Przygotowanie próbki osocza do spektrometrii mas przy użyciu zautomatyzowanej stacji roboczej

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy zautomatyzowaną metodę trawienia białek osocza do ilościowej analizy proteomicznej opartej na spektrometrii mas. W tym protokole etapy przenoszenia cieczy i inkubacji w celu denaturacji, redukcji, alkilowania i trawienia trypsyny są usprawnione i zautomatyzowane. Przygotowanie płytki 96-dołkowej z pożądaną precyzją zajmuje około pięciu godzin.

Streszczenie

Przygotowanie próbki do analizy spektrometrii mas w proteomice wymaga enzymatycznego rozszczepienia białek do mieszaniny peptydów. Proces ten obejmuje liczne etapy inkubacji i transferu cieczy w celu osiągnięcia denaturacji, redukcji, alkilacji i rozszczepienia. Dostosowanie tego przepływu pracy do zautomatyzowanej stacji roboczej może zwiększyć wydajność i zmniejszyć współczynniki wariancji, zapewniając w ten sposób bardziej wiarygodne dane do porównań statystycznych między typami próbek. Wcześniej opisaliśmy zautomatyzowany proces przygotowania próbek proteomicznych¹. W tym miejscu informujemy o rozwoju bardziej wydajnego i lepiej kontrolowanego przepływu pracy z następującymi zaletami: 1) Liczba etapów przenoszenia cieczy została zmniejszona z dziewięciu do sześciu poprzez połączenie odczynników; 2) Czas pipetowania jest skracany dzięki selektywnemu pipetowaniu końcówkami przy użyciu 96-pozycyjnej głowicy pipetującej z wieloma kanałami; 3) Potencjalna przepustowość jest zwiększona dzięki dostępności do 45 miejsc pokładowych; 4) Kompletna obudowa systemu zapewnia lepszą kontrolę temperatury i środowiska oraz zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia próbek lub odczynników; oraz 5) Dodanie stabilnych peptydów znakowanych izotopami, a także białka β-galaktozydazy do każdej próbki umożliwia monitorowanie i kontrolę jakości w całym procesie. Te ulepszenia sprzętowe i procesowe zapewniają dobrą odtwarzalność i poprawiają precyzję wewnątrz i między testami (CV poniżej 20%) dla kwantyfikacji białek i peptydów na podstawie LC-MS. Cały proces trawienia 96 próbek na 96-dołkowej płytce można zakończyć w ciągu około 5 godzin.

Wprowadzenie

Kwantyfikacja białek i peptydów oparta na spektrometrii mas (MS) jest coraz częściej stosowana jako narzędzie bioanalityczne do analizy osocza w podstawowych laboratoriach badawczych i klinicznych^2,3. Niezbędne oprzyrządowanie i informatyka szybko się rozwinęły, ponieważ MS stała się metodą z wyboru do ilościowego oznaczania białek lub zmodyfikowanych białek poprzez ukierunkowanie na określone sekwencje peptydów ze względu na jej zdolność do ilościowego oznaczania setek peptydów w jednym przebiegu MS⁴. Przygotowanie próbki służy jako podstawa każdej analizy proteomicznej. Przed analizą MS białka w próbce biologicznej są zazwyczaj denaturowane, redukowane, alkilowane, trawione do peptydów tryptycznych i odsalane⁵. Alkilacja blokuje cysteiny, aby zapobiec niekontrolowanym modyfikacjom i zapewnić, że wszystkie cysteiny mają tę samą masę. Następnie dodaje się trypsynę w celu trawienia białek do peptydów. Każdy z tych kroków wymaga optymalizacji, a cały proces tradycyjnie wykonywany jest ręcznie, co pozwala na wprowadzenie błędów analitycznych.

Tradycyjny proces rozwoju biomarkerów składa się z dwóch głównych procesów: proteomiki shotgun do globalnego odkrycia białek w celu stworzenia dogłębnego inwentarza białek⁶ oraz ukierunkowanej proteomiki do weryfikacji i walidacji mającej na celu precyzyjne i wysokoprzepustowe oznaczanie ilościowe białek⁷. Niezależnie od podejścia MS, przygotowanie próbki jest takie samo i koncentruje się na enzymatycznym rozszczepieniu białek do mieszaniny peptydów. Zgodnie z propozycją Van Eyka i Sobhani⁸, posiadanie metody, która pozwala na dokładną, precyzyjną i powtarzalną analizę zarówno dla testów odkrywczych, jak i celowanych, jest pożądane, aby skutecznie przenieść odkryte biomarkery do testów klinicznych. W tym celu pomocna będzie automatyzacja przygotowywania próbek, która zapewni możliwość zwiększenia wydajności analizy o wysokiej przepustowości. Metody ręczne zazwyczaj wprowadzają błędy analityczne wykraczające poza dopuszczalne limity określone przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) w zmienionych wytycznych dotyczących walidacji metod bioanalitycznych, które obejmują biomarkery i diagnostykę^2,9. Opracowanie szybkiego, bardzo dokładnego i bezobsługowego procesu przygotowywania próbek białek MS będzie konieczne, aby ułatwić badania nad biomarkerami, które wymagają przygotowania i analizy tysięcy próbek biologicznych. Przygotowanie próbki SM składa się z wielu etapów, w których mogą zostać wprowadzone błędy, a proces ten jest żmudny i czasochłonny.

W naszej ulepszonej metodzie, zautomatyzowana stacja robocza została zaprogramowana do wykonywania wszystkich niezbędnych procedur przygotowania próbki plazmy w sumie 6 kroków (Rysunek 1), aby zapewnić: 1) dokładne transfery cieczy; 2) reakcja jest inicjowana i zatrzymywana w określonym czasie; 3) reakcja odbywa się w kontrolowanej temperaturze (tj. w inkubatorze); i 4) reakcja ma równomierne mieszanie dla wszystkich reakcji. Wdrożyliśmy również dodawanie egzogennych białek kontroli jakości i wzorców wewnętrznych (wzorce peptydów znakowanych stabilnymi izotopami), aby zapewnić jakość i powtarzalną przepustowość kwantyfikacji białek i peptydów na bazie LC-MS w formacie 96-dołkowym. Łącznie z przygotowaniem odczynników, godzinami pracy i łącznie 1 000 000 etapów pipetowania wymagałoby przetworzenia 96 próbek w pojedynczych probówkach. Automatyzacja skraca czas pracy i zmniejsza liczbę interakcji międzyludzkich.

