Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59853

⸱

24 czerwca 2019

 , 
1Center for Immunity and Inflammation, Department of Pathology, Immunology and Laboratory Medicine, Rutgers New Jersey Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.  

Streszczenie

Limfocyty śródnabłonkowe wyrażające receptor limfocytów T γδ (γδ IEL) odgrywają kluczową rolę w immunologicznym nadzorze nabłonka jelitowego. Częściowo ze względu na brak ostatecznego liganda dla receptora limfocytów T γδ, nasza wiedza na temat regulacji aktywacji γδ IEL i ich funkcji in vivo pozostaje ograniczona. Wymaga to opracowania alternatywnych strategii badania szlaków sygnałowych zaangażowanych w regulację funkcji γδ IEL i reakcji tych komórek na lokalne mikrośrodowisko. Chociaż powszechnie wiadomo, że γδ IEL ograniczają translokację patogenów, zastosowanie obrazowania przyżyciowego miało kluczowe znaczenie dla zrozumienia czasoprzestrzennej dynamiki interakcji IEL/nabłonek w stanie ustalonym i w odpowiedzi na inwazyjne patogeny. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół wizualizacji zachowań migracyjnych IEL w błonie śluzowej jelita cienkiego myszy reporterowej z komórek T GFP γδ za pomocą konfokalnej mikroskopii laserowej z odwróconym dyskiem. Chociaż maksymalna głębokość obrazowania w tym podejściu jest ograniczona w porównaniu z zastosowaniem dwufotonowej laserowej mikroskopii skaningowej, konfokalna mikroskopia laserowa z wirującym dyskiem zapewnia przewagę w postaci szybkiej akwizycji obrazu przy zmniejszonym fotowybielaniu i fotouszkodzeniach. Korzystając z oprogramowania do analizy obrazów 4D, zachowanie nadzoru limfocytów T i ich interakcje z sąsiednimi komórkami mogą być analizowane po manipulacji eksperymentalnej, aby zapewnić dodatkowy wgląd w aktywację i funkcję IEL w błonie śluzowej jelit.

Wprowadzenie

Limfocyty śródnabłonkowe (IEL) znajdują się w nabłonku jelitowym i znajdują się zarówno wzdłuż błony podstawnej, jak i między sąsiednimi komórkami nabłonkowymi w bocznej przestrzeni międzykomórkowej1. Na każde 5-10 komórek nabłonka przypada około jeden IEL; te IEL służą jako strażnicy zapewniający nadzór immunologiczny nad dużą przestrzenią bariery nabłonkowej jelit2. IEL wyrażające receptor limfocytów T γδ (TCR) stanowią do 60% całkowitej populacji IEL w jelicie cienkim myszy. Badania na myszach z niedoborem limfocytów T γδ wykazują w dużej mierze ochronną rolę tych komórek w odpowiedzi na uszkodzenie jelit, stan zapalny i infekcję3,4,5. Pomimo wygenerowania klasy nokautu Tcrd mouse6, nasze zrozumienie biologii γδ IEL pozostaje ograniczone, częściowo ze względu na fakt, że ligandy rozpoznawane przez γδ TCR nie zostały jeszcze zidentyfikowane7. W rezultacie, brak narzędzi do badania tej populacji komórek utrudnił zbadanie roli aktywacji i funkcji γδ TCR w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Aby wypełnić tę lukę, opracowaliśmy techniki obrazowania na żywo w celu wizualizacji zachowań migracyjnych γδ IEL i interakcji z sąsiednimi enterocytami, aby zapewnić dodatkowy wgląd w funkcję γδ IEL i reakcję na bodźce zewnętrzne in vivo.

