Celem tej metody jest wygenerowanie in vivo modelu angiogenezy guza poprzez ksenografowanie komórek nowotworowych ssaków do zarodka danio pręgowanego, który ma fluorescencyjnie znakowane naczynia krwionośne. Obrazując ksenoprzeszczep i związane z nim naczynia, można uzyskać ilościowy pomiar odpowiedzi angiogennej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie in vivo i kwantyfikacja odpowiedzi angiogennej gospodarza w ksenoprzeszczepach guza danio pręgowanego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Angiogeneza nowotworów jest kluczowym celem terapii przeciwnowotworowej, a ta metoda została opracowana, aby dostarczyć nowy model do badania tego procesu in vivo. Ksenoprzeszczep danio pręgowanego jest tworzony przez wszczepienie komórek nowotworowych ssaków do przestrzeni okołokwiatowej zarodków danio pręgowanego dwa dni po zapłodnieniu, a następnie pomiar zakresu odpowiedzi angiogennej obserwowanej w eksperymentalnym punkcie końcowym do dwóch dni po implantacji. Kluczową zaletą tej metody jest możliwość dokładnego ilościowego określenia angiogennej odpowiedzi gospodarza danio pręgowanego na przeszczep. Umożliwia to szczegółowe badanie mechanizmów molekularnych, a także udziału gospodarza i guza w odpowiedzi angiogennej. Ksenoprzeszczepione zarodki mogą być poddawane różnym zabiegom, takim jak inkubacja z potencjalnymi lekami antyangiogenezą, w celu zbadania strategii hamowania angiogenezy guza. Odpowiedź angiogenna może być również obrazowana na żywo w celu zbadania bardziej dynamicznych procesów komórkowych. Stosunkowo niewymagająca technika eksperymentalna, niskie koszty utrzymania danio pręgowanego i krótki czas trwania eksperymentów sprawiają, że model ten jest szczególnie przydatny do opracowywania strategii manipulowania angiogenezą guza.
Wprowadzenie
Angiogeneza jest jedną z klasycznych cech charakterystycznych raka i stanowi cel terapii przeciwnowotworowej1,2. Aby zbadać ten proces, stworzono ksenoprzeszczepowe modele raka poprzez wszczepienie komórek nowotworowych ssaków zwierzętom, takim jak myszy3. Opracowano również model ksenoprzeszczepu danio pręgowanego, który polega na wszczepieniu komórek nowotworowych do 2 dni po zapłodnieniu (dpi) danio pręgowanego, co powoduje szybki wzrost naczyń krwionośnych danio pręgowanego do ksenoprzeszczepu4.
Ten protokół opisuje model ksenoprzeszczepu zarodka danio pręgowanego in vivo, w którym odpowiedź angiogenna może być dokładnie określona ilościowo w całym ksenoprzeszczepie. Metoda ta pozwala badaczowi na zbadanie in vivo mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw odpowiedzi angiogennej guza. Podatność genetyczna danio pręgowanego pozwala na zbadanie wkładu gospodarza, podczas gdy wybór różnych linii komórek nowotworowych pozwala również na zbadanie udziału guza w angiogenezie5,6,7. Ponadto, ponieważ larwy danio pręgowanego są przepuszczalne dla małych cząsteczek, można stosować specyficzne inhibitory szlaku lub przeszukiwać biblioteki leków w celu identyfikacji nowych inhibitorów angiogenezy nowotworów8,9,10,11.
Model ksenoprzeszczepu zarodka danio pręgowanego ma unikalne zalety w porównaniu z innymi modelami ksenoprzeszczepów ssaków. Ksenoprzeszczepy danio pręgowanego są tańsze i łatwiejsze do wykonania, można badać dużą liczbę zwierząt, a obrazowanie żywych komórek pozwala na szczegółowe badanie zachowania komórek4. W przeciwieństwie do innych modeli in vivo, które wymagają do kilku tygodni, aby zaobserwować znaczny wzrost naczyń, angiogenezę w ksenoprzeszczepach danio pręgowanego można zaobserwować w ciągu 24 godzin po implantacji3,4. Jednak brak adaptacyjnego układu odpornościowego u embrionalnego danio pręgowanego, choć korzystny dla utrzymania ksenoprzeszczepu, oznacza, że nie można zbadać adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej i jej udziału w angiogenezie guza. Ponadto brak komórek zrębu guza, niemożność ortotopowego wszczepienia guza oraz różnica w temperaturze utrzymania między komórkami danio pręgowanego i ssaków są potencjalnymi słabościami tej metody. Niemniej jednak przydatność tego modelu do obrazowania na żywo i możliwość dokładnego ilościowego określenia odpowiedzi angiogennej sprawia, że jest on wyjątkowo korzystny dla badania procesów komórkowych, które regulują angiogenezę guza in vivo.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie igieł do mikroiniekcji
- Włącz ściągacz do mikropipet i ustaw następujące parametry (skalibrowane dla modelu ściągacza do mikropipet wymienionego w tabeli materiałów): Ciepło, 680; Ciągnięcie, 75; Prędkość, 40; Czas, 55; Ciśnienie: 530.
