Artykuł metodologiczny

Indukowanie i charakterystyka stłuszczenia pęcherzykowego w zróżnicowanych komórkach HepaRG

DOI:

10.3791/59843

⸱

18 lipca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine, Sapienza University, 2Department of Internal Medicine - DMISM, Sapienza University, 3Center for Life Nano Science@Sapienza, Istituto Italiano di Tecnologia, 4Pasteur Institute Italy-Fondazione Cenci Bolognetti, 5INSERM U1052-Cancer Research Center of Lyon, 6Department of Hepatology, Croix Rousse Hospital, Hospices Civils de Lyon

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu opisujemy szczegółowy protokół indukowania stłuszczenia pęcherzyków wątroby w zróżnicowanych komórkach HepaRG za pomocą soli kwasu tłuszczowego oleinianu sodu i stosujemy metody wykrywania i kwantyfikacji akumulacji lipidów, w tym koherentną mikroskopię rozpraszania Ramanowskiego (CARS), analizę cytofluorymetryczną, barwienie czerwienią olejową O i qPCR.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stłuszczenie wątroby reprezentuje dysfunkcję metaboliczną, która wynika z nagromadzenia kropelek lipidów zawierających trójglicerydy w hepatocytach. Nadmierne nagromadzenie tłuszczu prowadzi do niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (NAFLD), która jest potencjalnie odwracalna i może przekształcić się w niealkoholowe stłuszczeniowe zapalenie wątroby (NASH), a ostatecznie marskość wątroby i raka wątrobowokomórkowego (HCC). Mechanizmy molekularne łączące akumulację lipidów w hepatocytach z progresją do NASH, nieodwracalnym uszkodzeniem wątroby, zwłóknieniem, marskością wątroby, a nawet HCC nadal pozostają niejasne. W tym celu opracowano kilka modeli in vitro i in vivo, aby wyjaśnić patologiczne procesy powodujące NAFLD. W niniejszym badaniu opisujemy model komórkowy do indukcji pęcherzykowego stłuszczenia wątroby, który składa się ze zróżnicowanych DMSO ludzkich komórek wątroby HepaRG traktowanych solą sodu oleinianu kwasów tłuszczowych. Rzeczywiście, komórki HepaRG traktowane oleinianem sodu gromadzą kropelki lipidów w cytoplazmie i wykazują typowe cechy stłuszczenia. Ten ludzki model in vitro stanowi cenną alternatywę dla modeli in vivo na myszach, a także dla pierwotnych ludzkich hepatocytów. Przedstawiamy również porównanie kilku metod kwantyfikacji i oceny akumulacji tłuszczu w komórkach HepaRG, w tym barwienia czerwienią olejową O, cytofluorymetrycznego pomiaru Bodipy, metabolicznej analizy ekspresji genów metodą qPCR oraz koherentnej mikroskopii rozpraszania Ramana Stokesa (CARS). Obrazowanie CARS łączy w sobie specyfikę chemiczną spektroskopii Ramanowskiej, techniki analizy chemicznej dobrze znanej w zastosowaniach materiałoznawstwa, z korzyściami płynącymi z szybkiej nieliniowej mikroskopii optycznej o wysokiej rozdzielczości, która umożliwia precyzyjną ocenę ilościową akumulacji lipidów i dynamiki kropelek lipidów. Ustanowienie skutecznego modelu in vitro do indukcji stłuszczenia pęcherzykowego, wraz z dokładną metodą kwantyfikacji i charakterystyki akumulacji lipidów, może doprowadzić do opracowania wczesnej diagnostyki NAFLD poprzez identyfikację markerów molekularnych oraz do opracowania nowych strategii leczenia.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stłuszczenie wątroby definiuje się jako wewnątrzwątrobowe nagromadzenie tłuszczu, w kropelkach lipidów zawierających trójglicerydy, co najmniej 5% masy wątroby. Przedłużone magazynowanie lipidów w wątrobie jest procesem potencjalnie odwracalnym, jednak może prowadzić do dysfunkcji metabolicznej wątroby, stanu zapalnego i zaawansowanych postaci niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (NAFLD), głównej przyczyny przewlekłej choroby wątroby w wielu częściach świata1,2. NAFLD jest chorobą wieloczynnikową, która może ewoluować w bardziej agresywne niealkoholowe stłuszczeniowe zapalenie wątroby (NASH), które z kolei może przekształcić się w marskość wątroby, a u niewielkiego odsetka pacjentów w raka wątrobowokomórkowego (HCC)1,3. Obecnie nie jest dostępna żadna zatwierdzona terapia jako specyficzne leczenie NAFLD, a połączenie modyfikacji diety i stylu życia pozostaje filarem leczenia NAFLD i NASH4,5,6.

