Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie białka o wysokiej masie cząsteczkowej w Streptococcus mutans

5.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59804

⸱

14 września 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Translational Research, Tsurumi University School of Dental Medicine, 2Laboratory for Oral Health Science

W tym artykule

Podsumowanie

Opisana tutaj jest prosta metoda oczyszczania produktu genowego u Streptococcus mutans. Technika ta może być korzystna w oczyszczaniu białek, zwłaszcza białek błonowych i białek o dużej masie cząsteczkowej, i może być stosowana z różnymi innymi gatunkami bakterii.

Streszczenie

Wyjaśnienie funkcji genu zazwyczaj polega na porównaniu cech fenotypowych szczepów typu dzikiego i szczepów, w których interesujący nas gen został zakłócony. Utrata funkcji w wyniku zakłócenia genu jest następnie przywracana przez egzogenne dodanie produktu zakłóconego genu. Pomaga to określić funkcję genu. Opisana wcześniej metoda polega na wytworzeniu szczepu Streptococcus mutans z zaburzeniami genu gtfC. W tym miejscu opisano niewymagającą metodę oczyszczania produktu genu gtfC z nowo wytworzonego szczepu S. mutans po rozerwaniu genu. Polega ona na dodaniu sekwencji kodującej polihistydynę na końcu 3′ genu będącego przedmiotem zainteresowania, co umożliwia proste oczyszczenie produktu genu za pomocą unieruchomionej chromatografii powinowactwa do metalu. Do modyfikacji genetycznej w tej metodzie nie są wymagane żadne reakcje enzymatyczne inne niż PCR. Odtworzenie produktu genu przez egzogenne dodanie po przerwaniu genu jest skuteczną metodą określania funkcji genów, które mogą być również dostosowane do różnych gatunków.

Wprowadzenie

Analiza funkcji genu zazwyczaj obejmuje porównanie cech fenotypowych szczepów dzikich ze szczepami, w których interesujący nas gen został zaburzony. Po wyprodukowaniu szczepu z zaburzonym genem, egzogenne dodanie produktu genu umożliwia przywrócenie funkcjonalności.

Najczęstszą metodą uzyskiwania oczyszczonych produktów genowych wymaganych do późniejszych testów odtwórczych jest przeprowadzenie ekspresji heterologicznej w Escherichia coli1. Jednak ekspresja białek błonowych lub białek o dużej masie cząsteczkowej jest często trudna przy użyciu tego systemu1. W takich przypadkach białko docelowe jest zwykle izolowane z komórek, które natywnie syntetyzują białko w złożonej serii etapów, co może prowadzić do utraty produktu genu. Aby przezwyciężyć te problemy, opracowano prostą procedurę oczyszczania produktu genowego za pomocą metody rozerwania genów2, metody splicingu DNA opartej na PCR3 (wyznaczona dwuetapowa fuzja PCR) oraz elektroporacji do transformacji genetycznej u Streptococcus mutans. Dodanie znacznika polihistydynowego (znacznika His) do C-końca produktu genu ułatwia jego oczyszczanie za pomocą chromatografii powinowactwa do unieruchomionych metali (IMAC).

Aby wyizolować szczep wykazujący ekspresję His-tag, całe genomowe DNA interesującego nas genu (w tym szczepie z zaburzonym genem ekspresji His-taga) jest zastępowane genem markerowym opornym na antybiotyki. Procedura generowania szczepu wykazującego ekspresję His-tag jest prawie identyczna z procedurą generowania szczepu z zaburzonym genem, jak opisano wcześniej4,5. W związku z tym metody rozrywania genów i izolacji produktów genowych powinny być przeprowadzane jako eksperymenty seryjne do celów analizy funkcjonalnej.