- Zamocuj kapilę ze szkła borokrzemianowego w ściągaczu do mikropipet i pociągnij kapilarę, aby wykonać dwie igły. Powtórz dla tylu igieł, ile chcesz.
2. Hodowla komórkowa do implantacji
UWAGA: Podczas korzystania z tego protokołu, każda linia komórkowa raka ssaków może być użyta do implantacji w embrionach danio pręgowanego jako ksenoprzeszczepy. Istnieje jednak duże zróżnicowanie w odpowiedzi angiogennej indukowanej między różnymi liniami komórkowymi5,11,12. Wykazano, że mysie komórki czerniaka B16-F1 indukują silną odpowiedź angiogenną u zarodków danio pręgowanego11 i dlatego są odpowiednie do stosowania w tym protokole.
- Hodować komórki B16-F1 w temperaturze 37 °C w kolbie o długości75 cm2 przy użyciu pożywki MEM-α uzupełnionej płodową surowicą bydlęcą (FBS) do końcowego stężenia 10% (v/v) i penicyliną/streptomycyną, każda w końcowym stężeniu 100 μg/ml.
- Usunąć pożywkę z 95-100% zlewającej się kolby o długości 75cm2 komórek B16-F1 i umyć komórki w 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o temperaturze pokojowej.
- Usunąć 5 ml PBS, dodać 2 ml 0,25% trypsyny/etylenodiaminotetraoctowego kwasu (EDTA) o temperaturze pokojowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 s.
- Postukać w bok kolby, aby określić, czy komórki zaczynają tracić swoje przyczepienie do dna kolby.
- Dodać 8 ml MEM-α o temperaturze pokojowej z 10% FBS do kolby, odpipetować do wnętrza kolby, aby wprowadzić do zawiesiny wszystkie komórki, które pozostały przyklejone do dna kolby, i odpipetować zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml.
- Odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 800 x g, 4-8 °C przez 5 minut, odessać pożywkę i przystąpić do znakowania komórek barwnikiem.
3. Znakowanie komórek B16-F1 barwnikiem fluorescencyjnym
UWAGA: Aby odróżnić wszczepione komórki nowotworowe od innych komórek w zarodku, komórki nowotworowe muszą być przed implantacją oznaczone odpowiednim barwnikiem fluorescencyjnym. Ten krok można pominąć, jeśli komórki już wyrażają reportery fluorescencyjne.
- Inkubować 2 ml pożywki MEM-α bez surowicy w temperaturze 37 °C.
- Przygotować roztwór podstawowy wybranego barwnika i rozcieńczyć go we wstępnie inkubowanych 2 ml pożywki MEM-α bez surowicy, aby uzyskać stężenie nadające się do użycia (przykłady barwników i stężeń odpowiednich dla komórek B16 F1 znajdują się w Tabeli Materiałów).
- Odpipetować 1 ml roztworu barwnika do osadu komórkowego (z kroku 2.6), dokładnie wymieszać pipetując, następnie dodać drugi 1 ml roztworu barwnika i wymieszać.
- Inkubować komórki i mieszaninę barwników w temperaturze 37 °C przez 40 minut, mieszając przez delikatne wstrząsanie przez 20 minut.
- Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 800 x g, 4-8 °C przez 5 min.
- Odessać supernatant i przemyć znakowane komórki przez pipetowanie z 5 ml PBS.
- Zawiesinę komórek należy ponownie odwirować w temperaturze 800 x g, w temperaturze 4-8 °C przez 5 minut, odessać supernatant i umieścić komórki na lodzie do momentu, gdy będą gotowe do implantacji.
nuta: Ostateczna osadka komórek nowotworowych powinna mieć objętość 20-40 μl.
4. Przygotowanie zarodków do implantacji
UWAGA: Wybierz transgeniczną linię danio pręgowanego, która ma fluorescencyjnie oznaczone naczynia krwionośne (np. kdrl:RFP, fli1a:EGFP, itp.)13,14.