Protokół

1. Programowanie dla automatycznego urządzenia do obsługi cieczy

1. Utwórz nową metodę z menu Plik (punkt menu Plik | Nowa metoda)
   UWAGA: Wykonaj kroki w podanej kolejności. Kursywa oznacza tekst do wpisania w oprogramowaniu Biomek. Prosimy o kontakt z autorami w celu uzyskania informacji na temat technik pipetowania i szablonów.
2. Wpisz zmienne kroku początkowego i ich wartości w kroku początkowym, zgodnie z tabelą 1.
3. Ustawić kolumny do selektywnego pipetowania końcówek. W przypadku kroków 1.3-1.7 kliknij krok Ustaw globalny na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody.
   1. Korzystając z kroku Ustaw globalnie, ustaw wartość =FirstColumn na zmienną FirstColumn_Global, value =LastColumn na zmienną LastColumn_Global, value =LastColumn-FirstColumn+1 na zmienną Columns, a value =Columns*8 na zmienną Wells.
   2. Wybierz krok Skrypt na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody. Wpisz skrypt VB zgodnie ze wskazówkami w Rysunek 2.
4. Ustawianie głośności dla miksów Set Global i roztworów.
   1. Korzystając z kroku Ustaw globalnie, ustaw odpowiednie wartości zmiennych miksu woluminu, jak pokazano w tabeli 2.
   2. Kliknij krok Jeśli na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody. W polu Warunki wpisz Autosampler.
   3. W obszarze Następnie kliknij krok Ustaw globalny na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody.
   4. Korzystając z kroku Ustaw globalnie, ustaw wartość =(MobilePhase*Columns)+10 na zmienną MobilePhaseWell.
   5. W obszarze W przeciwnym razie kliknij krok Ustaw globalny na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody.
   6. Korzystając z kroku Ustaw globalnie, ustaw wartość =0 na zmienną MobilePhaseWell
5. Konfiguracja konfiguracji oprogramowania laboratoryjnego z przewodnikiem (GLS)
   1. Kliknij krok Edytor pokładów na pasku narzędzi w obszarze Narzędzia. Utwórz nową talię, która będzie odpowiadać układowi talii w Rysunek 3 i oznacz ją jako Talia 1.
   2. Kliknij krok Konfiguracja z przewodnikiem na pasku narzędzi w obszarze Konfiguracja i urządzenia, a następnie przeciągnij go do metody. Przeciągnij i upuść typy sprzętu laboratoryjnego w pozycjach talii, jak wskazano w Tabeli 3. Następnie wypełnij zakładki w tabeli, jak pokazano w Tabeli 3 i Rysunek 4 (Konfiguracja konfiguracji z przewodnikiem).
6. Procedura konfiguracji liczenia napiwków
   1. Kliknij krok Definiuj procedurę na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody. Nazwij procedurę jako TipCount.
   2. Kliknij krok Skrypt na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody. Wpisz skrypt VB zgodnie ze wskazówkami w Rysunek 5 (Skrypt zliczania końcówek).
   3. Kliknij krok Jeśli na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody.
   4. W polu Warunki wpisz TL5 = 0.
   5. W obszarze Następnie kliknij krok Przenieś oprogramowanie laboratoryjne na pasku narzędzi w obszarze Kroki konfiguracji i urządzenia i przeciągnij go do metody. Przenieś sprzęt laboratoryjny z TL5 do TR3. Kliknij krok Przenieś oprogramowanie laboratoryjne na pasku narzędzi, w obszarze Kroki konfiguracji i urządzenia, a następnie przeciągnij go do metody. Przenieś sprzęt laboratoryjny z TL2 do TL5. Na koniec kliknij krok Przenieś oprogramowanie laboratoryjne na pasku narzędzi w sekcji Kroki konfiguracji i urządzenia i przeciągnij go do metody. Przenieś sprzęt laboratoryjny z BC90 do TL2.
7. Definiowanie procedury dla inkubatora
   1. Kliknij krok Definiuj procedurę na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody. Procedura nazwij jako Inkubator.
   2. Wpisz HalfTime jako nazwę zmiennej i 1800 jako wartość domyślną.
   3. Wpisz NextTemp jako nazwę zmiennej i 22 jako wartość domyślną.
   4. Wpisz temp jako nazwę zmiennej i 60 jako wartość domyślną.
   5. Kliknij krok Enhanced Move Labware na pasku narzędzi w obszarze Setup & Device Steps (Kroki konfiguracji i urządzenia) i przeciągnij go do metody. Przenieś sprzęt laboratoryjny z P11 na INHECO1.
   6. Kliknij krok Uruchom procedurę na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody. Nazwij procedurę jako TipCount.
   7. Kliknij krok INHECO Incubate na pasku narzędzi w obszarze Integracje i przeciągnij go do metody. Wpisz INHECO1, aby użyć urządzenia w pozycji, = HalfTime dla inkubacji dla, = Temp dla °C i 3 dla °C temperatury docelowej. Wybierz opcję Potrząśnij podczas inkubacji i styl potrząsania orbitalnego (zgodnie z ruchem wskazówek zegara). W przypadku ustawień wpisz 1,00 mm z boku na bok, 6,6 razy na sekundę, 1,00 mm do przodu i do tyłu i 6,6 razy na sekundę.
      UWAGA: Upewnij się, że zainstalowane jest oprogramowanie INHECO Incubator.
   8. Kliknij krok INHECO Incubate na pasku narzędzi w obszarze Integracje i przeciągnij go do metody. Wpisz INHECO1, aby użyć urządzenia w pozycji, = HalfTime dla inkubacji dla, = Temp dla °C i 3 dla °C temperatury docelowej. Wybierz opcję Potrząśnij podczas inkubacji i styl potrząsania orbitalnego (przeciwnie do ruchu wskazówek zegara). W przypadku ustawień wpisz 1,00 mm z boku na bok, 6,6 razy na sekundę, 1,00 mm do przodu i do tyłu z prędkością 6,6 razy na sekundę.
   9. Kliknij krok Pause (Wstrzymaj) na pasku narzędzi w obszarze Setup & Device Steps (Kroki konfiguracji i urządzenia), a następnie przeciągnij go do metody. Wstrzymaj cały system na 1 s.
   10. Kliknij krok Definiuj procedurę na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody. Procedura nazwij jako Inkubator.
   11. Kliknij krok INHECO Incubate na pasku narzędzi w obszarze Integracje i przeciągnij go do metody. Wpisz INHECO1, aby użyć urządzenia w pozycji, 1 dla Inkubacji, = NextTemp dla °C i 3 dla °C temperatury docelowej.
8. Definiowanie procedury dla Orbitala.
   1. Kliknij krok Enhanced Move Labware na pasku narzędzi w obszarze Setup & Device Steps (Kroki konfiguracji i urządzenia) i przeciągnij go do metody. Przenieś sprzęt laboratoryjny z P11 do Orbital1.
   2. Kliknij krok Uruchom procedurę na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody. Wybierz procedurę TipCount.
   3. Kliknij krok Akcja urządzenia na pasku narzędzi w obszarze Setup & Device Steps (Konfiguracja i kroki urządzenia) i przeciągnij go do metody. Wybierz Device OritalShaker0, Command TimedShake. Wprowadź prędkość wstrząsania 1000, czas osiągnąć pełną prędkość 2, czas potrząsnąć 30.
   4. Kliknij krok Enhanced Move Labware na pasku narzędzi w obszarze Setup & Device Steps (Kroki konfiguracji i urządzenia) i przeciągnij go do metody. Przenieś sprzęt laboratoryjny Orbital1 do P11.
9. Ustawianie pierwszego miksu
   1. Kliknij krok Wybierz końcówkę na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody. Wybierz pozycję zmiany kolejności TL4.