W niniejszej pracy, sekwencja kodująca polihistydynę jest dołączona do końca 3′ genu gtfC (GenBank locus tag SMU_1005), kodując glukozylotransferazę-SI (GTF-SI) w S. mutans6. Następnie przeprowadzono badania ekspresji u gatunków paciorkowców. Osiągnięcie heterologicznej ekspresji gtfC przez E. coli jest trudne, prawdopodobnie ze względu na dużą masę cząsteczkową GTF-SI. Szczep ten nosi nazwę S. mutans His-gtfC. Schematyczna ilustracja przedstawiająca organizację kasety genu oporności na gtfC i spektynomycynę (spcr)7 loci u S. mutans typu dzikiego (S. mutans WT) i jego pochodnych jest pokazana w Rysunek 1. GTF-SI jest białkiem wydzielniczym, które przyczynia się do rozwoju próchnicotwórczego biofilmu zębowego6. W obecności sacharozy obserwuje się przylegający biofilm na gładkiej powierzchni szkła w szczepie WT S. mutans, ale nie w szczepie S. mutans zakłóconym przez gtfC (S. mutans ΔgtfC)2,5. Tworzenie biofilmu zostaje przywrócone w S. mutans ΔgtfC po egzogennym dodaniu rekombinowanego GTF-SI. Szczep, S. mutans His-gtfC, jest następnie wykorzystywany do produkcji rekombinowanego GTF-SI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Generacja S. mutans ∆gtfC, w której cały region kodujący genu gtfC jest zastąpiony przez spcr, musi zostać zakończona przed wykonaniem tych protokołów. Zapoznaj się z opublikowanym artykułem, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat generation5.

1. Projekt podkładu

  1. Przygotuj podkłady pod budowę S. mutans His-gtfC.
    nuta: Sekwencje starterów stosowane w tym protokole przedstawiono w Tabeli 1. Dwuetapowa metoda fusion PCR do generowania S. mutans His-gtfC jest schematycznie zilustrowana w Rysunek 2.
    1. Zaprojektuj startery (gtfC-reverse i spcr-forward) do przyłączania sekwencji kodującej His-tag, interweniując między genem gtfC a spcr (Rysunek 2A).
      1. Dołącz łącznik GS i sekwencję kodowania His-tag do starterów gtfC-reverse i spc r-forward, w których 24 zasady w regionach 5' są względem siebie komplementarne.
        UWAGA: Sekwencja aminokwasowa łącznika GS i znacznika Hisa (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His) jest przyłączona do C-końca GTF-SI poprzez translację genów.
      2. Zaprojektuj starter gtfC-forward do przodu, aby celować w gen gtfC w genomie S. mutans WT >1 kb za genem, a starter spc r-reverse do celowania w dalszy region flankujący spcr w S. mutans ∆gtfC. Ustaw temperaturę topnienia8 (Tm) starterów gtfC-forward i spc r-reverse tak, aby odpowiadały temperaturom topnienia odpowiednio starterów gtfC-reverse i spcr-forward.
    2. Zaprojektuj zagnieżdżone startery (zagnieżdżone do przodu i zagnieżdżone-odwrotne) dla drugiego PCR (Rysunek 2B).
    3. Zaprojektuj startery (gtfC-forward i colony-reverse) specyficzne dla genomowego DNA transformantu (Rysunek 2C; startery są używane do PCR kolonii).
      nuta: Amplikony znajdują się na granicy między gtfC i spcr. Podkład gtfC-forward może być stosowany jako podkład do przodu.
    4. Zaprojektuj startery (góra-przód i dół-tył) w celu ostatecznego potwierdzenia generacji S. mutans His-gtfC (Rysunek 2C; produkt PCR amplifikowany przez startery jest używany do sekwencjonowania DNA).

2. Ekstrakcja genomowego DNA z S. mutans

UWAGA: Każdy szczep S. mutans powinien być hodowany w pożywce do infuzji serca mózgu (BHI) w temperaturze 37 °C w warunkach beztlenowych. Zmutowane szczepy S. mutans ∆gtfC i S. mutans His-gtfC są hodowane w BHI uzupełnionym 100 μg/ml spektynomycyny.

  1. Smugi S. mutans WT i S. mutans ∆gtfC oddzielnie na każdej z płytek agarowych BHI. Inkubować je przez noc w temperaturze 37 °C.
  2. Zbierz pojedyncze kolonie S. mutans WT lub S. mutans ∆gtfC za pomocą wysterylizowanej wykałaczki i zaszczepij w 1,5 ml bulionu BHI. Inkubować je przez noc w temperaturze 37 °C.
    nuta: Kolonie mogą być wykorzystane jako źródło matrycowego DNA do pierwszego PCR (krok 3.1).
  3. Przenieś 1 ml każdej kultury bakteryjnej do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odwirować kulturę przez 1 minutę przy 15 000 x g.
  4. Usunąć supernatant i dodać 1 ml buforu Tris-EDTA (pH 8,0) w celu ponownego zawieszenia osadu komórkowego.
  5. Odwirowywać zawiesinę przez 1 minutę przy 15 000 x g. Usunąć supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 50 μl buforu Tris-EDTA (pH 8,0).
  6. Podgrzewać zawiesinę za pomocą inkubatora blokowego przez 5 minut w temperaturze 95 °C. Odwirowywać zawiesinę przez 5 minut przy 15 000 x g.
  7. Przenieść supernatant do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml (supernatant posłuży jako matryca DNA do pierwszego PCR).