- Dwa dni przed implantacją należy złożyć ikrę danio pręgowanego zgodnie z wcześniejszym opisem i zebrać zarodki15.
nuta: Ponieważ nie wstrzykujemy tych ryb na wczesnym etapie, nie trzeba ich zbierać w ciągu 20 minut od tarła, jak opisano przez Rosen et al.15, ale można je zebrać po kilku godzinach krycia. - Umieścić zarodki w szalkach hodowlanych o średnicy 100 mm w gęstości około 100 zarodków na szalkę.
- Dodać 50 ml E316 (uzupełnione 5 μl 1% wodnego roztworu podstawowego błękitu metylenowego, aby zapobiec zanieczyszczeniu) do każdej szalki, usunąć wszelkie martwe zarodki lub zanieczyszczenia i przechowywać naczynie w ciemnym inkubatorze w temperaturze 28 °C do momentu przygotowania do wstrzyknięcia.
- W 1 dzień po zapłodnieniu (dpf) dodaj 1-fenylo-2-tiomocznik (PTU) do każdej potrawy, aby uzyskać końcowe stężenie 30 mg/l PTU w E3. PTU zapobiega pigmentacji, która może zakłócać zdolność oglądania komórek nowotworowych i naczyń krwionośnych.
- Przy 2 dpf użyj igieł lub pęsety, aby ręcznie usunąć zarodki, które się wykluły. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wybierz tyle transgenicznych zarodków, ile potrzeba do ksenoprzeszczepu (50-200).
- Przed implantacją należy znieczulić wybrane zarodki roztworem 300 μg/ml trikainy w E3, aby zapobiec przemieszczaniu się podczas zabiegu iniekcji.
- Napełnij naczynie o średnicy 35 mm 2% metylocelulozą w roztworze E3 do jednej czwartej objętości naczynia.
- Za pomocą pipety transferowej umieścić około 50 zarodków (minimalizując objętość przenoszonego roztworu E3) na metylocelulozie.
- Użyj końcówki pipety do mikroładowarki, aby ułożyć zarodki tak, aby wszystkie były ustawione pionowo, z główkami do góry i lewą stroną skierowaną do góry.
nuta: Kroki 4.7-4.9 można również przeprowadzić, układając zarodki na bloku agarozy, jak opisano wcześniej17, ale z naszego doświadczenia wynika, że zarodki są łatwiej ułożone, gdy są ułożone w metylocelulozie.
5. Perivitelin Iniekcja komórek rakowych ssaków do 2 zarodków dpf
UWAGA: Aby zapewnić, że komórki zbijają się ze sobą jako przeszczep po wszczepieniu, komórki muszą być zmieszane razem z mieszaniną macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Opisaliśmy etapy tworzenia takiej mieszaniny ogniwo/ECM przy użyciu mieszaniny ECM, o której mowa w Tabeli materiałów. W przypadku zastosowania alternatywnej matrycy kroki należy odpowiednio dostosować.
- Podzielić zapas ECM na 100 μl porcji w probówkach o pojemności 500 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.
- Rozmrozić podwielokrotność ECM i dodać 100 μl PBS w celu rozcieńczenia mieszaniny do 50% (v/v).
nuta: Rozcieńczony 50% ECM można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca. - Dobrze wymieszać 50% ECM z osadem komórek B16-F1 (z kroku 3.7) przez pipetowanie i mieszanie, aby uzyskać mieszaninę komórek/ECM w stosunku 2:1 i przechowywać mieszaninę na lodzie.
- Za pomocą pipety mikrokapilarnej pobrać 3-10 μl komórek.
- Ostrożnie włożyć końcówkę pipety do igły i wysunąć mieszaninę B16-F1/matryca do końca igły.
- Włóż igłę do uchwytu igły i przechyl pod kątem 45° do naczynia.
- Złamać końcówkę igły za pomocą pęsety, aby zrobić otwór wystarczająco duży, aby komórki mogły zostać wyrzucone z igły bez ściskania komórek.
- Włączyć butlę z powietrzem pod ciśnieniem dołączoną do aparatu iniekcyjnego i na chwilę włączyć wtryskiwacz w tryb "ciągły", aby wepchnąć komórki do końcówki igły.
- Wyjmij igłę z naczynia i zastąp naczynie hemocytometrem.
- Umieść kroplę oleju na hemocytometrze i wstrzyknij igłę raz w tę kroplę.