Mechanizmy molekularne prowadzące do rozwoju stłuszczenia wątroby w patogenezie NAFLD nadal pozostają do wyjaśnienia7. W tym kontekście opracowano modele mysie do badania progresji choroby stłuszczenia u ludzi. Istnieje niezliczona ilość różnych modeli, a każdy z nich ma swoje zalety i wady, w tym modele genetyczne, żywieniowe i chemicznie indukowane łączące różne podejścia. Genetycznie zmodyfikowane (transgeniczne lub nokautujące) myszy spontanicznie rozwijają chorobę wątroby. Należy jednak zauważyć, że mutacje te są bardzo rzadkie u ludzi, a delecja lub nadekspresja pojedynczego genu (np. myszy ob/ob) może nie naśladować etiologii wieloczynnikowej choroby człowieka na poziomie molekularnym8,9. Podobnie, choroba nabyta przez myszy po manipulacji dietetycznej lub farmakologicznej może nie naśladować skutków diety człowieka związanej z rozwojem NAFLD w man8. Modele zwierzęce ułatwiły jednak rozwój w zrozumieniu NAFLD i podejście to jest obecnie najczęściej stosowaną strategią w badaniach laboratoryjnych. Niemniej jednak replikacja wyników uzyskanych w modelach zwierzęcych u ludzi wielokrotnie kończyła się niepowodzeniem, co powodowało słabe tłumaczenie na clinic10.

Dlatego modele in vitro NAFLD mogą odgrywać fundamentalną rolę w wyjaśnianiu molekularnych mechanizmów progresji NAFLD i stanowią cenne narzędzie do badania dużej liczby związków. Pierwotne hodowle komórek, unieśmiertelnione linie komórkowe i biopsje wątroby były szeroko wykorzystywane do celów badawczych11. Pierwotne ludzkie hepatocyty bardzo przypominają ludzkie stany kliniczne, ale liczba dawców jest ograniczona, a pierwotne hodowle komórkowe wykazują słabą odtwarzalność ze względu na zmienność komórek. Obserwacje te, wraz z kwestiami etycznymi i logistycznymi, spowodowały, że użycie ludzkich pierwotnych hepatocytów jest ograniczone12. Tak więc linie komórkowe wątroby stanowią wygodną alternatywę, mającą kilka zasadniczych zalet w porównaniu z hodowlą pierwotną, ponieważ linie komórkowe wątroby rosną stabilnie, mają prawie nieograniczoną długość życia i stabilny fenotyp. Co więcej, linie komórkowe są łatwo dostępne, a warunki hodowli linii komórkowych wątroby są prostsze niż w przypadku hepatocytów pierwotnych i są standaryzowane w różnych laboratoriach.

Tutaj szczegółowo opisujemy in vitro komórkowy model pęcherzykowego stłuszczenia wątroby, reprezentowany przez zróżnicowane wątrobowo komórki HepaRG traktowane oleinianem sodu kwasu tłuszczowego. Linia komórkowa HepaRG została utworzona od pacjentki dotkniętej zakażeniem wirusowym zapaleniem wątroby typu C i dobrze zróżnicowanym guzem wątroby stopnia I Edmondsona14. Linia komórkowa HepaRG jest ludzką bipotencjalną linią komórek progenitorowych zdolną do różnicowania się po ekspozycji na 2% dimetylosulfotlenku (DMSO) w kierunku dwóch różnych fenotypów komórek: komórek żółciowych i hepatocytów. Zróżnicowane komórki HepaRG (dHepaRG) mają pewne cechy i właściwości wspólne z dorosłymi hepatocytami i mają zdolność do stabilnej ekspresji genów specyficznych dla wątroby, takich jak albumina, aldolazaB, cytochrom P450 2E1 (CYP2E1) i cytochrom P450 3A4 (CYP3A4)13 (krok 3). Traktowanie komórek dHepaRG solą sodu oleinianu (250 μM) przez 5 dni prowadzi do wytworzenia cytoplazmatycznych kropelek lipidów, naśladujących skutki stłuszczenia wątroby14,15,17,18 (krok 4). Nagromadzenie kropelek lipidów można łatwo wykryć za pomocą barwienia czerwienią olejową O (krok 5), barwnika rozpuszczalnego w tłuszczach lizochromu, który barwi neutralne trójglicerydy i lipidy na czerwono-pomarańczowo. Aby skutecznie określić ilościowo lipidy w tłuszczowym dHepaRG, tutaj ilustrujemy analizę cytofluorymetryczną po barwieniu 4,4-difluoro-1,3,5,7-tetrametylo-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen (Bodipy 505/515) (krok 6), lipofilową sondą fluorescencyjną, która lokalizuje się w wewnątrzkomórkowych ciałach lipidowych i została użyta do znakowania kropelek lipidów19. Ponadto tutaj pokazujemy, jak ocenić stłuszczenie za pomocą ilościowej deregulacji ekspresji genów w reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) (krok 7) kilku genów metabolicznych w komórkach dHepaRG. Aby dokładniej scharakteryzować i określić ilościowo akumulację kropelek lipidów po traktowaniu oleinianem sodu, przeprowadziliśmy koherentną mikroskopię rozpraszania Ramana Stokesa (CARS) (krok 8), innowacyjną technikę, która umożliwia wizualizację i kwantyfikację kropelek lipidów bez znakowania20,21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie pożywek hodowlanych i odczynników

