Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja miażdżycy u myszy

42.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59828

⸱

12 czerwca 2019

 ,  ,  , 
1Cardiovascular Medicine Unit, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, 2Department of Cardiovascular and Renal Research, Institute for Molecular Medicine, University of Southern Denmark (SDU)

W tym artykule

Podsumowanie

Mysie modele miażdżycy są użytecznymi narzędziami do badania szlaków patogennych na poziomie molekularnym, ale wymagają standaryzowanej kwantyfikacji rozwoju zmian. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę określania wielkości zmiany w głównych naczyniach tętniczych, w tym w korzeniu aorty, łuku aortalnym i tętnicy ramienno-głowowej.

Streszczenie

Choroby układu krążenia są główną przyczyną zgonów na świecie. Podstawową przyczyną w większości przypadków jest miażdżyca, która jest częściowo przewlekłą chorobą zapalną. Eksperymentalne badania miażdżycy wyjaśniły rolę cholesterolu i stanu zapalnego w procesie chorobowym. Doprowadziło to do udanych badań klinicznych nad środkami farmaceutycznymi, które zmniejszają objawy kliniczne miażdżycy. Staranne i dobrze kontrolowane eksperymenty na mysich modelach choroby mogą dokładniej wyjaśnić patogenezę choroby, która nie jest w pełni poznana. Standaryzowana analiza zmian chorobowych jest ważna dla zmniejszenia zmienności eksperymentalnej i zwiększenia odtwarzalności. Określenie wielkości zmiany w korzeniu aorty, łuku aorty i tętnicy ramienno-głowowej jest częstym punktem końcowym w eksperymentalnej miażdżycy. Protokół ten zawiera opis techniczny do oceny miażdżycy we wszystkich tych miejscach za pomocą jednej myszy. Protokół jest szczególnie przydatny, gdy materiał jest ograniczony, jak to często ma miejsce w przypadku charakteryzowania zwierząt modyfikowanych genetycznie.

Wprowadzenie

Choroby układu krążenia są główną przyczyną zgonów na świecie, a choroba niedokrwienna serca i udar mózgu odpowiadają za jeden na cztery zgony1. Większość przypadków jest spowodowana miażdżycą, chorobą charakteryzującą się powolnym gromadzeniem się blaszek lipidowych z objawami przewlekłego stanu zapalnego w dużych i średnich tętnicach2. Choroba zwykle pozostaje niezauważona przez kilka dziesięcioleci, aż pęknięcie lub erozja płytki nazębnej wywoła zakrzepicę tętniczą, która prowadzi do niedokrwiennego uszkodzenia tkanki.

Normalna tętnica składa się z warstwy wewnętrznej z komórkami śródbłonka i słabo rozmieszczonymi komórkami mięśni gładkich, warstwy środkowej z komórkami mięśni gładkich i elastycznymi blaszkami oraz otaczającej warstwy przybyszowej z luźną tkanką łączną3. Wewnętrzna retencja LDL kompensuje rozwój miażdżycy4. Akumulacja i modyfikacja lipoprotein prowadzi do agregacji i uwięzienia w obrębie błony wewnętrznej tętnicy5. Reakcja zapalna jest wywoływana przez uwięzione i zmodyfikowane lipoproteiny6. Komórki śródbłonka zaczynają wyrażać cząsteczki adhezyjne, takie jak VCAM-1 w miejscach w drzewie tętniczym o burzliwym przepływie krwi, co prowadzi do rekrutacji krążących monocytów i innych leukocytów7. Naciekające monocyty różnicują się w makrofagi, które pochłaniają lipidy, a następnie przekształcają się w komórki piankowe makrofagów8.

Miażdżyca tętnic jest badana na modelach mysich z coraz większą częstotliwością od połowy lat 80. C57BL/6 jest najczęściej używanym szczepem myszy wsobnych w tych badaniach i jest używany jako tło genetyczne dla większości genetycznie modyfikowanych szczepów9. Szczep ten powstał w 1920<'sup class="xref">10, a jego genom został opublikowany w 200211. Eksperymenty na modelach mysich mają kilka zalet: kolonie rozmnażają się szybko, pomieszczenia są efektywne przestrzennie, a chów wsobny zmniejsza zmienność eksperymentalną. Model pozwala również na manipulacje genetyczne, takie jak celowane delecje genów i wprowadzanie transgenów. Doprowadziło to do nowego patofizjologicznego zrozumienia choroby i nowych celów terapeutycznych12.

Myszy C57BL/6 typu dzikiego są naturalnie odporne na miażdżycę. Większość krążącego cholesterolu w HDL znajduje się u nich, a złożone zmiany miażdżycowe nie powstają nawet wtedy, gdy są karmione dietą wysokotłuszczową i wysokocholesterolową13. Myszy z hipercholesterolemią, takie jak Apoe-/- na tle C57BL/6, są zatem używane jako eksperymentalne modele miażdżycy14,15. Brak ApoE upośledza wychwyt resztkowych lipoprotein w wątrobie i poważnie zaburza metabolizm lipidów. U myszy Apoe-/- krążący cholesterol znajduje się głównie w cząsteczkach VLDL, a myszy rozwijają złożone blaszki miażdżycowe na regularnej diecie żywieniowej.

Ldlr-/- myszy naśladują rozwój miażdżycy obserwowany u ludzi z rodzinną hipercholesterolemią16. Myszy Ldlr-/- potrzebują diety typu zachodniego, aby rozwinąć miażdżycę17. Zachodnia dieta naśladuje przyjmowanie pokarmu przez ludzi i zwykle zawiera 0,15% cholesterolu. Receptor LDL rozpoznaje ApoB100 i ApoE i pośredniczy w wychwytywaniu cząsteczek LDL poprzez endocytozę. Receptory LDL mają zasadnicze znaczenie dla klirensu LDL z krążenia przez wątrobę, podczas gdy ekspresja receptora LDL w komórkach krwiotwórczych nie wpływa na ten proces. Otwiera to możliwość przeszczepienia komórek Ldlr+/+ szpiku kostnego biorcom Ldlr-/- z hipercholesterolemią i oceny rozwoju miażdżycy. Chimery szpiku kostnego są powszechnie wykorzystywane do badania udziału komórek krwiotwórczych w eksperymentalnej miażdżycy. Jednak przeszczep szpiku kostnego może wpływać na wielkość i skład blaszek miażdżycowych, co sprawia, że interpretacja wyników jest niejednoznaczna.

Różne warianty myszy Apoe-/- i Ldlr-/- z dodatkowymi zmianami genetycznymi zostały opracowane do badania specyficznych procesów choroby18. Jednym z przykładów są ludzkie APOB100-transgeniczne myszy Ldlr-/- (HuBL), które są nosicielami pełnowymiarowego genu APOB100 ludzkiego 19,20. Myszy te rozwijają hipercholesterolemię i miażdżycę przy regularnej diecie żywieniowej. Jednak rozwój złożonych blaszek miażdżycowych trwa co najmniej sześć miesięcy, a krótsze protokoły eksperymentalne zwykle wykorzystują zachodnią dietę21. Duża frakcja cholesterolu w osoczu krąży w cząsteczkach LDL, co nadaje myszom HuBL bardziej podobny do ludzkiego dyslipidemiczny profil lipoprotein w porównaniu z myszami Apoe-/- i Ldlr-//-. Myszy HuBL pozwalają również na badania ludzkiego apoB jako autoantygenu22.

Mysie modele miażdżycy rozwijają złożone blaszki miażdżycowe o wspólnych cechach ludzkiej choroby. Jednak blaszki są dość odporne na pęknięcie i wynikający z niego zawał mięśnia sercowego. Zakrzepica tętnic jest wykrywana tylko sporadycznie i eksperymentalnie trudna do oceny23,24,25. Opracowano specjalne modele pękania płytki nazębnej, ale w dziedzinie eksperymentalnej brakuje wiarygodnego i powtarzalnego modelu do oceny środków stabilizujących blaszkę miażdżycową.

