Interakcje białko-białko (IPP) mają fundamentalne znaczenie dla generowania efektów biologicznych. Wiele z nich jest ściśle związanych z chorobą i coraz częściej uznaje się, że stanowią one ważne cele dla działania leków1. Dostępnych jest wiele technik badania tych oddziaływań białkowych, z których niektóre są omówione w tym zbiorze lub w innych artykułach JoVE. Każda technika ma swoje zalety i ograniczenia2; jednak nie ma jednej idealnej techniki dla wszystkich IPP ze względu na ogromną różnorodność tych interakcji, które zachodzą w różnych przedziałach subkomórkowych, o szerokim zakresie powinowactwa (pikomolarny do milimolowego) i mogą mieć charakter tylko przejściowy.
Testy kinaz in vitro są pośrednim podejściem do badania IPP, które można wykorzystać do analizy, w jaki sposób kinazy pełnią swoją funkcjonalną rolę przenoszenia grupy fosforanowej z ATP do substratu. Cui i wsp.3 wykorzystują tę technikę, w połączeniu z trawieniem tryptycznym i spektrometrią mas, do identyfikacji miejsc fosforylacji specyficznych dla kinazy 1 zależnej od cykliny na fragmencie ludzkiego białka centromerowego F (CENP-F). Do funkcjonalnej weryfikacji nowych miejsc fosforylacji autorzy stosują test wiązania, łączący CENP-F zawierający mutację fosfomimetyczną i α karioferyny, receptor transportu jądrowego, zapewniając w ten sposób walidację krzyżową.
Koimmunoprecypitacja jest szeroko stosowaną metodą badania IPP, w której przeciwciało jest wykorzystywane do wychwytywania określonego celu wraz z innymi cząsteczkami białka, które są z nim związane. Zheng i współpracownicy4 stosują tę technikę do badania czynników indukowanych hipoksją (HIF), które działają jako heterodimery złożone z podjednostki α regulowanej tlenem i konstytutywnie wyrażonej podjednostki β, znanej również jako ARNT3. Interesującą informacją na temat ich protokołu jest to, że komórki są indukowane i zbierane w warunkach niedotlenienia, a endogenne białka z frakcji jądrowych są następnie koimmunoprecypitowane. Jak zauważają autorzy, jednym z ograniczeń tej metody jest to, że nie jest ona w stanie określić, czy IPP są bezpośrednie, czy pośrednie.
Nolan i wsp.5 przedstawiają protokół pomiaru liczby cząsteczek i ich jasności w obrazach z mikroskopii fluorescencyjnej "Liczba i jasność" (N&B), który można zastosować do wykrywania homooligomeryzacji białek. Technika ta może być stosowana zarówno in vitro, jak i in vivo i została zastosowana do dokładnego ilościowego określenia stanu oligomerycznego FKBP12F36V znakowanych mVenus przed i po dodaniu leku dimeryzującego. Autorzy omawiają zalety tej techniki w porównaniu z pokrewnymi technologiami i podkreślają znaczenie korekcji bielenia i długotrwałych wahań intensywności. Mikroskopy konfokalne wyposażone w detektory cyfrowe ułatwiają oznaczanie ilościowe, ale N&B jest również możliwe w przypadku detektorów analogowych.
Oczyszczanie powinowactwa kompleksów wielobiałkowych, wraz z identyfikacją ich składników, jest szeroko stosowaną techniką zrozumienia funkcji takich skompleksowanych białek. W protokole Luzarowskiego i wsp.6 technika ta idzie o krok dalej poprzez jednoczesne scharakteryzowanie zarówno IPP, jak i interakcji białko-metabolit (PMI) w transgenicznych komórkach roślinnych Arabidopsis. Tagged Kinazy difosforanowe nukleozydowe są oczyszczane pod względem powinowactwa za pomocą procedury znacznika oczyszczania tandemowego (TAP), a wychwycone białka i małe cząsteczki są następnie identyfikowane za pomocą spektrometrii mas. Wyjątkowość tego protokołu polega na możliwości identyfikacji zarówno ligandów hydrofobowych, jak i hydrofilowych; Jest to protokół ekstrakcji "trzy w jednym", który umożliwia badanie zarówno IPP, jak i PMI oraz stosuje oczyszczanie powinowactwa do sadzenia komórek.
