Artykuł metodologiczny

Przygotowanie próbki osocza do spektrometrii mas przy użyciu zautomatyzowanej stacji roboczej

11.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59842

⸱

24 kwietnia 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Advanced Clinical Biosystems Institute, Smidt Heart institute, Cedars Sinai Medical Center, 2Beckman Coulter Life Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy zautomatyzowaną metodę trawienia białek osocza do ilościowej analizy proteomicznej opartej na spektrometrii mas. W tym protokole etapy przenoszenia cieczy i inkubacji w celu denaturacji, redukcji, alkilowania i trawienia trypsyny są usprawnione i zautomatyzowane. Przygotowanie płytki 96-dołkowej z pożądaną precyzją zajmuje około pięciu godzin.

Streszczenie

Przygotowanie próbki do analizy spektrometrii mas w proteomice wymaga enzymatycznego rozszczepienia białek do mieszaniny peptydów. Proces ten obejmuje liczne etapy inkubacji i transferu cieczy w celu osiągnięcia denaturacji, redukcji, alkilacji i rozszczepienia. Dostosowanie tego przepływu pracy do zautomatyzowanej stacji roboczej może zwiększyć wydajność i zmniejszyć współczynniki wariancji, zapewniając w ten sposób bardziej wiarygodne dane do porównań statystycznych między typami próbek. Wcześniej opisaliśmy zautomatyzowany proces przygotowania próbek proteomicznych1. W tym miejscu informujemy o rozwoju bardziej wydajnego i lepiej kontrolowanego przepływu pracy z następującymi zaletami: 1) Liczba etapów przenoszenia cieczy została zmniejszona z dziewięciu do sześciu poprzez połączenie odczynników; 2) Czas pipetowania jest skracany dzięki selektywnemu pipetowaniu końcówkami przy użyciu 96-pozycyjnej głowicy pipetującej z wieloma kanałami; 3) Potencjalna przepustowość jest zwiększona dzięki dostępności do 45 miejsc pokładowych; 4) Kompletna obudowa systemu zapewnia lepszą kontrolę temperatury i środowiska oraz zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia próbek lub odczynników; oraz 5) Dodanie stabilnych peptydów znakowanych izotopami, a także białka β-galaktozydazy do każdej próbki umożliwia monitorowanie i kontrolę jakości w całym procesie. Te ulepszenia sprzętowe i procesowe zapewniają dobrą odtwarzalność i poprawiają precyzję wewnątrz i między testami (CV poniżej 20%) dla kwantyfikacji białek i peptydów na podstawie LC-MS. Cały proces trawienia 96 próbek na 96-dołkowej płytce można zakończyć w ciągu około 5 godzin.

Wprowadzenie

Kwantyfikacja białek i peptydów oparta na spektrometrii mas (MS) jest coraz częściej stosowana jako narzędzie bioanalityczne do analizy osocza w podstawowych laboratoriach badawczych i klinicznych2,3. Niezbędne oprzyrządowanie i informatyka szybko się rozwinęły, ponieważ MS stała się metodą z wyboru do ilościowego oznaczania białek lub zmodyfikowanych białek poprzez ukierunkowanie na określone sekwencje peptydów ze względu na jej zdolność do ilościowego oznaczania setek peptydów w jednym przebiegu MS4. Przygotowanie próbki służy jako podstawa każdej analizy proteomicznej. Przed analizą MS białka w próbce biologicznej są zazwyczaj denaturowane, redukowane, alkilowane, trawione do peptydów tryptycznych i odsalane5. Alkilacja blokuje cysteiny, aby zapobiec niekontrolowanym modyfikacjom i zapewnić, że wszystkie cysteiny mają tę samą masę. Następnie dodaje się trypsynę w celu trawienia białek do peptydów. Każdy z tych kroków wymaga optymalizacji, a cały proces tradycyjnie wykonywany jest ręcznie, co pozwala na wprowadzenie błędów analitycznych.

Tradycyjny proces rozwoju biomarkerów składa się z dwóch głównych procesów: proteomiki shotgun do globalnego odkrycia białek w celu stworzenia dogłębnego inwentarza białek6 oraz ukierunkowanej proteomiki do weryfikacji i walidacji mającej na celu precyzyjne i wysokoprzepustowe oznaczanie ilościowe białek7. Niezależnie od podejścia MS, przygotowanie próbki jest takie samo i koncentruje się na enzymatycznym rozszczepieniu białek do mieszaniny peptydów. Zgodnie z propozycją Van Eyka i Sobhani8, posiadanie metody, która pozwala na dokładną, precyzyjną i powtarzalną analizę zarówno dla testów odkrywczych, jak i celowanych, jest pożądane, aby skutecznie przenieść odkryte biomarkery do testów klinicznych. W tym celu pomocna będzie automatyzacja przygotowywania próbek, która zapewni możliwość zwiększenia wydajności analizy o wysokiej przepustowości. Metody ręczne zazwyczaj wprowadzają błędy analityczne wykraczające poza dopuszczalne limity określone przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) w zmienionych wytycznych dotyczących walidacji metod bioanalitycznych, które obejmują biomarkery i diagnostykę2,9. Opracowanie szybkiego, bardzo dokładnego i bezobsługowego procesu przygotowywania próbek białek MS będzie konieczne, aby ułatwić badania nad biomarkerami, które wymagają przygotowania i analizy tysięcy próbek biologicznych. Przygotowanie próbki SM składa się z wielu etapów, w których mogą zostać wprowadzone błędy, a proces ten jest żmudny i czasochłonny.

W naszej ulepszonej metodzie, zautomatyzowana stacja robocza została zaprogramowana do wykonywania wszystkich niezbędnych procedur przygotowania próbki plazmy w sumie 6 kroków (Rysunek 1), aby zapewnić: 1) dokładne transfery cieczy; 2) reakcja jest inicjowana i zatrzymywana w określonym czasie; 3) reakcja odbywa się w kontrolowanej temperaturze (tj. w inkubatorze); i 4) reakcja ma równomierne mieszanie dla wszystkich reakcji. Wdrożyliśmy również dodawanie egzogennych białek kontroli jakości i wzorców wewnętrznych (wzorce peptydów znakowanych stabilnymi izotopami), aby zapewnić jakość i powtarzalną przepustowość kwantyfikacji białek i peptydów na bazie LC-MS w formacie 96-dołkowym. Łącznie z przygotowaniem odczynników, godzinami pracy i łącznie 1 000 000 etapów pipetowania wymagałoby przetworzenia 96 próbek w pojedynczych probówkach. Automatyzacja skraca czas pracy i zmniejsza liczbę interakcji międzyludzkich.