   2. Kliknij krok INHECO Incubate na pasku narzędzi w obszarze Integracje i przeciągnij go do metody. Wpisz INHECO1 dla użycia urządzenia w pozycji, 1 dla inkubacji, 60 dla °C i 3 dla °C temperatury docelowej.
   3. Kliknij krok Pętla na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody w obszarze Wybierz krok porady. Wpisz col jako zmienną =FirstColumn jako Początek, =LastColumn jako Koniec i 1 jako Przyrost.
   4. Kliknij krok Select Tips Load Tips na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w kroku pętli. Z menu rozwijanego wybierz BC90 Tips, TL5 Location i TL2 backup Tips Location. Wybierz pozycję Pojedyncza kolumna (Pojedyncze kolumny) i wpisz wartość 1.
   5. Kliknij krok Select Tips Aspirate na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w kroku pętli. Wybierz typ okrągłego sprzętu laboratoryjnego BCDeep96 i pozycję płytki odczynnika. Wpisz objętość =FirstMix, Aspirate w kolumnie 1 i wierszu 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
   6. Kliknij krok Select Tips Dispense (Wybierz dozowanie końcówek) na pasku narzędzi w obszarze Liquid Handling Steps (Kroki obsługi cieczy) i przeciągnij go do metody w kroku pętli. Wybierz typ okrągłego sprzętu laboratoryjnego BCDeep96 i pozycję płytki odczynnika. Wpisz objętość =FirstMix, dozuj w kolumnie =col i wierszu 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
   7. Kliknij krok Select Tips Unload na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w kroku pętli. Wybierz opcję Unload tips to TR1 (Wyładuj końcówki do TR1).
10. Ustawianie przykładów
    1. Kliknij krok Jeśli na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody. Wpisz SamplePlate jako warunek.
    2. W obszarze Następnie kliknij krok Select Tips Load Tips (Wybierz wskazówki) na pasku narzędzi w obszarze Liquid Handling Steps (Kroki obsługi cieczy) i przeciągnij go do metody. Z menu rozwijanego wybierz BC90 Tips, TL5 Location i TL2 backup Tips Location. Wybierz pozycję Pojedyncze kolumny i wpisz =tipcolumns.
    3. Kliknij krok Wybierz aspirację końcówek na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody, w ciągu której znajduje się następca. Wybierz typ oprogramowania laboratoryjnego Greiner96RoundPS i pozycję próbek. Wpisz objętość =Próbka, Aspiruj w kolumnie =PierwszaKolumna i wiersz 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    4. Kliknij krok Select Tips Dispense (Wybierz dozowanie końcówek) na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody, w ciągu której znajduje się następca. Wybierz typ okrągłego sprzętu laboratoryjnego BCDeep96 i pozycję płytki reakcyjnej. Wpisz objętość = Próbka, dozuj w kolumnie = Pierwsza kolumna i wiersz 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    5. Kliknij krok Select Tips Unload na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody, w ciągu . Wybierz opcję Unload tips to TR1 (Wyładuj końcówki do TR1).
    6. Po zakończeniu kroku Jeśli kliknij krok Uruchom procedurę na pasku narzędzi w obszarze Kroki kontrolne i przeciągnij go do metody. Wybierz procedurę Inkubator. Wpisz HalfTime jako nazwę zmiennej i 1800 jako wartość domyślną. Wpisz NextTemp jako nazwę zmiennej i 22 jako wartość domyślną. Wpisz temp jako nazwę zmiennej i 60 jako wartość domyślną.
11. Ustawianie bloku cysteiny
    1. Kliknij krok Pętla na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody w obszarze Wybierz krok porady. Wpisz col jako zmienną =PierwszaKolumna jako Początek, =OstatniaKolumna jako Koniec i 1 jako Przyrost.
    2. W obszarze Pętla kliknij krok Select Tips Load Tips na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody. Z menu rozwijanego wybierz BC90 Tips, TL5 Location i TL2 backup Tips Location. Wybierz pozycję Pojedyncza kolumna (Pojedyncze kolumny) i wpisz wartość 1.
    3. Kliknij krok Wybierz aspirację końcówek na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w pętli. Wybierz typ okrągłego sprzętu laboratoryjnego BCDeep96 i pozycję płytki odczynnika. Wpisz objętość =CysteineMix, odessać w kolumnie 2 i rzędzie 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    4. Kliknij krok Select Tips Dispense (Wybierz dozowanie końcówek) na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w pętli. Wybierz typ okrągłego sprzętu laboratoryjnego BCDeep96 i pozycję płytki reakcyjnej. Wpisz objętość = CysteineMix, dozuj w kolumnie = kolumna i wiersz 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    5. Kliknij krok Select Tips Unload na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody, w ciągu . Wybierz opcję Unload tips to TR1 (Wyładuj końcówki do TR1).
    6. Po zakończeniu pętli If kliknij krok Uruchom procedurę na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody. Wybierz procedurę Inkubator. Wpisz HalfTime jako nazwę zmiennej i 300 jako wartość domyślną. Wpisz NextTemp jako nazwę zmiennej i 43 jako wartość domyślną. Wpisz temp jako nazwę zmiennej i 25 jako wartość domyślną.
12. Ustawianie drugiego miksu
    1. Kliknij krok Pętla na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody w obszarze Wybierz krok porady. Wpisz col jako zmienną =PierwszaKolumna jako Początek, =OstatniaKolumna jako Koniec i 1 jako Przyrost.
    2. W obszarze pętla kliknij krok Select Tips Load Tips na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody. Z menu rozwijanego wybierz BC90 Tips, TL5 Location i TL2 backup Tips Location. Wybierz pozycję Pojedyncza kolumna (Pojedyncze kolumny) i wpisz wartość 1.
    3. Kliknij krok Wybierz aspirację końcówek na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w pętli. Wybierz typ okrągłego sprzętu laboratoryjnego BCDeep96 i pozycję płytki odczynnika. Wpisz objętość =SecondMix, zassaj w kolumnie 3 i wierszu 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    4. Kliknij krok Select Tips Dispense (Wybierz dozowanie końcówek) na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w pętli. Wybierz typ okrągłego sprzętu laboratoryjnego BCDeep96 i pozycję płytki reakcyjnej. Wpisz objętość = SecondMix, Dozuj w kolumnie = kolumna i wiersz 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    5. Kliknij krok Select Tips Unload na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody, w ciągu . Wybierz opcję Unload tips to TR1 (Wyładuj końcówki do TR1).
    6. Po zakończeniu pętli Jeśli pętla kliknij krok Uruchom procedurę na pasku narzędzi w obszarze Kroki kontroli i przeciągnij go do metody. Wybierz procedurę Orbital.
    7. Kliknij krok Pause (Wstrzymaj) na pasku narzędzi w obszarze Setup & Device Steps (Kroki konfiguracji i urządzenia), a następnie przeciągnij go do metody. Wstrzymaj cały system na 1 s.
13. Ustawianie dodatku Trypsyny
    1. Kliknij krok Pętla na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody w obszarze Wybierz krok porady. Wpisz col jako zmienną =PierwszaKolumna jako Początek, =OstatniaKolumna jako Koniec i 1 jako Przyrost.