Test ligacji zbliżeniowej ma tę zaletę, że służy do wykrywania interakcji między endogennymi białkami w komórkach i tkankach. Karchugina i Chernoff7 wykorzystują tę technikę do wykazania obecności heterodimerów kinaz MST1 i MST2 w ludzkich komórkach Schwanna (HSC) i ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych (HEK-293). Ich artykuł zawiera kilka cennych wskazówek, jak skutecznie wykonać tę technikę. Wymagane są odpowiednie przeciwciała pierwszorzędowe wyhodowane u różnych gatunków przeciwko każdemu białku oddziałującemu, a ponieważ swoistość i czułość przeciwciał są kluczowe, stężenia przeciwciał powinny być precyzyjnie dostrojone. Autorzy stwierdzili, że szkiełka ze szklaną komorą są wygodne do analizy wielu linii komórkowych i kombinacji przeciwciał, ale zauważyli, że konieczne jest usunięcie całej silikonowej wkładki między studzienkami, aby uniknąć różnic w odległości konfokalnej podczas mikroskopii. Ponadto do walidacji wyników stosuje się różne kontrole dodatnie i ujemne.
Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) jest czułym testem, który można wykorzystać do zapewnienia rozdzielczości na poziomie atomowym i informacji ilościowych na temat interakcji białek i interakcji białko-ligand. Winkelaar i współpracownicywykorzystują tę technikę do badania interakcji dwóch białek (wimentyny i envoplakiny) znajdujących się w desmosomach, strukturach komórkowych zaangażowanych w adhezję komórka-komórka, które zwykle znajdują się w tkankach doświadczających intensywnego obciążenia mechanicznego. Autorzy wykorzystują 15-znakowanąN domenę wimentyny i uzyskują widmo 2D za pomocą heterojądrowej pojedynczej korelacji kwantowej (HSQC). W obecności domeny z envoplakiny obserwuje się rozległe poszerzenie linii i zanik pików, co jest zgodne z interakcją białkową. Autorzy dalej badają podstawy oddziaływania, wykorzystując mutagenezę i termoforezę w mikroskali (MST) w celu uzyskania informacji ilościowych.
Rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małymi kątami (SAXS) to technika, którą można wykorzystać do dostarczenia informacji o wielkości i konformacjach makrocząsteczki w roztworze oraz wygenerowania molekularnej otoczki dużych, wielodomenowych lub kompleksów białkowych w niskiej rozdzielczości. W protokole Mrozowicha i wsp.9 technika ta służy do generowania niskorozdzielczej struktury nidogenu-1 i lamininy γ-1 w kompleksie. Technika ta może być interesująca dla naukowców badających IPP w dużych białkach z wieloma domenami globularnymi, które są zbyt duże dla spektroskopii NMR i są trudne do krystalizacji dla krystalografii rentgenowskiej.
Szacuje się, że w interaktomii międzyludzkimzachodzi około 650 000 interakcji – wystarczająco dużo, aby naukowcy zajmujący się tą dziedziną mieli zajęcie jeszcze przez jakiś czas. Niedawnym osiągnięciem, które stało się możliwe dzięki postępom w mikroskopii, spektrometrii mas i uczeniu maszynowym, jest proteomika przestrzenna, która może dostarczyć w przyszłości cennych informacji w tejdziedzinie11. Ten zbiór metod PPI pomoże naukowcom stawić czoła temu ważnemu wyzwaniu, unikając jednocześnie potencjalnych pułapek.