Kwantyfikacja miażdżycy została opisana na wiele sposobów w literaturze. Ostatnie wysiłki miały na celu standaryzację projektowania eksperymentów, wykonywania i raportowania badań na zwierzętach26. Badacze mają różne preferencje i techniki dostosowane do ich laboratoriów. Większość projektów badawczych jest również wyjątkowa w tym sensie, że wymagają pewnych modyfikacji protokołu. Ze względu na wieloczynnikowy charakter choroby, optymalne kontrole różnią się w zależności od projektu. Lokalne warunki i brak standaryzacji mogą powodować obserwowane różnice w rozwoju choroby, co hamuje postęp w tej dziedzinie badań. Różnice w zmienności eksperymentalnej oznaczają również, że obliczenia mocy statystycznej muszą opierać się na badaniach pilotażowych w warunkach lokalnych.

Ilościowe określenie miażdżycy jest zalecane w kilku miejscach drzewa naczyniowego. Protokół ten opisuje, w jaki sposób uzyskać wyniki z korzenia aorty, łuku aorty i tętnicy ramienno-głowowej u jednej myszy, oprócz pozostawienia reszty aorty piersiowo-brzusznej do innych analiz. Preparaty na twarz umożliwiają szybkie ilościowe określenie blaszek lipidowych w łuku aorty. Obciążenie chorobą w tętnicy ramienno-głowowej można również określić ilościowo, jeśli próbki są starannie wyeksponowane. Bardziej czasochłonne przecięcie korzenia aorty pozostawia kilka sekcji dostępnych do szczegółowej oceny składu płytki nazębnej.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach wymagają zatwierdzenia przez komisje etyczne.

1. Uśmiercenie myszy i mikrodysekcja aorty

  1. Uśmierć mysz poprzez uduszenie CO2 i zmierz jej masę ciała.
  2. Spryskaj mysz 70% etanolem, aby uniknąć zanieczyszczenia próbek sierścią. Umieść mysz w pozycji na plecach. Od wcięcia nadmostkowego wykonaj cięcie w linii środkowej za pomocą nożyczek Mayo, prowadząc je niemal do kości łonowej.
    OSTRZEŻENIE: Etanol o wysokim stężeniu jest łatwopalny i może powodować poważne podrażnienie oczu. Stosuj środki ostrożności.
  3. Używając igły 23 G, upuść krew z myszy poprzez punkcję serca przez ścianę klatki piersiowej. Procedura ta pozwala zazwyczaj na pozyskanie 750 µL krwi z 20-tygodniowej myszy. Zazwyczaj połowę objętości pobiera się do probówki powlekanej EDTA tripotasowym, a drugą połowę do probówki powlekanej heparyną litową lub do serum. Delikatnie obracaj probówki i przechowuj je w temperaturze pokojowej do czasu dalszej obróbki.
  4. Użyj nożyczek Mayo, aby przeciąć otrzewną ścienną w linii środkowej i otworzyć jamę brzuszną. Przytrzymaj wyrostek mieczykowaty pęsetą anatomiczną, przetnij otrzewną bocznie po obu stronach i kontynuuj otwieranie przepony.
    1. Użyj nożyczek Mayo, aby otworzyć jamę klatki piersiowej, przecinając klatkę piersiową tak bocznie, jak to możliwe. Umożliwi to uzyskanie szerokich kątów dla narzędzi podczas późniejszej mikrodysekcji aorty.
  5. Wykonaj nacięcie w prawym przedsionku w celu odprowadzenia płynu perfuzyjnego. Wprowadź igłę 27 G przez wierzchołek serca w kierunku kranialnym. Utrzymuj igłę unieruchomioną w lewej komorze, powoli perfundując mysz 10 mL lodowatego roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) przez minimum 2 min. Obserwuj zmianę koloru wątroby na bledszy.
    UWAGA: Niektóre protokoły wykorzystują perfuzję paraformaldehydem, jednak zakłóca ona kilka późniejszych zastosowań, takich jak analiza immunohistochemiczna limfocytów. Dlatego w niniejszym protokole nie wykonuje się fiksacji perfuzyjnej paraformaldehydem.
  6. Wyizoluj interesujące organy (np. węzły chłonne, śledzionę, wątrobę, jelita, podskórne poduszki tłuszczowe w pachwinach, nerki itp.) za pomocą pęsety anatomicznej i nożyczek do dysekcji.
  7. Przetnij tchawicę i przełyk po prawej stronie serca, nie uszkadzając łuku aorty. Przetnij przeponę oraz struktury łączące trzewia z otrzewną zabronną, pozostawiając serce, aortę i nerki in situ. Odsuń płuca i trzewia w kierunku kaudalnym i przykryj je serwetką, aby rozpocząć mikrodysekcję zabronną węzłów chłonnych okołoaortycznych i aorty brzusznej.
  8. Rozpocznij mikrodysekcję pod stereomikroskopem przy powiększeniu 6x. Rozpocznij dysekcję rozwidlenia aorty, unosząc otaczające tkanki pęsetą Dumont i przecinając je pod napięciem nożyczkami Vannas.
    1. Kontynuuj dysekcję aorty brzusznej w kierunku kranialnym. Odetnij od aorty gałęzie brzuszne i uwolnij aortę proksymalnie poprzez otwór aorty w przeponie.
      UWAGA: Mikrodysekcja wymaga precyzyjnej koordynacji wzrokowo-ruchowej przy pracy ze stereomikroskopem, co wymaga pewnej praktyki do opanowania.
  9. Usuń tkankę tłuszczową pokrywającą aortę piersiową. Ostrożnie wykonaj dysekcję grzbietową grasicy, aby uwolnić łuk aorty wraz z gałęziami. Kontynuuj dysekcję tętnic szyjnych tak dystalnie, jak to możliwe w jamie klatki piersiowej. W szczególnych przypadkach można przeprowadzić dysekcję szyi, aby objąć rozwidlenie tętnicy szyjnej.
  10. Wypłucz narzędzia kolejno w wodzie dejonizowanej, roztworze do dekontaminacji RNaz, 70% etanolu i PBS przed właściwym przecięciem aorty. Unieś serce za wierzchołek pęsetą. Przetnij aortę blisko serca i umieść całe serce w probówce z PBS. Serce można przechowywać w lodzie przez kilka godzin przed dalszą obróbką i kriomontowaniem korzenia aorty.
  11. Przetnij łuk aorty zgodnie z Rysunkiem 1A. Umieść łuk aorty w probówce zawierającej 1 mL 4% formaldehydu na noc w temperaturze 4 °C. Próbkę można w ten sposób przechowywać przez kilka lat przed przypięciem i analizą.
    OSTRZEŻENIE: Formaldehyd może powodować raka, alergiczne reakcje skórne i jest szkodliwy w przypadku połknięcia. Stosuj wymagane środki ochrony indywidualnej.
  12. Wyizoluj pozostałą część aorty zstępującej i umieść ją w roztworze do stabilizacji RNA lub zamroź gwałtownie do późniejszej analizy RNA lub innego zastosowania. Optymalizacja przepływu pracy w celu zminimalizowania czasu dysekcji jest kluczowa, aby uniknąć nadmiernej degradacji RNA.
  13. Umieść probówki z pobraną krwią (pobrane w kroku 1.3) w wirówce. Wirować oddzielne probówki z plazmą i serum przy 1 500 x g przez 15 min w temperaturze pokojowej. Ostrożnie przenieś plazmę i serum do probówek do mikrocentryfugi i przechowuj w temperaturze -80 °C. Pobranie zarówno plazmy/serum z EDTA, jak i z heparyną, daje możliwości wielu późniejszych zastosowań.
  14. Umieść serce na podłożu z korka stroną brzuszną do góry. Przymocuj serce do korka igłą przebitą przez wierzchołek. Przytrzymaj podstawę serca pęsetą anatomiczną.
    1. Użyj skalpela, aby odciąć apikalne 2/3 serca; linia cięcia powinna przebiegać między dwoma przedsionkami, a skalpel powinien być nachylony pod kątem 20° kaudalnie w płaszczyźnie strzałkowej i 20° kranialnie w płaszczyźnie poprzecznej (Rysunek 1B).
  15. Zatop korzeń aorty w związku OCT (optimum cutting temperature), który powinien otaczać, ale nie infiltrować tkanki. Zanurz podstawę serca w związku OCT. Delikatnie uciśnij serce pęsetą, aby wypełnić korzeń aorty związkiem OCT i usunąć pęcherzyki powietrza.
  16. Przenieś próbkę na dno formy do kriosekcji wypełnionej OCT. Korzeń aorty powinien być teraz prostopadły do powierzchni dna. Umieść zamontowane serce na suchym lodzie w celu zamrożenia. Przechowuj próbki w woreczkach strunowych w temperaturze -80 °C do czasu wykonania kriosekcji zgodnie z sekcją 3 niniejszego protokołu.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Serce i łuk aorty in situ. (A) Płuca, tchawica, przełyk i grasica zostały usunięte, aby odsłonić łuk aorty in situ u 20-tygodniowej samicy myszy Apoe-/- na standardowej diecie w mikrofotografii, skala = 2 mm. Linie przerywane wskazują miejsca nacięcia łuku aorty i jego odgałęzień. (B) Schematyczne przedstawienie serca i aorty. Czerwona linia przerywana wskazuje miejsce nacięcia serca przed kriomontażem pierścienia aorty. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Analiza en face łuku aorty i tętnicy szyjno-głowowej