    2. W obszarze Pętla kliknij krok Select Tips Load Tips na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody. Wybierz z menu rozwijanego opcję BC90 Tips, TL5 Location (Lokalizacja TL5) i TL2 backup Tips Location (Lokalizacja kopii zapasowej TL2). Wybierz pozycję Pojedyncza kolumna (Pojedyncze kolumny) i wpisz wartość 1.
    3. Kliknij krok Wybierz aspirację końcówek na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w pętli. Wybierz typ okrągłego sprzętu laboratoryjnego BCDeep96 i pozycję płytki odczynnika. Wpisz objętość = Trypsyna, Odessaj w kolumnie 4 i wierszu 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    4. Kliknij krok Select Tips Dispense (Wybierz dozowanie końcówek) na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w pętli. Wybierz typ okrągłego sprzętu laboratoryjnego BCDeep96 i pozycję płytki reakcyjnej. Wpisz objętość = Trypsyna, Dozuj w kolumnie = kolumna i wiersz 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    5. Kliknij krok Select Tips Unload na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody, w ciągu . Wybierz opcję Unload tips to TR1 (Wyładuj końcówki do TR1).
    6. Po zakończeniu pętli If kliknij krok Uruchom procedurę na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody. Wybierz procedurę Inkubator. Wpisz HalfTime jako nazwę zmiennej i 3600 jako wartość domyślną. Wpisz NextTemp jako nazwę zmiennej i 25 jako wartość domyślną. Wpisz temp jako nazwę zmiennej i 43 jako wartość domyślną.
    7. Kliknij krok INHECO Incubate na pasku narzędzi w obszarze Integracje i przeciągnij go do metody. Upewnij się, że zainstalowane jest oprogramowanie INHECO Incubator. Wpisz INHECO1 dla użycia urządzenia w pozycji, 1 dla inkubacji, 25 dla °C i 5 dla °C temperatury docelowej.
14. Ustawianie hartowania
    1. Kliknij krok Pętla na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody w obszarze Wybierz krok porady. Wpisz col jako zmienną =PierwszaKolumna jako Początek, =OstatniaKolumna jako Koniec i 1 jako Przyrost.
    2. W obszarze Pętla kliknij krok Select Tips Load Tips na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody. Z menu rozwijanego wybierz BC90 Tips, TL5 Location i TL2 backup Tips Location. Wybierz pozycję Pojedyncza kolumna (Pojedyncze kolumny) i wpisz wartość 1.
    3. Kliknij krok Wybierz aspirację końcówek na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w pętli. Wybierz typ okrągłego sprzętu laboratoryjnego BCDeep96 i pozycję płytki odczynnika. Wpisz objętość = Zgasić, zassać w kolumnie 5 i wierszu 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    4. Kliknij krok Select Tips Dispense (Wybierz dozowanie końcówek) na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w pętli. Wybierz typ okrągłego sprzętu laboratoryjnego BCDeep96 i pozycję płytki reakcyjnej. Wpisz objętość = Zgasić, Dozować w kolumnie = kolumna i wiersz 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    5. Kliknij krok Select Tips Unload na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w obszarze Następnie. Wybierz opcję Unload tips to TR1 (Wyładuj końcówki do TR1).
    6. Po zakończeniu pętli Jeśli pętla kliknij krok Uruchom procedurę na pasku narzędzi w obszarze Kroki kontroli i przeciągnij go do metody. Wybierz procedurę Orbital.
    7. Kliknij krok Pause (Wstrzymaj) na pasku narzędzi w obszarze Setup & Device Steps (Kroki konfiguracji i urządzenia), a następnie przeciągnij go do metody. Wstrzymaj cały system na 1 s.
    8. Kliknij krok Pause (Wstrzymaj) na pasku narzędzi w obszarze Setup & Device Steps (Kroki konfiguracji i urządzenia), a następnie przeciągnij go do metody. Wybierz opcję Wstrzymaj cały system i wyświetl ten komunikat. Wpisz komunikat "Kontynuuj po odwirowaniu".
15. Ustawianie płytki do automatycznego podajnika próbek
    1. Kliknij krok Jeśli na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody w kroku Wybierz poradę. Wpisz Autosampler jako warunek.
    2. W obszarze Następnie kliknij krok Pętla na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody. Wpisz col jako zmienną =PierwszaKolumna jako Początek, =OstatniaKolumna jako Koniec i 1 jako Przyrost.
    3. W obszarze Pętla kliknij krok Select Tips Load Tips na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody. Z menu rozwijanego wybierz BC230 Tips, TL6 Location i TL2 backup Tips Location. Wybierz pozycję Pojedyncza kolumna (Pojedyncze kolumny) i wpisz wartość 1.
    4. Kliknij krok Wybierz aspirację końcówek na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w pętli. Wybierz typ okrągłego sprzętu laboratoryjnego BCDeep96 i pozycję płytki odczynnika. Wpisz objętość =Faza mobilna, Aspirat w kolumnie 6 i wierszu 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    5. Kliknij krok Select Tips Dispense (Wybierz dozowanie końcówek) na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w pętli. Wybierz Bio_RadPCR96 typu sprzętu laboratoryjnego i pozycję płytki automatycznego podajnika próbek. Wpisz objętość =Faza mobilna, Dozuj w kolumnie = kolumna i wiersz 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    6. Kliknij krok Select Tips Unload na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w obszarze Następnie. Wybierz opcję Unload tips to TR1 (Wyładuj końcówki do TR1).
    7. Po zakończeniu pętli If kliknij krok Uruchom procedurę na pasku narzędzi w obszarze Kroki sterowania i przeciągnij go do metody. Wybierz procedurę TipCount.
    8. Kliknij krok Select Tips Load Tips (Wybierz wskazówki, załaduj wskazówki) na pasku narzędzi w obszarze Liquid Handling Steps (Kroki obsługi cieczy) i przeciągnij go do metody. Wybierz z menu rozwijanego opcję BC90 Tips, TL5 Location (Lokalizacja TL5) i TL2 backup Tips Location (Lokalizacja kopii zapasowej TL2). Wybierz pozycję Pojedyncze kolumny i wpisz =tipcolumns.
    9. Kliknij krok Wybierz aspirację końcówek na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w pętli. Wybierz typ okrągłego sprzętu laboratoryjnego BCDeep96 i pozycję płytki reakcyjnej. Wpisz objętość =DigestTransfer, Aspirate w kolumnie = pierwsza kolumna i wiersz 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    10. Kliknij krok Select Tips Dispense (Wybierz dozowanie końcówek) na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w pętli. Wybierz Bio_RadPCR96 typu sprzętu laboratoryjnego i pozycję płytki automatycznego podajnika próbek. Wpisz objętość =Faza mobilna, Dozuj w kolumnie =Pierwsza kolumna i wierszu 1. Wybierz zoptymalizowaną technikę z menu rozwijanego techniki.
    11. Kliknij krok Select Tips Unload na pasku narzędzi w obszarze Kroki obsługi cieczy i przeciągnij go do metody w obszarze Następnie. Wybierz opcję Unload tips to TR1 (Wyładuj końcówki do TR1). W tym miejscu kończy się krok wyboru wskazówek.
    12. Zapisz i nazwij metodę.