- Policz liczbę komórek wyrzuconych jednym impulsem za pomocą hemocytometru i skalibruj igłę, aby wyrzucić około 150 komórek na impuls, dostosowując czas trwania impulsu.
nuta: Wyrzucenie takiej ilości komórek na impuls będzie wymagało kilku impulsów, aby wszczepić udany ksenoprzeszczep. Da to badaczowi większą kontrolę nad ostatecznym rozmiarem ksenoprzeszczepu guza, umożliwiając mu umiarkowane dostosowanie liczby/lokalizacji impulsów, aby każdy ksenoprzeszczep był większy lub mniejszy, zgodnie z tym, co uznają za stosowne. - Skieruj igłę w stronę woreczka żółtkowego zarodka i przepchnij ją przez woreczek żółtkowy w kierunku brzusznym, aż końcówka igły wyłoni się z woreczka żółtkowego i będzie wypychać naskórek zarodka po brzusznej stronie zarodka tuż za sercem.
nuta: Ustawić igłę tak, aby weszła do embrionalnego woreczka żółtkowego przed ostatecznym miejscem, w którym komórki zostaną wyrzucone. Zapewni to, że komórki zostaną wyrzucone w kierunku przeciwnym od serca, zmniejszając prawdopodobieństwo wstrzyknięcia komórek do wspólnej żyły kardynalnej. - Ostrożnie popchnij końcówkę igły nieco do przodu, aż utworzy przestrzeń (przestrzeń okołożółtkową) między naskórkiem a błoną woreczka żółtkowego, a następnie impulsuj wstrzykiwacz, aby wyrzucił część mieszaniny komórek do przestrzeni okołożółtkowej.
- Powtarzaj impulsy, aż 500-800 komórek zostanie wstrzykniętych do przestrzeni okołożółtkowej, tworząc widoczne wybrzuszenie, które rozciąga się co najmniej w połowie wzdłuż dna woreczka żółtkowego, a następnie wyjmij igłę z zarodka.
nuta: Jeśli komórki zablokują igłę lub zostaną uszkodzone podczas wstrzyknięcia, należy przepłukać igłę, przełączając się na chwilę w tryb "ciągły", a następnie z powrotem w tryb "pulsacyjny". Powinno to odblokować igłę i umożliwić swobodne i nieuszkodzone wyrzucanie komórek. - Kontynuuj robienie tego samego dla wszystkich zarodków w naczyniu, ładując nową igłę komórkami nowotworowymi w razie potrzeby.
- Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków należy wyjąć igłę i ścisnąć wszystkie zarodki razem za pomocą końcówki pipety mikrokapilarnej, tak aby można było je odpipetować z jak najmniejszą ilością metylocelulozy.
- Przenieść zarodki do naczynia regeneracyjnego zawierającego E3 (z PTU i błękitem metylenowym) i umyć je, delikatnie pipetując E3 wokół zarodków.
nuta: W tym momencie ksenoprzeszczepione zarodki można leczyć lekami, rozdzielając je na różne szalki i dodając roztwór leku do jednej szalki i roztwór kontrolny (taki jak nośnik leku) do drugiej szalki. - Inkubować zarodki w temperaturze 34 °C i dwa razy dziennie przeprowadzać kontrole w celu usunięcia martwych lub obrzękniętych zarodków z naczynia.
UWAGA: Stwierdzono, że 34 °C jest optymalną temperaturą do unaczynienia ksenoprzeszczepu i została również wykorzystana w innych badaniach wykorzystujących model angiogenezy embrionalnego ksenoprzeszczepu danio pręgowanego18. Ksenoprzeszczepy można obrazować w dowolnym momencie do 48 hpi (godzin po implantacji).
6. Obrazowanie na żywo
- Przy 48 hpi zidentyfikuj 3-5 zdrowych zarodków bez obrzęku. Znieczulij je w 150 μg/ml trikainy i zamontuj je bocznie w 1% agarozie o niskiej temperaturze topnienia (LMP), jak opisano wcześniej19.
nuta: Gdy agaroza krzepnie, użyj końcówki pipety mikrokapilarnej, aby utrzymać zarodki w pozycji bocznej. - Włącz mikroskop konfokalny, sterownik mikroskopu, lasery i oprogramowanie komputerowe do sterowania mikroskopem.
- Umieść naczynie pod mikroskopem konfokalnym. Używając soczewki obiektywu zanurzanej w wodzie z 20-krotnym powiększeniem, umieść ksenoprzeszczep w środku pola, korzystając z obrazowania w jasnym polu.
