Artykuł metodologiczny

Izolacja komórek jednojądrzastych blaszki właściwej z mysiej okrężnicy przy użyciu kolagenazy E

DOI:

10.3791/59821

⸱

26 września 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Hematology / Oncology and Bone Marrow Transplantation, University of Miami Miller School of Medicine, 2Batchelor Children's Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 3Department of Microbiology & Immunology, University of Miami Miller School of Medicine, 4Sylvester Comprehensive Cancer Center, University of Miami Miller School of Medicine, 5Holtz Children's Hospital, University of Miami Miller School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek jednojądrzastych, które znajdują się w blaszce właściwej jelita grubego, poprzez enzymatyczne trawienie tkanki za pomocą kolagenazy. Protokół ten pozwala na efektywną izolację komórek jednojądrzastych, w wyniku której powstaje zawiesina pojedynczej komórki, która z kolei może być wykorzystana do solidnego immunofenotypowania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jelito jest domem dla największej liczby komórek odpornościowych w organizmie. Układ odpornościowy jelita cienkiego i grubego kontroluje ekspozycję na antygeny egzogenne i moduluje odpowiedzi na silne bodźce immunologiczne pochodzenia mikrobiologicznego. Z tego powodu jelito jest głównym miejscem docelowym rozregulowania układu odpornościowego i stanu zapalnego w wielu chorobach, w tym między innymi w chorobach zapalnych jelit, takich jak choroba Leśniowskiego-Crohna i wrzodziejące zapalenie jelita grubego, choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD) po przeszczepie szpiku kostnego (BMT) oraz wiele stanów alergicznych i zakaźnych. Mysie modele zapalenia przewodu pokarmowego i zapalenia jelita grubego są intensywnie wykorzystywane do badania powikłań przewodu pokarmowego oraz do przedklinicznej optymalizacji strategii zapobiegania i leczenia. Dane zebrane z tych modeli poprzez izolację i analizę fenotypową komórek odpornościowych z jelita mają kluczowe znaczenie dla dalszego zrozumienia układu odpornościowego, które można zastosować do poprawy zaburzeń zapalnych przewodu pokarmowego i układowego. W niniejszym raporcie opisano wysoce skuteczny protokół izolacji komórek jednojądrzastych (MNC) z jelita grubego przy użyciu mieszanego gradientu gęstości opartego na krzemionce. Metoda ta w powtarzalny sposób izoluje znaczną liczbę żywotnych leukocytów, jednocześnie minimalizując zanieczyszczenia zanieczyszczeń, umożliwiając późniejsze fenotypowanie immunologiczne za pomocą cytometrii przepływowej lub innych metod.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż przewód pokarmowy (GI) jest głównie przeznaczony do przetwarzania i reabsorpcji składników odżywczych z pożywienia, przewód pokarmowy pełni również kluczową rolę w integralności układu naczyniowego, limfatycznego, nerwowego i wielu innych narządów poprzez swój śluzówkowy i podśluzówkowy układ odpornościowy1. Układ odpornościowy przewodu pokarmowego odgrywa wpływową rolę zarówno w zdrowiu przewodu pokarmowego, jak i ogólnoustrojowego ze względu na ciągłą ekspozycję na obce antygeny z żywności, bakterie komensalne lub atakujące patogeny1,2. W związku z tym układ odpornościowy przewodu pokarmowego musi utrzymywać delikatną równowagę, w której toleruje antygeny niepatogenne, jednocześnie odpowiednio reagując na antygeny chorobotwórcze1,2. Kiedy równowaga tolerancji i obrony zostaje zakłócona, może dojść do miejscowej lub ogólnoustrojowej dysregulacji immunologicznej i stanu zapalnego, co skutkuje niezliczonymi chorobami1,2,3.

