Artykuł metodologiczny

Przejściowe leczenie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych DMSO w celu promowania różnicowania

14.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59833

⸱

17 lipca 2019

 ,  ,  , 
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine, 2Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Generowanie zróżnicowanych typów komórek z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) jest bardzo obiecujące terapeutycznie, ale nadal stanowi wyzwanie. PSC często wykazują wrodzoną niezdolność do różnicowania, nawet gdy są stymulowane odpowiednim zestawem sygnałów. Opisane tutaj jest proste narzędzie do zwiększania różnicowania wieloliniowego w różnych liniach PSC.

Streszczenie

Pomimo rosnącego wykorzystania pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC), wyzwania związane z efektywnym różnicowaniem embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (ESC i iPSC) w różnych liniach pozostają. Opracowano wiele protokołów różnicowania, jednak zmienność między liniami komórkowymi i niskie wskaźniki różnicowania stanowią wyzwanie dla pomyślnego wdrożenia tych protokołów. Opisany poniżej jest łatwy i niedrogi sposób na zwiększenie zdolności różnicowania PSC. Wcześniej wykazano, że leczenie komórek macierzystych o niskim stężeniu dimetylosulfotlenku (DMSO) znacznie zwiększa skłonność różnych PSC do różnicowania się do różnych typów komórek po ukierunkowanym różnicowaniu. Wykazano, że technika ta jest skuteczna u różnych gatunków (np. myszy, naczelnych i ludzi) w wielu liniach, od neuronów i sferoid korowych po komórki mięśni gładkich i hepatocyty. Wstępna obróbka DMSO poprawia różnicowanie PSC poprzez regulację cyklu komórkowego i przygotowanie komórek macierzystych, aby były bardziej wrażliwe na sygnały różnicowania. Poniżej przedstawiono szczegółową metodologię wykorzystania tego prostego narzędzia jako powtarzalnego i szeroko stosowanego środka do skuteczniejszego różnicowania PSC według dowolnej wybranej linii.

Wprowadzenie

Wykorzystanie pluripotencjalnych komórek macierzystych doprowadziło do licznych postępów w badaniach biomedycznych, w tym w dziedzinie medycyny regeneracyjnej i terapii opartych na komórkach macierzystych, modelowania chorób i badań przesiewowych leków. Doprowadziło to również do powstania ogólnej perspektywy bardziej przekładalnych badań i medycyny spersonalizowanej. Pojawienie się technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) ponad 20 lat temu umożliwiło naukowcom opracowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych z tkanek somatycznych i zróżnicowanie ich w funkcjonalne typy komórek w celu zbadania różnych patologii, w tym chorób sercowo-naczyniowych, neurologicznych i immunologicznych. Chociaż poczyniono znaczne postępy w technologii różnicowania komórek macierzystych, nadal istnieją wyzwania związane ze skutecznym różnicowaniem ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i iPSC, co ogranicza powszechne stosowanie technologii komórek macierzystych w różnych programach badawczych. Wrodzona zmienność między różnymi liniami komórkowymi i klonami nadal stanowi przeszkodę w różnicowaniu linii komórek macierzystych do pożądanych linii1. Co więcej, wyprowadzanie dojrzałych, terminalnie zróżnicowanych funkcjonalnych komórek z hPSC pozostaje żmudnym i nieefektywnym procesem w wielu liniach genetycznych. W rzeczywistości komórki zróżnicowane z hPSC często nie różnicują się ostatecznie w funkcjonalne komórki2. W dalszym rozwoju terapii opartych na komórkach macierzystych do stosowania u pacjentów istnieje potrzeba poprawy i zapewnienia skuteczności komórek generowanych z hPSC.

Nasze laboratorium stworzyło szybkie i niedrogie narzędzie, które znacznie zwiększa efektywność różnicowania zarówno iPSC, jak i ESC w dojrzałe typy komórek. Odkryliśmy, że wstępne traktowanie hiPSC i hESC powszechnie stosowanym odczynnikiem dimetylosulfotlenku (DMSO) przez 24 godziny do 48 godzin przed ukierunkowanym różnicowaniem powoduje wyraźną poprawę zdolności różnicowania komórek macierzystych. Leczenie DMSO zwiększa odsetek hiPSC i hESC we wczesnej fazie G1 cyklu komórkowego i aktywuje białko siatkówczaka (Rb)3, krytyczny regulator proliferacji, przeżycia i różnicowania komórek4. W nowszych pracach stwierdzono, że Rb i członkowie jego rodziny są wymagani do pro-różnicujących efektów DMSO, tak że przejściowa inaktywacja Rb tłumi efekty DMSO, podczas gdy konstytutywna aktywacja Rb w sposób przejściowy wzmacnia efekty DMSO5. Analogicznie do cyklu komórkowego podczas rozwoju embrionalnego, cykl komórkowy ESC i iPSC charakteryzuje się skróconą fazą G1, która sprzyja samoodnawianiu6,7,8. Ta skrócona faza G1 pozwala na bardziej nieograniczoną proliferację, ale ogranicza potencjał różnicowania4,9. Promując zatrzymanie wzrostu w G1 i aktywując kontrole punktów kontrolnych w cyklu komórkowym hESC i iPSC, leczenie DMSO przygotowuje komórki do zmian losu komórek po ukierunkowanym różnicowaniu.

Do tej pory wykazano, że wstępna obróbka DMSO poprawia zdolność różnicowania wszystkich trzech listków zarodkowych w ponad 30 kontrolnych i specyficznych dla choroby ludzkich liniach komórkowych ESC i iPSC3,5, a także różnicowanie komórek macierzystych i innych linii komórkowych do wielu innych dojrzałych typów komórek w kolejnych badaniach10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 (Tabela 1). Ponadto wykazano, że leczenie DMSO jest skuteczne w zwiększaniu różnicowania komórek pierwotnych innych niż ludzkie21,23 (np. mysz, naczelne, króliki), co sugeruje wspólne mechanizmy dla różnych gatunków. Wreszcie, wstępne leczenie DMSO zostało również rozszerzone o technologię edycji genów, przy czym jedno konkretne badanie wykazało, że 24-godzinna wstępna obróbka DMSO hESC/iPSC znacznie zwiększyła zdolność do wydajności edycji niekodującego DNA za pośrednictwem białka 9 (Cas9) za pośrednictwem Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein-9 (Cas9) bez włączania niezamierzonych mutacji29. Poniżej przedstawiono szczegółową metodologię wstępnego traktowania hESC i iPSC za pomocą DMSO do zastosowań w biologii komórek macierzystych i ukierunkowanym różnicowaniu.