- Wybierz lasery wzbudzające, które są odpowiednie do wykrywania barwnika używanego do znakowania komórek nowotworowych i fluoroforu używanego do znakowania naczyń krwionośnych danio pręgowanego.
- Dostosuj wzmocnienie dla każdego lasera do poziomu, który umożliwia wykrycie zarówno komórek nowotworowych, jak i naczyń krwionośnych.
nuta: Po ustaleniu ustawień konfokalnych należy upewnić się, że są one niezmienione przez cały czas trwania eksperymentu, aby można było dokonać porównań między ksenoprzeszczepami. - Używając kanału laserowego odpowiedniego dla komórek nowotworowych, określ objętość do zobrazowania, która obejmuje całą objętość ksenoprzeszczepu, pozwalając na co najmniej jeden lub dwa odcinki optyczne po obu stronach przeszczepu. Użyj odstępów między sekcjami, które są oddalone od siebie o około 5 μm, aby utworzyć stos z.
nuta: Istotne jest, aby stos z zawierał całą objętość ksenoprzeszczepu. - Korzystając z obrazowania dwukanałowego, zobrazuj zarówno ksenoprzeszczep guza, jak i naczynia krwionośne. Powtórz kroki 6.6-6.7 dla każdej larwy, która ma być zobrazowana.
7. Obrazowanie poklatkowe
UWAGA: Ten model doskonale nadaje się do obrazowania dynamicznych procesów komórkowych ze względu na swoją przezroczystość i dostępność transgeników danio pręgowanego, które fluorescencyjnie znakują różne typy komórek. To sprawia, że obrazowanie poklatkowe jest kluczowym zastosowaniem tego modelu.
- Włączyć komorę środowiskową i ustawić ją na 34 °C co najmniej 2 godziny przed obrazowaniem. Jeśli komora nie jest nawilżona, dodaj naczynia z wodą.
- Znieczulić 3-5 zarodków (używając 120 μg/ml trikainy przy 2 dpf i 100 μg/ml trikainy przy 3 dpf) i zamontować je bocznie w 0,8% agarozie LMP w celu obrazowania poklatkowego zgodnie z wcześniej opisanym protokołem19.
nuta: Gdy agaroza krzepnie, użyj końcówki pipety mikrokapilarnej, aby utrzymać zarodki w pozycji bocznej. - Ustaw sprzęt i zobrazuj ksenoprzeszczep zgodnie z opisem w krokach 6.2-6.7, uzyskując stosy Z ksenoprzeszczepu w odstępach 10-minutowych.
nuta: Zarodek musi być utrzymywany w temperaturze 34 °C podczas obrazowania, a zawartość E3 na larwach w agarze musi być od czasu do czasu sprawdzana i uzupełniana, aby upewnić się, że nie wyschnie.
8. Kwantyfikacja angiogennej odpowiedzi na ksenoprzeszczep danio pręgowanego
UWAGA: Poniższe kroki wykorzystują oprogramowanie do analizy obrazów 3D. Konkretne kroki będą się różnić w zależności od używanego oprogramowania.
- Przenieś pliki obrazów konfokalnych stosu z ksenoprzeszczepem guza do nowego folderu w oprogramowaniu do analizy obrazów 3D.
nuta: Aby określić ilościowo poziom unaczynienia guza, należy stworzyć protokoły pomiarowe z ustawieniami skalibrowanymi tak, aby można je było wykorzystać do pomiaru objętości guza lub objętości naczynia dla wszystkich ksenoprzeszczepów. - Aby utworzyć protokół "Objętość guza" do pomiaru objętości ksenoprzeszczepów guza, przejdź do zakładki "Pomiar" w górnym menu, a następnie przeciągnij protokoły o nazwie "Znajdź obiekty" z listy protokołów, która pojawia się po lewej stronie okna, do miejsca zatytułowanego "Przeciągnij zadania tutaj, aby dokonać pomiarów".
- Upewnij się, że ten protokół jest ustawiony na pomiar obiektów w kanale guza, a następnie przeciągnij protokoły o nazwach "Przytnij do ROIs" i "Make ROI from Population" z listy protokołów do przestrzeni "Przeciągnij zadania tutaj, aby dokonać pomiarów". Upewnij się, że te dwa polecenia mają zastosowanie do obiektów oznaczonych przez "Znajdź obiekty".
- Przed kalibracją ustawień tego protokołu przejdź do menu rozwijanego nad etykietą "Tryb" w lewym górnym rogu okna i wybierz widok "Rozszerzona ostrość".