  1. Pożywka proliferacyjna: uzupełnij pożywkę E Williama o GlutaMAX, 10% płodową surowicę bydlęcą (FBS), 1% penicylinę/streptomycynę, 5 μg/ml insuliny i 0,5 μM hemibursztynian hydrokortyzonu.
  2. Pożywka różnicująca: uzupełnij pożywkę E Williama o GlutaMAX, 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny, 5 μg/ml insuliny, 50 μM hemibursztynianu hydrokortyzonu i 2% DMSO.
  3. Pożywka zamrażająca: pożywka proliferacyjna suplementu zawierająca 10% DMSO.
  4. Oleinian sodu: rozpuścić w 99% metanolu o stężeniu 100 mM, wymieszać O/N i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  5. Olej czerwony O: przygotuj roztwór podstawowy. Odważyć 0,35 g czerwonego oleju O i rozpuścić w 100 ml izopropanolu. Wymieszać O/N, przefiltrować (0,2 μm) i przechowywać w temperaturze pokojowej. Przygotować roztwór roboczy: zmieszać 6 ml roztworu podstawowego Oil Red O z 4 ml ddH2O. Pozostaw w temperaturze pokojowej (RT) na 20 minut, a następnie przefiltruj filtrem 0,2 μm. Właściwa filtracja jest wysoce zalecana w celu udanego barwienia, aby uniknąć tła.
  6. Bodipy (505/515): rozpuścić barwnik Bodipy (505/515) w DMSO przy stężeniu podstawowym 100 μM, przechowywać w temperaturze -20 °C w ciemności i stosować w końcowym stężeniu 100 nM.
  7. Zdobądź przezroczyste naczynia ze szklanym dnem do eksperymentów CARS.

2. Rozmrażanie, amplifikacja i kriokonserwacja komórek HepaRG

  1. Rozmrażanie komórek HepaRG w kriokonserwacji azotu poprzez zanurzenie partii w kąpieli o temperaturze 37 °C do momentu rozmrożenia. Wybierz partię o niskim przelocie (<20). Komórki HepaRG są dostępne na rynku.
  2. Szybko przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml pożywki proliferującej i wirować przez 5 minut (200 x g, 4 °C).
  3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki 5 ml pożywki proliferującej.
  4. Policz komórki i rozcieńcz, aby uzyskać płytki 2,5 x 104 komórki/cm2.
  5. Odnawiaj podłoże co 2 lub 3 dni. Komórki namnażają się z czasem podwojenia wynoszącym około 24 godzin.
  6. Odłącz komórki HepaRG przy 80% zbiegu przez 3-5 minut inkubacji z roztworem trypsyny 0,05%. Zebrać komórki w pożywce do proliferacji i wirować przez 5 minut (200 x g, 4 °C).
  7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki 5 ml pożywki proliferującej.
  8. Policz komórki i rozcieńcz, aby uzyskać płytki 2,5 x 104 komórki/cm2.
  9. Na tym etapie należy amplifikować komórki, powtarzając kroki 2.5-2.8, aby osiągnąć odpowiednią liczbę komórek do rozpoczęcia eksperymentów lub kriokonserwacji, jak w kroku 2.10.
  10. Aby kriokonserwować komórki HepaRG, odłącz komórki 24 godziny po posianiu przez 3-5 minut inkubacji z roztworem trypsyny 0,05%. Zebrać komórki w pożywce do proliferacji i wirować przez 5 minut (200 x g, 4 °C). Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w 1 ml / partię pożywki do zamrażania, 1,5 x 106 komórek / partię i kriokonserwować partie w ciekłym azocie.

3. Różnicowanie komórek HepaRG (Dzień 0-21) (Rysunek 1A)

  1. Dzień 0. Umieść komórki HepaRG o niskiej gęstości (2,5 x 104 komórki/cm2) do szalek poddanych działaniu kultury z odpowiednią objętością pożywki proliferacyjnej (Rysunek 1B). Do każdego testu należy posiać dwie szalki (barwienie czerwienią olejową O, analiza FACS, qPCR): jedną dla komórek kontrolnych i jedną dla komórek poddanych działaniu oleinianu. Jeśli wykonujesz pomiary CARS (krok 8), umieść komórki równolegle w przezroczystych naczyniach ze szklanym dnem. Jako kontrolę, należy zebrać jedno nieleczone naczynie (komórki proliferujące Dzień 0) w celu przeprowadzenia analizy ekspresji genów markerów różnicowania (patrz krok 3.6).
  2. Dzień 2 i Dzień 4. Zmień pożywkę na odpowiednią objętość pożywki proliferacyjnej i pozwól komórkom rosnąć aż do zbiegu.
  3. Dzień 7. Komórki muszą być w 100% zlewające się ( Rysunek 1C). Umyj komórki raz 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Usunąć 1x PBS i dodać odpowiednią objętość podłoża różnicującego.
  4. Dzień 8, 9, 12, 15, 18. Umyj komórki raz 1x PBS. Usunąć 1x PBS i dodać odpowiednią objętość podłoża różnicującego.
  5. Dzień 21. Obserwuj komórki HepaRG pod mikroskopem i upewnij się, że komórki są zlewającymi się kulturami zróżnicowanymi (Rysunek 1D).
  6. Jako kontrolę, zbierz jedno naczynie kontrolne (zróżnicowane komórki Dzień 21), aby przeprowadzić analizę ekspresji genów (krok 7) genów markera różnicowania (Rysunek 1E).
  7. W dniu 21 zróżnicowane komórki HepaRG można kriokonserwować w ciekłym azocie.