Protokół

1. Programowanie dla automatycznego urządzenia do obsługi cieczy

  1. Utwórz nową metodę z menu Plik (punkt menu Plik | Nowa metoda)
    UWAGA: Wykonaj kroki w podanej kolejności. Kursywa oznacza tekst do wpisania w oprogramowaniu Biomek. Prosimy o kontakt z autorami w celu uzyskania informacji na temat technik pipetowania i szablonów.
  2. Wpisz zmienne kroku początkowego i ich wartości w kroku początkowym, zgodnie z tabelą 1.
  3. Ustawić kolumny do selektywnego pipetowania końcówek. W przypadku kroków 1.3-1.7 kliknij krok Ustaw globalny na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody.
    1. Korzystając z kroku Ustaw globalnie, ustaw wartość =FirstColumn na zmienną FirstColumn_Global, value =LastColumn na zmienną LastColumn_Global, value =LastColumn-FirstColumn+1 na zmienną Columns, a value =Columns*8 na zmienną Wells.
    2. Wybierz krok Skrypt na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody. Wpisz skrypt VB zgodnie ze wskazówkami w Rysunek 2.
  4. Ustawianie głośności dla miksów Set Global i roztworów.
    1. Korzystając z kroku Ustaw globalnie, ustaw odpowiednie wartości zmiennych miksu woluminu, jak pokazano w tabeli 2.
    2. Kliknij krok Jeśli na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody. W polu Warunki wpisz Autosampler.
    3. W obszarze Następnie kliknij krok Ustaw globalny na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody.
    4. Korzystając z kroku Ustaw globalnie, ustaw wartość =(MobilePhase*Columns)+10 na zmienną MobilePhaseWell.
    5. W obszarze W przeciwnym razie kliknij krok Ustaw globalny na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody.
    6. Korzystając z kroku Ustaw globalnie, ustaw wartość =0 na zmienną MobilePhaseWell
  5. Konfiguracja konfiguracji oprogramowania laboratoryjnego z przewodnikiem (GLS)
    1. Kliknij krok Edytor pokładów na pasku narzędzi w obszarze Narzędzia. Utwórz nową talię, która będzie odpowiadać układowi talii w Rysunek 3 i oznacz ją jako Talia 1.
    2. Kliknij krok Konfiguracja z przewodnikiem na pasku narzędzi w obszarze Konfiguracja i urządzenia, a następnie przeciągnij go do metody. Przeciągnij i upuść typy sprzętu laboratoryjnego w pozycjach talii, jak wskazano w Tabeli 3. Następnie wypełnij zakładki w tabeli, jak pokazano w Tabeli 3 i Rysunek 4 (Konfiguracja konfiguracji z przewodnikiem).
  6. Procedura konfiguracji liczenia napiwków
    1. Kliknij krok Definiuj procedurę na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody. Nazwij procedurę jako TipCount.
    2. Kliknij krok Skrypt na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody. Wpisz skrypt VB zgodnie ze wskazówkami w Rysunek 5 (Skrypt zliczania końcówek).
    3. Kliknij krok Jeśli na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody.
    4. W polu Warunki wpisz TL5 = 0.
    5. W obszarze Następnie kliknij krok Przenieś oprogramowanie laboratoryjne na pasku narzędzi w obszarze Kroki konfiguracji i urządzenia i przeciągnij go do metody. Przenieś sprzęt laboratoryjny z TL5 do TR3. Kliknij krok Przenieś oprogramowanie laboratoryjne na pasku narzędzi, w obszarze Kroki konfiguracji i urządzenia, a następnie przeciągnij go do metody. Przenieś sprzęt laboratoryjny z TL2 do TL5. Na koniec kliknij krok Przenieś oprogramowanie laboratoryjne na pasku narzędzi w sekcji Kroki konfiguracji i urządzenia i przeciągnij go do metody. Przenieś sprzęt laboratoryjny z BC90 do TL2.
  7. Definiowanie procedury dla inkubatora
    1. Kliknij krok Definiuj procedurę na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody. Procedura nazwij jako Inkubator.
    2. Wpisz HalfTime jako nazwę zmiennej i 1800 jako wartość domyślną.
    3. Wpisz NextTemp jako nazwę zmiennej i 22 jako wartość domyślną.
    4. Wpisz temp jako nazwę zmiennej i 60 jako wartość domyślną.
    5. Kliknij krok Enhanced Move Labware na pasku narzędzi w obszarze Setup & Device Steps (Kroki konfiguracji i urządzenia) i przeciągnij go do metody. Przenieś sprzęt laboratoryjny z P11 na INHECO1.
    6. Kliknij krok Uruchom procedurę na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody. Nazwij procedurę jako TipCount.
    7. Kliknij krok INHECO Incubate na pasku narzędzi w obszarze Integracje i przeciągnij go do metody. Wpisz INHECO1, aby użyć urządzenia w pozycji, = HalfTime dla inkubacji dla, = Temp dla °C i 3 dla °C temperatury docelowej. Wybierz opcję Potrząśnij podczas inkubacji i styl potrząsania orbitalnego (zgodnie z ruchem wskazówek zegara). W przypadku ustawień wpisz 1,00 mm z boku na bok, 6,6 razy na sekundę, 1,00 mm do przodu i do tyłu i 6,6 razy na sekundę.
      UWAGA: Upewnij się, że zainstalowane jest oprogramowanie INHECO Incubator.
    8. Kliknij krok INHECO Incubate na pasku narzędzi w obszarze Integracje i przeciągnij go do metody. Wpisz INHECO1, aby użyć urządzenia w pozycji, = HalfTime dla inkubacji dla, = Temp dla °C i 3 dla °C temperatury docelowej. Wybierz opcję Potrząśnij podczas inkubacji i styl potrząsania orbitalnego (przeciwnie do ruchu wskazówek zegara). W przypadku ustawień wpisz 1,00 mm z boku na bok, 6,6 razy na sekundę, 1,00 mm do przodu i do tyłu z prędkością 6,6 razy na sekundę.
    9. Kliknij krok Pause (Wstrzymaj) na pasku narzędzi w obszarze Setup & Device Steps (Kroki konfiguracji i urządzenia), a następnie przeciągnij go do metody. Wstrzymaj cały system na 1 s.
    10. Kliknij krok Definiuj procedurę na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody. Procedura nazwij jako Inkubator.
    11. Kliknij krok INHECO Incubate na pasku narzędzi w obszarze Integracje i przeciągnij go do metody. Wpisz INHECO1, aby użyć urządzenia w pozycji, 1 dla Inkubacji, = NextTemp dla °C i 3 dla °C temperatury docelowej.
  8. Definiowanie procedury dla Orbitala.
    1. Kliknij krok Enhanced Move Labware na pasku narzędzi w obszarze Setup & Device Steps (Kroki konfiguracji i urządzenia) i przeciągnij go do metody. Przenieś sprzęt laboratoryjny z P11 do Orbital1.
    2. Kliknij krok Uruchom procedurę na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody. Wybierz procedurę TipCount.
    3. Kliknij krok Akcja urządzenia na pasku narzędzi w obszarze Setup & Device Steps (Konfiguracja i kroki urządzenia) i przeciągnij go do metody. Wybierz Device OritalShaker0, Command TimedShake. Wprowadź prędkość wstrząsania 1000, czas osiągnąć pełną prędkość 2, czas potrząsnąć 30.
    4. Kliknij krok Enhanced Move Labware na pasku narzędzi w obszarze Setup & Device Steps (Kroki konfiguracji i urządzenia) i przeciągnij go do metody. Przenieś sprzęt laboratoryjny Orbital1 do P11.
  9. Ustawianie pierwszego miksu
    1. Kliknij krok Wybierz końcówkę na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody. Wybierz pozycję zmiany kolejności TL4.