W ciągu ostatniej dekady, obrazowanie przyżyciowe znacznie poszerzyło nasze zrozumienie zdarzeń molekularnych związanych z wieloma aspektami biologii jelit, w tym z wydalaniem komórek nabłonkowych8, regulacja funkcji bariery nabłonkowej9,10, pobieranie próbek komórek szpikowych zawartości luminalnej11,12 oraz interakcje gospodarz-mikroorganizm11,13,14,15,16. W kontekście biologii IEL, zastosowanie mikroskopii przyżyciowej rzuciło światło na czasoprzestrzenną dynamikę ruchliwości IEL i czynniki pośredniczące w ich zachowaniu nadzoru13,14,15,16. Opracowanie myszy reporterowych TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP), które oznaczają γδ IELs za pomocą ekspresji jądrowej GFP17, ujawniło, że γδ IELs są wysoce ruchliwe w nabłonku i wykazują unikalne zachowanie nadzoru, które reaguje na infekcję mikrobiologiczną17,13,14. Niedawno opracowano kolejną mysz reporterową γδ z limfocytów T (Tcrd-GDL), która wyraża GFP w cytoplazmie, aby umożliwić wizualizację całej komórki18. Podobną metodologię zastosowano do zbadania wymagań specyficznych receptorów chemokin, takich jak receptor sprzężony z białkiem G (GPCR)-18 i -55, na dynamikę ruchliwości IEL19,20. W przypadku braku reportera specyficznego dla komórki, fluorescencyjne sprzężone przeciwciała przeciwko CD8α użyto do wizualizacji i śledzenia ruchliwości IEL in vivo19,20. Chociaż dwufotonowa laserowa mikroskopia skaningowa jest powszechnie stosowana do obrazowania przyżyciowego, zastosowanie konfokalnej mikroskopii laserowej z wirującym dyskiem zapewnia wyjątkowe korzyści w rejestrowaniu szybkich i wielokanałowych obrazów o wysokiej rozdzielczości przy minimalnym szumie tła. Technologia ta idealnie nadaje się do wyjaśnienia czasoprzestrzennej dynamiki interakcji immunologicznych/nabłonkowych w złożonym mikrośrodowisku błony śluzowej jelit. Ponadto, dzięki zastosowaniu różnych transgenicznych i/lub nokautujących modeli myszy, badania te mogą dostarczyć informacji na temat molekularnej regulacji funkcji jelitowych komórek immunologicznych i/lub nabłonkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie badania zostały przeprowadzone w akredytowanym przez Association of the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) obiekcie zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Rutgers New Jersey Medical School Comparative Medicine Resources.

1. Przygotowanie myszy

UWAGA: Poniższa procedura, obejmująca przygotowanie zwierzęcia i operację, zajmie 30-40 minut. Przed zabiegiem włącz mikroskop i rozgrzej dołączony inkubator na mikroskopie do 37 °C.

  1. Wykonaj eksperymenty na 8-10 tygodniowych myszach TcrdEGFP na tle C57BL / 6, które uzyskano od Bernarda Malissena (INSERM, Paryż, Francja). Zgodnie z procedurą zatwierdzoną przez IACUC, znieczulij mysz poprzez wstrzyknięcie dożylnie ketaminy (120 mg / kg) i ksylazyny (10 mg / kg) w zależności od masy ciała zwierzęcia. Oceń poziom znieczulenia na podstawie częstości oddechów (55–65 oddechów na minutę)21, szczypanie palców u nóg i odruch powiekowy.
  2. Po osiągnięciu znieczulenia w płaszczyźnie operacyjnej przymocuj tylne nogi myszy za pomocą taśmy do poduszki grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała, którą można monitorować za pomocą termometru doodbytniczego. Jeśli pojawią się oznaki, że znieczulenie słabnie (np. przyspieszone oddychanie, mruganie i/lub drganie mięśni oka w odpowiedzi na odruch powiekowy), należy ponownie podawać 50 μl ketaminy/ksylazyny na raz, aż mysz zostanie całkowicie uspokojona.
  3. Przygotować barwnik jądrowy, rozcieńczając 50 μl Hoechst 33342 (10 mg/ml) 315 μl 0,9% soli fizjologicznej; końcowe stężenie wynosi 37,5 mg/kg w przeliczeniu na masę myszy (przybliżona objętość 200 μl). Po znieczuleniu myszy powoli wstrzyknąć Hoechst za pomocą strzykawki tuberkulinowej przez zatokę żylną zadoczodołową.
    nuta: Odczekaj 1-2 minuty przed przejściem do następnego kroku, aby umożliwić myszy przyzwyczajenie się do zmiany objętości krążącej po wstrzyknięciu retroorbitalnym.
  4. Nałóż niewielką ilość lubrykantu na oczy, aby zapobiec ich wysuszeniu.