2. Przygotuj próbkę, sprzęt laboratoryjny i odczynniki

1. Przenieś 5 μl zebranego zdrowego osocza ludzkiego do polipropylenowej, 96-okrągłej płytki głębinowej.
   UWAGA: Patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się z odczynnikami i materiałami eksploatacyjnymi stosowanymi w tym protokole. Zakupiono trypsynę traktowaną TPCK, a stosunek trypsyny do substratu i czas inkubacji zostały specjalnie zoptymalizowane. Jeśli stosuje się trypsynę innego gatunku, taką jak trypsyna rekombinowana o klasie sekwencyjnej, należy przetestować i zoptymalizować stosunek enzymu do substratu oraz czas inkubacji.

3. Procedura operacyjna

1. Kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania.
2. Na karcie Metoda wybierz opcję Home All Axes (Położenie początkowe wszystkich osi), aby zorientować i przygotować automatyczną obsługę cieczy. Upewnij się, że wszystkie strzykawki na stanowisku pracy nie zawierają widocznych pęcherzyków powietrza.
3. W obszarze Plik wybierz pozycję Otwórz | Metoda.
4. Wybierz metodę (Rysunek 6).
5. Uruchom metodę, klikając zieloną ikonę Uruchom w kształcie trójkąta.
6. Aby na końcu metody przygotować płytkę automatycznego podajnika próbek, wprowadź wartość "true" w polu Wprowadź wartość, która ma być używana w polu "Autosampler", a następnie kliknij przycisk OK. Jeśli tabliczka automatycznego podajnika próbek nie jest przygotowywana, wprowadź wartość "false", a następnie kliknij przycisk OK.
7. Wprowadź wartość "1" w wierszu polecenia Wprowadź wartość, która ma być używana w kolumnie "firstcolumn", a następnie kliknij przycisk OK.
8. Wprowadź wartość "12" w polu Wprowadź wartość, która ma być używana dla "lastcolumn", a następnie kliknij przycisk OK.
   UWAGA: Ten krok i krok 4.7 nakazują stacji roboczej przeprowadzenie trawienia na 12 kolumnach płytki 96-dołkowej, w wyniku czego wszystkie dołki płytki są używane do trawienia
9. Jeśli używana jest płytka z próbką o objętości co najmniej 20 μl, wprowadź wartość "true" w monicie Wprowadź wartość, która ma być używana dla "SamplePlate", a następnie kliknij przycisk OK. Jeśli płytka próbkowania nie jest używana, wprowadź wartość "false", a następnie kliknij przycisk OK.
   UWAGA: Jeśli płytka do pobierania próbek nie jest używana, dodać 5 μl próbki do każdego odpowiedniego dołka płytki reakcyjnej.
10. Postępuj zgodnie ze wskazówkami w oknie Guided Labware Setup (Konfiguracja oprogramowania laboratoryjnego z przewodnikiem) i kliknij przycisk Kontynuuj.
    UWAGA: Następne okno opisuje układ "Płytki odczynnika", która ma zostać przygotowana (Rysunek 7, Tabela uzupełniająca 1). Następujące objętości zostaną podzielone na porcje do każdej z 8 studzienek pojedynczej kolumny w 96-dołkowej płytce o pojemności 1 ml Deep Round:
    Kolumna 1: 540 μl mieszaniny reakcyjnej 1,
    Kolumna 2: 50 μl bloku cysteiny.
    Kolumna 3: 730 μl mieszaniny reakcyjnej 2,
    Kolumna 4: 130 μl trypsyny.
    Kolumna 5: 130 μl roztworu hartującego.
    Kolumna 5: 1090 μl roztworu fazy ruchomej (jeśli użytkownik wpisał wartość "true" w kroku 6).
11. Kliknij przycisk Dalej, a w następnym oknie opisano minimalną objętość (20 μl), którą należy podać na płytce próbki. Jeśli użytkownik wprowadzi wartość "false" dla monitu dotyczącego płytki z próbką (krok 9), użytkownik zostanie poproszony o dodanie próbki o 5 μl do płytki reakcyjnej.
12. Kliknij Next.
    UWAGA: Następne okno pokazuje, że na pokładzie automatycznej ładowarki do obsługi cieczy należy umieścić puste pudełko na końcówki o pojemności 90 μl.
13. Kliknij ponownie przycisk Dalej, aby ułożyć pokład automatycznego urządzenia do obsługi cieczy zgodnie ze specyfikacją i ilustracją (Rysunek 8), w tym płytkę odczynnika, płytkę reakcyjną, płytkę próbki, płytkę automatycznego podajnika próbek, 6 pełnych pojemników na końcówki 90 μl, puste pudełko na końcówki 90 μl i pełne pudełko na końcówki 230 μl.
14. Kliknij przycisk Zakończ, aby rozpocząć metodę.
    UWAGA: Po kliknięciu przycisku Zakończ użytkownik nie może sięgnąć do automatycznego urządzenia do obsługi cieczy. Spowoduje to "przerwanie kurtyny świetlnej" maszyny i zatrzymanie urządzenia do obsługi cieczy ze względów bezpieczeństwa.
15. Po wyświetleniu monitu Kontynuuj po odwirowaniu wyjmij płytkę reakcyjną i odwiruj ją przez 30 minut przy 3,000 obr./min.
16. Po zakończeniu wirowania umieść płytkę reakcyjną z powrotem w automatycznym urządzeniu do obsługi cieczy w pozycji, w której znajdowała się przed wirowaniem, a następnie kliknij przycisk Kontynuuj.
    UWAGA: Automatyczna obsługa cieczy zatrzyma się ponownie po zakończeniu metody. Jeśli użytkownik wpisał wartość "true" w kroku 6, płytkę automatycznego podajnika próbek można następnie wyjąć ze stacji roboczej i umieścić w autosamplerze urządzenia do chromatografii cieczowej w celu analizy.

4. LC-MSMS

1. Roztwory peptydów w wysokoprzepływowej HPLC składającej się z kolumny C18 o wymiarach 2,1 mm x 100 mm i średnicy 3,5 μm o natężeniu przepływu 0,25 ml/min i analizowane w linii produkcyjnej na spektrometrze mas z potrójnym kwadrupolem.
   UWAGA: Po mineralizacji peptydów, ukierunkowana metoda LC-MSMS do ilościowego oznaczania peptydów z próbek przygotowanych przez roboty jest szczegółowo opisana¹ po krótkim opisie LC-MSMS.
2. Ustawić temperaturę pieca kolumnowego na 40 °C. Użyj buforu A (2% ACN, 98% wody, 0,1% kwasu mrówkowego) i buforu B (95% ACN, 5% wody, 0,1% kwasu mrówkowego) jako dwóch faz ruchomych.
3. Zrównoważ kolumnę z 5% B przez 5 minut po załadowaniu. Eluuj peptydy w ciągu 30 minut z liniowym gradientem buforu B od 5% do 35%.
   1. Przed załadowaniem następnej próbki należy poddać kolumnę recyklingowi, przemłukując ją roztworem 98% B przez 10 minut, a następnie 5% B przez 5 minut.
   2. W celu przekierowania on-line, należy skierować eluent zakolumnowy do odpadów, zanim dostanie się do źródła jonów za pomocą dwufazowego zaworu przełączającego.
4. Przetwarzanie danych MRM.

Wyniki

Zautomatyzowany proces przygotowania próbek proteomicznych na zautomatyzowanej stacji roboczej został zaadaptowany z naszego poprzedniego automatycznego protokołu z solidną metodą akwizycji LC-SRM-MS¹ dla albuminy, wybranego białka osocza, oraz β-galaktozydazy (β-gal), egzogennego białka używanego do kontroli jakości. Po przetworzeniu próbki przeprowadzono na potrójnym kwadrupolowym LC-MS w teście SRM ukierunkowanym na albuminę surowicy, β-galaktozydazę. Współczynnik zmienności (CV) sygnału SRM dla każdego przejścia wykorzystano do monitorowania odtwarzalności protokołu automatycznego trawienia.