4. Indukcja stłuszczenia pęcherzykowego (Dzień 21–26)

  1. Dzień 21. Rozcieńczyć oleinian sodu (100 mM) odpowiednią objętością pożywki do całkowitego różnicowania do końcowego stężenia 250 μM (1:400). Dodać 99% metanolu w stosunku 1:400 (taką samą objętość jak oleinian sodu) do innej podwielokrotności pożywki różnicującej, aby przeprowadzić obróbkę kontrolną nośnika. (Na przykład: dodać 25 μl oleinianu sodu do 10 ml pożywki i równolegle dodać 25 μl 99% metanolu do 10 ml pożywki). Umyj komórki raz 1x PBS i dodaj nośnik lub pożywkę z olejinianem sodu.
  2. Dzień 23 i Dzień 25. Zmień pożywkę na odpowiednią objętość świeżo przygotowanego podłoża, jak w kroku 4.1.
  3. Dzień 26. Obserwuj pod mikroskopem optycznym, że kropelki lipidów gromadzą się w komórkach traktowanych oleinianem sodu i są łatwo widoczne jako półprzezroczyste kropelki w cytoplazmie, jak w Rysunek 2A.

5. Ocena przeciążenia lipidami i indukcji stłuszczenia: barwienie czerwienią olejową O

  1. Umyj komórki raz za pomocą 1x PBS i całkowicie usuń 1x PBS.
  2. Dodać 4% paraformaldehydu (rozcieńczonego w 1x PBS) i inkubować przez 15 minut w temperaturze RT.
    ostrożność: Paraformaldehyd jest toksyczny, więc ten krok należy wykonać w dygestorium, przy użyciu sprzętu ochronnego, w tym rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i maski.
  3. Usuń paraformaldehyd i umyj komórki dwukrotnie 1x PBS. Komórki można przechowywać w 1x PBS w temperaturze 4 °C przez kilka dni przed barwieniem. Owiń parafilmem i przykryj folią aluminiową, aby zapobiec wysychaniu komórek.
  4. Usuń 1x PBS. Inkubować komórki z 60% izopropanolem przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Usuń izopropanol i pozwól komórkom całkowicie wyschnąć w temperaturze pokojowej.
  6. Dodać roztwór roboczy Oil Red O i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Objętość roztworu roboczego wymagana dla każdej próbki odpowiada objętości pożywki użytej do hodowli komórek.
  7. Usuń roztwór czerwonej czerwieni olejowej O i natychmiast dodaj ddH2O. Umyj komórki 4 razy za pomocą ddH2O.
  8. Pozyskaj obrazy pod mikroskopem do analizy (Rysunek 2B).
  9. Aby usunąć barwnik Oil Red O: usuń całą wodę i pozostaw do wyschnięcia; dodaj 1 ml 100% izopropanolu i inkubuj przez 10 minut, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
  10. Kilkakrotnie pipetować izopropanol z wymytym barwnikiem Oil Red O w górę iw dół, upewniając się, że cała czerwień olejowa O znajduje się w roztworze. Przenieś roztwór do kuwety. Zmierz OD500 nm za pomocą spektrofotometrii i użyj 100% izopropanolu jako ślepej próby (Rysunek 2C).

6. Ocena przeciążenia lipidami i indukcji stłuszczenia: barwienie bodipy i analiza cytofluorymetryczna

  1. Umyj komórki raz za pomocą 1x PBS. Inkubować z 100 nM Bodipy rozcieńczonym w 1x PBS w ciemności przez 40 minut w temperaturze 37 °C. Do pomiarów cytometrii przepływowej należy włączyć niebarwioną kontrolę. Od tego momentu należy w miarę możliwości chronić próbki przed światłem.
    nuta: Objętość roztworu barwiącego wymagana dla każdej próbki odpowiada objętości pożywki użytej do hodowli komórek.
  2. Usuń roztwór barwiący i umyj komórki raz 1x PBS. Przejdź do kroków 6.3-6.6. do analizy FACS (sortowanie komórek aktywowane fluorescencją) lub do kroku 6.7 dla obrazowania mikroskopowego.
  3. Delikatnie zeskrob komórki za pomocą 1x PBS i przenieś go do probówki o pojemności 15 ml. Wirować przez 10 minut (200 x g, 4 °C).
  4. Delikatnie usunąć supernatanty, nie naruszając granulek i przemyć 3 ml 1x PBS. Wirować przez 5 minut (200 x g, 4 °C).
  5. Usunąć supernatanty i ponownie zawiesić w 300 μl 1x PBS, a następnie przenieść do probówki FACS.
  6. Natychmiast zmierz intensywność fluorescencji Bodipy'ego za pomocą analizy cytofluorymetrycznej z długościami fal wzbudzenia/emisji 505/515 nm (Rysunek 3A, B).
  7. Umyj komórki raz za pomocą 1x PBS i całkowicie usuń PBS.
  8. Dodać 4% paraformaldehydu (rozcieńczonego w 1x PBS) i inkubować przez 15 minut w temperaturze RT.
    ostrożność: Paraformaldehyd jest toksyczny, więc ten krok należy wykonać w dygestorium, przy użyciu sprzętu ochronnego, w tym rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i maski.
  9. Usunąć paraformaldehyd i umyć próbki 3x przez 5 minut w PBS. Komórki mogą być przechowywane w 1x PBS w temperaturze 4 °C lub natychmiast zobrazowane ( Rysunek 3C). Do przechowywania owiń parafolią i przykryj folią aluminiową, aby zapobiec wyschnięciu komórek.