W jelicie znajduje się co najmniej 70% wszystkich komórek limfoidalnych w ciele4. Większość pierwotnych interakcji immunologicznych obejmuje co najmniej jedną z trzech stacji immunologicznych w jelicie: 1) łatki Peyera, 2) limfocyty śródnabłonkowe (IEL) i 3) limfocyty blaszki właściwej (LPL). Każdy z nich składa się ze złożonej, połączonej ze sobą sieci komórek odpornościowych, które szybko reagują na normalne wyzwania immunologiczne w gut5. Ograniczona do zrębu powyżej muscularis mucosae, blaszka właściwa o luźnej strukturze jest tkanką łączną błony śluzowej jelit i obejmuje rusztowanie dla kosmków, naczyń krwionośnych, drenażu limfatycznego i błony śluzowej układu nerwowego, a także wiele wrodzonych i adaptacyjnych podzbiorów immunologicznych6,7,8,9. LPL składają się z limfocytów T CD4 + i CD8 + w przybliżonym stosunku 2:1, komórek plazmatycznych i komórek linii szpikowej, w tym komórek dendrytycznych, komórek tucznych, eozynofili i makrofagów6.

Rośnie zainteresowanie zrozumieniem dysregulacji immunologicznej i stanu zapalnego jelit w odniesieniu do różnych stanów chorobowych. Takie schorzenia, jak choroba Leśniowskiego-Crohna i wrzodziejące zapalenie jelita grubego, objawiają się różnym stopniem zapalenia jelita grubego10,11,12. Ponadto u pacjentów ze złośliwymi lub niezłośliwymi zaburzeniami szpiku kostnego lub układu odpornościowego, którzy przechodzą allogeniczny przeszczep szpiku kostnego (allo-BMT), mogą rozwinąć się różne formy zapalenia jelita grubego, w tym 1) bezpośrednia toksyczność wynikająca ze schematów kondycjonowania przed BMT, 2) infekcje spowodowane immunosupresją po BMT i 3) choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD) wywołana przez limfocyty T typu dawcy reagujące na alloantygeny dawcy w tkankach po BMT13, 14,15. Wszystkie te powikłania po BMT skutkują znaczącymi zmianami w środowisku immunologicznym jelit16,17,18. Proponowana metoda pozwala na wiarygodną ocenę akumulacji komórek odpornościowych w okrężnicy myszy, a po zastosowaniu u mysich biorców po BMT ułatwia skuteczne oznaczanie komórek odpornościowych zarówno dawcy, jak i biorcy zaangażowanych w tolerancję przeszczepu19,20. Dodatkowe przyczyny zapalenia jelit to nowotwory złośliwe, alergie pokarmowe lub zaburzenia mikrobiomu jelitowego. Protokół ten umożliwia dostęp do jednojądrzastych komórek jelitowych z okrężnicy oraz, z modyfikacjami, do leukocytów jelita cienkiego w każdym z tych przedklinicznych modeli mysich.

Wyszukiwanie w PubMed przy użyciu terminów "jelito ORAZ komórka odpornościowa ORAZ izolacja" ujawnia ponad 200 publikacji opisujących metody trawienia jelita cienkiego w celu ekstrakcji komórek odpornościowych. Jednak podobne poszukiwania w literaturze dotyczącej jelita grubego nie przyniosły dobrze nakreślonych protokołów określających izolację komórek odpornościowych z okrężnicy. Może to być spowodowane tym, że okrężnica ma więcej warstw mięśniowych i śródmiąższowych, co sprawia, że jest trudniejsza do całkowitego strawienia niż jelito cienkie. W przeciwieństwie do istniejących protokołów, ten protokół wykorzystuje kolagenazę E z Clostridium histolyticum bez innych kolagenaz bakteryjnych (kolagenaza D / Kolagenaza I). Wykazaliśmy, że przy użyciu tego protokołu trawienie tkanki okrężnicy można osiągnąć przy zachowaniu jakości izolowanych jednojądrzastych komórek odpornościowych jelit (MNC) bez dodatku odczynników przeciwzbrylających, takich jak wersynian sodu (EDTA), Dyspaza II i dezoksyrybonukleaza I (DNAse I)21,22,23. Protokół ten jest zoptymalizowany, aby umożliwić powtarzalną, solidną ekstrakcję żywotnego MNC z mysiej okrężnicy do dalszych ukierunkowanych badań i powinien nadawać się do badania immunologii okrężnicy lub (z modyfikacjami) jelita cienkiego24,25.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami badań nad gryzoniami, które zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of the University of Miami Miller School of Medicine, które spełniają standardy weterynaryjne określone przez American Association for Laboratory Animal Science (AALAS).