Zautomatyzowaliśmy etapy dodawania i mieszania odczynników do trawienia 5 μL próbek osocza za pomocą 2-godzinnej inkubatora trypsyny na pokładzie. Aby określić odtwarzalność, 5 μl puli osocza pipetowano do wielu dołków płytki reakcyjnej z głowicą wielokanałową (96 pinów). Aby monitorować spójność, dodaliśmy białko β-gal przed reakcjami redukcji i alkilacji. Zautomatyzowany proces przygotowania próbek proteomicznych został przetestowany przy użyciu solidnej metody akwizycji LC-SRM-MS, obejmującej albuminę, białko osocza o największej obfitości, oraz białko β-gal, stosowane do kontroli jakości. Trzy peptydy β-gal i dwa peptydy albuminy monitorowano z przetworzonych białek albuminy osocza i wzbogaconego białka β-gal (Tabela 4).

Aby zaoszczędzić czas i uprościć procedurę, zredukowaliśmy etapy przenoszenia cieczy, takie jak dodawanie/mieszanie/inkubacja odczynnika i mieszaniny reakcyjnej za pomocą stacji roboczej, z dziewięcioetapowego przepływu pracy do sześcioetapowego przepływu pracy (Rysunek 1). Całkowity przebieg proteomicznego przebiegu pracy składał się z dwóch elementów eksperymentalnych: zautomatyzowanego przygotowania próbki i LC-MS/MS. Po pierwsze, oceniliśmy precyzję pozyskiwania danych LC-MS/MS SRM przez osiem kolejnych wstrzyknięć z tej samej studni mineralizacyjnej płytki automatycznego próbnika. Precyzja zautomatyzowanego procesu przygotowywania próbek została obliczona na podstawie procentu współczynnika wariancji (%CV) całkowitego przepływu pracy proteomicznego SRM minus%CV LC-MS/MS (Rysunek 9B). Dzięki usprawnionej procedurze trawienia osocza na zautomatyzowanej stacji roboczej, eksperymentalna precyzja automatycznego przygotowywania próbek wynosiła mniej niż 11,4% dla egzogennych wzbogaconych białek β-gal (średnio 10,0%) i mniej niż 14,9% dla najobficiej występującej albuminy surowicy ludzkiej (średnio 9,9%) (Rysunek 9). Zgodnie z oczekiwaniami zaobserwowano dobre natężenie sygnału zarówno dla albuminy surowicy ludzkiej, jak i białek β-gal (Rysunek 9C).

Dla każdego etapu pipetowania i przenoszenia cieczy, techniki zostały specjalnie zoptymalizowane. Aby monitorować precyzję etapów przenoszenia cieczy, zwiększyliśmy wzorce peptydów znakowanych stabilnymi izotopami (SIL) dla endogennego białka albuminy surowicy ludzkiej i egzogennego białka β-gal w trzech niezależnych etapach przenoszenia odczynników: Reaction Mix 1, Cysteine Blocker i Reaction Mix 2 (Rysunek 10). Sygnały MRM z tych pięciu peptydów SIL zostały pozyskane w celu monitorowania precyzji zautomatyzowanych etapów przenoszenia cieczy. Średni %CV dla peptydów, DDNPNLPR^ i GDFQFNISR^ (^ reprezentuje aminokwas znakowany N15) z etapu Reaction Mix 1 wahał się od 1,8% do 11,2%. Średni %CV jednego peptydu (IDPNAWVER^) z etapu blokera cysteiny wahał się od 6,6 do 8,8%. Średni %CV dwóch peptydów (WVGYGQDSR^ i LVNEVTEFAK^) wahał się od 6,2% do 11,9% (Rysunek 10).

Aby zweryfikować proces automatycznego przygotowywania próbek proteomicznych, oceniliśmy odtwarzalność w wielu białkach i wielu dniach dla albuminy surowicy ludzkiej, egzogennego β–galu i 40 dodatkowych białek osocza. Przetworzyliśmy 21 powtórzonych próbek (połączone normalne ludzkie osocze), lokalizacja studni pokazana na Rysunek 11A, w trzech różnych dniach. Intra-day CV zostały obliczone na podstawie 21 odwiertów przygotowanych tego samego dnia. Średnie %CV w ciągu dnia dla 40 białek wahały się od 4% do 20% (Ryc. 11B). Aby ocenić efekt krawędzi zautomatyzowanego przepływu pracy opartego na płytach, %CV obliczono z określonych dołków w wyznaczonych kolumnach i wierszach (Rysunek 12A dla mapy kolumn i wierszy). Intensywność sygnałów MRM była podobna we wszystkich konfiguracjach kolumn i wierszy, a %CV mieściło się w zakresie od 3% do 22% (Rysunek 12B).

Podsumowując, zoptymalizowany zautomatyzowany przepływ pracy daje 96 jednorodnie przetworzonych próbek w czasie krótszym niż pięć godzin z doskonałą precyzją eksperymentalną. Aby zapewnić kompatybilność ze zautomatyzowanym przepływem pracy, wybraliśmy odczynniki, które mają znikome niespecyficzne reakcje uboczne, są stabilne w świetle otoczenia, są przyjazne dla LC-MS/MS i mogą być przechowywane jako zamrożone podwielokrotności.