7. Ocena przeciążenia lipidami i indukcji stłuszczenia: qPCR

  1. Umyj komórki raz za pomocą 1x PBS. Zeskrobać komórki za pomocą 1x PBS, odwirować przy 200 x g i wyrzucić supernatant. Na tym etapie komórki mogą być pobierane w temperaturze -80 °C lub przetwarzane zgodnie z etapem 7.2.
  2. Przeprowadzić całkowitą izolację RNA standardowymi metodami przy użyciu dostępnych w handlu odczynników zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Ocenić stężenie RNA za pomocą pomiaru spektrofotometrycznego UV, upewniając się, że czystość RNA jest wysoka (bliska 2,0) w oparciu o odczyt A260/A280.
  4. Zsyntetyzuj cDNA z 1 μg całkowitego RNA za pomocą standardowego zestawu do syntezy cDNA.
  5. Rozcieńczyć cDNA do końcowej objętości 50 μl za pomocąH2O.
  6. Przeanalizować każdą próbkę cDNA w trzech egzemplarzach metodą qPCR: przygotować jedną główną mieszankę qPCR (Tabela 1), która jest wystarczająca do przeprowadzenia wymaganych reakcji dla każdego startera, w tym starterów specyficznych dla trzech genów porządkowych jako kontroli: gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH), aktyny B i rybosomalnych 18S (patrz Tabela materiałów dla sekwencji starterów):
  7. Dozować 18 μl mieszanki wzorcowej na dołek na płytkę wielościenną do PCR.
  8. Dodać 2 μl próbki cDNA do każdego dołka. Uszczelnij płytę.
  9. Uruchom próbki zgodnie z instrukcją Thermal Cycler.

8. Ocena przeciążenia lipidami i indukcji stłuszczenia: CARS

  1. Utrwal wcześniej przygotowane komórki na naczyniach ze szklanym dnem, jak opisano w krokach 5.1-5.3.
  2. Włącz komercyjny przestrajalny pikosekundowy impulsowy system laserowy, dostrajając go tak, aby uzyskać dwa wyjścia o różnych długościach fal. Różnica częstotliwości między wyjściami musi wynosić 2,840 cm-1, aby wytworzyć intensywny sygnał świetlny CARS odpowiadający symetrycznemu rozciąganiu metylenu; dla wyjścia o stałej długości fali przy 1,064 nm (światło "Stokesa"), druga długość fali powinna być dostrojona do 817 nm (światło "pompy").
  3. Upewnij się, że wyjście 817 nm przestrzennie i czasowo pokrywa się z wyjściem 1,064 nm: użyj odpowiedniego lustra dichroicznego (tj. z cięciem między 817 a 1,064 nm), aby przestrzennie połączyć wiązki i użyj optycznej linii opóźniającej, aby uzyskać czasowe nakładanie się impulsów laserowych.
  4. Upewnij się, że obie współrozchodzące się wiązki są skolimowane i że ich średnice mają podobne wartości, które są odpowiednie dla układu optycznego w mikroskopie, który skupi je na próbce; jeśli to konieczne, oddzielnie skolimuj wiązki przed zwierciadłem dichroicznym, które je łączy.
  5. Włącz komercyjny system odwróconego mikroskopu, który powinien zawierać jednostkę skanującą laserową na podczerwień i dwukanałową czerwono-zieloną jednostkę detekcyjną epi, a następnie ustaw współpropagujące wiązki laserowe w jednostce skanującej.
  6. Otwierając dwukanałową jednostkę detekcji epi, wyjmij kostkę filtra i zastąp jej czerwony filtr detekcji długości fali filtrem pasmowoprzepustowym, który może wybrać sygnał CARS 2,840 cm-1, który jest wyśrodkowany na 663 nm dla schematu wzbudzenia pompy 817/1,064 nm/Stokesa. Preferowany jest filtr o wąskim paśmie przenoszenia (20 nm), aby uniknąć gromadzenia wysokich poziomów fluorescencyjnych sygnałów tła.
  7. Umieść naczynie na stoliku odwróconego mikroskopu CARS i za pomocą 100-krotnego obiektywu zanurzonego w oleju przesuń pionową pozycję obiektywu, aby skupić się na komórkach.
  8. Skonfiguruj oprogramowanie mikroskopu, aby zbierać obrazy o wysokiej rozdzielczości (1024 x 1024 pikseli) w polu widzenia obejmującym 127 μm x 127 μm.
  9. Ustaw oprogramowanie mikroskopu tak, aby w sposób ciągły rejestrowało i wyświetlało obrazy o polu widzenia 127 μm x 127 μm i sprawdzało wyświetlane obrazy, optymalizując parametry zbierania obrazów. Upewnij się, że moce lasera są zrównoważone w celu szybkiego zbierania obrazu i zminimalizowania uszkodzeń, w razie potrzeby wstawiając odpowiednie filtry o neutralnej gęstości w ścieżkach wiązki i wybierz czas przebywania pikseli, który umożliwia zbieranie obrazów z dobrym stosunkiem sygnału do szumu w wybranych warunkach mocy lasera.
  10. Uzyskuj i zapisuj obrazy kilku różnych pól widzenia w obrębie anteny w zoptymalizowanych warunkach. Opcjonalnie wielofotonowe obrazy fluorescencyjne, generowane przez emisję na zielonej długości fali (głównie ze wzbudzenia dwufotonowego przy długości fali 817 nm), mogą być jednocześnie zbierane przez drugi detektor epi. Powtórz kroki 8.7-8.10 dla każdego dania.
  11. Na potrzeby analizy obrazu CARS należy przetwarzać obrazy przy użyciu implementacji ImageJ na FIDŻI. Użyj funkcji Despeckle (lub podobnego narzędzia do odszumiania) na każdym obrazie przed dalszą analizą, aby poprawić stosunek sygnału do szumu bez utraty szczegółów.
  12. Użyj FIJI, aby ręcznie wybrać komórki, a następnie automatycznie zlicz kropelki lipidów w podzielonych na segmenty pojedynczych komórkach, aby uzyskać statystyki dotyczące obszarów i liczb kropel lipidów dla każdej komórki oraz dla całego zestawu danych obrazu dla każdej potrawy.