  1. Przygotuj podkładki do przypinania do analizy en face łuków aorty. Złóż odcinek folii z wosku parafiny osiem razy, aby uzyskać płaską powierzchnię o wymiarach 25 mm x 25 mm. Owiń ją czarną izolacyjną taśmą elektryczną, aby stworzyć ciemne tło dla aorty. Umieść etykietę na tylnej stronie podkładki i za pomocą ołówka zapisz numer identyfikacyjny myszy (tusz z zwykłego długopisu zniknie podczas procesu barwienia).
  2. Przenieś łuk aorty na podkładkę do przypinania i nanieś na niego kroplę PBS. Rozpocznij oczyszczanie aorty z pozostałej tkanki tłuszczowej okołozewnętrznej pod stereomikroskopem.
    1. Użyj nożyczek Vannasa i pęsety Dumont, aby delikatnie usunąć całą otaczającą tkankę tłuszczową, nie manipulując aortą i nie uszkadzając jej. Sudan IV intensywnie barwi tkankę tłuszczową, dlatego kluczowe jest usunięcie całej takiej tkanki na tym etapie.
      UWAGA: Utrzymuj aortę w stanie wilgotnym przez cały czas, aplikując dodatkowy PBS w razie potrzeby.
  3. Rozetnij aortę w płaszczyźnie wieńcowej, wprowadzając nożyczki Vannasa do światła aorty, aby odsłonić powierzchnię wewnętrzną (intima). Rozpocznij cięcie od zewnętrznej krzywizny łuku wstępującego w kierunku dystalnym i kontynuuj rozcinanie odgałęzień, w tym tętnicy szyjno-obojczykowej. Pozostaw nienaruszoną część grzbietową odcinka piersiowego zstępującego.
    1. Rozetnij mniejszą krzywiznę i rozłóż aortę, aby odsłonić powierzchnię wewnętrzną.
      UWAGA: Krok ten wymaga precyzyjnej motoryki i pewnej wprawy w celu opanowania techniki.
  4. Przypnij otwarty łuk do podkładki, używając tępych końców mikroigieł entomologicznych. Do umieszczania igieł użyj mikroportu Castroviejo. Po umieszczeniu igieł delikatnie odgnij je od preparatu. Przypnij aortę płasko do podkładki, nie rozciągając preparatu. Przechowuj przypięty łuk skierowany stroną rozcięcia w dół w szalce Petriego wypełnionej PBS w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać.
  5. Przygotuj roztwór roboczy Sudan IV. W ciemnej butelce wymieszaj 1 g proszku Sudan IV, 100 mL 70% etanolu i 100 mL acetonu, a następnie delikatnie mieszaj przez 10 min. Nie ma potrzeby filtrowania roztworu; można go używać przez kilka miesięcy, jeśli jest przechowywany w ciemności w temperaturze pokojowej. Jeśli kolor barwienia nie jest satysfakcjonujący, można przygotować nowy roztwór i ponownie zabarwić preparaty.
    OSTRZEŻENIE: Aceton jest cieczą łatwopalną, która może spowodować poważne podrażnienie oczu. Przechowywać w dobrze wentylowanym miejscu i stosować środki ostrożności podczas pracy.
  6. Ustaw na blacie laboratoryjnym pięć szalek Petriego: jedną wypełnioną 70% etanolem, jedną wypełnioną roztworem roboczym Sudan IV, dwie wypełnione 80% etanolem i jedną wypełnioną PBS.
    1. Zacznij od płukania preparatu w 70% etanolu przez 5 min, umieszczając podkładkę w pierwszej szalce Petriego łukiem skierowanym w dół. Przenieś preparat do roztworu roboczego Sudan IV i pozostaw do zabarwienia łuku na 7 min.
    2. Następnie płucz w 80% etanolu przez 3 min dwukrotnie, aby odbarwić prawidłową powierzchnię wewnętrzną. Czas odbarwiania można dostosować w celu optymalizacji wyników. Na koniec wypłucz w PBS przed ponownym umieszczeniem preparatu w oryginalnej szalce Petriego.
  7. Wykonaj mikrofotografie za pomocą stereomikroskopu z 10-krotnym powiększeniem podłączonego do kamery cyfrowej. Zrób zdjęcia przypiętego łuku zanurzonego w PBS, używając małych metalowych obciążników (20 mm x 10 mm x 5 mm), aby przycisnąć podkładkę do dna szalki Petriego. Umieść linijkę obok aorty w celu kalibracji obrazu.
  8. Użyj oprogramowania do analizy obrazu (np. ImageJ), aby określić powierzchnię zmiany i całkowitą powierzchnię wewnętrzną. W przypadku braku punktów orientacyjnych definiujących łuk aorty, pomiar wykonuje się zazwyczaj od początku aorty wstępującej w dół do pierwszej gałęzi międzyżebrowej (Rysunek 2A). Użyj funkcji kwantyfikacji powierzchni w oprogramowaniu, aby ręcznie obrysować całkowitą powierzchnię łuku wewnętrznej warstwy.
    UWAGA:     Kwantyfikacja zmian powinna być przeprowadzona w sposób zaślepiony; zaleca się, aby drugi badacz potwierdził wyniki.
    1. W programie ImageJ wybierz narzędzie zaznaczania wielokąta (polygon selection tool) i obrysuj całkowitą powierzchnię łuku poprzez wielokrotne kliknięcia. Następnie wybierz funkcję pomiaru (measure) w menu analizy, aby wyświetlić całkowitą powierzchnię łuku w oknie wyników.
    2. Następnie obrysuj wszystkie blaszki zabarwione Sudan IV w łuku. Sudan IV jest lizochromowym barwnikiem diazo, który barwi lipidy, triglicerydy i lipoproteiny na kolor pomarańczowo-czerwony. W programie ImageJ wybierz narzędzie zaznaczania swobodnego (freehand selection tool) i obrysuj wszystkie blaszki, trzymając klawisz Alt. Kliknij pomiar w menu analizy, aby wyświetlić powierzchnię łuku wolną od zmian w oknie wyników.
    3. Oblicz względną powierzchnię zmiany, odejmując powierzchnię wolną od zmian od całkowitej powierzchni łuku, a następnie dzieląc wynik przez całkowitą powierzchnię łuku.
  9. Ostrożnie przypnij tętnice podobojczykowe i szyjne, aby umożliwić kwantyfikację zmian w tętnicy szyjno-obojczykowej (Rysunek 2A). Kwantyfikacja zmian w tętnicach podobojczykowych i wspólnych tętnicach szyjnych jest zazwyczaj bardzo trudna i odpowiednio niecelowa.
    1. W programie ImageJ obrysuj oba fragmenty tętnicy szyjno-obojczykowej za pomocą narzędzia zaznaczania wielokąta, trzymając klawisz Shift. Kliknij pomiar w menu analizy, aby wyświetlić całkowitą powierzchnię tętnicy szyjno-obojczykowej w oknie wyników.
    2. Następnie wybierz narzędzie zaznaczania swobodnego i obrysuj wszystkie blaszki w tętnicy szyjno-obojczykowej, trzymając klawisz Alt. Kliknij pomiar w menu analizy, aby wyświetlić powierzchnię tętnicy szyjno-obojczykowej wolną od zmian w oknie wyników.
    3. Oblicz względną powierzchnię zmiany, odejmując powierzchnię wolną od zmian od całkowitej powierzchni tętnicy szyjno-obojczykowej, a następnie dzieląc wynik przez całkowitą powierzchnię tętnicy szyjno-obojczykowej.