Protokół

1. Utrzymanie komórek macierzystych

UWAGA: Opisany poniżej protokół utrzymania komórek dotyczy komórek macierzystych (PSC) utrzymywanych w przylegającej monowarstwie. Pożywki, inne odczynniki i płytki do hodowli komórkowych używane przed leczeniem DMSO można dostosować w razie potrzeby. W przypadku wszystkich poniższych protokołów zawartych w tym manuskrypcie, komórki powinny być traktowane pod komorą bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Pokryj sterylne, 6-dołkowe, poddane kulturze tkankowej matrycę lub substrat kwalifikowany do pluripotencjalnych komórek macierzystych przygotowany zgodnie z instrukcjami producenta i inkubuj przez co najmniej 1 godzinę w inkubatorze CO2 (5% CO2, wilgotna atmosfera). Powlekane płyty można owijać folią i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.
  2. Rozmrozić kriokonserwowane PSC w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Wysterylizuj fiolkę etanolem przed wprowadzeniem do komory bezpieczeństwa biologicznego, a następnie natychmiast przenieś komórki przez pipetowanie do sterylnej stożkowej probówki zawierającej 5-10 objętości wstępnie podgrzanej pożywki z komórek macierzystych.
  3. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  4. Odessać pożywkę i delikatnie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki z komórkami macierzystymi uzupełnionej inhibitorem 10 μM ROCK, takim jak Y-27632.
  5. Odessać matrycę hodowlaną z płytki i wysiać komórki o pożądanej gęstości, zwykle 0,5-1 x 106 komórek na studzienkę w co najmniej 2 ml pożywki z komórek macierzystych na studzienkę.
    nuta: Gęstość posiewu może się różnić w zależności od linii komórkowych i klonów i powinna być odpowiednio zoptymalizowana.
  6. Utrzymuj komórki, codziennie zastępując je wstępnie podgrzanym podłożem z komórek macierzystych. Podziel komórki przy około 70%-80% zbiegu lub gdy kolonie komórek zaczną się stykać.
  7. W celu rozszczepienia komórek należy odessać pożywkę i raz umyć komórki sterylnym PBS. Inkubować komórki z 1 ml roztworu enzymu dysocjacyjnego na studzienkę przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C.
  8. Umyj i ponownie zawieś komórki za pomocą wstępnie podgrzanej pożywki z komórek macierzystych i przenieś do sterylnej stożkowej probówki z 5-10 objętościami pożywki z komórek macierzystych. Wykonaj kroki 1.3-1.7, aby pokryć komórki.

2. Wstępna obróbka DMSO

UWAGA: Podczas posiewu komórek do wstępnej obróbki DMSO przed różnicowaniem, początkowa gęstość komórek posiewu powinna być zoptymalizowana z uwzględnieniem typowego tempa wzrostu linii komórek macierzystych, jak również stosowanego protokołu różnicowania. W razie potrzeby zweryfikuj pluripotencję za pomocą konwencjonalnych markerów. Komórki powinny być pasażowane co najmniej 1x-2x po wstępnym rozmrożeniu przed różnicowaniem.

  1. Różnicowanie kultur 2D
    1. Gdy komórki osiągną odpowiednie zbiegowisko, należy przygotować powlekane płytki, rozdzielić komórki i przygotować zawiesinę jednokomórkową, jak opisano powyżej.
    2. Policz żywe komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek, w tym błękitu trypana lub innego markera żywotności.
    3. Umieść komórki na powlekanej 6-dołkowej płytce w proporcji 0,5-1 x 106 komórek na dołek w pożywce z komórkami macierzystymi za pomocą inhibitora 10 μM ROCK.
      nuta: W przypadku linii komórkowych testowanych w naszym laboratorium gęstości te zazwyczaj skutkowały 80%-90% zlewającymi się komórkami w ciągu 24-godzinnej obróbki wstępnej DMSO.
    4. Pozostawić komórki do inkubacji przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 (5 % CO2 , wilgotna atmosfera).
    5. Przygotuj 1%-2% DMSO w podgrzanym podłożu z komórkami macierzystymi (np. 100 μL DMSO w 10 ml pożywki = 1% roztwór DMSO lub 200 μl DMSO w 10 ml pożywki = 2% roztwór DMSO).
    6. Po 24 godzinnej inkubacji odessać pożywkę z komórek i zastąpić ją roztworem DMSO.
    7. Pozostawić komórki do inkubacji przez 24 godziny do 48 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 (5 % CO2 w wilgotnej atmosferze) przed różnicowaniem.
      nuta: Zazwyczaj 24-godzinne leczenie DMSO jest wystarczające w większości ludzkich linii ESC i iPSC. Linie komórkowe o bardzo wolnym tempie wzrostu (długie czasy podwajania) mogą odnieść korzyści z 48-godzinnej inkubacji z DMSO. W przypadku 48-godzinnej inkubacji z DMSO, pożywkę można zastąpić świeżą pożywką z komórek macierzystych o zawartości 1%-2% DMSO po pierwszych 24 godzinach leczenia.
  2. Różnicowanie kultur 3D:
    1. Gdy komórki osiągną odpowiednie zbieganie, należy je rozdzielić i zebrać w zawiesinie komórkowej, jak opisano powyżej.
    2. Policz żywe komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek wraz ze znacznikiem żywotności.
    3. Umieść komórki w niepowlekanej, 6-dołkowej płytce o niskim stopniu przylegania w 0,5-1 x 106 komórek na dołek w pożywce z komórkami macierzystymi z inhibitorem 10 μM ROCK.
      nuta: W przypadku linii komórkowych testowanych w naszym laboratorium gęstości te zazwyczaj skutkowały powstawaniem sfery 3D hPSC w ciągu 24 godzin od ustawienia komórek.
    4. Pozostawić komórki do inkubacji przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 (5 % CO2 , wilgotna atmosfera).
    5. Przygotuj 1%-2% DMSO we wstępnie podgrzanym podłożu z komórkami macierzystymi (np. 100 μL DMSO w 10 ml pożywki = 1% roztwór DMSO lub 200 μl DMSO w 10 ml pożywki = 2% roztwór DMSO).
    6. Wymienić pożywkę zgodnie ze standardowymi procedurami (np. przechylić płytkę pod kątem 30°-45°, aby kulki komórkowe osiadły na dnie studzienki; przenieść komórki do sterylnej probówki stożkowej i pozwolić, aby kulki komórkowe osiadły na dnie probówki; lub delikatnie zebrać komórki w zawiesinie za pomocą pipety o pojemności 5 lub 10 ml do sterylnej probówki stożkowej i odwirować komórki w ilości 300 x g przez 5 min przy RT).
    7. Odessać pożywkę z komórek i zastąpić ją roztworem DMSO, delikatnie pipetując.
    8. Pozostawić komórki do inkubacji przez 24 godziny do 48 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 (5 % CO2 w wilgotnej atmosferze) przed różnicowaniem.
      nuta: Zazwyczaj 24-godzinne leczenie DMSO jest wystarczające w większości ludzkich linii ESC i iPSC. Linie komórkowe o bardzo wolnym tempie wzrostu (długie czasy podwajania) mogą odnieść korzyści z 48-godzinnej inkubacji z DMSO. W przypadku 48-godzinnej inkubacji z DMSO, pożywkę można zastąpić świeżą pożywką z komórek macierzystych o zawartości 1%-2% DMSO po pierwszych 24 godzinach leczenia.

3. Różnicowanie do pierwotnych listków zarodkowych

UWAGA: Poniższe opisują metody, które wcześniej okazały się skuteczne w naszym laboratorium dla PSC hodowanych w monowarstwie na płytkach 6-dołkowych. Po leczeniu DMSO należy zastosować dowolny wybrany protokół różnicowania, aby promować różnicowanie do pożądanych linii. Usuń roztwór DMSO po 24-48 godzinach leczenia i kontynuuj różnicowanie zgodnie ze standardowymi protokołami.