    2. Kliknij krok INHECO Incubate na pasku narzędzi w obszarze Integracje i przeciągnij go do metody. Wpisz INHECO1 dla użycia urządzenia w pozycji, 1 dla inkubacji, 60 dla °C i 3 dla °C temperatury docelowej.
    3. Kliknij krok Pętla na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody w obszarze Wybierz krok porady. Wpisz col jako zmienną =FirstColumn jako Początek, =LastColumn jako Koniec i 1 jako Przyrost.
    4. Kliknij krok Select Tips Load Tips na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w kroku pętli. Z menu rozwijanego wybierz BC90 Tips, TL5 Location i TL2 backup Tips Location. Wybierz pozycję Pojedyncza kolumna (Pojedyncze kolumny) i wpisz wartość 1.
    5. Kliknij krok Select Tips Aspirate na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w kroku pętli. Wybierz typ okrągłego sprzętu laboratoryjnego BCDeep96 i pozycję płytki odczynnika. Wpisz objętość =FirstMix, Aspirate w kolumnie 1 i wierszu 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    6. Kliknij krok Select Tips Dispense (Wybierz dozowanie końcówek) na pasku narzędzi w obszarze Liquid Handling Steps (Kroki obsługi cieczy) i przeciągnij go do metody w kroku pętli. Wybierz typ okrągłego sprzętu laboratoryjnego BCDeep96 i pozycję płytki odczynnika. Wpisz objętość =FirstMix, dozuj w kolumnie =col i wierszu 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    7. Kliknij krok Select Tips Unload na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w kroku pętli. Wybierz opcję Unload tips to TR1 (Wyładuj końcówki do TR1).
  10. Ustawianie przykładów
    1. Kliknij krok Jeśli na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody. Wpisz SamplePlate jako warunek.
    2. W obszarze Następnie kliknij krok Select Tips Load Tips (Wybierz wskazówki) na pasku narzędzi w obszarze Liquid Handling Steps (Kroki obsługi cieczy) i przeciągnij go do metody. Z menu rozwijanego wybierz BC90 Tips, TL5 Location i TL2 backup Tips Location. Wybierz pozycję Pojedyncze kolumny i wpisz =tipcolumns.
    3. Kliknij krok Wybierz aspirację końcówek na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody, w ciągu której znajduje się następca. Wybierz typ oprogramowania laboratoryjnego Greiner96RoundPS i pozycję próbek. Wpisz objętość =Próbka, Aspiruj w kolumnie =PierwszaKolumna i wiersz 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    4. Kliknij krok Select Tips Dispense (Wybierz dozowanie końcówek) na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody, w ciągu której znajduje się następca. Wybierz typ okrągłego sprzętu laboratoryjnego BCDeep96 i pozycję płytki reakcyjnej. Wpisz objętość = Próbka, dozuj w kolumnie = Pierwsza kolumna i wiersz 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    5. Kliknij krok Select Tips Unload na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody, w ciągu . Wybierz opcję Unload tips to TR1 (Wyładuj końcówki do TR1).
    6. Po zakończeniu kroku Jeśli kliknij krok Uruchom procedurę na pasku narzędzi w obszarze Kroki kontrolne i przeciągnij go do metody. Wybierz procedurę Inkubator. Wpisz HalfTime jako nazwę zmiennej i 1800 jako wartość domyślną. Wpisz NextTemp jako nazwę zmiennej i 22 jako wartość domyślną. Wpisz temp jako nazwę zmiennej i 60 jako wartość domyślną.
  11. Ustawianie bloku cysteiny
    1. Kliknij krok Pętla na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody w obszarze Wybierz krok porady. Wpisz col jako zmienną =PierwszaKolumna jako Początek, =OstatniaKolumna jako Koniec i 1 jako Przyrost.
    2. W obszarze Pętla kliknij krok Select Tips Load Tips na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody. Z menu rozwijanego wybierz BC90 Tips, TL5 Location i TL2 backup Tips Location. Wybierz pozycję Pojedyncza kolumna (Pojedyncze kolumny) i wpisz wartość 1.
    3. Kliknij krok Wybierz aspirację końcówek na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w pętli. Wybierz typ okrągłego sprzętu laboratoryjnego BCDeep96 i pozycję płytki odczynnika. Wpisz objętość =CysteineMix, odessać w kolumnie 2 i rzędzie 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    4. Kliknij krok Select Tips Dispense (Wybierz dozowanie końcówek) na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w pętli. Wybierz typ okrągłego sprzętu laboratoryjnego BCDeep96 i pozycję płytki reakcyjnej. Wpisz objętość = CysteineMix, dozuj w kolumnie = kolumna i wiersz 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    5. Kliknij krok Select Tips Unload na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody, w ciągu . Wybierz opcję Unload tips to TR1 (Wyładuj końcówki do TR1).
    6. Po zakończeniu pętli If kliknij krok Uruchom procedurę na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody. Wybierz procedurę Inkubator. Wpisz HalfTime jako nazwę zmiennej i 300 jako wartość domyślną. Wpisz NextTemp jako nazwę zmiennej i 43 jako wartość domyślną. Wpisz temp jako nazwę zmiennej i 25 jako wartość domyślną.
  12. Ustawianie drugiego miksu
    1. Kliknij krok Pętla na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody w obszarze Wybierz krok porady. Wpisz col jako zmienną =PierwszaKolumna jako Początek, =OstatniaKolumna jako Koniec i 1 jako Przyrost.
    2. W obszarze pętla kliknij krok Select Tips Load Tips na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody. Z menu rozwijanego wybierz BC90 Tips, TL5 Location i TL2 backup Tips Location. Wybierz pozycję Pojedyncza kolumna (Pojedyncze kolumny) i wpisz wartość 1.
    3. Kliknij krok Wybierz aspirację końcówek na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w pętli. Wybierz typ okrągłego sprzętu laboratoryjnego BCDeep96 i pozycję płytki odczynnika. Wpisz objętość =SecondMix, zassaj w kolumnie 3 i wierszu 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    4. Kliknij krok Select Tips Dispense (Wybierz dozowanie końcówek) na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w pętli. Wybierz typ okrągłego sprzętu laboratoryjnego BCDeep96 i pozycję płytki reakcyjnej. Wpisz objętość = SecondMix, Dozuj w kolumnie = kolumna i wiersz 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    5. Kliknij krok Select Tips Unload na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody, w ciągu . Wybierz opcję Unload tips to TR1 (Wyładuj końcówki do TR1).
    6. Po zakończeniu pętli Jeśli pętla kliknij krok Uruchom procedurę na pasku narzędzi w obszarze Kroki kontroli i przeciągnij go do metody. Wybierz procedurę Orbital.
    7. Kliknij krok Pause (Wstrzymaj) na pasku narzędzi w obszarze Setup & Device Steps (Kroki konfiguracji i urządzenia), a następnie przeciągnij go do metody. Wstrzymaj cały system na 1 s.
  13. Ustawianie dodatku Trypsyny
    1. Kliknij krok Pętla na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody w obszarze Wybierz krok porady. Wpisz col jako zmienną =PierwszaKolumna jako Początek, =OstatniaKolumna jako Koniec i 1 jako Przyrost.