Rysunek 1: Schemat procesu przygotowania próbki. Wymieniono 6 głównych etapów przenoszenia cieczy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Skrypt ładowania końcówki. Szczegóły skryptu VB są pokazane tutaj. Skrypt określa warunki ładowania końcówki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Zautomatyzowany układ pokładu stacji roboczej. Pokład składa się z ALP 1x1, ALP do ładowania końcówek, Trash, Tip wash, Peltiera i inkubatora. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Właściwości płytki odczynnika. Pokazane są właściwości wymagane dla oprogramowania laboratoryjnego Reagent Plate podczas uzyskiwania dostępu za pomocą konfiguracji Guided Labware. Wybierz odpowiednią kolumnę i wpisz zmienne, jak pokazano na rysunku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Skrypt liczenia napiwków. Ten skrypt pomaga śledzić liczbę końcówek na pokładzie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Przegląd metody trawienia i porcjowania próbek osocza. Kroki dotyczące obliczeń odczynników, konfiguracji sprzętu laboratoryjnego i manipulacji cieczami w metodzie obchodzenia się z cieczami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Układ płytki odczynnika. Pokazano odczynniki chemiczne potrzebne do mineralizacji plazmowej i przygotowania automatycznego podajnika próbek i rozmieszczone na płytce z odczynnikiem. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie uwagi technicznej¹⁰. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Układ sprzętu laboratoryjnego na pokładzie zautomatyzowanej stacji roboczej. Pokazany jest układ pokładu dla metody trawienia plazmowego dla osoby zajmującej się obsługą cieczy. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie uwagi technicznej¹⁰. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Precyzja całkowitego proteomicznego przepływu pracy składa się z CV stacji roboczej i docelowego CV LC MS/MS.
Monitorowano pięć peptydów z β-galu i albuminy, pokazano chromatogramy i czas retencji peptydu dla każdego peptydu (A), precyzję określono na podstawie reprezentatywnego eksperymentu przetwarzania 30 dołków / próbek, obliczono CVs% dla całkowitego przepływu pracy proteomicznej, analizę LC MS / MS i zautomatyzowane przetwarzanie próbki (B). Ogólnie rzecz biorąc, strawione peptydy wykazywały dobre sygnały w zakresie od 1x10⁵ do 1x10⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 10: Wyznaczanie precyzji dla etapów przenoszenia cieczy. Syntetyczne peptydy wzbogacono w odczynniki specyficzne dla danego kroku, a automatyczne przenoszenie cieczy określono za pomocą całkowite%CV. Z 30 dołków/próbek, eksperyment minus% CV LC MSMS (określony przez 8 powtórzonych wstrzyknięć LC MSMS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 11: Wielodniowa odtwarzalność zautomatyzowanego procesu przygotowania próbki proteomicznej z analizą MRM 42 białek. (A) Mapa płytki reakcyjnej dla każdego z trzech dni jest pokazana tutaj, 5 μl osocza dodano do każdego z 21 dołków. 3 studnie, do których odebrano 5 UL wody, wykorzystano jako kontrole ujemne/ślepe. (B) Średnia intensywność 190 przemian składa się z 75 peptydów i 42 białek (po lewej), a %CV dla każdej przemiany MRM obliczono na podstawie trawienia w 21 dołkach na każdy dzień (po prawej). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 12: Odtwarzalność określonych lokalizacji studni (położenie kolumn i rzędów). (A) Położenie kolumn i wierszy wraz z mapą tablic jest pokazane tutaj. (B) Specyficzne dla lokalizacji kolumn i rzędów sygnały MRM o średniej intensywności z określonych dołków (po lewej) i cv% (po prawej) z mineralizacji na pojedynczej płytce. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 13: Zrzut ekranu edytora techniki. Dla każdego szablonu pipetowania zdefiniuj właściwości wykrywania poziomu cieczy, wykrywania skrzepów, przebijania, rodzaju cieczy, ogólnego, aspiratu, dozowania, mieszania i kalibracji. Wzór i techniki stosowane w niniejszym protokole przedstawiono w tabeli uzupełniającej 2). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

powiedział: pkt. pkt. Rozdział pkt.

zmienna	zmienna	wartość	opis
Automatyczny podajnik próbek	boolowski	prawdziwy	Korzystanie z automatycznego podajnika próbek
Betagal	liczba całkowita	5	Objętość Betagal
Zobacz materiał BG1	liczba całkowita	0,8	Objętość BG1
Zobacz materiał BG2	liczba całkowita	0,8	Wolumin BG2
Zobacz materiał BG3	liczba całkowita	0,8	Objętość BG3
CysteinBlocker (Bloker Cysteiny)	liczba całkowita	Wydanie orzeczenia 1,25	Objętość blokera cysteiny
Bufor cysteiny	liczba całkowita	0,45	Objętość buforu cysteiny
Denaturant (Denaturant)	liczba całkowita	5	Objętość denaturantu
Transfer na trawie	liczba całkowita	10	Objętość transferu trawienia
Pierwszy bufor	liczba całkowita	25,9	Pierwszy wolumin buforowy
Pierwsza kolumna	liczba całkowita	1	Pierwsza kolumna
Zobacz materiał HSA1	liczba całkowita	0,8	Wolumin HSA1
Zobacz materiał HSA2	liczba całkowita	0,8	Wolumin HSA2
Ostatnia kolumna	liczba całkowita	12	Ostatnia kolumna
Faza mobilna	liczba całkowita	90	Ruchoma objętość fazy
ugasić	liczba całkowita	10	Kolumna hartownicza
Czynnik redukujący	liczba całkowita	5	Kolumna środka redukującego
próbka	liczba całkowita	5	Przykładowa kolumna
Płytka próbna	boolowski	prawdziwy	Użyj płytki próbnej
Drugi bufor	liczba całkowita	58,4	Drugi wolumin buforowy
trypsyna	liczba całkowita	10	Kolumna Trypsyna

Tabela 1: Zmienne kroku startowego

wartość	zmienna
=Pierwszy Bufor+Denatrant+Środek Redukujący+Betagal+BG1+HSA1	Pierwszy miks
=Bloker cysteiny+Bufor cysteiny+BG2	Mieszanka cysteiny
=Drugi bufor+BG3+HSA2	Drugi miks
=(PierwszyMieszanie*Kolumny)+30	Najpierw MixWell
= (CysteineMix*Kolumny)+20	CysteinaStudnia
=(SecondMix*Kolumny)+10	Drugi MixWell
=(Trypsyna*Kolumny)+10	TrypsinWell
=(Wygaszanie*Kolumny)+10	Dobrze zgasić
=(Studnia PierwszegoMieszania*8)+100	Pierwszy MixStock
=CysteinaStudnia*8+20	CysteinaMixStock
=(Studnia Mieszania*8)+100	SecondMixStock (Drugi MixStock)

Tabela 2: Zmienne dotyczące miksu objętości

próbek próbek

typ	nazwa	pozycja	głębokość	Właściwości	używać?
BCDeep96Okrągły	Płytka odczynnika	Klasa P5	1 (góra)	#	=nie SamplePlate
BCDeep96Okrągły	Płytka odczynnika	Klasa P5	1 (góra)	#	=Tabliczka próbki
BCDeep96Okrągły	Płytka reakcyjna	Zobacz materiał P11	1 (góra)		prawdziwy
Bio_RadPCR96*	Próbki	Zobacz materiał P9	1 (góra)		=Tabliczka próbki
Bio_RadPCR96*	Płyta automatycznego podajnika próbek	Zobacz materiał P10	1 (góra)		=Automatyczny podajnik
Zobacz materiał BC90	pusty		1 (góra)		prawdziwy
Zobacz materiał BC90			1 (góra)		prawdziwy
Zobacz materiał BC90			1 (góra)		prawdziwy
Zobacz materiał BC230			1 (góra)		=Automatyczny podajnik
Zobacz materiał BC90			1 (góra)		=Kolumny>1
Zobacz materiał BC90			1 (góra)		=Kolumny>3
Zobacz materiał BC90			1 (góra)		=Kolumny>5
Zobacz materiał BC90			1 (góra)		=Kolumny>7
Zobacz materiał BC90			1 (góra)		=Kolumny>9
Uwaga: *: Odpowiada 96-dołkowej płytce Bio-Rad. #: Kliknij właściwości, a następnie wprowadź zmienne głośności, jak pokazano na rysunku 6.

Tabela 3: Konfiguracja konfiguracji z przewodnikiem

szt. do zmian szt. TGLI lat szt. lat szt. KB szt. dni szt. lat szt. pkt. zł dni pkt. KM lat dni Rozdział pkt. lat szt. pkt. dni szt. pkt. TGL lat szt. szt. lat pkt. pkt. pkt. dni pkt. pkt. dni pkt. pkt.