  1. Różnicowanie endodermy (na podstawie Kroon et al.30)
    1. Wstępnie potraktuj komórki DMSO, jak opisano powyżej dla kultur 2D.
    2. Przygotować roztwory podstawowe Wnt3a i Activin A.
    3. Przygotować pożywkę do różnicowania endodermalnego dnia 1, dodając Wnt3a do końcowego stężenia 20 ng/ml i aktywinę A do końcowego stężenia 100 ng/ml do odpowiedniej objętości wstępnie podgrzanej pożywki RPMI.
    4. Po wstępnej obróbce DMSO odessać pożywkę z komórek i zastąpić ją pożywką dnia 1 (np. 2 ml na dołek płytki 6-dołkowej).
    5. Pozostawić komórki do inkubacji przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 (5 % CO2 , wilgotna atmosfera).
    6. Przygotować pożywkę do różnicowania endodermalnego dnia 2 i 3, dodając Activinę A do końcowego stężenia 100 ng / ml do odpowiedniej objętości wstępnie podgrzanej pożywki RPMI.
    7. Odessać pożywkę z komórek i zastąpić ją pożywką dnia 2 (np. 2 ml na dołek płytki 6-dołkowej).
    8. Pozostawić komórki do inkubacji przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 (5 % CO2 , wilgotna atmosfera).
    9. Odessać pożywkę z komórek i zastąpić pożywką dnia 3 (np. 2 ml na dołek płytki 6-dołkowej).
  2. Różnicowanie mezodermy (zaadaptowane z Zhang et al.31)
    1. Wstępnie potraktuj komórki DMSO, jak opisano powyżej dla kultur 2D.
    2. Przygotować roztwory podstawowe Wnt3a i Activin A.
    3. Przygotować mezodermalne pożywki różnicujące, dodając Wnt3a do końcowego stężenia 20 ng/ml i Activinę A do końcowego stężenia 100 ng/ml do odpowiedniej objętości wstępnie podgrzanych zaawansowanych pożywek RPMI.
    4. Po wstępnej obróbce DMSO odessać pożywkę z komórek i zastąpić pożywką różnicującą (np. 2 ml na dołek płytki 6-dołkowej).
    5. Pozostawić komórki do inkubacji przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 (5 % CO2 , wilgotna atmosfera).
  3. Różnicowanie ektodermy (zaadaptowane z Chambers et al.32)
    1. Wstępnie potraktuj komórki DMSO, jak opisano powyżej dla kultur 2D.
    2. Przygotuj roztwory podstawowe Noggin i SB431542.
    3. Przygotować ektodermalne podłoża bazowe różnicujące, rozpuszczając zamiennik surowicy nokautującej (KOSR) do końcowego stężenia 10% w nokautującym DMEM.
      nuta: Przygotuj wystarczającą ilość podłoża bazowego na 3-4 dni wymiany nośnika.
    4. Przygotować ektodermalne pożywki różnicujące, dodając Noggin do końcowego stężenia 500 ng/ml i SB431542 do końcowego stężenia 10 μM do odpowiedniej objętości wstępnie podgrzanego KOSR/knockout DMEM.
    5. Po wstępnej obróbce DMSO odessać pożywkę z komórek i zastąpić pożywką różnicującą (np. 2 ml na dołek płytki 6-dołkowej).
    6. Pozostawić komórki do inkubacji przez 3-4 dni w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 (5% CO2 , wilgotna atmosfera), zastępując codziennie pożywkę świeżo dodanymi czynnikami różnicującymi.

4. Różnicowanie do typów komórek progenitorowych

Poniższe metody opisują metody, które wcześniej okazały się skuteczne w naszym laboratorium dla PSC hodowanych w kulturach 2D lub 3D. Po leczeniu DMSO należy zastosować dowolny wybrany protokół różnicowania, aby promować różnicowanie do pożądanych linii. Usuń roztwór DMSO po 24-48 godzinach leczenia i kontynuuj różnicowanie zgodnie ze standardowymi protokołami.

  1. Różnicowanie neuronalnych komórek progenitorowych (zaadaptowane z Tchieu et al.33)
    1. Przygotować 6-dołkowe płytki, pokrywając matrycą lub substratem o zredukowanym czynniku wzrostu zakwalifikowanym do pluripotencjalnych komórek macierzystych, zgodnie z instrukcjami producenta, przez co najmniej 1 godzinę w inkubatorze CO2 (5% CO2 , wilgotna atmosfera). Powlekane płyty można owijać folią i przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.
    2. Płytki PSC, jak opisano powyżej, o gęstości 0,5-1 x 106 komórek na studzienkę w pożywce z komórek macierzystych zawierającej inhibitor ROCK.
    3. Wstępnie potraktuj komórki DMSO, jak opisano powyżej dla kultur 2D.
    4. Przygotuj małe inhibitory chemiczne LDN193189, SB431542 i roztwory podstawowe XAV939.
    5. Przygotuj pożywki różnicujące neuroektodermę na dni 1-3, uzupełniając pożywkę Essential 6 o LDN193189 500 nM, SB431542 10 μM i 2 μM XAV939.
    6. Po wstępnym leczeniu DMSO odessać pożywkę i zastąpić pożywką neuroektodermą dni 1-3 (np. 2 ml na dołek płytki 6-dołkowej). Zmieniaj media codziennie.
    7. Przygotuj pożywkę różnicującą neuroektodermę w dniach 4-12, uzupełniając pożywkę Essential 6 LDN193189 500 nM i SB431542 10 μM.
    8. W 4 dniu różnicowania odessać pożywkę i zastąpić ją pożywką neurodektodermą w dniach 4-12. Zmieniaj nośniki codziennie.
    9. Po 12 dniach różnicowania zróżnicowane komórki powinny wykazywać ekspresję odpowiednich markerów nerwowych komórek progenitorowych (NPC). NPC mogą być dalej utrzymywane w ośrodkach nerwowych zawierających DMEM/F-12, 2% B-27, 1% N-2 i uzupełnione 10 μg/ml zasadowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF). Przenikaj NPC podczas zlewania się za pomocą roztworu odłączającego komórki, posiewając NPC w 0,5-1 x 106 komórek na studzienkę.
  2. Różnicowanie komórek progenitorowych oligodendrocytów (na podstawie Douvaras i Fossati34)
    1. Płytki PSC należy rozłożyć zgodnie z powyższym opisem w gęstości 1 x10,5 na dołek na powlekanych płytkach 6-dołkowych w pożywce z komórek macierzystych zawierającej inhibitor ROCK.
    2. Wstępnie potraktuj komórki DMSO, jak opisano powyżej dla kultur 2D.
    3. Przygotuj roztwory podstawowe SB431542, LDN193189, kwasu all-trans-retinowego (RA) i wygładzonego agonisty (SAG).
    4. Przygotuj pożywkę różnicującą dni 0–8, uzupełniając DMEM/F-12 o 10 μM SB431542, 250 nM LDN193189 i 100 nM RA.
    5. Po wstępnym leczeniu DMSO inkubować komórki z pożywką różnicującą przez 8 dni, codziennie zmieniając pożywkę ze świeżo dodanymi czynnikami różnicującymi (np. 2 ml na dołek płytki 6-dołkowej).
    6. W dniu 8 zastąp pożywkę DMEM / F-12 zawierającą 1x roztwór aminokwasów endogennych MEM (NEAA), 1X L-glutaminę, 2-merkaptoetanol, penicylinę/streptomycynę i 1x N-2 uzupełnioną 100 nM RA i 1 μM SAG. Zmieniaj nośniki codziennie.
    7. Po 12 dniach różnicowania zróżnicowane komórki powinny wykazywać odpowiednią ekspresję odpowiednich markerów komórek progenitorowych oligodendrocytów (OPC).
  3. Różnicowanie endokrynologicznych komórek progenitorowych (na podstawie Pagliuca et al.35)
    1. Nasiona PSC w ilości 6 x 105 komórek/ml w pożywce z komórek macierzystych plus 10 μM inhibitor ROCK w kolbach obrotowych o pojemności 500 ml umieszczone na 9-pozycyjnej płytce mieszającej ustawionej na prędkość obrotową 70 obr./min w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 100%.
    2. Pozwól, aby kiście osiadły na dnie kolby, zaaspiruj pożywkę, a następnie wstępnie potraktuj 1%-2% DMSO.
    3. Przygotuj roztwory podstawowe Activin A, Chir99021, KGF, Sant1, kwasu all-trans retinowego (RA), LDN193189, PdBU, XXI, Alk51, T3 i betaceluiny.
    4. Przygotować podłoża bazowe do różnicowania na podstawie postaci użytkowej podanej w Tabeli 3.
    5. Po wstępnej obróbce DMSO odessać pożywkę i zastąpić pożywką S1 uzupełnioną 100 ng / ml aktywiny A i 3 mM Chir99021 (np. 500 ml na kolbę). Pozostawić na inkubację przez 24 godziny.
    6. W dniu 2 zastąp pożywkę pożywką S1 uzupełnioną 100 ng/ml aktywiny A. Pozostaw do inkubacji przez 2 dni.
    7. W 4 dniu zastąp pożywkę pożywką S2 uzupełnioną 50 ng/ml KGF. Pozostawić do inkubacji na 3 dni, zmieniając pożywkę po pierwszych 2 dniach (dzień 6).
    8. W dniu 7 zastąp pożywkę pożywką S3 uzupełnioną 50 ng/ml KGF, 0,25 mM Sant1, 2 mM RA i 200 nM LDN193189. Pozostawić na inkubację przez 24 godziny.
    9. W 8 dniu zastąp pożywkę pożywką S3 uzupełnioną 50 ng/ml KGF, 0,25 mM Sant1, 2 mM RA, 200 nM LDN193189 i 500 nM PdBU. Pozostawić na inkubację przez 24 godziny.
    10. W dniu 9 zastąp pożywkę pożywką S3 uzupełnioną 50 ng / ml KGF, 0,25 mM Sant1 i 100 nM RA. Pozostawić do inkubacji na 5 dni, zmieniając pożywkę co 2 dni (dzień 11 i 13).
    11. W dniach 14 i 16 zastąp pożywkę pożywką S5 uzupełnioną 0,25 mM Sant1, 100 nM RA, 1 mM XXI, 10 mM Alk5i II, 1 mM T3 i 20 ng/ml betaceluliny (całkowita inkubacja 4 dni).
    12. W dniach 18 i 20 zastąp pożywkę pożywką S5 uzupełnioną 25 nM RA, 1 mM XXI, 10 mM Alk5i II, 1 mM T3 i 20 ng/ml betaceluliny.