figure-protocol-2
Rycina 2: Ilościowe oznaczanie zmian miażdżycowych. (A) Łuk aorty od 20-tygodniowego męskiego płodu ludzkiego APOB100-transgeniczny Ldlr-/- (HuBL) mysz karmiona dietą zachodnią przez dziesięć tygodni, preparat rozpięty i barwiony Sudanem IV w celu uwidocznienia blaszek bogatych w lipidy. Całkowita powierzchnia łuku aorty została obrysowana białą linią przerywaną na mikrofotografii, pasek skali = 2 mm. Żółte linie przerywane obrysowują całkowitą powierzchnię tętnicy szyjno-głowowej. (B) Przekrój poprzeczny pierścienia aorty w 400 µm z zatoki aorty u 20-tygodniowego samca Ldlr-/- mysz karmiona dietą zachodnią przez osiem tygodni przedstawiona na mikrofotografii, skala = 500 µmCzarne linie przerywane obrysowują całkowitą powierzchnię naczynia oraz zmiany miażdżycowe zabarwione Oil Red O, zlokalizowane w wewnętrznej błonie tętnicy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

3. Kriosieczenie pierścienia aorty

  1. Ustaw temperaturę kriotomu na -20 °C, a grubość skrawka na 10 µm. Zamocuj blok OCT zawierający pierścień aorty w uchwycie do próbek, tak aby tkanka komory była skierowana na zewnątrz. Rozpoczynając cięcie, precyzyjnie dostosuj wyrównanie powierzchni skrawania, aby była równoległa do uchwytu do próbek.
  2. Usuń nadmiar otaczającego OCT, aby ułatwić zbieranie skrawków bez zagięć. Pierścień aorty powinien być teraz ustawiony prostopadle do ostrza noża, pod warunkiem, że podstawa serca została prawidłowo umieszczona w formie.
  3. Pobierz początkowe skrawki kontrolne na zwykłe szkiełka mikroskopowe, które zostaną później odrzucone. Pierwsze skrawki powinny zawierać wyłącznie tkankę mięśnia sercowego. Przesuwaj się w głąb tkanki o 200 µm za razem. Pobierz skrawka i sprawdź postęp za pomocą mikroskopu świetlnego.
  4. Zbliżając się do drogi odpływu z lewej komory, sprawdzaj każdy skrawka co 100 µm pod mikroskopem. Po zaobserwowaniu pierwszych oznak ściany naczynia, zmniejsz krok do 50 µm.
    UWAGA: Pojawienie się pierwszej zastawki aorty stanowi punkt zero dla zbierania skrawków. Może być trudno precyzyjnie określić moment pojawienia się zastawek, jednak dokładna lokalizacja jest kluczowa dla porównywania zmian w tym samym obszarze.
  5. Przechyl próbkę w stronę zastawki w punkcie zero, aby wyrównać płaszczyznę cięcia z dwiema pozostałymi zastawkami. Jest to niezbędne do uzyskania rzeczywistych przekrojów poprzecznych aorty. Wykonaj rysunek pierścienia aorty, zaznaczając pojawiające się zastawki, i licz każdy skrawka o grubości 10 µm wycinany od punktu zero wzwyż.
    1. Gdy pojawi się druga zastawka, ponownie lekko przechyl próbkę w kierunku przeciwnym do zastawki, aby wyrównać ją z trzecią zastawką. Różnica poziomów między zastawkami nie powinna przekraczać 50 µm. Rozpocznij zbieranie skrawków na szkiełka od poziomu 90 µm wzwyż.
    2. Zbieraj skrawki zgodnie z planem rozmieszczenia na szkiełkach przedstawionym na Rysunku 3. Zbieranie skrawków można rozpocząć od 190 µm, jeśli pierścień aorty jest przechylony o więcej niż 50 µm, aby zapewnić dodatkową przestrzeń do ustawienia pierścienia w pozycji prostej. Kontynuuj cięcie aż do osiągnięcia poziomu 800 µm od punktu zero. Jeśli na tym poziomie nadal widoczne są blaszki miażdżycowe, zakres pobierania można rozszerzyć do 1,000 µm.
      UWAGA: Uproszczona organizacja szkiełek została przedstawiona na Rysunku uzupełniającym 1, co może zwiększyć szybkość cięcia. Optymalny plan rozmieszczenia skrawków na szkiełkach powinien zostać ustalony w zależności od planu projektu.
  6. Utrwal skrawki po pobraniu.
    1. Skrawki przeznaczone do barwienia Oil Red O oraz barwienia kolagenu czerwienią picrosiriusa utrwal w 4% formaldehydzie przez 10 min. Przepłucz w wodzie dejonizowanej, wysusz i przechowuj w temperaturze pokojowej do momentu przejścia do sekcji 4 niniejszego protokołu. Jeśli szkiełka mają zostać niezwłocznie zabarwione Oil Red O i są nadal wilgotne, umieść je w 60% izopropanolu na 1 min, aby przyspieszyć proces suszenia.
      OSTROŻNIE: Izopropanol jest cieczą łatwopalną, która może powodować poważne podrażnienie oczu oraz senność lub zawroty głowy. Przechowywać w dobrze wentylowanym miejscu i stosować środki ostrożności podczas obchodzenia się z substancją.
    2. Skrawki przeznaczone do immunohistochemii lub immunofluorescencji utrwal w lodowatym czystym acetonie przez 10 min. Susz w temperaturze pokojowej przez 30 min. Przechowuj skrawki w -20 °C.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Organizacja szkiełek dla seryjnych przekrojów pierścienia aorty. Podczas kriosekcjonowania pierścienia aorty należy zebrać każdy przekrój o grubości 10 µm obejmujący pierwsze 800 µm aorty wstępującej. Systematyczna organizacja szkiełek jest niezbędna do uzyskania odpowiednich przekrojów dla różnych zastosowań. Analiza składu zmian zazwyczaj obejmuje barwienie Oil Red O w celu wykrycia lipidów oraz barwienie czerwienią picrosiriusową w celu wykrycia kolagenu. Pozostałe przekroje są zbierane i utrwalane w acetonie do badań immunohistochemicznych oraz barwienia immunofluorescencyjnego. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Gisterå et al30. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Barwienie Oil Red O i kwantyfikacja miażdżycy w korzeniach aorty