    2. W obszarze Pętla kliknij krok Select Tips Load Tips na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody. Wybierz z menu rozwijanego opcję BC90 Tips, TL5 Location (Lokalizacja TL5) i TL2 backup Tips Location (Lokalizacja kopii zapasowej TL2). Wybierz pozycję Pojedyncza kolumna (Pojedyncze kolumny) i wpisz wartość 1.
    3. Kliknij krok Wybierz aspirację końcówek na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w pętli. Wybierz typ okrągłego sprzętu laboratoryjnego BCDeep96 i pozycję płytki odczynnika. Wpisz objętość = Trypsyna, Odessaj w kolumnie 4 i wierszu 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    4. Kliknij krok Select Tips Dispense (Wybierz dozowanie końcówek) na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w pętli. Wybierz typ okrągłego sprzętu laboratoryjnego BCDeep96 i pozycję płytki reakcyjnej. Wpisz objętość = Trypsyna, Dozuj w kolumnie = kolumna i wiersz 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    5. Kliknij krok Select Tips Unload na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody, w ciągu . Wybierz opcję Unload tips to TR1 (Wyładuj końcówki do TR1).
    6. Po zakończeniu pętli If kliknij krok Uruchom procedurę na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody. Wybierz procedurę Inkubator. Wpisz HalfTime jako nazwę zmiennej i 3600 jako wartość domyślną. Wpisz NextTemp jako nazwę zmiennej i 25 jako wartość domyślną. Wpisz temp jako nazwę zmiennej i 43 jako wartość domyślną.
    7. Kliknij krok INHECO Incubate na pasku narzędzi w obszarze Integracje i przeciągnij go do metody. Upewnij się, że zainstalowane jest oprogramowanie INHECO Incubator. Wpisz INHECO1 dla użycia urządzenia w pozycji, 1 dla inkubacji, 25 dla °C i 5 dla °C temperatury docelowej.
  14. Ustawianie hartowania
    1. Kliknij krok Pętla na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody w obszarze Wybierz krok porady. Wpisz col jako zmienną =PierwszaKolumna jako Początek, =OstatniaKolumna jako Koniec i 1 jako Przyrost.
    2. W obszarze Pętla kliknij krok Select Tips Load Tips na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody. Z menu rozwijanego wybierz BC90 Tips, TL5 Location i TL2 backup Tips Location. Wybierz pozycję Pojedyncza kolumna (Pojedyncze kolumny) i wpisz wartość 1.
    3. Kliknij krok Wybierz aspirację końcówek na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w pętli. Wybierz typ okrągłego sprzętu laboratoryjnego BCDeep96 i pozycję płytki odczynnika. Wpisz objętość = Zgasić, zassać w kolumnie 5 i wierszu 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    4. Kliknij krok Select Tips Dispense (Wybierz dozowanie końcówek) na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w pętli. Wybierz typ okrągłego sprzętu laboratoryjnego BCDeep96 i pozycję płytki reakcyjnej. Wpisz objętość = Zgasić, Dozować w kolumnie = kolumna i wiersz 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    5. Kliknij krok Select Tips Unload na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w obszarze Następnie. Wybierz opcję Unload tips to TR1 (Wyładuj końcówki do TR1).
    6. Po zakończeniu pętli Jeśli pętla kliknij krok Uruchom procedurę na pasku narzędzi w obszarze Kroki kontroli i przeciągnij go do metody. Wybierz procedurę Orbital.
    7. Kliknij krok Pause (Wstrzymaj) na pasku narzędzi w obszarze Setup & Device Steps (Kroki konfiguracji i urządzenia), a następnie przeciągnij go do metody. Wstrzymaj cały system na 1 s.
    8. Kliknij krok Pause (Wstrzymaj) na pasku narzędzi w obszarze Setup & Device Steps (Kroki konfiguracji i urządzenia), a następnie przeciągnij go do metody. Wybierz opcję Wstrzymaj cały system i wyświetl ten komunikat. Wpisz komunikat "Kontynuuj po odwirowaniu".
  15. Ustawianie płytki do automatycznego podajnika próbek
    1. Kliknij krok Jeśli na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody w kroku Wybierz poradę. Wpisz Autosampler jako warunek.
    2. W obszarze Następnie kliknij krok Pętla na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody. Wpisz col jako zmienną =PierwszaKolumna jako Początek, =OstatniaKolumna jako Koniec i 1 jako Przyrost.
    3. W obszarze Pętla kliknij krok Select Tips Load Tips na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody. Z menu rozwijanego wybierz BC230 Tips, TL6 Location i TL2 backup Tips Location. Wybierz pozycję Pojedyncza kolumna (Pojedyncze kolumny) i wpisz wartość 1.
    4. Kliknij krok Wybierz aspirację końcówek na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w pętli. Wybierz typ okrągłego sprzętu laboratoryjnego BCDeep96 i pozycję płytki odczynnika. Wpisz objętość =Faza mobilna, Aspirat w kolumnie 6 i wierszu 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    5. Kliknij krok Select Tips Dispense (Wybierz dozowanie końcówek) na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w pętli. Wybierz Bio_RadPCR96 typu sprzętu laboratoryjnego i pozycję płytki automatycznego podajnika próbek. Wpisz objętość =Faza mobilna, Dozuj w kolumnie = kolumna i wiersz 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    6. Kliknij krok Select Tips Unload na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w obszarze Następnie. Wybierz opcję Unload tips to TR1 (Wyładuj końcówki do TR1).
    7. Po zakończeniu pętli If kliknij krok Uruchom procedurę na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody. Wybierz procedurę TipCount.
    8. Kliknij krok Select Tips Load Tips (Wybierz wskazówki, załaduj wskazówki) na pasku narzędzi w obszarze Liquid Handling Steps (Kroki obsługi cieczy) i przeciągnij go do metody. Wybierz z menu rozwijanego opcję BC90 Tips, TL5 Location (Lokalizacja TL5) i TL2 backup Tips Location (Lokalizacja kopii zapasowej TL2). Wybierz pozycję Pojedyncze kolumny i wpisz =tipcolumns.
    9. Kliknij krok Wybierz aspirację końcówek na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w pętli. Wybierz typ okrągłego sprzętu laboratoryjnego BCDeep96 i pozycję płytki reakcyjnej. Wpisz objętość =DigestTransfer, Aspirate w kolumnie = pierwsza kolumna i wiersz 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    10. Kliknij krok Select Tips Dispense (Wybierz dozowanie końcówek) na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w pętli. Wybierz Bio_RadPCR96 typu sprzętu laboratoryjnego i pozycję płytki automatycznego podajnika próbek. Wpisz objętość =Faza mobilna, Dozuj w kolumnie =Pierwsza kolumna i wierszu 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    11. Kliknij krok Select Tips Unload na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w obszarze Następnie. Wybierz opcję Unload tips to TR1 (Wyładuj końcówki do TR1). W tym miejscu kończy się krok wyboru wskazówek.
    12. Zapisz i nazwij metodę.