5. Immunocytochemiczna walidacja różnicowania

UWAGA: Poniższe metody opisują ogólny protokół immunocytochemiczny, który można dostosować w razie potrzeby. Przeciwciała pierwszorzędowe to te, które zostały wcześniej zwalidowane w naszym laboratorium. Można również stosować inne techniki walidacji różnicowania (np. cytometria przepływowa, qPCR, sekwencjonowanie RNA, western blot, testy funkcjonalne itp.).

  1. Komórki znakowane immunologicznie
    1. W przypadku kultur 3D w zawiesinie, płytki całe komórki klastry lub klastry rozproszone w zawiesinę jednokomórkową na powlekanych płytkach przez 18-24 godziny przed utrwaleniem.
    2. Odessać pożywkę z przylegających komórek i krótko przemyć PBS w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
    3. W celu utrwalenia komórek odessać PBS i inkubować komórki z 4% paraformaldehydem (PFA) w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej na shaker.
      ostrożność: Zapas PFA powinien być przygotowywany pod wyciągiem ze względu na jego toksyczność. Nie wdychać i nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
    4. Usuń PFA i wyrzuć do odpowiedniego pojemnika na odpady chemiczne.
    5. Myj komórki 3x PBS przez co najmniej 5 minut na pranie w temperaturze RT na shakerze.
    6. W celu przenikania i blokowania komórek inkubować komórki z 5% surowicą osła przygotowaną w 0,3% triton-x 100/PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
    7. Przygotować pierwszorzędowy roztwór przeciwciała w tym samym roztworze, który jest używany do permeabilizacji/blokowania.
    8. Inkubować w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce.
    9. Po całonocnej inkubacji przemyć komórki 3x PBS przez co najmniej 5 minut na przemycie w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
    10. Przygotować drugorzędowy roztwór przeciwciała w roztworze przepuszczalnym/blokującym.
    11. Pozostawić do inkubacji w roztworze przeciwciał drugorzędowych przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
    12. Odessać roztwór przeciwciał drugorzędowych i przemyć komórki 3x PBS przez co najmniej 5 minut na przemycie w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
    13. Inkubować komórki z DAPI lub innym preferowanym markerem w celu uzyskania odpowiedniego czasu inkubacji i płukać w PBS.
  2. Kwantyfikacja obrazu
    1. Uzyskaj co najmniej trzy obrazy na każde schorzenia pod mikroskopem fluorescencyjnym i/lub za pomocą platformy przesiewowej o wysokiej zawartości.
    2. Określ ilościowo procent komórek dodatnich dla każdego markera, zliczając całkowitą liczbę komórek barwionych przeciwciałami i całkowitą liczbę komórek (na podstawie barwienia jąder DAPI/Hoechst) przy użyciu bezstronnego oprogramowania do obrazowania (np. ImageJ) lub zautomatyzowanej platformy przesiewowej do analiz.

Wyniki

Morfologia iPSCs traktowanych DMSO
Ludzkie iPSCs pochodzące od osób z grupy kontrolnej hodowano albo w adherentniej monowarstwie 2D, albo w formie trójwymiarowych sfer komórkowych w zawiesinie. Około 24 h po początkowym wysiewaniu komórki traktowano 1% lub 2% DMSO przez 24 h w pożywce podtrzymującej. Reprezentatywne obrazy w jasnym polu po traktowaniu DMSO przedstawiono na Rysunku 1. Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami dotyczącymi iPSCs utrzymywanych w monowarstwie3, wstępne traktowanie DMSO spowodowało przejściowy, zależny od dawki spadek tempa wzrostu w porównaniu z komórkami nietraktowanymi DMSO (Rysunek 1A). Zmniejszona proliferacja wiąże się ze zwiększeniem kontaktu międzykomórkowego, co jest szczególnie wyraźne w komórkach traktowanych 2% DMSO, wykazujących zwiększoną tendencję do tworzenia bardziej zagęszczonych kolonii komórkowych. W innych typach komórek wykazano, że indukowane przez DMSO zatrzymanie cyklu w fazie G1 wiąże się ze zwiększoną ekspresją białek zaangażowanych w interakcje międzykomórkowe, które wspomagają zatrzymanie wzrostu indukowane inhibicją kontaktową36. W przypadku iPSCs utrzymywanych jako sfery komórkowe 3D, traktowanie DMSO w podobny sposób zwiększyło liczbę sfer komórkowych (Rysunek 1B). Ponadto traktowanie DMSO doprowadziło do mniejszej zmienności rozmiarów sfer 3D, co wcześniej wykazano jako wskaźnik poprawy zdolności różnicowania komórek37. Co istotne, ani 1%, ani 2% DMSO nie spowodowało toksyczności komórkowej, co zmierzono za pomocą oceny żywotności (n = 3; hodowla 2D % żywych = kontrola: 80 ± 1,3; 1% DMSO: 82 ± 3,7, 2%: 81 ± 2,7; hodowla 3D % żywych = kontrola: 81 ± 4,3; 1% DMSO: 82 ± 6,7, 2%: 82 ± 2,7). Ogólnie wyniki te są zgodne z tezą, że traktowanie DMSO zmienia cykl komórkowy i wzorce wzrostu w hodowlach komórek macierzystych. Efekty te w zakresie hamowania wzrostu są odwracalne po usunięciu DMSO z pożywki, co wykazano wcześniej3.