- Odznacz kanały nienowotworowe w okienku po prawej stronie, klikając czarne kółko pod każdym nagłówkiem kanału, tak aby widoczny był tylko kanał nowotworowy. Użyj narzędzia "Odręczne" w górnej części okna, aby narysować "obszar zainteresowania" (ROI) wokół całej objętości guza.
nuta: Uważaj, aby upewnić się, że żaden guz nie został pominięty w ROI. Zapewni to region, w którym należy wykonać protokół podczas kalibracji ustawień. - Wybierz etykietę "Podsumowanie" w panelu pod obrazem i ustaw opcję "Wyświetlanie", aby wyświetlić "Populacja 2". Aby skalibrować, kliknij gwiazdkę w zadaniu Znajdź obiekty, co otworzy okno ustawień. Dostosuj "Próg" za pomocą "Intensywności" i określając "Dolny" próg, aż zostaną wybrane tylko komórki nowotworowe, a nie fluorescencja tła.
nuta: Jest to ważne, aby wykrywana była tylko fluorescencja komórek nowotworowych w wybranym ROI (narysowanym w 8.5) i nie mierzona była żadna fluorescencja tła. - Określ "Minimalny rozmiar obiektu" tak, aby mierzone były tylko nienaruszone komórki, a nie mniejsze kawałki szczątków komórek (np. ustawiając "Minimalny rozmiar obiektu" na 100 μm3). Zapisz ten protokół jako "Objętość guza", klikając zakładkę Pomiary w górnym menu i klikając "Zapisz protokół" i użyj tych samych ustawień do pomiaru wszystkich ksenoprzeszczepów.
- Aby zmierzyć objętość naczyń krwionośnych związanych z ksenoprzeszczepem, musisz wykonać nowy protokół. Przejdź do górnego menu, kliknij zakładkę Pomiary i kliknij "Wyczyść protokół". Przeciągnij zadania "Znajdź obiekty" i "Przytnij do ROI" do przestrzeni zatytułowanej "Przeciągnij zadania tutaj, aby dokonać pomiarów" dla tego protokołu.
- Upewnij się, że pierwsze polecenie jest ustawione na pomiar obiektów w kanale naczynia krwionośnego, a następne polecenie jest ustawione na zastosowanie do obiektów zidentyfikowanych przez pierwsze polecenie. Następnie usuń zaznaczenie kanałów niezwiązanych z naczyniami w skrajnym prawym okienku, aby widoczne były tylko naczynia krwionośne.
- Określ ustawienia dla "Objętości naczynia" w podobny sposób, jak dla protokołu "Objętość guza" i zapisz ten protokół jako "Objętość naczynia" (patrz 8.6-8.7).
- Wyczyść protokół i narysuj ROI wokół ksenoprzeszczepu, uważając, aby nie uwzględnić żadnej autofluorescencji niezwiązanej z guzem. Zmierz sumę objętości obiektów w kanale nowotworowym w tym ROI, klikając kartę Pomiary, wybierając polecenie "Przywróć protokół" i wybierając protokół "Objętość guza".
- Korzystając z nowego zwrotu z inwestycji utworzonego przez protokół "Objętość guza", użyj protokołu "Objętość naczynia", aby zmierzyć całkowitą objętość obiektów w kanale naczynia w tym ROI, klikając kartę Pomiary, wybierając polecenie "Przywróć protokół" i wybierając protokół "Objętość naczynia".
- Podziel objętość naczynia przez objętość guza i pomnóż odpowiedź przez 100, aby uzyskać procentową wartość unaczynienia przeszczepu.