2. Przygotuj próbkę, sprzęt laboratoryjny i odczynniki

  1. Przenieś 5 μl zebranego zdrowego osocza ludzkiego do polipropylenowej, 96-okrągłej płytki głębinowej.
    UWAGA: Patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się z odczynnikami i materiałami eksploatacyjnymi stosowanymi w tym protokole. Zakupiono trypsynę traktowaną TPCK, a stosunek trypsyny do substratu i czas inkubacji zostały specjalnie zoptymalizowane. Jeśli stosuje się trypsynę innego gatunku, taką jak trypsyna rekombinowana o klasie sekwencyjnej, należy przetestować i zoptymalizować stosunek enzymu do substratu oraz czas inkubacji.

3. Procedura operacyjna

  1. Kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania.
  2. Na karcie Metoda wybierz opcję Home All Axes (Położenie początkowe wszystkich osi), aby zorientować i przygotować automatyczną obsługę cieczy. Upewnij się, że wszystkie strzykawki na stanowisku pracy nie zawierają widocznych pęcherzyków powietrza.
  3. W obszarze Plik wybierz pozycję Otwórz | Metoda.
  4. Wybierz metodę (Rysunek 6).
  5. Uruchom metodę, klikając zieloną ikonę Uruchom w kształcie trójkąta.
  6. Aby na końcu metody przygotować płytkę automatycznego podajnika próbek, wprowadź wartość "true" w polu Wprowadź wartość, która ma być używana w polu "Autosampler", a następnie kliknij przycisk OK. Jeśli tabliczka automatycznego podajnika próbek nie jest przygotowywana, wprowadź wartość "false", a następnie kliknij przycisk OK.
  7. Wprowadź wartość "1" w wierszu polecenia Wprowadź wartość, która ma być używana w kolumnie "firstcolumn", a następnie kliknij przycisk OK.
  8. Wprowadź wartość "12" w polu Wprowadź wartość, która ma być używana dla "lastcolumn", a następnie kliknij przycisk OK.
    UWAGA: Ten krok i krok 4.7 nakazują stacji roboczej przeprowadzenie trawienia na 12 kolumnach płytki 96-dołkowej, w wyniku czego wszystkie dołki płytki są używane do trawienia
  9. Jeśli używana jest płytka z próbką o objętości co najmniej 20 μl, wprowadź wartość "true" w monicie Wprowadź wartość, która ma być używana dla "SamplePlate", a następnie kliknij przycisk OK. Jeśli płytka próbkowania nie jest używana, wprowadź wartość "false", a następnie kliknij przycisk OK.
    UWAGA: Jeśli płytka do pobierania próbek nie jest używana, dodać 5 μl próbki do każdego odpowiedniego dołka płytki reakcyjnej.
  10. Postępuj zgodnie ze wskazówkami w oknie Guided Labware Setup (Konfiguracja oprogramowania laboratoryjnego z przewodnikiem) i kliknij przycisk Kontynuuj.
    UWAGA: Następne okno opisuje układ "Płytki odczynnika", która ma zostać przygotowana (Rysunek 7, Tabela uzupełniająca 1). Następujące objętości zostaną podzielone na porcje do każdej z 8 studzienek pojedynczej kolumny w 96-dołkowej płytce o pojemności 1 ml Deep Round:
    Kolumna 1: 540 μl mieszaniny reakcyjnej 1,
    Kolumna 2: 50 μl bloku cysteiny.
    Kolumna 3: 730 μl mieszaniny reakcyjnej 2,
    Kolumna 4: 130 μl trypsyny.
    Kolumna 5: 130 μl roztworu hartującego.
    Kolumna 5: 1090 μl roztworu fazy ruchomej (jeśli użytkownik wpisał wartość "true" w kroku 6).
  11. Kliknij przycisk Dalej, a w następnym oknie opisano minimalną objętość (20 μl), którą należy podać na płytce próbki. Jeśli użytkownik wprowadzi wartość "false" dla monitu dotyczącego płytki z próbką (krok 9), użytkownik zostanie poproszony o dodanie próbki o 5 μl do płytki reakcyjnej.
  12. Kliknij Next.
    UWAGA: Następne okno pokazuje, że na pokładzie automatycznej ładowarki do obsługi cieczy należy umieścić puste pudełko na końcówki o pojemności 90 μl.
  13. Kliknij ponownie przycisk Dalej, aby ułożyć pokład automatycznego urządzenia do obsługi cieczy zgodnie ze specyfikacją i ilustracją (Rysunek 8), w tym płytkę odczynnika, płytkę reakcyjną, płytkę próbki, płytkę automatycznego podajnika próbek, 6 pełnych pojemników na końcówki 90 μl, puste pudełko na końcówki 90 μl i pełne pudełko na końcówki 230 μl.
  14. Kliknij przycisk Zakończ, aby rozpocząć metodę.
    UWAGA: Po kliknięciu przycisku Zakończ użytkownik nie może sięgnąć do automatycznego urządzenia do obsługi cieczy. Spowoduje to "przerwanie kurtyny świetlnej" maszyny i zatrzymanie urządzenia do obsługi cieczy ze względów bezpieczeństwa.
  15. Po wyświetleniu monitu Kontynuuj po odwirowaniu wyjmij płytkę reakcyjną i odwiruj ją przez 30 minut przy 3,000 obr./min.
  16. Po zakończeniu wirowania umieść płytkę reakcyjną z powrotem w automatycznym urządzeniu do obsługi cieczy w pozycji, w której znajdowała się przed wirowaniem, a następnie kliknij przycisk Kontynuuj.
    UWAGA: Automatyczna obsługa cieczy zatrzyma się ponownie po zakończeniu metody. Jeśli użytkownik wpisał wartość "true" w kroku 6, płytkę automatycznego podajnika próbek można następnie wyjąć ze stacji roboczej i umieścić w autosamplerze urządzenia do chromatografii cieczowej w celu analizy.

4. LC-MSMS

  1. Roztwory peptydów w wysokoprzepływowej HPLC składającej się z kolumny C18 o wymiarach 2,1 mm x 100 mm i średnicy 3,5 μm o natężeniu przepływu 0,25 ml/min i analizowane w linii produkcyjnej na spektrometrze mas z potrójnym kwadrupolem.
    UWAGA: Po mineralizacji peptydów, ukierunkowana metoda LC-MSMS do ilościowego oznaczania peptydów z próbek przygotowanych przez roboty jest szczegółowo opisana1 po krótkim opisie LC-MSMS.
  2. Ustawić temperaturę pieca kolumnowego na 40 °C. Użyj buforu A (2% ACN, 98% wody, 0,1% kwasu mrówkowego) i buforu B (95% ACN, 5% wody, 0,1% kwasu mrówkowego) jako dwóch faz ruchomych.
  3. Zrównoważ kolumnę z 5% B przez 5 minut po załadowaniu. Eluuj peptydy w ciągu 30 minut z liniowym gradientem buforu B od 5% do 35%.
    1. Przed załadowaniem następnej próbki należy poddać kolumnę recyklingowi, przemłukując ją roztworem 98% B przez 10 minut, a następnie 5% B przez 5 minut.
    2. W celu przekierowania on-line, należy skierować eluent zakolumnowy do odpadów, zanim dostanie się do źródła jonów za pomocą dwufazowego zaworu przełączającego.
  4. Przetwarzanie danych MRM.

Wyniki

Zautomatyzowany schemat przygotowania próbek proteomicznych na stacji roboczej został dostosowany z naszego poprzedniego protokołu automatycznego z zastosowaniem niezawodnej metody akwizycji LC-SRM-MS1 dla albuminy, wybranego białka osocza, oraz β-galaktozydazy (β-gal), białka egzogennego wykorzystywanego do kontroli jakości. Po przetworzeniu próbki analizowano na potrójnym kwadrupolowym LC-MS w teście SRM nakierowanym na albuminę surowiczą oraz β-galaktozydazę. Współczynnik zmienności (CV) sygnału SRM dla każdego przejścia został wykorzystany do monitorowania powtarzalności zautomatyzowanego protokołu trawienia.

Zautomatyzowano etapy dodawania odczynników i mieszania podczas trawienia próbek osocza o objętości 5 μL z 2-godzinną inkubacją trypsyną w inkubatorze pokładowym. W celu określenia powtarzalności, 5 μL puli osocza naniesiono do wielu studni płytki reakcyjnej za pomocą głowicy wielokanałowej (96 pinów). Aby monitorować spójność, przed reakcjami redukcji i alkilacji dodano białko β-gal. Zautomatyzowany schemat przygotowania próbek proteomicznych przetestowano za pomocą niezawodnej metody akwizycji LC-SRM-MS, obejmującej albuminę, białko o najwyższej zawartości w osoczu, oraz białko β-gal stosowane do kontroli jakości. Monitorowano trzy peptydy β-gal oraz dwa peptydy albuminy z przetworzonych białek albuminy osocza i dodanego białka β-gal (Tabela 4).