1. Przygotowanie roztworów

  1. Jak opisano w Tabeli 1, przygotuj bufor dwukropek, pożywkę do separacji gęstości na bazie krzemionki 100%, pożywkę do separacji gęstości na bazie krzemionki 66%, pożywkę do separacji gęstości na bazie krzemionki 44%, bufor do mineralizacji kolagenazy E i bufor FACS.
    1. Przygotuj bufor jelita grubego dzień przed zabiegiem i przechowuj go przez noc w temperaturze 4 °C.
    2. Dzień przed zabiegiem należy przygotować w 100% gęstościowe podłoża do separacji na bazie krzemionki i przechowywać je przez noc w temperaturze 4 °C, umieszczając w temperaturze pokojowej rano w dniu zabiegu do rozmrożenia.
    3. Przygotuj 66% i 44% pożywki separacyjne na bazie krzemionki rano w dniu izolacji, używając pożywki do separacji o 100% gęstości na bazie krzemionki w temperaturze pokojowej i buforu dwukropek.
    4. Odmierz odpowiednią ilość kolagenazy E pochodzącej z Clostridium histolyticum i przechowuj w temperaturze -20 °C przez noc przed zabiegiem. Następnego ranka rozpuścić w odpowiedniej objętości Colon Buffer, aby uzyskać Collagenase Digestion Buffer. W przypadku wszystkich inkubacji z buforem do wytrawiania kolagenazy w dniu zabiegu, roztwory należy wstępnie ogrzać do 37 °C.
  2. Przez wszystkie etapy protokołu utrzymywać jedną wirówkę w temperaturze 20 °C i prędkości obrotowej 859 x g, z wyłączonymi hamulcami (0 opóźnienie) dla wirowania gradientowego. Ustaw kolejną na 4 °C i prędkość obrotową 859 x g, ze standardowym opóźnieniem, dla etapów prania.

2. Zbieranie dwukropka

  1. Poddać mysz eutanazji przez uduszenie CO2 , a następnie metodę potwierdzającą zatwierdzoną przez AALAC.
  2. Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach i spryskaj futro 70% etanolem. Za pomocą dużych nożyczek do tkanek wykonaj pionowe nacięcie w linii środkowej i odsłoń nienaruszoną otrzewną.
  3. Za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych otwórz otrzewną. Użyj kleszczy, aby przesunąć jelito cienkie na bok i odsłonić okrężnicę zstępującą. Lekko pociągnij w górę okrężnicę zstępującą, aby maksymalnie odsłonić odbytniczą część okrężnicy. Przetnij dystalną część odbytnicy głęboko w miednicy i wypreparuj i usuń całą okrężnicę jako jedną jednostkę, od dystalnej odbytnicy do czapeczki kątowej.
  4. Przenieś okrężnicę do 20 ml schłodzonego buforu jelita grubego w probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml.