3. Amplifikacja PCR

UWAGA: Tabela 1, Tabela 2 i Tabela 3 podsumowują odpowiednio startery, odczynniki i cykle amplifikacji PCR.

  1. Wykonaj pierwszy PCR, używając genomu S. mutans WT i S. mutans ∆gtfC jako matryc PCR. Amplifikuj regiony, w których znajduje się dolna część genu gtfC i te, w których występuje spcr, za pomocą starterów opisanych w kroku 1.1.1.2 (Rysunek 2A).
  2. Elektroforeza każdy produkt PCR na 1% żelu agarozowym. Wytnij pożądane fragmenty DNA o wielkości około 1000 pz i 2000 pz. Oczyść fragmenty z żeli za pomocą metody ekstrakcji żelem na bazie membrany krzemionkowej.
    nuta: Podstawowe procedury dla PCR9, elektroforezy w żelu DNA10 i oczyszczania DNA11 są szczegółowo opisane w innym miejscu.
  3. Wykonaj drugi PCR, używając produktów pierwszego PCR (w przybliżeniu równomolowego) jako matryc PCR z zagnieżdżonymi starterami do przodu i zagnieżdżonym-odwrotnym (Rysunek 2B).
  4. Elektroforeza jedna dziesiąta mieszaniny PCR na żelu agarozowym. Potwierdź wygenerowanie odpowiedniego amplikonu o wartości około 3 000 pz.
  5. Wytrącić pozostały produkt PCR.
    UWAGA:     Oczyszczanie produktu PCR nie jest konieczne, ponieważ niespecyficzne amplikony generowane przez drugi PCR nie zakłócają rekombinacji homologicznej.
    1. Dodać wodę wolną od nukleaz do mieszaniny PCR i doprowadzić całkowitą objętość do 100 μl, a następnie 0,1 objętości (10 μl) 3 M octanu sodu (pH 5,2) i 2,5 objętości (250 μl) absolutnego alkoholu etylowego. Wymieszaj i przechowuj mieszaninę przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    2. Odwirować próbkę przez 20 minut przy sile 15 000 x g w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Dodaj 1 ml 70% etanolu, aby przepłukać osad DNA.
    3. Odwirować próbkę przez 5 minut w temperaturze 15 000 x g w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Wysuszyć na powietrzu i rozpuścić osad DNA w 10 μl wody wolnej od nukleaz
      4. .

4. Transformacja komórek

  1. Przygotuj kompetentną bakterię S. mutans WT do wprowadzenia drugiego produktu PCR, postępując zgodnie z krokami opisanymi w poprzedniej publikacji5. Przechowywać ogniwa w temperaturze -80 °C.
    nuta: Na potrzeby tego eksperymentu kompetentne komórki WT S. mutans zostały już zakonserwowane w temperaturze -80 °C, aby wytworzyć S. mutans ∆gtfC.
  2. Zmieszać 5 μl skoncentrowanego drugiego produktu PCR z 50 μl podwielokrotności lodowato zimnych kompetentnych komórek zamrożonych wcześniej. Dodać mieszaninę do kuwet do elektroporacji. Podać pojedynczy impuls elektryczny (1,8 kV, 2,5 ms, 600 Ω, 10 μF) do ogniw za pomocą aparatu do elektroporacji.
  3. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl bulionu BHI. Natychmiast rozprowadzić 10–100 μl zawiesiny na płytkach agarowych BHI zawierających spektynomycynę. Inkubować płytki przez 2–6 dni w temperaturze 37 °C, aż kolonie urosną na tyle, aby można je było zebrać.