W celu oszczędności czasu i uproszczenia procedury, zredukowaliśmy etapy przenoszenia cieczy podczas dodawania/mieszania/inkubacji odczynnika i mieszaniny reakcyjnej za pomocą stacji roboczej z dziewięciostopniowego do sześciostopniowego procesu roboczego (Rysunek 1). Całkowity proces proteomiczny składał się z dwóch komponentów eksperymentalnych: zautomatyzowanego przygotowania próbek oraz LC-MS/MS. W pierwszej kolejności oceniono precyzję pozyskiwania danych LC-MS/MS SRM poprzez osiem następujących po sobie wtryknięć z tej samej studzienki trawien płytki autosamplera. Precyzję zautomatyzowanego procesu przygotowania próbek obliczono jako procent współczynnika zmienności (%CV) całkowitego procesu proteomicznego SRM pomniejszony o %CV metody LC-MS/MS (Rysunek 9B). Dzięki usprawnionej procedurze trawienia osocza na zautomatyzowanej stacji roboczej, precyzja eksperymentalna zautomatyzowanego przygotowania próbek wynosiła mniej niż 1,4% dla egzogennych białek β-gal (średnio 10,0%) oraz mniej niż 14,9% dla najliczniejszej albuminy surowicy ludzkiej (średnio 9,9%) (Rysunek 9). Zgodnie z oczekiwaniami, zaobserwowano dobre intensywności sygnału zarówno dla albuminy surowicy ludzkiej, jak i białek β-gal (Rysunek 9C).

Dla każdego etapu pipetowania i przenoszenia cieczy zoptymalizowano odpowiednie techniki. Aby monitorować precyzję etapów przenoszenia cieczy, do trzech niezależnych kroków przenoszenia odczynników dodano standardy peptydów znakowanych stabilnymi izotopami (SIL) dla endogennej ludzkiej albuminy surowiczej oraz egzogennego białka β–gal: do Mieszaniny Reakcyjnej 1, Blokera Cysteiny oraz Mieszaniny Reakcyjnej 2 (Rysunek 10). Sygnały MRM z tych pięciu peptydów SIL były pozyskiwane w celu monitorowania precyzji zautomatyzowanych etapów przenoszenia cieczy. Średni %CV dla peptydów DDNPNLPR^ oraz GDFQFNISR^ (^ oznacza aminokwas znakowany N15) z etapu Mieszaniny Reakcyjnej 1 mieścił się w zakresie od 1,8% do 1,2%. Średni %CV dla jednego peptydu (IDPNAWVER^) z etapu Blokera Cysteiny mieścił się w zakresie od 6,6% do 8,8%. Średni %CV dla dwóch peptydów (WVGYGQDSR^ oraz LVNEVTEFAK^) mieścił się w zakresie od 6,2% do 1,9% (Rysunek 10).

Aby zweryfikować zautomatyzowany proces przygotowywania próbek do proteomiki, oceniono powtarzalność dla wielu białek w ciągu kilku dni dla albuminy surowicy ludzkiej, egzogenicznej β–gal oraz 40 dodatkowych białek plazmy. Przetworzono 21 próbek powtórzonych (połączona prawidłowa plazma ludzka), których rozmieszczenie w dołkach przedstawiono na Ryc. 1A, w trzech różnych dniach. Współczynniki zmienności (CV) wewnątrz dnia obliczono z 21 dołków przygotowanych tego samego dnia. Średnie wartości %CV wewnątrz dnia dla 40 białek wynosiły od 4% do 20% (Ryc. 1B). Aby ocenić efekt brzegowy zautomatyzowanego procesu opartego na płytce, obliczono %CV z konkretnych dołków w wyznaczonych kolumnach i rzędach (Ryc. 12A przedstawia mapę kolumn i rzędów). Intensywności sygnałów MRM były zbliżone we wszystkich konfiguracjach kolumn i rzędów, a wartości %CV mieściły się w zakresie od 3% do 2% (Ryc. 12B).

Podsumowując, zoptymalizowany zautomatyzowany proces pozwala na uzyskanie 96 jednolitych próbek w czasie krótszym niż pięć godzin, przy zachowaniu doskonałej precyzji eksperymentalnej. W celu zapewnienia kompatybilności z automatycznym workflow wybrano odczynniki, które wykazują pomijalne niespecyficzne reakcje uboczne, są stabilne w świetle otoczenia, są odpowiednie do analiz LC-MS/MS i mogą być przechowywane jako zamrożone alikwoty.

Schemat procesu ilościowego oznaczania białek: trawienie, analiza LC-MS/MS, wizualizacja wyników; diagram.
Rycina 1: Schemat procesu przygotowania próbek. Wymieniono 6 głównych etapów przenoszenia cieczy. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Fragment kodu VBScript do iterowania po kolumnach danych, pętla for i konkatenacja ciągów znaków.
Rysunek 2: Skrypt ładowania końcówki. Szczegóły skryptu VB przedstawiono tutaj. Skrypt określa warunki obciążenia końcówki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Schemat planu laboratorium, rozmieszczenie sprzętu, przedstawia urządzenia Peltiera i inkubatory orbitalne, układ doświadczalny.
Rysunek 3: Układ platformy zautomatyzowanej stacji roboczej. Platforma składa się z modułów ALPs 1x1, modułów ALPs do ładowania końcówek, pojemnika na odpady, stacji mycia końcówek, elementu Peltiera oraz inkubatora. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Interfejs konfiguracji płytek laboratoryjnych, ustawianie objętości odczynników, układ 96 dołków, wybór rodzaju cieczy.
Rysunek 4: Właściwości płytki z odczynnikami. Przedstawiono właściwości wymagane dla sprzętu laboratoryjnego typu Płyta z Odczynnikami (Reagent Plate) podczas korzystania z funkcji Guided Labware Setup. Należy wybrać odpowiednią kolumnę i wpisać zmienne zgodnie z oznaczeniami na rysunku. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Kod VBScript do automatyzacji laboratorium; schemat przedstawiający proces inicjalizacji pudełka z końcówkami.
Rysunek 5: Skrypt do liczenia końcówek. Ten skrypt pomaga monitorować liczbę końcówek znajdujących się na pokładzie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Schemat procesu dla zautomatyzowanego eksperymentu; obliczenia odczynników, etapy mieszania, proces autopróbnika.
Rysunek 6: Przegląd metody trawienia i rozdzielania próbek osocza na aalikwoty. Kroki obliczeń odczynników, przygotowania sprzętu laboratoryjnego i manipulacji cieczami w metodzie automatycznego dozownika cieczy. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat automatycznej konfiguracji laboratorium z instrukcjami dotyczącymi płytki z odczynnikami do przygotowania próbek, zawierający etapy mieszania.
Rysunek 7: Układ płytki z odczynnikami. Przedstawiono odczynniki chemiczne niezbędne do trawienia osocza i przygotowania autosamplera, rozmieszczone na płytce z odczynnikami. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie noty technicznej.10. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat konfiguracji zautomatyzowanej chromatografii z płytkami z odczynnikami, kontrolą temperatury i etapami reakcji.
Rysunek 8: Układ akcesoriów laboratoryjnych na pokładzie automatycznej stacji roboczej. Przedstawiono układ pokładu dla metody trawienia plazmy w automatycznym systemie do obsługi cieczy. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie noty technicznej.10. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Układ chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas wraz z chromatogramami i wykresami analizy danych proteomicznych.
Rysunek 9: Precyzja całkowitego procesu proteomicznego składa się z CV stacji roboczej oraz CV ukierunkowanej analizy LC MS/MS.
Monitorowano pięć peptydów z β-gal oraz albuminy; przedstawiono chromatogramy oraz czas retencji dla każdego peptydu (A), Precyzję określono na podstawie 30 studzienek/próbek w eksperymencie reprezentatywnym, obliczono wartości CV% dla całkowitego procesu proteomicznego, analizy LC-MS/MS oraz zautomatyzowanego przetwarzania próbek (B). Ogólnie rzecz biorąc, trawione peptydy wykazały dobre sygnały w zakresie od 1x105 do 1x108. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Schemat zautomatyzowanego procesu LC-MS/MS; analiza peptydów; zmienność danych (%CV) przedstawiona na wykresie słupkowym.
Rysunek 10: Określenie precyzji etapów przenoszenia cieczy. Syntetyczne peptydy dodano do reagentów specyficznych dla poszczególnych etapów, a automatyczny transfer cieczy oceniono na podstawie całkowitego %CV. W eksperymencie obejmującym 30 studzienek/próbek odliczono %CV LC-MS/MS (wyznaczony na podstawie 8 powtórnych wstrzykiwań do LC-MS/MS). Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Konfiguracja płytki 96-dołkowej dla analizy osocza wraz z wykresami przedstawiającymi intensywność i CV% w ciągu trzech dni.
Rysunek 1: Wielodniowa powtarzalność zautomatyzowanego procesu przygotowania próbek proteomicznych z analizą MRM 42 białek. (A) Poniżej przedstawiono schematy płytek reakcyjnych dla każdego z trzech dni, 5 µL do każdego z 21 dołków dodano osocze. Do 3 dołków dodano 5 µl wody, które posłużyły jako ujemne kontrole/kontrolki tła. (BŚrednie intensywności 190 przejść obejmują 75 peptydów i 42 białka (lewo), a %CV dla każdego przejścia MRM obliczono na podstawie trawienia 21 dołków dla każdego dnia (prawo). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.