3. Czyszczenie jelita grubego

  1. Umieść okrężnicę na zwilżonym ręczniku papierowym i usuń stały stolec, wywierając łagodny nacisk na ścianę jelita końcem nożyczek lub kleszczy.
  2. Umieścić okrężnicę na szalce Petriego i przepłukać jelito 10 ml schłodzonego buforu jelita grubego za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o sile 18 G.
  3. Przenieś okrężnicę do zwilżonego ręcznika papierowego Colon Buffer i usuń krezkę i tłuszcz ostrym końcem nożyczek.
  4. Umieść okrężnicę na szalce Petriego wypełnionej 5-10 ml schłodzonego buforu jelita grubego, mieszając ręcznie w celu umycia pozostałej zawartości okrężnicy. Powtórz 2-3 razy.
  5. Przeciąć okrężnicę wzdłużnie od bardziej muskularnego końca odbytnicy do bliższej okrężnicy (tworząc pojedynczy prostokątny otwarty kawałek okrężnicy) na szalce Petriego wypełnionej świeżo schłodzonym buforem okrężnicy. Wyrzuć istniejące nośniki i napełnij je czystym, schłodzonym buforem dwukropek.
  6. Umyj jelito 3 razy, energicznie obracając je na szalce Petriego i zastępując 5-10 ml schłodzonego buforu jelita grubego po każdym przemyciu.
  7. Umieść prostokątną tkankę jelita grubego na ręczniku papierowym zwilżonym buforem Colon Buffer i pokrój ją, krojąc poziomo, a następnie na małe fragmenty (odcinki 3 mm x 3 mm).
  8. Ostrożnie zbierz fragmenty jelita grubego za pomocą drobnych kleszczy do 20 ml schłodzonego buforu jelita grubego w stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml.
  9. Umyj fragmenty jelita grubego 3 razy, za każdym razem przemyj je w 20 ml buforu jelita grubego, energicznie obracając probówkę przez 30 sekund. Pomiędzy każdym mieszaniem pozwól, aby fragmenty tkanki osiadły na dnie probówki. Dekantacja lub odsysanie próżniowe supernatantu, zapobiegając jednocześnie utracie fragmentów tkanek w procesie aspiracji między każdym myciem.
    nuta: Nie ma potrzeby wymiany rurki po każdym praniu.

4. Trawienie kolagenazy 1

  1. Dodaj 20 ml buforu do wytrawiania kolagenazy do umytych fragmentów jelita grubego w stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml.
  2. Umieścić zamkniętą probówkę o pojemności 50 ml w temperaturze 37 °C w inkubowanej wytrząsarce orbitalnej z prędkością obrotową ustawioną na 2 x g przez 60 minut. Upewnij się, że fragmenty tkanki są w ciągłym ruchu podczas mieszania; jeśli to konieczne, stopniowo zwiększaj szybkość rotacji, aby upewnić się, że żadne fragmenty tkanki nie osiądą na dnie probówki.

5. Przygotuj gradienty mediów separacyjnych na bazie krzemionki

  1. Przygotuj 66% i 44% pożywki do separacji gęstości na bazie krzemionki, używając 100% pożywek do separacji gęstości na bazie krzemionki w temperaturze 20 °C (temperatura pokojowa) i buforu dwukropek.
  2. Wlej 5 ml 66% pożywki do separacji gęstości na bazie krzemionki do każdej z 3 oddzielnych probówek polipropylenowych o pojemności 15 ml. Przygotuj 3 probówki na dwukropek. Tworzy to podstawę procedury izolacji gradientowej o większej gęstości, na którą zostaną nałożone media separacyjne o mniejszej gęstości w celu utworzenia gradientu separacji.
  3. Przechowywać w temperaturze 20 °C do czasu użycia.

6. Pobranie supernatantu z trawienia 1

  1. Zebrać tylko supernatant za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml i przefiltrować supernatant przez sitko do komórek z tkaniny filtrującej pory o wielkości 40 μm, umieszczone w czystej probówce stożkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml, po zakończeniu trawienia kolagenazą 1. Należy uważać, aby nie zassać żadnych istniejących fragmentów tkanki.
    nuta: Zachowaj wszelkie pozostałe widoczne fragmenty tkanek w probówce. Zostaną one poddane drugiemu trawieniu kolagenazy (krok 8).

7. Bufor trawienia kolagenazy gaszącej

  1. Napełnij całkowicie probówkę polipropylenową o pojemności 50 ml schłodzonym buforem Colon Buffer.
    nuta: Kolagenaza jest aktywna w temperaturze 37 °C; Stąd schłodzony bufor dezaktywuje ten enzym.
  2. Odwirować probówkę w temperaturze 4 °C przy 800 x g przez 5 min.
    1. Odrzucić supernatant przez zasysanie próżniowe. Umyj komórki 25 ml świeżego buforu jelita grubego i odwiruj przy 800 x g przez 5 minut.
    2. Zawiesić osad w mniej niż 1 ml świeżo schłodzonego buforu jelita grubego.
    3. Umieść stożkową probówkę polipropylenową o pojemności 50 ml na lodzie.