- Powtórzyć kroki od 8.11 do 8.13 dla wszystkich pozostałych ksenoprzeszczepów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Poprzez obrazowanie pojedynczego ksenoprzeszczepu w 6., 24. i 48. godzinie po implantacji (hpi), odpowiedź angiogenną w różnych punktach czasowych można obliczyć zgodnie z przedstawionym na Rysunku 1A-C. Najsilniejszą odpowiedź angiogenną obserwuje się między 24. a 48. godziną po implantacji, przy czym maksymalny poziom unaczynienia przeszczepu stwierdza się około 2. dnia po implantacji (dpi) (Rysunek 1A-...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pierwszym krytycznym krokiem w protokole jest implantacja komórek nowotworowych. Istotne jest, aby komórki zostały wstrzyknięte w miejsce, które pozwoli ksenoprzeszczepowi na pomyślne zagnieżdżenie się w zarodku bez powodowania obrzęku zarodka. Wstrzyknięcie, które jest zbyt przednie, może pozwolić komórkom przesunąć się w kierunku serca, blokując krwiobieg i prowadząc do obrzęku, podczas gdy wstrzyknięcie, które jest zbyt tylne, spowoduje źle wszczepiony ksenoprzeszczep. Najlepiej unikać wstrzyknięcia przedniego, wprowa...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Panu Alhadowi Mahagaonkarowi za zarządzanie obiektem dla zebry na Uniwersytecie w Auckland oraz Jednostce Badawczej Obrazowania Biomedycznego, Szkole Nauk Medycznych, Uniwersytecie w Auckland, za pomoc w poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Prace te były wspierane przez grant projektowy Health Research Council of New Zealand (14/105), grant projektu Royal Society of New Zealand Marsden Fund (UOA1602) oraz grant projektowy Auckland Medical Research Foundation (1116012) przyznany J.W.A.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Butla powietrzna | BOC | 011G | Ksenotransplantacja |
| Komórki B16-F1 | ATCC | Hodowla komórkowa | |
| BD Matrigel LDEV-free (mieszanina macierzy zewnątrzkomórkowej) | Corning | 356235 | Ksenotransplantacja |
| Kapilary ze szkła borokrzemianowego | Warner Instruments | G100T-4 | OD = 1,00 mm, ID = 0,78 mm, Długość = 10 cm Komórka do wstrzykiwania komórek |
| naczynie hodowlane o średnicy 35 mm | Thermofisher NZ | NUN153066 | Hodowla ryb |
| Naczynie do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Hodowla ryb |
| Kolba do hodowli komórkowych 75 cm2 | In Vitro Technologie | COR430641 | Hodowla komórkowa |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Etykietowanie komórek, stężenie zapasów (10 mM w DMSO), stężenie robocze (0,2 μ M w pożywce bez surowicy) |
| Dimetylosulfotlenek | Sigma-Aldrich | D8418 | Leczenie farmakologiczne, znakowanie komórek |
| Pożywka E3 (60x w 2 l wody) 34,8 g NaCl 1,6 g KCl 5,8 g CaCl2· 2H2O 9,78 g MgCl2· 6H2O dostosuj do pH 7,2 za pomocą NaOH | W domu [1] | Hodowla ryb | |
| Metanosulfonian etylo-3-aminobenzoesanu (Trikaina) | Sigma-Aldrich | E10521 | Ksenotransplantacja, obrazowanie |
| Końcówka filtra 1,000 μ L | VWR | 732-1491 | Używany podczas wielu etapów |
| Końcówka filtra 200 μ L | VWR | 732-1489 | Używany podczas wielu etapów |
| Końcówka filtra 10 i mu; L | VWR | 732-1487 | Używany podczas wielu etapów |
| Mikroskop fluorescencyjny | Leica | MZ16FA | Przygotowanie zarodków |
| FBS (pochodzenie z Nowej Zelandii) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Rękawice do hodowli komórkowych |
| Dowolna marka | Używany podczas wielu etapów | ||
| Komora zliczania komórek hemocytometru Ulepszony Neubauer | HawksleyVet | AC1000 | Ksenotransplantacja |
| Heraeus Multifuge X3R Wirówka | Thermofisher Scientific | 75004500 | Hodowla komórkowa, Znakowanie komórek |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Etykietowanie komórek, Stężenie wyjściowe (1 mg/ml w DMSO), Stężenie robocze (6 μ g/ml w pożywkach bez surowicy) |
| Niska temperatura topnienia, UltraPure Agaroza Thermofisher | Scientific | 16520050 | Imaging |
| Metyloceluloza | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Ksenotransplantacja |
| Błękit metylenowy | sigma-Aldrich | M9140 | Mikroładowarka do hodowli ryb |
| 0,5-20 μ L końcówka do pipet do ładowania mikrokapilar | Eppendorf | 5242956003 | Mikropipety ksenotransplantacyjne |
| Dowolna marka | Używany podczas wielu etapów | ||
| Ściągacz do mikropipet P 87 | Sutter Instruments | Ksenotransplantacja | |
| Mikroskop inkubator klatkowy | Okolab | Obrazowanie poklatkowe | |
| Kuchenka mikrofalowa | Dowolna marka handlowa | Obrazowanie | |
| Olej mineralny | Sigma-Aldrich | M3516 | Ksenotransplantacja |
| Minimal Essential Media (MEM) - alpha | Thermofisher Scientfic | 12561056 | Hodowla komórkowa |
| Wtryskiwacz ciśnieniowy MPPI-2 | Stosowane oprzyrządowanie | Ksenotransplantacja | |
| Mikromanipulator Narishige | Grupa | NarishigeKsenotransplantacja | |
| Nikon D Eclipse C1 Mikroskop konfokalny | Nikon | Obrazowanie | |
| N-fenylotiomocznika (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Hodowla ryb |
| PBS | Gibco | 10010023 | Hodowla komórkowa |
| Penicylina Streptomycyna | Life Technologies | 15140122 | Napełniacz do pipet do hodowli komórkowych |
| S1 Thermoscientific | 9501 | Posiewy komórkowe | |
| Paskietka serologiczna 10 ml | Corning | 4488 | Hodowla komórkowa |
| Paskietka serologiczna 25 ml | Corning | 4489 | Hodowla komórkowa |
| Paskietka serologiczna 5 ml | Corning | 4485 | Hodowla komórkowa |
| Paskietka serologiczna 2 ml | Corning | 4486 | hodowli komórkowych |
| 22 G | Amtech | SH 182 | Hodowla ryb |
| Inkubator do hodowli tkankowych | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i Hodowla | komórkowa |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Leczenie farmakologiczne | |
| komórkowych | |||
| Fine Science Tools | 11295-10 | do hodowli ryb | |
| (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Analiza obrazu |
Bibliografia
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Huang, D., et al. Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma. Cancer Research. 70 (3), 1053-1062 (2010).