9. Test żywotności komórek MTT

  1. Na płytce zróżnicowano komórki HepaRG w 96-dołkową płytkę o gęstości 1 x 105 komórek/basenik w końcowej objętości 100 μl pożywki do hodowli różnicowej.
  2. 24 godziny po wysiewie potraktować komórki 99% metanolem (nośnikiem) oraz 100 μM, 250 μM i 500 μM oleinianu sodu i palmitynianu sodu rozcieńczonymi w 100 μl pożywki/basenika różnicującego w trzech powtórzeniach.
  3. Zmienić pożywkę na 99% metanol i na 100 μM, 250 μM i 500 μM oleinian sodu i palmitynian sodu rozcieńczone w 100 μl pożywki/basenika różnicującego co 24 godziny.
  4. 96 godzin po poddaniu działaniu metanolu/oleinianu sodu/palmitynianu sodu, należy poddać komórki działaniu 2 μM doksorubicyny rozcieńczonej w 100 μl pożywki różnicowej/basenika w trzech powtórzeniach jako kontrolę.
  5. 18 godzin po poddaniu działaniu doksorubucyny należy zmienić pożywkę na 100 μl pożywki do różnicowania.
  6. Odmierzyć pipetą 20 μl odczynnika 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-5-(3-karboksymetoksyfenylo)-2-(4-sulfofenylo)-2H-tetrazolowego odczynnika MTT (tabela materiałów) do każdego dołka 96-dołkowej płytki testowej zawierającej komórki w 100 μl pożywki do hodowli różnicowania. Włączyć kontrolę tła poprzez pipetowanie 20 μl odczynnika do studzienki kontrolnej bez komórek w 100 μl pożywki do hodowli różnicowania w trzech powtórzeniach.
  7. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5%CO2
    8. .
  8. Po inkubacji przez 30, 60 i 90 minut z odczynnikiem tetrazolowym MTT, należy zapisać absorbancję przy 490 nm za pomocą 96-dołkowego czytnika płytek. Odjąć absorbancję tła studzienek kontrolnych bez komórek od wartości absorbancji dla innych próbek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje skuteczną metodę indukowania i charakteryzowania stłuszczenia pęcherzykowego w komórkach HepaRG zróżnicowanych DMSO poprzez leczenie oleinianem sodu (Rysunek 1A).