  1. Przygotować nasycony roztwór Oil Red O, rozpuszczając 1 g Oil Red O w 100 mL izopropanolu. Mieszać roztwór w ciemnej butelce przez 1 h w temperaturze pokojowej. Nasycony roztwór można przechowywać przez kilka miesięcy.
    UWAGA: Zaleca się posiadanie osobnego sprzętu laboratoryjnego do barwienia Oil Red O, ponieważ sprzęt, który miał kontakt z tym roztworem, jest trudny do oczyszczenia.
  2. Przygotować roztwór roboczy, mieszając 75 mL nasyconego roztworu Oil Red O z 50 mL wody dejonizowanej. Pozostawić w temperaturze pokojowej na 10 min. Przefiltrować przez jakościowy papier filtracyjny.
  3. Umieścić preparaty w roztworze roboczym Oil Red O na 20 min. Płukać pod bieżącą wodą przez 5 min.
  4. Aby ułatwić wizualizację tkanki, barwić hematoksyliną Mayera przez 1 min. Płukać w letniej wodzie z kranu przez 5 min. Wszystkie jądra powinny być teraz zabarwione na kolor niebieski; dostosować czas barwienia w celu optymalizacji wyniku.
  5. Zamontować preparaty w wodnym medium montażowym (np. żelatynie glicerolowej Kaisera). Przed użyciem podgrzać żelatynę glicerolową Kaisera do 40 °C, aby stała się płynna. Suszenie preparatów nie jest konieczne, ponieważ medium montażowe jest na bazie wody. Należy uważać, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza podczas nakładania szkiełka nakrywkowego.
    OSTRZEŻENIE: Żelatyna glicerolowa Kaisera zawiera fenol, który jest podejrzewany o wywoływanie wad genetycznych. Stosować wymagane środki ochrony indywidualnej.
  6. Wykonać cyfrowe mikrofotografie za pomocą kamery podłączonej do mikroskopu świetlnego. Zazwyczaj pełna ściana naczynia i granice zmian są wyraźnie widoczne przy 50-krotnym powiększeniu. Zapisywać obrazy w wysokiej rozdzielczości, najlepiej w formacie TIFF (tagged image file format).
  7. Przeprowadzić analizę wielkości zmian za pomocą systemu oprogramowania do komputerowej analizy obrazu. Oil Red O jest lizochromowym barwnikiem diazo, który barwi lipidy obojętne i wizualizuje blaszki miażdżycowe na intensywny czerwony kolor, co ułatwia ilościowe określenie zmian.
    UWAGA:     Kwantyfikacja zmian powinna być przeprowadzona metodą ślepej próby; zaleca się, aby drugi badacz potwierdził uzyskane wyniki.
    1. Użyć funkcji kwantyfikacji obszaru w oprogramowaniu do analizy obrazu, aby zdefiniować całkowity obszar naczynia, obrysowując zewnętrzną błonę sprężystą ściany naczynia aorty (Rycina 2B). W programie ImageJ wybrać narzędzie do zaznaczania wielokąta i obrysować obszar poprzez wielokrotne kliknięcia. Następnie wybrać funkcję pomiaru (measure) w menu analizy (analyze). Całkowity obszar naczynia zostanie wyświetlony w oknie wyników.
    2. Następnie przeprowadzić kwantyfikację zmian miażdżycowych w warstwie wewnętrznej naczynia, zdefiniowanej przez wewnętrzną błonę sprężystą i granicę światła naczynia. Zazwyczaj zmiany na płatkach zastawek są wykluczane z pomiaru27. W programie ImageJ wybrać narzędzie do zaznaczania ręcznego (freehand selection) i obrysować wszystkie blaszki, trzymając klawisz Alt. Wybrać funkcję pomiaru (measure) w menu analizy, aby wyświetlić obszar naczynia wolny od zmian w oknie wyników.
    3. Obliczyć względny obszar zmian, odejmując obszar wolny od zmian od całkowitego obszaru naczynia, a następnie dzieląc wynik przez całkowity obszar naczynia.
      UWAGA: Skalibrować wyniki w oprogramowaniu do analizy obrazu zgodnie z użytym powiększeniem, aby uzyskać bezwzględny obszar zmian w mikrometrach kwadratowych.
  8. Zdefiniować obszar zabarwiony Oil Red O w obrębie zmian, korzystając z funkcji progu kolorystycznego (color threshold) w oprogramowaniu do analizy obrazu, aby obliczyć procentowy udział obszaru pozytywnego pod kątem Oil Red O w całkowitym obszarze zmiany.
    1. W programie ImageJ obrysować cały obszar zmiany za pomocą narzędzia do zaznaczania ręcznego, trzymając klawisz Shift. Wybrać funkcję pomiaru (measure) w menu analizy, aby wyświetlić całkowity obszar zmiany w oknie wyników.
    2. Wybrać funkcję wyczyść poza (clear outside) w menu edycji (edit). Zmienić typ obrazu na 8-bitowy w menu obrazu (image).
    3. Ustawić czerwony próg dla obszaru negatywnego pod kątem Oil Red O, wybierając funkcję progu (threshold) w podmenu dostosowania (adjust) menu obrazu. Kliknąć zastosuj (apply). Przekształcić obraz w binarny, wybierając tę opcję w podmenu binarnym (binary) menu procesu (process).
      UWAGA: Intensywność barwienia Oil Red O zazwyczaj różni się między partiami. Dlatego ustalanie progu kolorystycznego jest zalecane tylko w obrębie tej samej partii barwienia. Wynik powinien być przedstawiony wraz z opisem sposobu określenia i standaryzacji progu.
    4. Przeanalizować obraz, wybierając funkcję analizy cząstek (analyze particles) w menu analizy i kliknąć OK. Całkowity obszar zmiany negatywny pod kątem Oil Red O zostanie teraz wyświetlony w oknie podsumowania. Obliczyć względny obszar pozytywny pod kątem Oil Red O, odejmując obszar negatywny od całkowitego obszaru zmiany, a następnie dzieląc przez całkowity obszar zmiany.

Wyniki

W modelach mysich miażdżycy najbardziej wyraźne zmiany mają tendencję do rozwijania się w korzeniu aorty oraz łuku aorty. Niniejszy protokół opisuje kwantyfikację miażdżycy w korzeniu aorty, łuku aorty i tętnicy szyjno-głowowej u jednej myszy. Mierzalne zmiany w zstępującej części aorty piersiowej oraz w aorcie brzusznej występują jedynie u zwierząt w zaawansowanym stadium choroby. W tym protokole części te nie są analizowane pod kątem nasilenia miażdżycy, lecz są zachowywane do późniejszej analizy poziomów mRNA lub innych badań. Przekroje seryjne zmian miażdżycowych w korzeniu aorty są zazwyczaj przedstawiane na wykresie, gdzie na osi y znajduje się wielkość zmiany, a na osi x odległość od zatoki aorty28. Prawdziwe przekroje poprzeczne są kluczowe dla kwantyfikacji wielkości zmian. Przekroje skośne mogą prowadzić do zawyżenia wielkości zmian, a nachylenie wynoszące zaledwie 20° może zawyżyć bezwzględną powierzchnię zmiany o 15%29. Jednak obliczenie ułamka powierzchni zmiany w stosunku do całkowitej powierzchni naczynia sprawia, że wynik jest mniej wrażliwy na ewentualne różnice w kącie cięcia (Rycina 4A). Odpowiednią metodą statystyczną do wykrywania różnic między grupami jest zazwyczaj standardowa dwuczynnikowa analiza wariancji (ANOVA). Następnie przeprowadza się testy post-hoc Bonferroniego w celu wykrycia różnic na określonych poziomach. Jako test uzupełniający do ANOVA można również zastosować najmniejszą istotną różnicę Fishera. Zmniejsza ona prawdopodobieństwo wystąpienia błędu statystycznego typu II, ale nie uwzględnia wielokrotnych porównań. Dodatkowo, pomocne może być obliczenie pola pod krzywą lub średniej wielkości zmiany na mysz i przedstawienie danych na wykresie punktowym, aby lepiej zwizualizować zmienność osobniczą w obrębie grup (Rycina 4B).

