209 (4458), 809-810 (1980).
  9. Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
  10. Piret, G., Perez, M. T., Prinz, C. N. Support of Neuronal Growth Over Glial Growth and Guidance of Optic Nerve Axons by Vertical Nanowire Arrays. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (34), 18944-18948 (2015).
  11. Campos, L. S. Neurospheres: Insights biology into neural stem cell biology. Journal of Neuroscience Research. 78 (6), 761-769 (2004).
  12. Ahmed, S. The Culture of Neural Stem Cells. Journal of Cellular Biochemistry. 106, 1-6 (2009).
  13. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  14. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular Neurobiology. 34 (3), 153-161 (2006).
  15. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  16. Pradhan, K., et al. Neuro-Regenerative Choline-Functionalized Injectable Graphene Oxide Hydrogel Repairs Focal Brain Injury. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1535-1543 (2019).
  17. Ray, B., Bailey, J. A., Sarkar, S., Lahiri, D. K. Molecular and immunocytochemical characterization of primary neuronal cultures from adult rat brain: Differential expression of neuronal and glial protein markers. Journal of Neuroscience Methods. 184 (2), 294-302 (2009).
  18. Robinson, A. P., Rodgers, J. M., Goings, G. E., Miller, S. D. Characterization of Oligodendroglial Populations in Mouse Demyelinating Disease Using Flow Cytometry: Clues for MS Pathogenesis. PLoS ONE. 9 (9), (2014).
  19. Osterberg, N., Roussa, E. Characterization of primary neurospheres generated from mouse ventral rostral hindbrain. Cell and Tissue Research. 336 (1), 11-20 (2009).
  20. Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
  21. Qu, Q. H., et al. High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1. Nature Communications. 5, 3449(2014).
  22. Bradke, F., Dotti, C. G. Differentiated neurons retain the capacity to generate axons from dendrites. Current Biology. 10 (22), 1467-1470 (2000).
  23. Theocharatos, S., et al. Regulation of Progenitor Cell Proliferation and Neuronal Differentiation in Enteric Nervous System Neurospheres. PLoS ONE. 8 (1), (2013).
  24. Binder, E., et al. Enteric Neurospheres Are Not Specific to Neural Crest Cultures: Implications for Neural Stem Cell Therapies. PLoS ONE. 10 (3), e0119467(2015).
  25. Cordey, M., Limacher, M., Kobel, S., Taylor, V., Lutolf, M. P. Enhancing the Reliability and Throughput of Neurosphere Culture on Hydrogel Microwell Arrays. Stem Cells. 26 (10), 2586-2594 (2008).
  26. Ladiwala, U., Basu, H., Mathur, D. Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor/Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap. PLoS ONE. 7 (6), (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Generowanie neurosferpierwotna hodowla neuron wkorowe neurony hipokampag sto wysiewu kom rektrawienie trypsyn z EDTAocena ywotno ci b kitem trypanowymocena ywotno ci testem MTTcharakterystyka poprzez immunostainingj dra barwione Hoechst 33258
Generowanie neurosfer z mieszanych pierwotnych neuronów hipokampa i kory mózgowej wyizolowanych z zarodka szczura E14-E16 Sprague Dawley
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.