- Ribatti, D. Tumor Angiogenesis Assays. , 1st. edn, Humana Press. (2016).
- Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos. Cancer Research. 67 (7), 2927-2931 (2007).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. Journal of Pathology. 227 (4), 431-445 (2012).
- Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
- Astin, J. W., et al. Vegfd can compensate for loss of Vegfc in zebrafish facial lymphatic sprouting. Development. 141 (13), 2680-2690 (2014).
- Yang, J. H., Hu, J., Wan, L., Chen, L. J. Barbigerone inhibits tumor angiogenesis, growth and metastasis in melanoma. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (1), 167-174 (2014).
- Zhang, S., et al. SKLB1002, a novel potent inhibitor of VEGF receptor 2 signaling, inhibits angiogenesis and tumor growth in vivo. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4439-4450 (2011).
- Muthukumarasamy, K. M., et al. Identification of noreremophilane-based inhibitors of angiogenesis using zebrafish assays. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (5), 1569-1578 (2016).
- Britto, D. D., et al. Macrophages enhance Vegfa-driven angiogenesis in an embryonic zebrafish tumor xenograft model. Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nature Protocols. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- Huang, H., Zhang, B., Hartenstein, P. A., Chen, J. N., Lin, S. NXT2 is required for embryonic heart development in zebrafish. BMC Developmental Biology. 5, 7(2005).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).
- Eng, T. C. Y., Astin, J. W. Characterization of Zebrafish Facial Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 71-83 (2018).
- Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768(2011).
- Nakamura, K., et al. KRN951, a highly potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases, has antitumor activities and affects functional vascular properties. Cancer Research. 66 (18), 9134-9142 (2006).
- Okuda, K. S., et al. A zebrafish model of inflammatory lymphangiogenesis. Biology Open. 4 (10), 1270-1280 (2015).
- Steinberg, F., Konerding, M. A., Streffer, C. The vascular architecture of human xenotransplanted tumors: histological, morphometrical, and ultrastructural studies. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 116 (5), 517-524 (1990).
- Vermeulen, P. B., et al. Microvessel quantification in primary colorectal carcinoma: an immunohistochemical study. British Journal of Cancer. 71 (2), 340-343 (1995).
- Heilmann, S., et al. A Quantitative System for Studying Metastasis Using Transparent Zebrafish. Cancer Research. 75 (20), 4272-4282 (2015).
- Okuda, K. S., Lee, H. M., Velaithan, V., Ng, M. F., Patel, V. Utilizing Zebrafish to Identify Anti-(Lymph)Angiogenic Compounds for Cancer Treatment: Promise and Future Challenges. Microcirculation. 23 (6), 389-405 (2016).
- Zhao, C., et al. Endothelial Cords Promote Tumor Initial Growth prior to Vascular Function through a Paracrine Mechanism. Scientific Reports. 6, 19404(2016).
- Goel, S., Wong, A. H., Jain, R. K. Vascular normalization as a therapeutic strategy for malignant and nonmalignant disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (3), a006486(2012).
- Schmitt, C. E., Holland, M. B., Jin, S. W. Visualizing vascular networks in zebrafish: an introduction to microangiography. Methods in Molecular Biology. , 59-67 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