5. Weryfikacja Rekombinacji i Przechowywania Genomu

  1. Wykonaj colony PCR, używając starterów gtfC-forward i colony-reverse do badań przesiewowych pod kątem rekombinacji. Elektroforezę każdego produktu PCR kolonii na żelu agarozowym. Potwierdź fragment DNA o długości około 1500 pz.
  2. Wybierz jedną z pozytywnych kolonii za pomocą wysterylizowanej wykałaczki i zahoduj komórki przez noc w 2 ml bulionu BHI zawierającego spektynomycynę.
  3. Wymieszać 0,8 ml kultury bakteryjnej z 0,8 ml sterylnego 50% glicerolu i wyrobić w temperaturze -80 °C lub -20 °C.
  4. Przenieść pozostały 1 ml zawiesiny komórkowej do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Powtórz kroki 2.3–2.7, aby wyodrębnić genomowe DNA z komórek.
  5. Wykonaj PCR przy użyciu starterów góra-przód i dół-tył oraz genomowego DNA jako matrycy. Powtórz krok 3.2, aby oczyścić amplifikowany produkt DNA z żeli.
  6. Określić sekwencję DNA oczyszczonego amplikonu przez sekwencjonowanie DNA.
    nuta: Upewnij się, że potwierdziłeś generowanie S. mutans His-gtfC przez sekwencjonowanie DNA.

6. Oczyszczanie GTF-SI oznaczonego polihistydyną

  1. Smugi S. mutans His-gtfC na płytce agarowej BHI zawierającej spektynomycynę. Inkubować je przez noc w temperaturze 37 °C.
  2. Zbierz pojedynczą kolonię za pomocą wysterylizowanej wykałaczki i komórek subkultury w 3 ml bulionu BHI. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  3. Przygotować dwie kolby stożkowe z 1 litrem bulionu BHI bez spektynomycyny. Zaszczepić 1 ml zawiesiny do hodowli na noc w 1 litrze bulionu BHI. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  4. Koncentrat białkowy z supernatantu kultury przez wytrącanie siarczanu amonu.
    UWAGA:     Ekstrakt z ciał komórkowych, jeśli białko docelowe jest wewnątrzkomórkowe. Podstawowe procedury wytrącania siarczanu amonu są szczegółowo opisane w innym miejscu12.
    1. Odwirować zawiesinę kultur bakteryjnych przez 20 minut przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C. Odzyskać supernatant z hodowli do szklanej zlewki o pojemności 3 l.
    2. Dodać 1,122 g siarczanu amonu do 2 l supernatantu (80% nasycenia), energicznie mieszając za pomocą mieszadła magnetycznego. Pozostawić osad do uformowania się przez 4 godziny lub dłużej w temperaturze 4 °C, mieszając.
      UWAGA: Tworzenie osadu można kontynuować przez noc.
    3. Odwirować roztwór wytrącony siarczanem amonu o stężeniu 15 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant.
    4. Zebrać osad szpatułką i przenieść do szklanej zlewki o pojemności 200 ml. Zawiesić osady w 35 ml buforu wiążącego (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 5 mM imidazolu, pH 8,0).
    5. Zawiesinę należy dializować w stosunku do 2 500 ml buforu wiążącego za pomocą rurki do dializy z regenerowanej celulozy, w temperaturze 4 °C, mieszając. Po 2 godzinach należy wymienić roztwór do dializy i kontynuować dializę przez noc.
    6. Ponownie wymienić roztwór dializacyjny. Kontynuuj dializę przez dodatkowe 2 godziny.
  5. Odwirować dializowaną zawiesinę o stężeniu 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przefiltrować supernatant przez filtr membranowy za pomocą sprzętu do filtracji ssącej. Przenieść filtrat do kolby o średnicy75 cm2.
  6. Frakcjonować GTF-SI znakowany polihistydyną z przefiltrowanej zawiesiny metodą chromatografii powinowactwa do unieruchomionych metali (IMAC).
    1. Przenieść 2 ml zawiesiny żywicy IMAC z ładunkiem niklu (około 1 ml żywicy) do kolumny chromatograficznej, której wylot jest podłączony do rurki silikonowej. Usunąć roztwór do przechowywania za pomocą przepływu grawitacyjnego.
      ostrożność: Nie pozwól, aby żywica wyschła w całym IMAC.
    2. Dodaj 3 ml wody destylowanej do kolumny, aby przepłukać żywicę. Dodać 5 ml buforu wiążącego, aby zrównoważyć żywicę.
    3. Odciąć przepływ za pomocą kurka szczypcowego Hoffmanna. Dodać 5 ml przefiltrowanej zawiesiny z kroku 6.5, aby uzyskać zawiesinę.
    4. Dodać całą gnojowicę do pozostałej przefiltrowanej zawiesiny. Delikatnie mieszać mieszaninę przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Załaduj mieszaninę z powrotem na kolumnę. Usunąć zawiesinę za pomocą przepływu grawitacyjnego. Przemyć żywicę IMAC 20 ml buforu wiążącego.
      nuta: Dostosuj natężenie przepływu do około 2 ml/min za pomocą kurka zaciskowego Hoffmann przez cały kolejny IMAC.
    6. Eluować rekombinowany GTF-SI za pomocą 20 ml buforu elucyjnego (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 500 mM imidazolu, pH 8,0).
      nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Eluat należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Żywica IMAC może być ponownie użyta. Zapoznaj się z instrukcją żywicy IMAC.
  7. Zastąp bufor elucyjny buforem magazynującym (50 mM bufor fosforanowy, pH 6,5) i zagęścić rekombinowany roztwór GTF-SI do około 1 ml za pomocą odśrodkowego urządzenia do ultrafiltracji. Przechowywać rekombinowany roztwór GTF-SI w temperaturze 4 °C.
    nuta: Potwierdź oczyszczenie GTF-SI znakowane polihistydyną za pomocą SDS-PAGE13 i western blotting14, stosując przeciwciało monoklonalne anty-polihistydyny sprzężone z peroksydazą chrzanową. Dodanie CHAPS (stężenie końcowe, 0,1%) do eluentu może być wymagane w celu uniknięcia niespecyficznej adsorpcji na jednostce, w zależności od białka docelowego.