Białko ID	Sekwencja peptydowa	Q1 Masa (Da)	Q3 Masa (Da)	Czas (min)	Fragment jonu	Potencjał deklastracyjny	Energia zderzenia	Potencjał wyjścia z komórki kolizyjnej
sp|P00722|BGAL_ELOCI	GDFQFNISR	542,3 pkt.	262,1	Pytanie 19,7	+2y2	61	21	8
		542,3 pkt.	636	Pytanie 19,7	+2y5	61	25	12
		542,3 pkt.	764,2 pkt.	Pytanie 19,7	+2y6	61	25	Rozdział 18
	IDPNAWVER	550,3 pkt.	436,1	Rozdział 18,1	+2y7+2	61	23	8
		550,3 pkt.	871.2	Rozdział 18,1	+2y7	61	25	Rozdział 18
		550,3 pkt.	774,2 pkt.	Rozdział 18,1	+2y6	61	33 Rozdział 33	8
	WVGYGQDSR	534,3	782,1	Rozdział 12.1	+2y7	51 Rozdział 51	25	6
		534,3	562,1	Rozdział 12.1	+2y5	51 Rozdział 51	27 Rozdział 27	6
		534,2 pkt.	505,2	Rozdział 12.1	+2y4	90	25	8
sp|Zobacz materiał P02768|ALBU_HUMAN	DDNPNLPR	470,8	596,2 pkt.	Pytanie 9,2	+2y5	61	27 Rozdział 27	16
		470,8	499,3 pkt.	Pytanie 9,2	+2y4	61	27 Rozdział 27	Rozdział 18
		470,8	710,4	Pytanie 9,2	+2y6	61	27 Rozdział 27	Rozdział 18
	LVNEVTEFAK	575,3 pkt.	694,4	Rozdział 18,2	+2y6	73,1	29,6	Rozdział 18
		575,3 pkt.	937,5	Rozdział 18,2	+2y8	73,1	29,6	Rozdział 18
		575,3 pkt.	823.4	Rozdział 18,2	+2y7	73,1	29,6	Rozdział 18

Tabela 4: Parametry MRM

Tabela uzupełniająca 1: Płytka z odczynnikiem Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 2: Szablon protokołu Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Przetwarzanie próbek do spektrometrii mas wymaga denaturacji, redukcji i alkilowania białek w celu zablokowania cystein oraz trawienia trypsyny w celu rozszczepienia białek na peptydy. Każda reakcja chemiczna lub enzymatyczna musi zostać zainicjowana w określonym czasie i przeprowadzona w kontrolowanej temperaturze, a każdy etap procesu obejmuje wiele etapów przenoszenia cieczy, w których można wprowadzić eksperymentalne zmiany. Rozwiązaniem tego dylematu jest zautomatyzowane przetwarzanie próbek. Obecnie dostępne systemy obsługi cieczy mają możliwość przenoszenia odczynników do płytek 96-dołkowych z dokładnością i precyzją mniejszą niż 5%, w zależności od zastosowanego typu głowicy i końcówki, a także inkubacji próbek, w razie potrzeby z wstrząsaniem, w kontrolowanych temperaturach w zakresie od 14 °C do 70 °C. Użyliśmy zautomatyzowanej maszyny do obsługi cieczy do przetwarzania osocza do testów SRM w formacie 96-dołkowym.

W złożonych mieszaninach białek w surowicy, osoczu i innych próbkach biologicznych znajduje się wiele tysięcy miejsc rozszczepienia proteazy; Każde z tych białek ma unikalne właściwości wpływające na dostępność miejsca rozszczepienia i stabilność powstałych peptydów. W związku z tym niemożliwe jest zaprojektowanie procedury przetwarzania próbki, która byłaby optymalna dla każdego białka. Najlepszą alternatywą jest bycie tak konsekwentnym, jak to tylko możliwe.

Aby osiągnąć spójność, zoptymalizowaliśmy każdy etap pipetowania wykonywany przez automatyczną centralę do obsługi cieczy. Najpierw rozważyliśmy wymaganą objętość i ograniczenia wynikające z rodzaju cieczy (plazmowa, wodna lub organiczna) i odpowiadających im właściwości (lepkość, spójność i lotność), sprzętu (głowica pipetująca na stanowisku roboczym i ramiona chwytające płytkę) oraz sprzętu laboratoryjnego. Następnie zmienialiśmy prędkość i ciągnącą szczelinę powietrzną do zasysania, prędkość i objętość wydmuchu do dozowania oraz siłę i czas mieszania, jednocześnie włączając dotyk końcówki po zasysaniu i/lub dozowaniu, jeśli to konieczne, aby wyeliminować przywieranie cieczy do zewnętrznej strony końcówek (Rysunek 13, Tabela uzupełniająca 1). Unikalny peptyd SIL, wstępnie przebadany pod kątem stabilności, został dodany do każdego odczynnika, aby umożliwić monitorowanie precyzji każdego etapu obchodzenia się z cieczą. Po optymalizacji, CV procesu dla większości przejść wynosiło mniej niż 10%, co świadczy o dobrej odtwarzalności ze zautomatyzowaną stacją roboczą (Rysunek 9, Rysunek 10, Rysunek 11 i Rysunek 12).

Przedstawiony tutaj zautomatyzowany przepływ pracy zapewnia spójne trawienie enzymatyczne z lepszą odtwarzalnością i przepustowością w porównaniu z metodami ręcznymi (Rysunek 9, Rysunek 10). Podejście to daje nadzieję na poprawę dokładności i niezawodności odkrywania i walidacji biomarkerów za pomocą spektrometrii mas.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wspólna biorekultywacja	zdrowego osocza ludzkiego		osocze ludzkie testowane w manuskrypcie
Acetonitryl, HPLC Grade	Thermo Fisher Scientific	A998SK1	LC MS/MS rozpuszczalnik
B-galaktozydaza Rekombinowana z	egzogennych białek kontrolnych	Sigma-Aldrich	G3153-5MG
Zautomatyzowana stacja robocza Biomek i7	Beckman Coulter, Inc.		Stanowisko do przygotowywania próbek proteomicznych: Zautomatyzowane stacje robocze Biomek nie są przeznaczone ani zatwierdzone do stosowania w diagnostyce chorób lub innych schorzeń
Biomek i-Series Tips 230µ L Niesterylny	Beckman Coulter, Inc.	B85903	Końcówki, materiały eksploatacyjne do i7
Końcówki Biomek i-Series 90µ L Niesterylny	Beckman Coulter, Inc.	B85881	Końcówki, materiały eksploatacyjne do i7
FG, Zestaw Trypsyna TPCK	Sciex	4445250	Trypsyna stosowana w trawieniu
Hard-Shell 96-dołkowe płytki PCR, niskoprofilowe, cienkościenne, listwowe, zielone/przezroczyste	Bio-Rad	#hsp9641	Płytka automatycznego podajnika
próbek Oktyl B-D-Glukopiranozyd	Sigma-Aldrich	O9882-5G	detergent stosowany w trawieniu
Polipropylen, 96-okrągłe płytki głębinowe Sterylne	Beckman Coulter, Inc.	267007	Odczynnik i płytka mineralizująca
Wybitność System HPLC UFLCXR	Shimadzu, Japonia		System LC o wysokim przepływie
QTRAP 6500	SCIEX		Spektrometr masowy
Woda, klasa HPLC	Thermo Fisher Scientific	W54	LC MS/MS rozpuszczalnik
Xbridge BEH30 C18 2,1 mm x 100 mm	Wody	186003564	kolumna LC MSMS