Układ płytki do analizy danych, wykres pola piku, CV% z wykorzystaniem formatu wielodobkowego do pomiaru intensywności.
Rycina 12: Powtarzalność konkretnych lokalizacji studzienek (położenie kolumn i wierszy). (A) Przedstawiono tutaj rozmieszczenie kolumn i wierszy wraz z mapą płytki. (B) Sygnały MRM specyficzne dla położenia kolumn i wierszy o średnich intensywnościach z określonych studzienek (lewa strona) oraz cv% (prawa strona) z trawienia z jednej płytki. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.

Schemat procesu pipetowania z opisem kroków oraz prędkości zasysania, dozowania i mieszania w dołkach.
Rycina 13: Zrzut ekranu edytora technik. Dla każdego szablonu pipetowania należy zdefiniować właściwości wykrywania poziomu cieczy, wykrywania skrzepów, przebijania, rodzaju cieczy, ustawienia ogólne, aspiracji, dozowania, mieszania oraz kalibracji. Szablon i techniki zastosowane w niniejszym protokole przedstawiono w Tabela uzupełniająca 2). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

ZmiennaZmiennaWartośćOpis
AutosamplerBooleanTRUEUżyj autopróbownika
BetagalInteger5Objętość Betagal
BG1Integer0.8Objętość BG1
BG2Integer0.8Objętość BG2
BG3Integer0.8Objętość BG3
CysteinBlockerInteger1.25Objętość blokeru cysteiny
CysteineBufferInteger0.45Objętość buforu cysteiny
DenaturantInteger5Objętość denaturanta
DigestTransferInteger10Objętość przeniesienia hydrolizatu
First BufferInteger25.9Objętość pierwszego buforu
First ColumnInteger1Pierwsza kolumna
HSA1Integer0.8Objętość HSA1
HSA2Integer0.8Objętość HSA2
lastcolumnInteger12Ostatnia kolumna
MobilePhaseInteger90Objętość fazy ruchomej
QuenchInteger10Kolumna wygaszania (quench)
ReducingAgentInteger5Kolumna czynnika redukującego
SampleInteger5Kolumna próbki
SamplePlateBooleanTRUEUżyj płytki z próbkami
SecondBufferInteger58.4Objętość drugiego buforu
TrypsinInteger10Kolumna trypsyny

Tabela 1: Zmienne etapu początkowego

WartośćZmienna
=PierwszyBufor+Denaturant+Reduktor+Betagal+BG1+HSA1FirstMix
=Blokator cysteiny+Bufor cysteinowy+BG2CysteineMix
=DrugiBufor+BG3+HSA2SecondMix
=(FirstMix*Columns)+30Wymieszaj dokładnie
= (CysteineMix*Kolumny)+20CysteineWell
=(SecondMix*Columns)+10Drugie wymieszanie w dołku
=(Trypsyna*Kolumny)+10TrypsinWell
=(Quench*Columns)+10QuenchWell
=(FirstMixWell*8)+10Pierwszy Roztwór Zapasowy Mieszaniny
=CysteineWell*8+20Roztwór zapasowy mieszaniny cysteiny
=(SecondMixWell*8)+10DrugiZapasMieszaniny

Tabela 2: Zmienne objętości mieszaniny

TypNazwaPołożenieGłębokośćWłaściwościZastosowanie?
BCDeep96RoundPłytka z odczynnikamiP51(góra)#=nie SamplePlate
BCDeep96RoundPłyta z odczynnikamiP51(góra)#=PłytkaPróbkowa
BCDeep96RoundPłyta reakcyjnaP11(góra)PRAWDZIWE
Bio_RadPCR96*PróbkiP91(góra)=PłytkaPróbkowa
Bio-Rad PCR96*Płytka do autopróbnikaP101(góra)Autopróbnik
BC90Pusty1(góra)PRAWDA
BC901(góra)PRAWDA
BC901(góra)PRAWDZIWE
BC2301(góra)Autopróbnik
BC901(góra)Kolumny>1
BC901(góra)=Kolumny>3
BC901(góra)=Kolumny>5
BC901(góra)=Kolumny>7
BC901(góra)=Kolumny>9
Uwaga:
*: Odpowiada płytce Bio-Rad z 96 dołkami.
Kliknij Właściwości, a następnie wprowadź zmienne objętości zgodnie z instrukcją na Rysunku 6.