Opracowanie traktowania DMSO poprawia różnicowanie hESC w pierwotne listki zarodkowe
Komórki hESC linii HUES6 wysiano na pokryte płytki na 24 h, a następnie poddano działaniu 2% DMSO przez 24 h w pożywce podtrzymującej. Następnie komórki różnicowano w trzy pierwotne listki zarodkowe zgodnie z modelami traktowania przedstawionymi na Rysunku 2A30,31,32. Zróżnicowane komórki utrwalono i poddano barwieniu immunologicznemu na prototypowe markery każdego z listków zarodkowych (SOX17 dla endodermy, brachyury dla mezodermy i SOX1 dla ektodermy). Jak pokazano na Rysunku 2B, 24-godzinne wstępne traktowanie 2% DMSO zwiększyło proporcję komórek wykazujących ekspresję każdego z odpowiednich markerów listków zarodkowych. Jest to zgodne z wcześniejszymi raportami z naszego laboratorium, które wykazały zwiększoną immunoreaktywność, ekspresję genów, a także bezwzględną liczbę komórek zróżnicowanych w kierunku wszystkich listków zarodkowych w komórkach macierzystych traktowanych DMSO3,5. HUES6 jest linią hESC o bardzo niskiej skłonności do różnicowania we wszystkich liniach1, jednak traktowanie DMSO znacząco poprawia jej zdolność do różnicowania we wszystkie listki zarodkowe.

Obróbka DMSO poprawia różnicowanie w typy komórek progenitorowych
Aby zbadać wpływ DMSO na różnicowanie w typy komórek progenitorowych OUN, ludzkie iPSC różnicowano w komórki progenitorowe neuronów (NPC) lub komórki progenitorowe oligodendrocytów (OPC). W celu generowania NPC komórki poddano wstępnej obróbce 2% DMSO przez 24 h w medium podtrzymującym, a następnie 12-dniowemu ukierunkowanemu różnicowaniu33 (Rysunek 3A). Jak pokazano na Rysunku 3B, wstępna obróbka 2% DMSO zwiększyła ekspresję markera NPC PAX6 w porównaniu z kontrolą. Stosując inny, wcześniej zwalidowany protokół34 (Rysunek 3C), iPSC różnicowano przez 12 dni w OPC. Podobnie jak w przypadku NPC, OPC pochodzące z iPSC poddanych wstępnej obróbce 2% DMSO przez 24 h wykazały zwiększoną proporcję komórek wykazujących ekspresję markerów OPC OLIG2 (Rysunek 3D).

Wstępna obróbka DMSO utrzymuje się, zwiększając różnicowanie w dojrzałe typy komórek
Aby zbadać wpływ DMSO na późniejsze etapy protokołu różnicowania, hESC HUES8 poddano wstępnej obróbce 2% DMSO przez 24 h przed różnicowaniem w komórki β zgodnie z 20-dniowym protokołem różnicowania kierowanego opisanym na Rysunku 4a35. Wykorzystano linię HUES8, ponieważ wcześniej wykazano, że wykazuje ona większą skłonność do linii endodermalnej1,38. Na etapie endodermy definitywnej zróżnicowane komórki wykazują ekspresję SOX17 i FOXA2, specyficznych markerów endodermy definitywnej (DE). Wraz z dalszym różnicowaniem do etapu progenitorów trzustkowych (PP1), zróżnicowane komórki wykazują ekspresję PDX1 i FOXA2, markerów charakterystycznych dla komórek progenitorowych trzustki. Na tych etapach różnicowania komórek trzustki wydajność indukcji do DE, a następnie do PP1, była wysoka zarówno dla kontrolnych, jak i poddanych działaniu DMSO hESC zróżnicowanych do każdego z tych etapów (Rysunek 4B, etapy 1 i 3). Pomimo że odnotowano zwiększoną skłonność linii komórkowej HUES8 do różnicowania w kierunku linii endodermalnej, w miarę dalszej indukcji różnicowania w bardziej wyspecjalizowane typy komórek na etapach końcowych, hESC poddane działaniu DMSO znacznie częściej wytwarzają dojrzałe komórki endokrynne trzustki. Wydajność generowania komórek progenitorowych trzustki PDX1/NKX6.1+, komórek endokrynnych Neurogenin 3+ oraz komórek SC-β NKX6.1/C-peptide+ była znacznie wyższa w hESC poddanych działaniu DMSO (Rysunek 4B, etapy 4 i 5). Wyniki te są zgodne z różnicowaniem NPC i OPC, wykazując, że DMSO zwiększa potencjał różnicowania w typy komórek progenitorowych, a także dowodzą, że efekt DMSO utrzymuje się podczas generowania bardziej wyspecjalizowanych typów komórek. Jest to spójne z wcześniejszymi badaniami, w których wykazaliśmy, że wstępna 24-godzinna obróbka DMSO zwiększa różnicowanie w końcowe typy komórek we wszystkich blaszkach zarodkowych, w tym w komórki neuronalne oraz bijące kardiomiocyty31,39 w liniach komórkowych o wysokiej lub niskiej skłonności do różnicowania3.

Wstępna obróbka DMSO poprawia funkcję komórek pochodzących z hESC po transplantacji in vivo
Wcześniej wykazaliśmy skuteczność obróbki DMSO w zwiększaniu wydajności różnicowania hESC w funkcjonalne komórki progenitorowe trzustki, które następnie wykazują wyraźną poprawę wydzielania insuliny in vivo3. Stosując wcześniej opublikowane protokoły3,30,40, komórki hESC linii HUES8 poddano działaniu 1% DMSO przez 24 h, zróżnicowano w komórki progenitorowe trzustki i przeszczepiono immunodeficyjnym myszom SCID-Beige w celu oceny funkcjonalności (np. wydzielania insuliny w odpowiedzi na obciążenie glukozą lub stymulację KCl) (Rycina 5A). Choć wydajność różnicowania w progenitorowe komórki trzustki FOXA2+ (~90%) i PDX1+ (~75%) była porównywalna między hESC kontrolnymi a hESC traktowanymi DMSO (Rycina 5B) dla linii hESC HUES8, komórki zróżnicowane z hESC po 24-godzinnej obróbce 1% DMSO wykazały poprawioną reaktywność na stymulację glukozą i KCl po transplantacji in vivo. Poprawa funkcjonalności była widoczna w ciągu 2 tygodni po transplantacji (Rycina 5C) i utrzymywała się co najmniej do 16 tygodnia po transplantacji (Rycina 5D). Podsumowując, wyniki te sugerują, że wstępna obróbka DMSO nie tylko zwiększa wydajność różnicowania w warstwy zarodkowe, komórki progenitorowe i bardziej dojrzałe typy komórek, ale także trwale poprawia funkcjonalność zróżnicowanych komórek in vivo.