7. Przywrócenie funkcjonalności za pomocą rekombinowanego GTF-SI

  1. Umieść każdy szczep S. mutanna płytce agarowej BHI indywidualnie. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
  2. Za pomocą wysterylizowanej wykałaczki zbierz pojedynczą kolonię, aby zaszczepić ją w 2 ml bulionu BHI. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  3. Użyj 20 μl nocnej kultury S. mutans ∆gtfC, aby zaszczepić 2 ml bulionu BHI zawierającego 1% sacharozy bez antybiotyków w szklanej probówce. Dodać GTF-SI lub równoważną objętość nośnika do hodowli S. mutans ∆gtfC i wyhodować komórki z probówką umieszczoną w pozycji pochylonej przez noc.
    nuta: Wysterylizuj roztwór GTF-SI sterylnym filtrem strzykawkowym i oznacz stężenie białka za pomocą testu białkowego kwasu bicinchoninowego 15 przed użyciem.
  4. Mieszać zawiesiny kultur za pomocą mieszalnika wirowego przez 10 s. Zdekantować zawiesiny. Umyj probówki odpowiednią ilością wody destylowanej.
  5. Zabarwić biofilmy na ściance probówki 1 ml 0,25% błękitu brylantowego Coomassie (CBB).
  6. Zdekantować roztwór barwiący po 1 minutach. Umyj probówki odpowiednią ilością wody destylowanej. Wysuszyć probówki na powietrzu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rycina 3 przedstawia wielkość każdego amplikonu z pierwszej reakcji PCR (Rycina 3A) oraz drugiej reakcji PCR (Rycina 3B). Wielkość każdego amplikonu była zgodna z przewidywaną wielkością opisaną w Tabeli 1. Rycina 4A przedstawia kolonie S. mutans przekształcone produktem drugiej reakcji PCR i wysiane na płytki z agarem BHI zawierającym spektynom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Projektowanie starterów jest najważniejszym krokiem w protokole. Sekwencje starterów gtfC-reverse i spc r-forward zostały automatycznie określone na podstawie sekwencji zarówno regionu końcowego 3′ gtfC, jak i regionu końcowego 5′ spcr. Każdy starter zawiera 24 komplementarne zasady, które kodują łącznik GS i sekwencję kodującą His-tag w swoich 5' regionach. Zakłócenia natywnych sekwencji regulatorowych zlokalizowanych w górnych regionach flankujących można unikną...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) (granty o numerach 16K15860 i 19K10471 dla T. M., 17K12032 dla M. I., i 18K09926 dla N. H.) oraz Fundację Nauki i Technologii SECOM (SECOM) (numer grantu 2018.09.10 nr 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgaroseNippon GeneticsNE-AG02Do elektroforezy w żelu agarozowym
AnaeropackMitsubishi Gas ChemicalA-03System hodowli beztlenowej
Przeciwciało monoklonalne Anti-His-TagMBLD291-7sprzężonych z HRP
Thermo Fisher Scientific23227Pomiar stężenia białka
Rosół do infuzji serca mózguBecton, Dickinson237500Pożywka do hodowli bakterii
CBB R-250Wako031-17922Do barwienia biofilmu
Ultrafiltracyjne urządzenie odśrodkoweSartoriusVS2032Wymiana buforu i zagęszczenie białka
WirówkaKubota7780II
Kolumna chromatograficznaBio-Rad7321010Do
zacisku membranowego do dializyMarka Fisher21-153-100
Rurki do dializyAs One2-316-06
Polimeraza DNATakaraR045ASekwencjonowanie DNA polimerazy DNA o wysokiej wierności
Eurofins Genomics
Substrat ECLBio-Rad170-5060Do western blotting
EDTA (0,5 M, pH 8,0)Wako311-90075Przygotowanie buforu Tris-EDTA
Kuweta do elektroporacjiBio-Rad1652086odstęp 0,2 cm
ElektroporatorBio-Rad1652100