Oil Red O to rozpuszczalny w tłuszczach, jasnoczerwony barwnik diazo, który barwi lipidy obojętne. Lipidy polarne w błonach komórkowych nie ulegają zabarwieniu. Barwienie Oil Red O można przeprowadzać na próbkach świeżych, mrożonych lub utrwalonych formaliną, ale nie na próbkach zatopionych w parafinie ze względu na usuwanie lipidów podczas wymaganego procesu deparafinizacji. Ilościowe oznaczenie akumulacji lipidów w zmianie można przeprowadzić poprzez wyznaczenie progu kolorystycznego dla obszaru pozytywnego z Oil Red O w stosunku do całkowitej powierzchni zmiany (Rysunek 4C). Hematoksylina barwi jądra komórkowe na niebiesko, co ułatwia wizualizację morfologii blaszki miażdżycowej. Prawa i lewa tętnica wieńcowa zazwyczaj odchodzą od aorty w odległości około 250 µm od zatoki aorty27, co często pokrywa się z obszarem największych zmian. Przekroje poprzeczne z tego regionu są często prezentowane jako wyniki reprezentatywne (Rysunek 4D).

figure-results-1
Rysunek 4: Zmiany miażdżycowe w korzeniu aorty. (AOceniono 28-tygodniowe samce chimer szpiku kostnego, karmione dietą zachodnią przez osiem tygodni, aby określić wpływ Smad7wpływ limfocytów T z niedoborem [brak określenia czynnika] na rozwój miażdżycy. Badania eksperymentalne Ldlr-/- otrzymane chimery Cd4-Cre+Smad7fl/fl odebrano szpik kostny oraz próbki kontrolne Cd4-Cre+Smad7fl/+ szpik kostny. Wykres przedstawia kwantyfikację powierzchni zmian miażdżycowych z ośmiu kolejnych przekrojów, 100 - 800 µm z zatoki aorty, przedstawionej jako ułamek zmiany w całkowitej powierzchni naczynia (Cd4-Cre+Smad7fl/+/Ldlr-/- n=6, Cd4-Cre+Smad7fl/fl/Ldlr-/- n = 9, dwuczynnikowa ANOVA z testem post-hoc Bonferroniego, wykres przedstawia średnią ±SEM, nawiasy klamrowe oznaczają poziom istotności dla porównania szczepów). (B) Połączony wykres punktowy i słupkowy przedstawia średnią powierzchnię zmian miażdżycowych w przekrojach pierścienia aorty (Cd4-Cre+Smad7fl/+/Ldlr-/- n=6, Cd4-Cre+Smad7fl/fl/Ldlr-/- n = 9, test t Studenta t-test) (C) Ułamek obszaru wybarwionego Oil Red O w zmianach (Cd4-Cre+Smad7fl/+/Ldlr-/- n = 4, Cd4-Cre+Smad7fl/fl/Ldlr-/- n = 6, test t Studenta t-test, ns=nieistotne statystycznie) (B-CKropki reprezentują poszczególne myszy, a słupki przedstawiają średnią ±SEM (skaningowa mikroskopia elektronowa).D) Reprezentatywne mikrofotografie przedstawiające barwienie Oil Red O (kolor czerwony) lipidów obojętnych w pierścieniu aorty 300 µm z zatoki aorty (powiększenie 50x), Pasek skali = 500 µm. *p ≤ 0.05, ***p ≤ 0,001. Rycina została zmodyfikowana na podstawie opracowania Gisterå i wsp.31. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Do barwienia aorty przygotowanej metodą en face można wykorzystać Oil Red O, jednak w niniejszym protokole zastosowano Sudan IV, który jest innym wygodnym, rozpuszczalnym w tłuszczach barwnikiem diazowym. Sudan IV wyraźnie uwidacznia blaszki miażdżycowe w kolorze pomarańczowo-czerwonym poprzez barwienie lipidów, triglicerydów i lipoprotein. Usunięcie ciemnego tła na reprezentatywnych obrazach łuków aorty przygotowanych en face może poprawić prezentację wizualną (Rycina 5A). Zazwyczaj wielkość zmian ma rozkład normalny w obrębie grup, co pozwala na przeprowadzenie testów statystycznych za pomocą testu t Studenta pomiędzy grupami. Wykres punktowy, przedstawiający zarówno poszczególne myszy, jak i średnią porównywaną między grupami, jest informatycznym sposobem prezentacji wyników (Rycina 5B-C). Ponieważ zmienność w obrębie grup zazwyczaj różni się w zależności od lokalizacji w drzewie naczyniowym, zazwyczaj konieczne jest przeprowadzenie oddzielnych obliczeń mocy statystycznej. Niepotrzebnej zmienności można uniknąć poprzez biegłość w metodzie i standaryzację protokołu. Uzyskanie wyników istotnych statystycznie jest ważne, jednak zawsze należy brać pod uwagę również znaczenie biologiczne zaobserwowanej różnicy.

figure-results-2
Rysunek 5: Zmiany miażdżycowe w łuku aorty i tętnicy szyjno-głowowej. (A) Reprezentatywne mikrografie łuków aorty w rzucie en face z blaszkami lipidowymi barwionymi Sudanem IV (kolor pomarańczowy) pobranych od 20-tygodniowych myszy karmionych dietą zachodnią przez dziesięć tygodni, przedstawione wspólnie. Pasek skali = 2 mm. Człowiek APOB100-transgeniczny Ldlr-/- (HuBL) myszy wykorzystano jako grupę kontrolną, a grupa eksperymentalna składała się z myszy transgenicznych TCR z limfocytami T reaktywnymi wobec LDL (BT1) skrzyżowano z HuBL myszy. (B) Zmiany miażdżycowe w łuku aorty (HuBL n = 10, BT1xHuBL n = 12; test t Studenta t-test). (C) Zmiany miażdżycowe w tętnicy szyjno-głowowej (HuBL n = 8, BT1xHuBL n = 9, test t Studenta t-test). (B-CKropki reprezentują poszczególne myszy, słupki przedstawiają średnią ±SEM.p ≤ 0,05. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Gisterå i wsp.32. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina dodatkowa 1: Alternatywna organizacja szkiełek dla przekrojów seryjnych pierścienia aorty. Uproszczona systematyczna organizacja szkiełek dla zbioru przekrojów z pierścienia aorty. Zbiór ten umożliwia barwienie lipidów Oil Red O oraz barwienie immunohistochemiczne lub immunofluorescencyjne. Pominięto dedykowane szkiełka do barwienia kolagenu czerwienią Picrosirius. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Choroby układu krążenia są głównym zabójcą na świecie i potrzebne są nowe pomiary zapobiegawcze2. Mysie modele choroby stanowią kompleksową platformę do badania patofizjologii i eksperymentalnych metod leczenia13. Wiarygodna kwantyfikacja wielkości zmiany ma zasadnicze znaczenie dla tego podejścia. Jednak metody oznaczania ilościowego różnią się w zależności od laboratorium. Standaryzacja i optymalizacja to proces trwający od 1980 roku 13,27,33,34. Korzenie aorty stały się najpopularniejszym miejscem do ilościowego określania eksperymentalnej miażdżycy. Przekroje blaszek umożliwiają porównanie objętości blaszki miażdżycowej pomiędzy grupami. Preparaty en face są preferowane do ilościowego oznaczania zmian w większych segmentach aorty. Metoda en face wizualizuje ilość płytki nazębnej i umożliwia ilościowe określenie pokrycia obszaru płytki nazębnej, ale nie uwzględnia grubości płytki nazębnej. Biologiczne znaczenie obserwowanych różnic jest poparte spójnymi wynikami w różnych miejscach drzewa naczyniowego. Ocena rozwoju miażdżycy w różnych lokalizacjach dotyczy możliwych skutków specyficznych dla danego miejsca. Wpływ przeszczepionych komórek krwiotwórczych na rozwój miażdżycy można ocenić w chimerach Ldlr-/-, z hipercholesterolemią. Jednak napromienianie całego ciała wpływa na proces miażdżycy, wywołując skutki specyficzne dla danego miejsca. Bardziej widoczne zmiany miażdżycowe rozwijają się w korzeniu aorty, natomiast zmniejszony rozwój zmian obserwuje się w łukach aorty35.