Zróżnicowany typ komórekWyjściowy typ komórek% DMSOCzas trwania inkubacji z DMSOŹródło
Komórki wątrobyESC
Linia komórkowa hepatoma
ESC
ESC
Mezenchymalne komórki macierzyste
iPSC
ESC
ESC
Linia komórkowa hepatoma
ESC		1,0
1,0
1,0
0,5
0,1-2,0
1,0
1,0
0,5
1,0
0,6		8 dni
Kilka dni
7 dni
10-14 dni
7-21 dni
7 dni
4 dni
5 dni
2-21 dni
Przez cały okres		Basma et al., 2008
Kanebratt and Andersson, 2008
Hay et al., 2009
Duan et al., 2010
Alizadeh et al., 2014
Kondo et al., 2014
Szkolnicka et al., 2014
Czysz et al., 2015
Nikolaou et al., 2016
Vanhove et al., 2016
Pierwotne listki zarodkoweESC i iPSC
hESC
hESC		0,1-2,0
0,5
0,1-2,0		24 godziny
24 godziny
24 godziny		Chetty et al., 2013
Chetty et al., 2015
Li et al., 2018
Komórki sercaESC i iPSC
Komórki P19
ESC i iPSC
Fetalne mezenchymalne komórki macierzyste		0,1-2,0
1,0
1,0-2,0
0,8-1,0		24 godziny
4 dni
24-30 godzin
24 godziny		Chetty et al., 2013
Choi et al., 2014
van den Berg et al., 2016
Deng et al., 2017
Komórki trzustkiESC i iPSC
hESC		0,1-2,0
0,5		24 godziny
24 godziny		Chetty et al., 2013
Chetty et al., 2015
Komórki mięśni gładkichKomórki P191,04 dniChoi et al., 2014
Komórki śródbłonkaKomórki P191,04 dniChoi et al., 2014
EnterocytyiPSC0-1,64 dniOgaki et al., 2015
Nabłonek jelitaiPSC0-1,64 dniOgaki et al., 2015
Komórki neuronalneiPSC z tamaryny0,05-2,024 godzinyQiu et al., 2015
NeutrofileLinia komórkowa białaczki1,256-8 dniTeimourian and Moghanloo, 2016
Miotubule szkieletoweiPSC1,524 godzinySwartz et al., 2016
Organoid korowyhiPSC1,024 godzinyYoon et al., 2018

Tabela 1: Podsumowanie wcześniej opublikowanych prac wykazujących korzystny wpływ traktowania DMSO na różnicowanie.

S1S2S3S5
MCDB131 (L)1111
Glukoza (g)0.440.440.443.6
NaHCO3 (g)2.461.231.231.754
FAF-BSA (g)20202020
ITS-X (ml)0.020.0255
Glutamax (ml)10101010
Witamina C (mg)44444444
Heparyna (mg)00010
P/S (ml)10101010

Tabela 2: Składniki podstawowych pożywek do różnicowania komórek progenitorowych endokrynnych.

Porównanie hodowli komórkowych 2D i 3D z zastosowaniem DMSO; wyniki mikroskopowe dla analizy efektu leku.
Rycina 1: Traktowanie DMSO zmienia wzrost hPSC. (A) Reprezentatywne obrazy w polu jasnym hiPSC wysianych w monowarstwie, które nie były poddane działaniu żadnego czynnika (kontrola) lub były traktowane 1% lub 2% DMSO przez 24 h. DMSO indukuje przejściowe, zależne od dawki hamowanie wzrostu iPSCs. (B) Reprezentatywne obrazy w polu jasnym hiPSC wysianych na płytkach o niskiej adhezji w celu umożliwienia tworzenia sfer 3D, które nie były poddane działaniu żadnego czynnika (kontrola) lub były traktowane 1% lub 2% DMSO przez 24 h. Traktowanie DMSO skutkuje mniejszą zmiennością w tworzeniu sfer 3D w porównaniu z grupą kontrolną. Pasek skali = 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Ścieżki różnicowania endodermy, mezodermy i ektodermy; wyniki barwienia immunofluorescencyjnego DAPI.
Rysunek 2: Leczenie DMSO poprawia różnicowanie hPSC w pierwotne listki zarodkowe. (A) Schemat protokołów różnicowania stosowanych w celu uzyskania trzech pierwotnych listków zarodkowych. (B) Reprezentatywne obrazy zróżnicowanych hESC HUES6 oznakowanych immunochemicznie przeciwko SOX17 (endoderma), brachyury (mezoderma) i SOX1 (ektoderma). Wstępna inkubacja z 2% DMSO przez 24 h zwiększyła wydajność różnicowania we wszystkich trzech listkach zarodkowych. Procenty komórek różnicujących się w komórki endodermalne SOX17+, mezodermalne Brachyury (Brachy)+ lub ektodermalne SOX1+ po ukierunkowanym różnicowaniu w każdy listek zarodkowy dla hESC kontrolnych i traktowanych DMSO są podane wraz z SEM z trzech powtórzeń biologicznych. Nieparzysty test t: endoderma p = 0.0003; mezoderma p = 0.047; ektoderma p = 0.015. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Etapy różnicowania progenitorów neuronalnych i oligodendrocytów; immunofluorescencja; barwienie na Pax6 i Olig2.
Rysunek 3: Leczenie DMSO poprawia różnicowanie w typy komórek progenitorowych neuronów. (A) Schemat protokołu różnicowania wykorzystanego do generowania komórek progenitorowych neuronów (NPCs). (B) Reprezentatywne obrazy ludzkich iPSCs różnicowanych w NPCs z immunoznakowaniem Pax6. 24 h wstępnego traktowania 2% DMSO zwiększyło liczbę komórek dodatnich dla PAX6. Procenty komórek różnicujących się w Pax6+ NPCs po ukierunkowanym różnicowaniu kontrolnych i traktowanych DMSO ludzkich iPSCs są podane wraz z SEM z trzech powtórzeń biologicznych. Nie sparowany test t: p = 0,0225. Pasek skali = 200 µm. (C) Schemat protokołu różnicowania wykorzystanego do generowania komórek progenitorowych oligodendrocytów (OPCs). (D) Reprezentatywne obrazy ludzkich iPSCs różnicowanych w OPCs z immunoznakowaniem markerów OPC Olig2. 24 h wstępnego traktowania 2% DMSO zwiększyło ekspresję obu markerów OPC w porównaniu z kontrolą. Procenty komórek różnicujących się w Olig2+ OPCs po ukierunkowanym różnicowaniu kontrolnych i traktowanych DMSO ludzkich iPSCs są podane wraz z SEM z czterech powtórzeń biologicznych. Nie sparowany test t: p = 0,0466. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat etapów różnicowania komórek macierzystych; wyniki immunobarwienia dla progenitorów trzustki.
Rysunek 4: Leczenie DMSO zwiększa potencjał różnicowania terminalnego hPSC. (A) Schemat ok. 20-dniowego ukierunkowanego różnicowania hESC HUES8 w terminalnie zróżnicowane komórki endokrynne trzustki. (B) Immunobarwienie dla wskazanych markerów na każdym etapie różnicowania po ukierunkowanym różnicowaniu nieleczonych komórek kontrolnych oraz komórek poddanych wstępnej obróbce 2% DMSO przez 24 h. Wstępne leczenie DMSO utrzymuje się, aby zwiększyć różnicowanie w terminalne typy komórek endokrynnych w późniejszych etapach ukierunkowanego różnicowania. Procenty komórek różnicujących się w kierunku wskazanych markerów na każdym etapie różnicowania po ukierunkowanym różnicowaniu hESC kontrolnych i traktowanych DMSO są zaznaczone wraz z SEM z dwóch do czterech powtórzeń biologicznych. Pasek skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces różnicowania trzustki i odpowiedź insulinowa; wykresy słupkowe przedstawiają dane po transplantacji.
Rysunek 5: Wstępna obróbka hPSC przy użyciu DMSO zwiększa reaktywność na glukozę po transplantacji komórek progenitorowych trzustki in vivo. (A) Schemat ukierunkowanego różnicowania (~15 dni) hESC HUES8 w komórki progenitorowe trzustki (PP2) po braku obróbki (kontrola) lub 24-godzinnej obróbce 1% DMSO oraz następującej po niej transplantacji (5 milionów komórek) do immunodeficyjnych myszy SCID-Beige. (B) Procent komórek różnicujących się w PDX1+ i FOXA2+ komórki progenitorowe trzustki po ukierunkowanym różnicowaniu in vitro hESC z grupy kontrolnej i grupy traktowanej DMSO bezpośrednio przed transplantacją (n = 1). (C) Średnie pomiary ELISA ludzkiej insuliny w surowicy myszy po niskim (2.5 mM) lub wysokim (15 mM) obciążeniu glukozą lub stymulacji chlorkiem potasu (KCl) w (C) 2 tygodniu i (D) 16 tygodniu po transplantacji komórek progenitorowych trzustki zróżnicowanych z hESC z grupy kontrolnej i grupy traktowanej DMSO (słupki błędów = SEM; n = 3 w 2. i 16. tygodniu dla kontroli; n = 2 w 2. i 16. tygodniu dla DMSO). Dwukierunkowa ANOVA: p = 0.0051 dla kontroli vs. DMSO w 2. tygodniu; p = 0.0116 dla kontroli vs. DMSO w 16. tygodniu. Myszy badane w różnych punktach czasowych były różne. Wyniki zostały zaadaptowane z Chetty et al.3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Podsumowując, protokół ten opisuje proste i niedrogie narzędzie do zwiększania zdolności różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) do wszystkich pierwotnych listków rozrodczych, różnych typów wyspecjalizowanych komórek progenitorowych, a nawet funkcjonalnych, dojrzałych typów komórek w warunkach in vitro i in vivo. Zilustrowano specyficzne protokoły różnicowania, które zostały skutecznie odtworzone w naszym laboratorium, a także w innych, ale po leczeniu DMSO można zastosować dowolny protokół różnicowania. Jak pokazano w Tabeli 1, wiele laboratoriów wykazało również poprawę różnicowania PSC po przejściowym leczeniu DMSO przy użyciu różnych paradygmatów do generowania różnych innych typów komórek końcowych. Ponadto, chociaż przedstawione tu metody opisują zastosowanie ludzkich PSC, obróbka wstępna DMSO może być stosowana u różnych gatunków i wykazano, że jest skuteczna u PSC myszy, królików i naczelnych.