Tabela 3: Konfiguracja zestawu prowadzonego

Białko IDSekwencja peptydowaQ1 Masa (Da)Masa Q3 (Da)Czas (min)Jon fragmentowyPotencjał rozgrupowaniaEnergia kolizjiPotencjał wyjściowy komory kolizyjnej
sp|P0072|BGAL_ELOCIGDFQFNISR542.3262.119.7+2y261218
542.363619.7+2y5612512
542.3764.219.7+2y6612518
IDPNAWVER550.3436.118.1+2y7+261238
550.3871.218.1+2y7612518
550.3774.218.1+2y661338
WVGYGQDSR534.3782.112.1+2y751256
534.3562.112.1+2y551276
534.2505.212.1+2y490258
sp|P02768|ALBU_HUMANDDNPNLPR470.8596.29.2+2y5612716
470.8499.39.2+2y4612718
470.8710.49.2+2y6612718
LVNEVTEFAK575.3694.418.2+2y673.129.618
575.3937.518.2+2y873.129.618
575.3823.418.2+2y773.129.618

Tabela 4: Parametry MRM

Tabela uzupełniająca 1: Wykaz odczynników Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 2: Szablon protokołu Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Przetwarzanie próbek do spektrometrii mas wymaga denaturacji, redukcji i alkilowania białek w celu zablokowania cystein oraz trawienia trypsyny w celu rozszczepienia białek na peptydy. Każda reakcja chemiczna lub enzymatyczna musi zostać zainicjowana w określonym czasie i przeprowadzona w kontrolowanej temperaturze, a każdy etap procesu obejmuje wiele etapów przenoszenia cieczy, w których można wprowadzić eksperymentalne zmiany. Rozwiązaniem tego dylematu jest zautomatyzowane przetwarzanie próbek. Obecnie dostępne systemy obsługi cieczy mają możliwość przenoszenia odczynników do płytek 96-dołkowych z dokładnością i precyzją mniejszą niż 5%, w zależności od zastosowanego typu głowicy i końcówki, a także inkubacji próbek, w razie potrzeby z wstrząsaniem, w kontrolowanych temperaturach w zakresie od 14 °C do 70 °C. Użyliśmy zautomatyzowanej maszyny do obsługi cieczy do przetwarzania osocza do testów SRM w formacie 96-dołkowym.

W złożonych mieszaninach białek w surowicy, osoczu i innych próbkach biologicznych znajduje się wiele tysięcy miejsc rozszczepienia proteazy; Każde z tych białek ma unikalne właściwości wpływające na dostępność miejsca rozszczepienia i stabilność powstałych peptydów. W związku z tym niemożliwe jest zaprojektowanie procedury przetwarzania próbki, która byłaby optymalna dla każdego białka. Najlepszą alternatywą jest bycie tak konsekwentnym, jak to tylko możliwe.

Aby osiągnąć spójność, zoptymalizowaliśmy każdy etap pipetowania wykonywany przez automatyczną centralę do obsługi cieczy. Najpierw rozważyliśmy wymaganą objętość i ograniczenia wynikające z rodzaju cieczy (plazmowa, wodna lub organiczna) i odpowiadających im właściwości (lepkość, spójność i lotność), sprzętu (głowica pipetująca na stanowisku roboczym i ramiona chwytające płytkę) oraz sprzętu laboratoryjnego. Następnie zmienialiśmy prędkość i ciągnącą szczelinę powietrzną do zasysania, prędkość i objętość wydmuchu do dozowania oraz siłę i czas mieszania, jednocześnie włączając dotyk końcówki po zasysaniu i/lub dozowaniu, jeśli to konieczne, aby wyeliminować przywieranie cieczy do zewnętrznej strony końcówek (Rysunek 13, Tabela uzupełniająca 1). Unikalny peptyd SIL, wstępnie przebadany pod kątem stabilności, został dodany do każdego odczynnika, aby umożliwić monitorowanie precyzji każdego etapu obchodzenia się z cieczą. Po optymalizacji, CV procesu dla większości przejść wynosiło mniej niż 10%, co świadczy o dobrej odtwarzalności ze zautomatyzowaną stacją roboczą (Rysunek 9, Rysunek 10, Rysunek 11 i Rysunek 12).

Przedstawiony tutaj zautomatyzowany przepływ pracy zapewnia spójne trawienie enzymatyczne z lepszą odtwarzalnością i przepustowością w porównaniu z metodami ręcznymi (Rysunek 9, Rysunek 10). Podejście to daje nadzieję na poprawę dokładności i niezawodności odkrywania i walidacji biomarkerów za pomocą spektrometrii mas.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wspólna biorekultywacjazdrowego osocza ludzkiegoosocze ludzkie testowane w manuskrypcie
Acetonitryl, HPLC GradeThermo Fisher ScientificA998SK1LC MS/MS rozpuszczalnik
B-galaktozydaza Rekombinowana zegzogennych białek kontrolnychSigma-AldrichG3153-5MG
Zautomatyzowana stacja robocza Biomek i7Beckman Coulter, Inc.Stanowisko do przygotowywania próbek proteomicznych: Zautomatyzowane stacje robocze Biomek nie są przeznaczone ani zatwierdzone do stosowania w diagnostyce chorób lub innych schorzeń
Biomek i-Series Tips 230µ L NiesterylnyBeckman Coulter, Inc.B85903 Końcówki, materiały eksploatacyjne do i7
Końcówki Biomek i-Series 90µ L NiesterylnyBeckman Coulter, Inc.B85881 Końcówki, materiały eksploatacyjne do i7
FG, Zestaw Trypsyna TPCKSciex4445250Trypsyna stosowana w trawieniu
Hard-Shell 96-dołkowe płytki PCR, niskoprofilowe, cienkościenne, listwowe, zielone/przezroczyste Bio-Rad#hsp9641Płytka automatycznego podajnika
próbek Oktyl B-D-GlukopiranozydSigma-AldrichO9882-5Gdetergent stosowany w trawieniu
Polipropylen, 96-okrągłe płytki głębinowe SterylneBeckman Coulter, Inc.267007Odczynnik i płytka mineralizująca
Wybitność System HPLC UFLCXRShimadzu, JaponiaSystem LC o wysokim przepływie
QTRAP 6500SCIEXSpektrometr masowy
Woda, klasa HPLCThermo Fisher ScientificW54LC MS/MS rozpuszczalnik
Xbridge BEH30 C18 2,1 mm x 100 mmWody186003564kolumna LC MSMS
Inc. E.Coli .

Bibliografia

  1. Fu, Q., et al. Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation Workflow for Quantitative Mass Spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
  2. Lehmann, S., et al. Clinical mass spectrometry proteomics (cMSP) for medical laboratory: What does the future hold? Clinica Chimica Acta. 467, 51-58 (2017).
  3. Abbatiello, S. E., et al. Large-Scale Interlaboratory Study to Develop, Analytically Validate and Apply Highly Multiplexed, Quantitative Peptide Assays to Measure Cancer-Relevant Proteins in Plasma. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2357-2374 (2015).
  4. Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (7), 577-583 (2005).
  5. Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).
  6. Yates, J. R. 3rd Pivotal role of computers and software in mass spectrometry - SEQUEST and 20 years of tandem MS database searching. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1804-1813 (2015).
  7. Nilsson, T., et al. Mass spectrometry in high-throughput proteomics: ready for the big time. Nature Methods. 7 (9), 681-685 (2010).
  8. Van Eyk, J. E., Sobhani, K. Precision Medicine. Circulation. 138 (20), 2172-2174 (2018).
  9. Hoofnagle, A. N., et al. Recommendations for the Generation, Quantification, Storage, and Handling of Peptides Used for Mass Spectrometry-Based Assays. Clinical Chemistry. 62 (1), 48-69 (2016).
  10. Wijayawardena, B., Fu, Q., Johnson, C., Van Eyk, J. E., Kowalski, M. Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation on Biomek i-Series. Technical note, Beckman Coulter Life Science. Document # AAG-4890APP02. 19, (2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zautomatyzowane przygotowanie próbekanaliza spektrometrią masprzepływ pracy proteomicznysystem do automatycznego dozowania cieczytrawienie białekpeptydy stabilnych izotopówkwantyfikacja LC-MSwspółczynnik zmiennościpłytka 96-dołkowa
Przygotowanie próbki osocza do spektrometrii mas przy użyciu zautomatyzowanej stacji roboczej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.