Różnicowanie komórek HepaRG.
Aby skutecznie indukować różnicowanie, proliferujące komórki muszą być wysiewane w niskiej gęstości (2,5 x 104 komórki/cm2) w pożywce proliferacyjnej. Po wysianiu w niskiej gęstości komórki aktywni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje, jak różnicować komórki HepaRG i jak indukować stłuszczenie pęcherzykowe poprzez leczenie oleinianem sodu (ryc. 1A). Rzeczywiście, w porównaniu z innymi liniami komórkowymi ludzkiego raka wątrobowokomórkowego (HCC), linia komórkowa HepaRG wykazuje cechy dorosłych ludzkich hepatocytów, stanowiąc cenną alternatywę dla hodowanych ex vivo pierwotnych ludzkich hepatocytów 13,14,15.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy prof. Christianowi Trepo (INSERM U871, Lyon, Francja), który uprzejmie dostarczył komórki HepaRG. Jesteśmy wdzięczni Ricie Appodii za pomoc administracyjną. Prace te były wspierane przez MIUR- Ministero dell'istruzione, dell'università e della ricerca (FIRB 2011–2016 RBAP10XKNC) oraz Uniwersytet Sapienza w Rzymie (prot. C26A13T8PS; Prot. C26A142MCH; Prot. C26A15LSXL).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Hyclon HyClone Klon płodu II GE HealthcareSH30066
William' s E medium z GlutaMAX Thermofisher32551087
Penicylina/streptomycyna SIGMAP4333
Insulina SIGMAI9278
Hemibursztynian hydrokortyzonuSIGMAH2270
DMSO, dimetylosulfotlenekSIGMAD2438     
Oleinian soduSIGMAO7501 
MetanolSIGMA179337
IzopropanolSIGMA278475
BODIPY 505/515ThermofisherD3921
PBSThermofisher14190-250
Roztwór formaldehyduSIGMA252549
DNAseI wolny od RNAseIPromegaM198A 
Naczynia ze szklanym dnemWillco WellsGWST-5040
Oil Red solutionSIGMAO625
CellTiter 96 AQueous One SolutionPromega G3582
q-PCR nazwa oligoSequence
ACACB DLACAAGCCGATCACCAAGAGTAAAA
ACACB REVCCCTGAGTTATCAGAGGCTGG&
BETA;-AKTYNA DLAGCACTCTTCCAGAGCCTTCCT
β-aktyna REVAGGTCTTTGCGGATGTCCAC
ALBUMINA DLAALBUMINY TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG
ALBUMINA REVAAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC
ALDOB DLAGCATCTGTCAGCAGAATGGA 
ALDOB REVTAGACAGCAGCCAGGACCTT
APOB FORCCTCCGTTTTGGTGGTAGAG
APOB REV  CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA
APOC3 DLACTCAGCTTCATGCAGGGTTA
APOC3 REVGGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG
CPT1A DLATCATCAAGAAATGTCGCACG
CPT1A REVGCCTCGTATGTGAGGCAAAA
CYP2E1 DLATTGAAGCCTCTCGTTGACCC
CYP2E1 REVCGTGGTGGGATACAGCCAA
CYP3A4 DLACTTCATCCAATGGACTGCATAAAT
CYP3A4 REVTCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA
GAPDH FORTGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG
GAPDH REVAGGGATGATGTTGGAGAGCC
GPAM FORTCTTTGGGTGTGGGGGHATGTT
GPAM REVATGCACATCTCGCTCTTGAATAA
IL6 DLACCTGAACCTTCCAAAGATGGC
IL6 REVACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG
PDK4 DLAACAGACAGGAAACCCAAGCCAC
PDK4 REVTGGAGGTGAGAAGGAACATACACG
PLIN2 DLATTGCAGTTGCCAATACCTATGC
PLIN2 REVCCAGTCACAGTAGTCGTCACA
PLIN4 DLAAATGAGTTGGAGGGGGGGGGGGGGGGACATC
PLIN4 REVGGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC
SCD DLATCTAGCTCCTATACCACCACCACCA
SCD REVTCGTCTCCAACTTATCTCCTCC
SLC2A1 DLATGCTCATCAACCGCAACGAG
SLC2A1 REVCCGACTCTCTCCTTCCTTCATCTCCTG
18S DLACGCCGCTAGAGGTGAAATTC
18S REVTTGGCAAATGCTTTCGCTC