Chociaż wiadomo, że wyższe dawki DMSO są cytotoksyczne, niskie dawki stosowane w tej metodzie (1%-2%) przez okres przejściowy powodują minimalną śmierć komórki. Podczas gdy ogólna liczba komórek bezpośrednio po leczeniu DMSO może się zmniejszyć z powodu promowania przez DMSO zatrzymania cyklu komórkowego w fazie G1 cyklu komórkowego, poprzednie badania pokazują, że komórki są w stanie osiągnąć ten sam poziom konfluencji, co kultury kontrolne po usunięciu DMSO3.

Procent i czas trwania wstępnej obróbki DMSO powinny być zoptymalizowane dla każdej linii komórkowej. Czas leczenia należy dostosować z uwzględnieniem czasu cyklu/podwojenia komórek. Na przykład PSC myszy mają zazwyczaj znacznie krótszy czas jazdy na rowerze wynoszący około 15 godzin; w związku z tym leczenie DMSO przez 15 godzin dla tych komórek jest wystarczające. Niektóre laboratoria wykazały również, że leczenie DMSO jest korzystne, gdy jest kontynuowane podczas protokołu różnicowania lub w niższych stężeniach (patrz Tabela 1). Należy zauważyć, że niektóre linie PSC są bardziej podatne na różnicowanie do określonych linii. Na przykład wykazano, że komórki HUES6 są mniej podatne na różnicowanie, a zatem mają wyraźną poprawę po leczeniu DMSO (ryc. 2). Alternatywnie, wykazano, że komórki HUES8 użyte na rycinie 4 i rycinie 5 mają większą skłonność do różnicowania endodermalnego; w związku z tym wykazano mniej różnic między grupą kontrolną a DMSO w zakresie różnicowania na początkowych etapach w kierunku ostatecznej endodermy. Niemniej jednak poprawę wstępnego leczenia DMSO obserwuje się na późniejszych etapach różnicowania w tej linii komórkowej (Figura 4B). Zabieg DMSO jest również wszechstronny, ponieważ jest skuteczny zarówno w systemach hodowli komórkowych 2D, jak i 3D, może być stosowany z różnymi rodzajami materiału powlekającego na płytkach do hodowli komórkowych i działa w różnych typach pożywek konserwacyjnych, które sprzyjają wzrostowi i ekspansji hPSC (np. mTeSR, E8, pożywki kondycjonowane MEF itp.).

Mówiąc bardziej ogólnie, wyniki te sugerują, że stan wyjściowy pluripotencjalnych komórek macierzystych ma silny wpływ na skłonność do początkowego różnicowania, a także końcowego różnicowania w funkcjonalne typy komórek. Wcześniej wykazaliśmy, że leczenie DMSO działa poprzez Rb w hPSC 3,5. Rb odgrywa ważną rolę w promowaniu końcowego różnicowania, przeżycia komórek i stabilności genetycznej komórek 41,42,43,44, a zatem może wyjaśniać trwały wpływ na komórki zróżnicowane z hPSC traktowanych DMSO. Ukierunkowanie na te wczesne sposoby regulacji może sprawić, że hPSC znajdą się na lepszej trajektorii różnicowania i ostatecznie poprawią ich użyteczność w medycynie regeneracyjnej.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty ze Stanford University School of Medicine oraz stypendium Siebel Fellowship przyznane S. C.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanolGibco21985023
6-dołkowa przezroczysta, wielodołkowa płytka do hodowli komórkowej z płaskim dnem i płaskim dnemCorning353046
9-pozycyjna płytka mieszająca ChemglassCLS-4100
AccutaseGibco11105-01
Activin A R& D Systems338-AC
Advanced RPMIGibco12633012
Alk5i IIAxxoraALX-270-445
Kwas all-trans retinowy Sigma-AldrichR2625
anty-BrachyuryR& D SystemsAF2085Nie zaobserwowano zmienności w różnych numerach partii
anty-C-peptideBadania rozwojowe Hybridoma BankGN-ID4Nie zaobserwowano zmienności w różnych numerach partii
anty-FoxA2Millipore07-633Nie zaobserwowano zmienności w różnych numerach partii
anty-Nkx2.2University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank74.5A5Nie zaobserwowano zmienności w różnych numerach partii
anty-Nkx6.1University of Iowa, Developmental Hybridoma Bank;  F55A12-supernatantNie zaobserwowano zmienności dla różnych numerów partii
anty-Olig2EMD MilliporeMABN50Nie zaobserwowano zmienności dla różnych numerów partii
anty-Pax-6Biolegend901301Brak zmienności obserwowanej dla różnych numerów partii
anty-Pdx1R& D SystemsAF2419Nie zaobserwowano zmienności dla różnych numerów partii
anty-SOX1 R& D SystemsAF3369Nie zaobserwowano zmienności w różnych numerach partii
anty-SOX17R& D SystemsAF1924Nie zaobserwowano zmienności w różnych numerach partii
B-27 Suplement, minus Witamina AGibco12587010
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastówGibcoPHG0264
BetacellulinThermo Fisher Scientific 
Chir99021Stemgent04-000-10
CMRL 1066Corning99-603-CV
Countess II FL Automatyczny licznik komórekThermo Fisher Scientific 
Sigma D-(+)-glukozy G7528 
DAPIInvitrogen D1306
Jednorazowe kolby obrotoweCorning, VWR89089-814
DMEM/F-12Gibco11320033
DMSO Sigma-AldrichD2650
Essential 6 MediaGibcoA1516501
FAF-BSAProliant 68700
FGF7PeproTech100-19
GeltrexGibcoA1413202
GlutaMAX Gibco35050061
Heparyna Sigma H3149 
Ludzka ultraczuła insulina ELISAALPCO Diagnostyka80-INSHUU-E01.1
ITS-XInvitrogen 
KGFPeprotechAF-100-19
Knockout DMEMGibco10829018
KnockOut Zamiennik serumGibco10828028
L-3,3′,5-trijodotyronina (T3)EMD Milipore642245
LDN193189Stemgent04-0074
Matrigel MatrixCorning354277
MCDB-131 Komórka 15-100-CV 
MEM NEAAGibco11140050
mTeSR 1StemCell Technologies5850
N2 SuplementLife Technologies17502048
NaHCO3Sigma S3817 
Noggin Fc Chimera BiałkoR& D Systems3344-NG-050
PdBUEMD Millipore524390
Penicylina/Streptomycyna Technologie medialne 30-002-CI
RPMIGibco11875-093
Sant1Sigma-AldrichS4572
SB431542Stemgent04-0010
Wygładzony agonista, SAGEMD Millipore566660
StemPro AccutaseGibcoA1110501 
TrypLEGibco12604013
Ultra-Low Attachment MicroplatesCorning3471
Witamina CSigma-AldrichA4544 
Wnt3aR& D Systems5036-WN
XAV 939Tocris3748
XXIEMD Millipore565790
Y-27632StemCell Technologies72302
50932345AMQAF100051500056