Roztwór EtBrNippon Gene315-90051Do elektroforezy żelu agarozowego
Przecinak do taśmżelowych Nippon GeneticsFG-830
Gel zestaw do ekstrakcjiNippon GeneticsFG-91202Ekstrakcja DNA z żelu agarozowego
ImagerGE Healthcare29083461Dla SDS-PAGE i western blot
ImidazolWako095-00015Bufor wiążący i preparat buforu elucyjnego
InkubatorNippon Medical & Instrumenty chemiczneEZ-022Ustawienie temperatury: 4 & stopnie; C
InkubatorNippon Medical & Instrumenty chemiczneLH-100-RDSUstawienie temperatury: 37 ° C
Filtr membranowyMerck MilliporeJGWP047000,2 & mikro; m średnica
MikrowirówkaKubota3740
NaClWako191-01665Przygotowanie buforu wiążącego i buforu elucyjnego
NaH2PO4· 2H2OWako192-02815Przygotowanie buforu wiążącego i buforu elucyjnego
NaOHWako198-13765Przygotowanie buforu wiążącego i buforu elucyjnego
(NH4)2SO4Wako015-06737Wytrącanie siarczanu amonu Żywica
naładowana niklemBio-Rad1560133Dla IMAC
Startery PCREurofins Genomics Zamówionyzamówienie
standard białkowyBio-Rad161-0381Do SDS-PAGE i western blotting
Aparat do filtracji rozpuszczalnikowejJako jedenFH-1G
SpectinomycinWako195-11531Antybiotyki; stosować przy 100 μ g/ml
Sterylny filtr strzykawkowyMerckmilliporeSLGV004SL0,22 i mikro; m średnica
Streptococus mutans Δ gtfCSzczep magazynowy w laboratorium.gtfC zastąpiony przez spcr
>Streptococus mutans UA159Szczep podstawowy w laboratorium.S. mutans ATCC 700610, Szczep typu dzikiego
SacharozaWako196-00015Do rozwoju biofilmu
TAE (50 i razy; )Nippon Gene313-90035Do elektroforezy w żelu agarozowym
TermocyklerBio-RadPTC-200
Tris-HCl (1 M, pH 8,0)Wako314-90065Preparat buforowy Tris-EDTA
Zestaw do oznaczania białek BCA IMAC na

Bibliografia

  1. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
  2. Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product. Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).
  3. Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
  4. Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101(2016).
  5. Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
  6. Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).
  7. LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).
  8. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
  9. Database, J. S. E. PCR: The Polymerase Chain Reaction. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  10. Database, J. S. E. DNA Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  11. Database, J. S. E. Gel Purification. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  12. Wingfield, P. T. Protein precipitation using ammonium sulfate. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
  13. Database, J. S. E. Separating Protein with SDS-PAGE. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  14. Database, J. S. E. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  15. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  16. Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).
  17. Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
  18. Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zak cenie genuoczyszczanie bia ekchromatografia powinowactwa do zimmobilizowanych jon w metaliwytr canie siarczanem amonuSDS PAGEWestern blotelektroporacjawycinanie z eluamplifikacja PCR
Oczyszczanie białka o wysokiej masie cząsteczkowej w Streptococcus mutans
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.