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Starley, B. Q., Calcagno, C. J., Harrison, S. A. Nonalcoholic fatty liver disease and hepatocellular carcinoma: a weighty connection. Hepatology. 51 (5), 1820-1832 (2010).
  2. Byrne, C. D., Targher, G. NAFLD: a multisystem disease. Journal of Hepatology. 62 (1), Suppl 47-64 (2015).
  3. Marra, F., Gastaldelli, A., Svegliati Baroni, G., Tell, G., Tiribelli, C. Molecular basis and mechanisms of progression of non- alcoholic steatohepatitis. Trends in Molecular Medicine. 14, 72-81 (2008).
  4. Chalasani, N., et al. The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American Association for the Study of Liver Diseases. Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).
  5. Banini, B. A., Sanyal, A. J. Current and future pharmacologic treatment of nonalcoholic steatohepatitis. Current Opinion in Gastroenterology. 33 (3), 134-141 (2017).
  6. Takahashi, Y., Sugimoto, K., Inui, H., Fukusato, T. Current pharmacological therapies for nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis. World Journal of Gastroenterology. 21 (13), 3777-3785 (2015).
  7. Younossi, Z., et al. Global burden of NAFLD and NASH: trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (1), 11-20 (2018).
  8. Santhekadur, P. K., Kumar, D. P., Sanyal, A. J. Preclinical models of non-alcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 68 (2), 230-237 (2018).
  9. Nagarajan, P., Mahesh Kumar, M. J., Venkatesan, R., Majundar, S. S., Juyal, R. C. Genetically modified mouse models for the study of nonalcoholic fatty liver disease. World Journal of. Gastroenterology. 18 (11), 1141-1153 (2012).
  10. Oseini, A. M., Cole, B. K., Issa, D., Feaver, R. E., Sanyal, A. J. Translating scientific discovery: the need for preclinical models of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology International. 12 (1), 6-16 (2018).
  11. Ramboer, E., Vanhaecke, T., Rogiers, V., Vinken, M. Immortalized human hepatic cell lines for in vitro testing and research purposes. Methods in Molecular Biology. 1250, 53-76 (2015).
  12. Gómez-Lechón, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. Human hepatocytes in primary culture: the choice to investigate drug metabolism in man. Current Drug Metabolism. 5 (5), 443-462 (2004).
  13. Marion, M. J., Hantz, O., Durantel, D. The HepaRG cell line: biological properties and relevance as a tool for cell biology, drug metabolism, and virology studies. Methods in Molecular Biology. 640, 261-272 (2010).
  14. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  15. Anthérieu, S., Rogue, A., Fromenty, B., Guillouzo, A., Robin, M. A. Induction of vesicular steatosis by amiodarone and tetracycline is associated with up-regulation of lipogenic genes in HepaRG cells. Hepatology. 53 (6), 1895-1905 (2011).
  16. Rouge, A., et al. PPAR agonists reduce steatosis in oleic acid-overloaded HepaRG cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 276 (1), 73-81 (2014).
  17. Belloni, L., et al. Targeting a phospho-STAT3-miRNAs pathway improves vesicular hepatic steatosis in an in vitro and in vivo model. Scientific Reports. 8, 13638(2018).
  18. Nunn, A. D. G., et al. The histone deacetylase inhibiting drug Entinostat induces lipid accumulation in differentiated HepaRG cells. Scientific Reports. 6, 28025(2016).
  19. Donato, M. T., et al. Cytometric analysis for drug-induced steatosis in HepG2 cells. Chemico-Biological Interactions. 181 (3), 417-423 (2009).
  20. Hellerer, T., Axäng, C., Brackmann, C., Hillertz, P., Pilon, M., Enejder, A. Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (37), 14658-14663 (2007).
  21. Le, T. T., Ziemba, A., Urasaki, Y., Brotman, S., Pizzorno, G. Label-free evaluation of hepatic microvesicular steatosis with multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. PLoS One. 7 (11), 51092(2012).
  22. Guillouzo, A., Corlu, A., Aninat, C., Glaise, D., Morel, F., Guguen-Guillouzo, C. The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
  23. Nelson, L. J., et al. Human hepatic HepaRG cells maintain an organotypic phenotype with high intrinsic CYP450 Activity/metabolism and significantly outperform standard HepG2/C3A cells for pharmaceutical and therapeutic applications. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 120 (1), 30-37 (2017).
  24. Gerets, H. H. J., Tilmant, K., Gerin, B., Chanteux, H., Depelchin, B. O., Dhalluin, S., Atienzar, F. A. Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins. Cell Biology and Toxicology. 28 (2), 69-87 (2012).
  25. Pusl, T., et al. Free fatty acids sensitize hepatocytes to bile acid-induced apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (3), 441-445 (2008).
  26. Gentile, C. L., Pagliassotti, M. J. The role of fatty acids in the development and progression of nonalcoholic fatty liver disease. The Journal of Nutritional Biochemistry. 19 (9), 567-576 (2008).
  27. Mei, S., et al. Differential roles of unsaturated and saturated fatty acids on autophagy and apoptosis in hepatocytes. Journal of Pharmacological Experimental Therapy. 339, 487-498 (2011).
  28. Malhi, H., Bronk, S. F., Werneburg, N. W., Gores, G. J. Free fatty acids induce JNK-dependent hepatocyte lipoapoptosis. Journal of Biological Chemistry. 281, 12093-12101 (2006).
  29. Moravcová, A., Červinková, Z., Kučera, O., Mezera, V., Rychtrmoc, D., Lotková, H. The effect of oleic and palmitic acid on induction of steatosis and cytotoxicity on rat hepatocytes in primary culture. Physiological Research. 64, Suppl 5 627-636 (2015).
  30. Ohsaki, Y., Shinohara, Y., Suzuki, M., Fujimoto, T. A pitfall in using BODIPY dyes to label lipid droplets for fluorescence microscopy. Histochemistry and Cell Biology. 133 (4), 477-480 (2010).
  31. Rinia, H. A., Burger, K. N., Bonn, M., Müller, M. Quantitative label-free imaging of lipid composition and packing of individual cellular lipid droplets using multiplex CARS microscopy. Biophysical Journal. 95 (10), 4908-4914 (2008).
  32. Waschatko, G., Billecke, N., Schwendy, S., Jaurich, H., Bonn, M., Vilgis, T. A., Parekh, S. H. Label-free in situ imaging of oil body dynamics and chemistry in germination. Journal of The Royal Society Interface. 13 (123), (2016).
  33. Jüngst, C., Winterhalder, M. J., Zumbusch, A. Fast and long term lipid droplet tracking with CARS microscopy. Journal of Biophotonics. 4 (6), 435-441 (2011).
  34. Welte, M. A., Gould, A. P. Lipid droplet functions beyond energy storage. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), Pt B 1260-1272 (2017).
  35. Cohen, S. Lipid droplets as organelles. International Review of Cell and Molecular Biology. 337, 83-110 (2018).
  36. Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets finally get a little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obr bka oleinianem sodubarwienie Oil Red Opomiar Bodipymikroskopia CARSakumulacja kropel lipidowychmodel st uszczenia w trobyzr nicowane hepatocytyNAFLD in vitro

Powiązane artykuły