8. Trawienie kolagenazy 2

  1. Powtórzyć krok 4 (Trawienie 1) z pozostałymi fragmentami tkanek zachowanymi z kroku 6.1.

9. Dezagregacja tkanek po trawieniu 2

  1. Energicznie przepłukać fragmenty tkanki w przód iw tył między probówką a strzykawką o pojemności 10 ml przez igłę o końcu 18 G.
  2. Powtarzaj to spłukiwanie przez co najmniej 7-8 pełnych pasaży, kontynuując, aż nie będą widoczne żadne duże fragmenty tkanek ani zanieczyszczenia.

10. Filtruj komórki

  1. Przepuść zawiesinę dezagregacji tkanek przez sitko do komórek z tkaniny filtracyjnej o porach 40 μm do czystej probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml.
  2. Umyj sitko komórkowe z tkaniny filtracyjnej 10 ml schłodzonym buforem dwukroli, aby odzyskać wszelkie komórki uwięzione w filtrze.

11. Gaszenie trawienia kolagenazy

  1. Napełnij 50 ml polipropylenową rurkę stożkową do krawędzi schłodzonym buforem Colon Buffer.
    nuta: Temperatura buforu jelita grubego ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia wygaszenia aktywności kolagenazy.
  2. Wirować w temperaturze 4 °C i 800 x g przez 5 min.
  3. Odrzucić supernatant przez zasysanie próżniowe.
  4. Przemyć przez ponowne zamieszanie w 25 ml świeżo schłodzonego buforu dwukroli, a następnie odwirować w temperaturze 4 °C, 800 x g przez 5 minut.
  5. Odrzucić supernatant przez zasysanie próżniowe.
  6. Połączyć zawieszone osady z Trawienia kolagenazy 1 (krok 7) do odpowiedniej probówki z kroku 11.4.
  7. Powtórz krok 11.4 (mycie i odwirowanie).

12. Separacja gęstości na bazie krzemionki Separacja gradientowa mediów

UWAGA: Wykonaj kroki 12-18 tak szybko, jak to możliwe, aby zapewnić szybkie wygaszenie aktywności kolagenazy.

  1. Postępując zgodnie z krokiem 11.7, ponownie zawieś każdą osadkę w 24 ml łącznie 44% pożywki do separacji gęstości na bazie krzemionki na okrężnicę.
  2. Powoli nałożyć 8 ml pożywki z kroku 12.1 na każdą z trzech probówek przygotowanych w kroku 5.2 (zawierających 66% pożywki do separacji gęstości na bazie krzemionki), używając pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Utrzymuj stały i powolny przepływ mediów separacyjnych o gęstości 44%, jednocześnie nakładając gradient, aby uniknąć zakłóceń interfejsu.
  3. Ostrożnie zrównoważyć wszystkie probówki w wiadrach wirówki za pomocą wagi lub wagi.
  4. Obracać probówki przez 20 minut w temperaturze 859 x g w wirówce bez hamulca w temperaturze 20 °C. Przed wyjęciem probówek należy odczekać, aby wirniki całkowicie się zatrzymały, uważając, aby nie zakłócić pracy komórek na granicy faz gradientu.