Co ważne, w badaniach eksperymentalnej miażdżycy należy zająć się nie tylko wielkością zmiany. Kluczowym parametrem jest również skład zmian chorobowych. Kilka cech płytki nazębnej powiązano z objawami choroby u ludzi36. Seryjne cięcie korzenia aorty pozostawia kilka sekcji dostępnych do dokładnej analizy składu płytki nazębnej. Pęknięcie blaszki miażdżycowej u ludzi charakteryzuje się cienką włóknistą czapeczką z niewielką liczbą komórek mięśni gładkich, rzadką zawartością kolagenu i objawami stanu zapalnego w blaszkach36. Chociaż pęknięcie płytki nazębnej jest rzadkim zdarzeniem w mysich modelach miażdżycy, markery stabilności płytki miażdżycowej są pouczające do oceny. Podejścia translacyjne mogą potwierdzić wyniki badań mechanistycznych z modeli mysich i odkryć ważne cechy chorób u ludzi31. Stan zapalny blaszek miażdżycowych można określić za pomocą barwienia immunohistochemicznego VCAM-1, MHC klasy II, makrofagów i limfocytów30. Niektóre protokoły wykorzystują przekroje podłużne w płaszczyźnie czołowej łuku aorty lub tętnicy ramienno-głowowej do pomiaru wielkości i składu zmian miażdżycowych37. Jednak ta alternatywna metoda pozostawia tylko kilka sekcji do analizy, co ogranicza jej zastosowania.

Pierwszym krytycznym krokiem w tym protokole jest zdolność do skutecznego pobierania aort. Koordynacja ręka-oko pod mikroskopem wymaga praktyki i ma kluczowe znaczenie zarówno dla mikrodysekcji, jak i późniejszego unieruchomienia łuku aorty. Kolejnym krytycznym krokiem w tym protokole jest pobranie szeregowych odcinków z korzenia aorty. Dla każdej myszy należy zebrać osiemdziesiąt kolejnych sekcji, co wymaga zarówno skupienia, jak i cierpliwości. Biegłość metodologiczna mogłaby znacznie przyspieszyć opisane procesy. Niemniej jednak kwantyfikacja zmian miażdżycowych jest nadal czasochłonnym zadaniem. Nowa technologia, zautomatyzowana obsługa i obrazowanie małych zwierząt mogą w przyszłości ułatwić ilościowe określenie eksperymentalnej miażdżycy. Postęp miażdżycy jest powolny, a większość protokołów eksperymentalnych w modelach mysich zajmuje ponad cztery miesiące, aby ukończyć13. W związku z tym aorty muszą być pobierane w zoptymalizowany sposób w punktach końcowych badania. Protokół ten stanowi kompleksowy przewodnik po efektywnym pobieraniu aort, a proponowane przetwarzanie przygotowuje aorty do wielozadaniowego zastosowania, w tym do ilościowego oznaczania zmian w korzeniu aorty, łuku aorty i tętnicy ramienno-głowowej. Miejmy nadzieję, że protokół może zmniejszyć zmienność eksperymentalną, zwiększyć wiarygodność wyników i doprowadzić do odkryć, które utorują drogę do nowych metod leczenia miażdżycy.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy wszystkim byłym członkom eksperymentalnej jednostki badawczej Görana K Hanssona, która pomogła rozwinąć ten protokół w ciągu ostatniego ćwierćwiecza. Jesteśmy szczególnie wdzięczni za wkład Antonino Nicoletti, Xinghua Zhou, Anny-Karin Robertson i Inger Bodin. Praca ta była wspierana przez grant 06816 i wsparcie Linneusza 349-2007-8703 ze Szwedzkiej Rady ds. Badań Naukowych oraz przez granty ze Szwedzkiej Fundacji Serca-Płuc, Rady Hrabstwa Sztokholm, Fundacji Profesor Nanny Svartz, Fundacji Loo i Hansa Ostermanów na rzecz Badań Medycznych, Fundacji Badawczej Karolinska Institutet oraz Fundacji Chorób Geriatrycznych przy Karolinska Institutet.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetonVWR Chemicals20066.296Do utrwalania skrawków do immunohistochemii.
taśma elektroizolacyjna (szerokość 50 mm)Każdy wyspecjalizowany sprzedawca-Dotworzenia łóżek przypinających do łuków aorty.
WirówkaEppendorf5417CMikrowirówka stołowa.
Tablica korkowaKażdy wyspecjalizowany sprzedawca-Do wycinania serc w ramach przygotowań do kriomontażu korzeni aorty.
CryostatThermo ScientificMicrom HM 560Do seryjnej kriosekcji korzeni aorty.
Woda dejonizowana-do płukania i przygotowywania roztworów.
Cyfrowy aparatLeica MicrosystemsDC4805,1 megapiksela CCD do zdjęć w wysokiej rozdzielczości łuków aorty i odcinków korzeni aorty.
Nożyczki preparacyjne (10 cm, proste)World Precision Instruments14393Do ogólnego preparowania narządów.
Kleszcze Dumont #5 (11 cm, proste)World Precision Instruments500341Do mikrodysekcji aorty.
Etanol 70% (v/v)VWR Chemicals83801.290Wysoce łatwopalne ciecze i pary, przechowywać w dobrze wentylowanym miejscu i przechowywać w chłodnym miejscu.
Etanol absolutny ≥ 99,8%VWR Chemicals20821.310Wysoce łatwopalne ciecze i pary, przechowywać w dobrze wentylowanym miejscu i przechowywać w chłodnym miejscu.
Formaldehyd 4% stabilizowany, buforowany (pH 7,0)VWR Chemicals9713.1000Działa szkodliwie przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu.
Oprogramowanie doanalizy obrazuImageJ NIH.
Kleszczyki do tęczówki (10 cm, zakrzywione, ząbkowane)World Precision Instruments15915-GUżywane jako kleszcze anatomiczne.
IzopropanolMerck1096341011łatwopalna ciecz, powoduje poważne podrażnienie oczu i może powodować senność lub zawroty głowy.
Kaiser's glicerol gelatynaMerck1092420100Wodne podłoże montażowe zawierające fenol. Podejrzewa się, że powoduje wady genetyczne.
Mikroskop świetlnyLeica MicrosystemsDM LB2Do analizy podczas przekrojów i dokumentacji mikrofotografii barwionych czerwienią olejową.
Mayer's hematoxylinHistolab1820Nietoksyczny roztwór barwiący bez hydratu chloralu, ale powoduje poważne podrażnienie oczu.
Nożyczki Mayo (17 cm, proste)World Precision Instruments501751-GDo ogólnego rozwarstwienia.
Uchwyt na igłę Micro Castroviejo (9 cm, prosty)World Precision Instruments503376Do przypinania łuków aorty.
Probówki do mikrowirówekCorningMCT-175-CMikroprobówki polipropylenowe z nasadką zatrzaskową.
Microlance 3 igły, rozmiar 23BD300800Do pobierania krwi.
Microlance 3 igły, 27 gaugeBD302200Do perfuzji myszy.
Mikrovette 500 i mikro; L, K3 EDTASarstedt20.1341.100Do pobierania krwi.
Mikrovette 500 i mikro; L, Heparyna litowaSarstedt20.1345.100Do pobierania krwi.
Szpilki do owadów Minutien, 0,10 mmFine Science Tools26002-10Do przypinania łuków aorty.
Olej Red OSigma-AldrichO0625Nie klasyfikowany jako substancja lub mieszanina stwarzająca zagrożenie.
Optymalna temperatura cięcia (OCT) cryomountHistolab45830Do zatapiania tkanki.
Parafilm MBemisPM992Folia parafinowa stosowana do tworzenia łożysk pinowych dla łuków aorty.
Szalki Petriego (100 mm x 20 mm)Dowolny dostawca kultur komórkowych-Proponowany jako pojemnik do przechowywania upiętych aort.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)-sterylny i wolny od RNaz roztwór jest wymagany do perfuzji myszy.
Jakościowa bibuła filtracyjna (klasa 1001)Munktell120006Do filtrowania roztworu roboczego Oil Red O (typowa retencja 2-3 &mikro; m).
Odczynnik stabilizujący RNAlater RNAQiagen76106Do stabilizacji RNA w próbkach tkanek
RNaseZap Roztwór do dekontaminacji RNazyInvitrogenAM9780Roztwór do dekontaminacji powierzchni, który niszczy RNazy w kontakcie.
Rękojeść do skalpela #3 (13 cm)World Precision Instruments500236Do wycinania serc w ramach przygotowań do kriomontażu korzeni aorty.
Standardowe ostrze skalpela #10World Precision Instruments500239Do wycinania serc w przygotowaniu do kriomontażu korzeni aorty.
Mikroskop stereoskopowyLeica MicrosystemsMZ6Do preparacji i dokumentacji en face
Sudan IVSigma-AldrichS4261Nie klasyfikowany jako substancja lub mieszanina niebezpieczna.
Preparaty mikroskopowe Superfrost PlusThermo ScientificJ1800AMNZDo pobierania odcinków korzenia aorty.
Kleszczyki do tkanek (15 cm)World Precision Instruments501741-GDo ogólnego preparowania.
Krioformy Tissue-Tek (10 mm x 10 mm x 5 mm)Sakura4565Do osadzania korzeni aorty w OCT.
Nożyczki Vannas (8 cm, proste)World Precision Instruments503378Do mikrodysekcji aorty.