Bibliografia

  1. Osafune, K., et al. Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines. Nature Biotechnology. 26 (3), 313-315 (2008).
  2. Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Review Genetics. 15 (2), 82-92 (2014).
  3. Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
  4. Conklin, J. F., Sage, J. Keeping an eye on retinoblastoma control of human embryonic stem cells. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (5), 1023-1030 (2009).
  5. Li, J., et al. A transient DMSO treatment increases the differentiation potential of human pluripotent stem cells through the Rb family. PLoS One. 13 (12), 0208110(2018).
  6. Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246 (4930), 629-634 (1989).
  7. Pardee, A. B. G1 events and regulation of cell proliferation. Science. 246 (4930), 603-608 (1989).
  8. Orford, K. W., Scadden, D. T. Deconstructing stem cell self-renewal: genetic insights into cell-cycle regulation. Nature Review Genetics. 9 (2), 115-128 (2008).
  9. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  10. Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
  11. Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).
  12. Duan, Y., et al. Differentiation and characterization of metabolically functioning hepatocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 28 (4), 674-686 (2010).
  13. Szkolnicka, D., Farnworth, S. L., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Deriving functional hepatocytes from pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 30, 1-12 (2014).
  14. Vanhove, J., et al. H3K27me3 Does Not Orchestrate the Expression of Lineage-Specific Markers in hESC-Derived Hepatocytes In Vitro. Stem Cell Reports. 7 (2), 192-206 (2016).
  15. Kanebratt, K. P., Andersson, T. B. Evaluation of HepaRG cells as an in vitro model for human drug metabolism studies. Drug Metabolism & Disposition. 36 (7), 1444-1452 (2008).
  16. Nikolaou, N., Green, C. J., Gunn, P. J., Hodson, L., Tomlinson, J. W. Optimizing human hepatocyte models for metabolic phenotype and function: effects of treatment with dimethyl sulfoxide (DMSO). Physiological Reports. 4 (21), (2016).
  17. Kondo, Y., et al. An efficient method for differentiation of human induced pluripotent stem cells into hepatocyte-like cells retaining drug metabolizing activity. Drug Metabolism Pharmacokinetics. 29 (3), 237-243 (2014).
  18. Alizadeh, E., et al. The effect of dimethyl sulfoxide on hepatic differentiation of mesenchymal stem cells. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology. 44 (1), 157-164 (2016).
  19. Czysz, K., Minger, S., Thomas, N. DMSO efficiently down regulates pluripotency genes in human embryonic stem cells during definitive endoderm derivation and increases the proficiency of hepatic differentiation. PLoS One. 10 (2), 0117689(2015).
  20. Ogaki, S., Morooka, M., Otera, K., Kume, S. A cost-effective system for differentiation of intestinal epithelium from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports. 5, 17297(2015).
  21. Choi, S. C., et al. Mixl1 and Flk1 Are Key Players of Wnt/TGF-beta Signaling During DMSO-Induced Mesodermal Specification in P19 cells. Journal of Cellular Physiology. 230 (8), 1807-1821 (2015).
  22. Chetty, S., et al. A Src inhibitor regulates the cell cycle of human pluripotent stem cells and improves directed differentiation. Journal of Cell Biology. 210 (7), 1257-1268 (2015).
  23. Qiu, Z., et al. Marmoset induced pluripotent stem cells: Robust neural differentiation following pretreatment with dimethyl sulfoxide. Stem Cell Research. 15 (1), 141-150 (2015).
  24. Swartz, E. W., et al. A Novel Protocol for Directed Differentiation of C9orf72-Associated Human Induced Pluripotent Stem Cells Into Contractile Skeletal Myotubes. Stem Cells Translational Medicine. 5 (11), 1461-1472 (2016).
  25. Teimourian, S., Moghanloo, E. Thwarting PTEN Expression by siRNA Augments HL-60 Cell Differentiation to Neutrophil-Like Cells by DMSO and ATRA. DNA Cell Biology. 35 (10), 591-598 (2016).
  26. van den Berg, C. W., Elliott, D. A., Braam, S. R., Mummery, C. L., Davis, R. P. Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes Under Defined Conditions. Methods in Molecular Biology. 1353, 163-180 (2016).
  27. Deng, F., et al. Combination of retinoic acid, dimethyl sulfoxide and 5-azacytidine promotes cardiac differentiation of human fetal liver-derived mesenchymal stem cells. Cell Tissue Bank. 17 (1), 147-159 (2016).
  28. Yoon, S. J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2018).
  29. Stratigopoulos, G., De Rosa, M. C., LeDuc, C. A., Leibel, R. L., Doege, C. A. DMSO increases efficiency of genome editing at two non-coding loci. PLoS One. 13 (6), 0198637(2018).
  30. Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nature Biotechnology. 26 (4), 443-452 (2008).
  31. Zhang, P., et al. Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells. Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).
  32. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  33. Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
  34. Douvaras, P., Fossati, V. Generation and isolation of oligodendrocyte progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (8), 1143-1154 (2015).
  35. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  36. Fiore, M., Degrassi, F. Dimethyl sulfoxide restores contact inhibition-induced growth arrest and inhibits cell density-dependent apoptosis in hamster cells. Experimental Cell Research. 251 (1), 102-110 (1999).
  37. Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
  38. Bock, C., et al. Reference Maps of human ES and iPS cell variation enable high-throughput characterization of pluripotent cell lines. Cell. 144 (3), 439-452 (2011).
  39. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  40. D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
  41. Jacks, T., et al. Effects of an Rb mutation in the mouse. Nature. 359 (6393), 295-300 (1992).
  42. Nguyen, D. X., Baglia, L. A., Huang, S. M., Baker, C. M., McCance, D. J. Acetylation regulates the differentiation-specific functions of the retinoblastoma protein. The EMBO Journal. 23 (7), 1609-1618 (2004).
  43. Slack, R. S., et al. Cells differentiating into neuroectoderm undergo apoptosis in the absence of functional retinoblastoma family proteins. Journal of Cell Biology. 129 (3), 779-788 (1995).
  44. Gu, W., et al. Interaction of myogenic factors and the retinoblastoma protein mediates muscle cell commitment and differentiation. Cell. 72 (3), 309-324 (1993).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Traktowanie DMSOróżnicowanie komórekregulacja cyklu komórkowegozatrzymanie w fazie G1różnicowanie warstw zarodkowychneuralne komórki progenitoroweróżnicowanie endodermytransplantacja komórektesty funkcjonalne
Przejściowe leczenie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych DMSO w celu promowania różnicowania
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.