13. Zbieranie komórek jednojądrzastych z interfejsu gradientu

  1. Wizualizuj interfejs gradientu (w pobliżu znaku 5 ml), w którym zwykle występuje biały pasek o grubości 1-2 mm (zawierający MNC).
    nuta: Można, ale nie trzeba widzieć białego paska. Jednak MNC będzie na tym interfejsie i powinien zaciemnić przejrzystość interfejsu gradientowego.
  2. Odessać próżniowo i wyrzucić górne 7 ml górnego gradientu, aby umożliwić łatwiejszy dostęp pipety do interfejsu.
  3. Używając ciągłego ręcznego ssania i stałego ruchu obrotowego nadgarstka, zbierz warstwę graniczną komórek do czystej stożkowej rurki polipropylenowej o pojemności 50 ml. Zbieraj, aż interfejs między 2 gradientami będzie czysty i ogniotrwały (wolny od komórek).
  4. Napełnij probówkę zbiorczą 50 ml schłodzonego buforu FACS. Wirować w temperaturze 4 °C, 800 x g przez 5 min.
  5. Zassać supernatant przez aspirację próżniową i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu FACS.
  6. Policz komórki na hemocytometrze w rozcieńczeniu 1:2 przy użyciu odpowiednich metod wykluczania martwych komórek.
  7. Przejdź do barwienia FACS lub innych testów ze świeżo wyizolowaną MNC okrężnicy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas pracy z modelami choroby jelita grubego u myszy pomocna jest możliwość zarówno ilościowego, jak i jakościowego oszacowania, wśród MNC jelita grubego, wielu podzbiorów komórek odpornościowych zaangażowanych w proces zapalny. Jednokomórkowa zawiesina MNC uzyskana dzięki zastosowaniu tego protokołu ułatwia taką charakterystykę fenotypową w solidny i powtarzalny sposób. Jako dowód zasady zastosowania tej metody izolacji w różnych warunkach eksperymentalnych, uzyskaliśmy MNC okrężnicy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół wizualny opisuje dobrze tolerowane metody izolacji komórek jednojądrzastych okrężnicy, w tym limfocytów blaszki właściwej (LPL). Biorąc pod uwagę, że protokół ten został zoptymalizowany pod kątem oceny ciężkich modeli zapalenia jelita grubego myszy po przeszczepie, w których cytokiny zapalne i uszkodzenia tkanek sprzyjają słabej żywotności odzyskanego MNC, przewidujemy, że metody te można przełożyć na inne zastosowania wymagające analizy fenotypowej MNC okrężnicy. Obejmują one między innymi ocenę zapalenia j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty #1K08HL088260 i #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.) oraz Batchelor Foundation for Pediatric Research (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). Myszy C57BL/6 i BALB/c użyte w tym badaniu zostały wyhodowane w naszej placówce lub dostarczone przez Jackson Labs lub Taconic.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
60 mm Petri DIshThermo Scientific150288 1x
PBSCorning21-040-CV
10x PBSLonza BioWhittakerBW17-517Q
10 ml jednorazowa pipeta serologicznaCorning4100
10 mlBecton Dickinson302995
15 mL niesterylne probówkistożkoweTruLineTR2002
18 G igłaBecton Dickinson305180
25 ml Jednorazowa pipeta serologicznaCorning4250
40 μ m wielkość porów Sitko komórkoweCorning352340
50 ml Falcon TubeCorning21008-951
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)SigmaA4503-1KG
Bufor utrwalającyBiolegend420801
E. coli Kolagenaza E z Clostridium histolyticumSigmaC2139
EDTA, 0,5 M Sterylny RozwiązanieAmrescoE177-500ML
Płodowa surowica bydlęcaThermo /Fisher Scientific -HyCLoneSV30014.03
HEPESGE Healthcare-HyCloneSH30237.01
PercollGE Healthcare-Life Sciences1708901
RPMI MediumCorning17-105-CV
Azydek soduVWR Life Science Amresco97064-646
Błękit trypanowyLonza BioWhittaker17-942E

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schneeman, B. Gastrointestinal physiology and functions. British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).
  2. Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
  3. Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
  4. Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
  5. Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Waisman, A., Becher, B. , Humana Press. New York, NY. 21-25 (2014).
  6. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
  7. Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
  8. Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
  9. Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
  10. Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. Irritable Bowel Syndrome. The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).
  11. Harb, W. J. Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
  12. Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. Ulcerative Colitis. The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).
  13. Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
  14. Hatzimichael, E., Tuthill, M. Hematopoietic stem cell transplantation. Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).
  15. Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
  16. Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
  17. Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
  18. Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
  19. Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
  20. van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
  21. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114(2016).
  22. Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281(2018).
  23. Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
  24. Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
  25. Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
  26. Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
  27. Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
  28. Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
  29. Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
  30. Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  31. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
  32. van der Heijden, P. j, Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja jelita grubego myszytrawienie kolagenaz Eseparacja w gradiencie g sto cianaliza cytometrycznafiltracja przez sitko kom rkoweinkubacja w inkubatorze orbitalnymprzemywanie buforem FACSfenotypowanie kom rek odporno ciowychprzeszczep szpiku kostnego

Powiązane artykuły