Bibliografia

  1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
  2. Gistera, A., Hansson, G. K. The immunology of atherosclerosis. Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 368-380 (2017).
  3. Hansson, G. K. Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease. New England Journal of Medicine. 352 (16), 1685-1695 (2005).
  4. Williams, K. J., Tabas, I. The response-to-retention hypothesis of early atherogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 15 (5), 551-561 (1995).
  5. Pentikainen, M. O., Oorni, K., Ala-Korpela, M., Kovanen, P. T. Modified LDL - trigger of atherosclerosis and inflammation in the arterial intima. Journal of Internal Medicine. 247 (3), 359-370 (2000).
  6. Ruuth, M., et al. Susceptibility of low-density lipoprotein particles to aggregate depends on particle lipidome, is modifiable, and associates with future cardiovascular deaths. European Heart Journal. 39 (27), 2562-2573 (2018).
  7. Nakashima, Y., Raines, E. W., Plump, A. S., Breslow, J. L., Ross, R. Upregulation of VCAM-1 and ICAM-1 at atherosclerosis-prone sites on the endothelium in the ApoE-deficient mouse. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18 (5), 842-851 (1998).
  8. Goldstein, J. L., Ho, Y. K., Basu, S. K., Brown, M. S. Binding site on macrophages that mediates uptake and degradation of acetylated low density lipoprotein, producing massive cholesterol deposition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 333-337 (1979).
  9. Paigen, B., Morrow, A., Brandon, C., Mitchell, D., Holmes, P. Variation in susceptibility to atherosclerosis among inbred strains of mice. Atherosclerosis. 57 (1), 65-73 (1985).
  10. Russell, E. S. Origins and history of mouse inbred strains: contributions of Clarence Cook Little. Origins of Inbred Mice, Morse, HC, eds. (Academic Press, NY). , 33-43 (1978).
  11. Waterston, R. H., et al. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420 (6915), 520-562 (2002).
  12. Gistera, A., Ketelhuth, D. F. J. Lipid-driven immunometabolic responses in atherosclerosis. Current Opinion in Lipidology. 29 (5), 375-380 (2018).
  13. Maganto-Garcia, E., Tarrio, M., Lichtman, A. H. Mouse models of atherosclerosis. Current Protocols in Immunology. Chapter 15, Unit 15.24.11-23 (2012).
  14. Plump, A. S., et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 71 (2), 343-353 (1992).
  15. Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 258 (5081), 468-471 (1992).
  16. Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. Journal of Clinical Investigation. 92 (2), 883-893 (1993).
  17. Ishibashi, S., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Herz, J., Burns, D. K. Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice. Journal of Clinical Investigation. 93 (5), 1885-1893 (1994).
  18. Ketelhuth, D. F., Gistera, A., Johansson, D. K., Hansson, G. K. T cell-based therapies for atherosclerosis. Current Pharmaceutical Design. 19 (33), 5850-5858 (2013).
  19. Skalen, K., et al. Subendothelial retention of atherogenic lipoproteins in early atherosclerosis. Nature. 417 (6890), 750-754 (2002).
  20. Boren, J., et al. Identification of the low density lipoprotein receptor-binding site in apolipoprotein B100 and the modulation of its binding activity by the carboxyl terminus in familial defective apo-B100. Journal of Clinical Investigation. 101 (5), 1084-1093 (1998).
  21. Sanan, D. A., et al. Low density lipoprotein receptor-negative mice expressing human apolipoprotein B-100 develop complex atherosclerotic lesions on a chow diet: no accentuation by apolipoprotein(a). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (8), 4544-4549 (1998).
  22. Gistera, A., et al. Vaccination against T-cell epitopes of native ApoB100 reduces vascular inflammation and disease in a humanized mouse model of atherosclerosis. Journal of Internal Medicine. , (2017).
  23. Johnson, J. L., Jackson, C. L. Atherosclerotic plaque rupture in the apolipoprotein E knockout mouse. Atherosclerosis. 154 (2), 399-406 (2001).
  24. Calara, F., et al. Spontaneous plaque rupture and secondary thrombosis in apolipoprotein E-deficient and LDL receptor-deficient mice. The Journal of Pathology. 195 (2), 257-263 (2001).
  25. Caligiuri, G., Levy, B., Pernow, J., Thoren, P., Hansson, G. K. Myocardial infarction mediated by endothelin receptor signaling in hypercholesterolemic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (12), 6920-6924 (1999).
  26. Daugherty, A., et al. Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), e131-e157 (2017).
  27. Paigen, B., Morrow, A., Holmes, P. A., Mitchell, D., Williams, R. A. Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice. Atherosclerosis. 68 (3), 231-240 (1987).
  28. Purcell-Huynh, D. A., et al. Transgenic mice expressing high levels of human apolipoprotein B develop severe atherosclerotic lesions in response to a high-fat diet. Journal of Clinical Investigation. 95 (5), 2246-2257 (1995).
  29. Nicoletti, A., Kaveri, S., Caligiuri, G., Bariety, J., Hansson, G. K. Immunoglobulin treatment reduces atherosclerosis in apo E knockout mice. Journal of Clinical Investigation. 102 (5), 910-918 (1998).
  30. Gistera, A., Ketelhuth, D. F. Immunostaining of Lymphocytes in Mouse Atherosclerotic Plaque. Methods in Molecular Biology. 1339, 149-159 (2015).
  31. Gistera, A., et al. Transforming growth factor-beta signaling in T cells promotes stabilization of atherosclerotic plaques through an interleukin-17-dependent pathway. Science Translational Medicine. 5 (196), 196ra100 (2013).
  32. Gistera, A., et al. Low-Density Lipoprotein-Reactive T Cells Regulate Plasma Cholesterol Levels and Development of Atherosclerosis in Humanized Hypercholesterolemic Mice. Circulation. 138 (22), 2513-2526 (2018).
  33. Daugherty, A., Whitman, S. C. Quantification of atherosclerosis in mice. Methods in Molecular Biology. 209, 293-309 (2003).
  34. Baglione, J., Smith, J. D. Quantitative assay for mouse atherosclerosis in the aortic root. Methods in Molecular Biology. 129, 83-95 (2006).
  35. Schiller, N. K., Kubo, N., Boisvert, W. A., Curtiss, L. K. Effect of gamma-irradiation and bone marrow transplantation on atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 21 (10), 1674-1680 (2001).
  36. Naghavi, M., et al. From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part I. Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).
  37. Seijkens, T. T. P., et al. Targeting CD40-Induced TRAF6 Signaling in Macrophages Reduces Atherosclerosis. Journal of the American College of Cardiology. 71 (5), 527-542 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ilo ciowe oznaczanie mia d ycymodele mysieanaliza pier cioniasta aortyanaliza uku aortyt tnica szyjno g owowabarwienie Sudanem IVbarwienie Oil Red Otechnika kriotomiianaliza en facepomiar wielko ci zmian

Powiązane artykuły