2. Chirurgia na myszach: laparotomia w celu odsłonięcia błony śluzowej jelit

  1. Wykonaj pionowe nacięcie o długości 2 cm przez skórę i otrzewną wzdłuż linii środkowej dolnej części brzucha, aby uzewnętrznić obszar jelita, który ma być zobrazowany.
  2. Za pomocą kleszczy pod kątem ostrożnie wyciągnij jelito ślepe z jamy otrzewnej i zidentyfikuj obszar jelita cienkiego, który ma zostać zobrazowany. Uważaj, aby podczas tego procesu nie rozerwać naczyń krwionośnych krezki. Aby zminimalizować potencjalne uszkodzenia lub krwawienie, unikaj chwytania lub szczypania jelita kleszczami.
  3. Zlokalizuj odpowiedni obszar jelita cienkiego (2–3 cm) do obrazowania, który zawiera minimalną zawartość kału. Ostrożnie włóż jelito ślepe i pozostałe jelito cienkie do jamy otrzewnej, pozostawiając interesujący nas segment uzewnętrzniony.
    nuta: Na tym etapie należy unikać nakłuwania jelita ślepego lub przerywania naczyń krwionośnych krezki.
  4. Umieść dwie pary kleszczyków po obu stronach leżącej poniżej krezki między naczyniami krwionośnymi i delikatnie pocieraj końcówki kleszczy o siebie, aby utworzyć otwór w błonie (Rysunek 1)22. Umożliwi to przejście igły przez krezkę podczas zamykania jamy otrzewnej pod jelitem.
  5. Zamknij nacięcie, zachowując uzewnętrznienie pętli jelita. Za pomocą kleszczy kątowych i zakrzywionej, stożkowej igły przymocowanej do 5-centymetrowego szwu wbij się z jednej strony otrzewnej, przejdź przez otwór wykonany w poprzednim kroku i w górę przez drugą stronę wyściółki otrzewnej. Umieść jeden szew u górze, a drugi w pobliżu dolnej części nacięcia.
    nuta: Na tym etapie unikaj uszkodzenia naczyń krwionośnych.
  6. Powtórz ten proces, aby zamknąć skórę pod pętlą jelitową, umieszczając jeden szew w środku nacięcia, między poprzednimi szwami w leżącej poniżej otrzewnej.
    nuta: Ważne jest, aby uzewnętrzniać tylko obszar, który ma być obrazowany; Zmniejszy to obcy ruch podczas obrazowania. Pamiętaj, aby unikać wiązania tętnic krezkowych.
  7. Użyj elektrokoagulacji, aby wykonać linię perforacji wzdłuż granicy antykrezkowej. Natychmiast po kauteryzacji nałóż kilka kropel wody na powierzchnię jelita, aby zapobiec dodatkowemu uszkodzeniu tkanek wywołanemu ciepłem. Osusz chusteczką Kimwiste, aby usunąć resztki wody.
  8. Wytnij małą poziomą szczelinę na dystalnej krawędzi kauteryzowanej tkanki za pomocą nożyczek Vannas i przystąp do cięcia wzdłuż kauteryzowanej linii w kierunku bliższego końca zewnętrzizowanego segmentu tkanki (około 1,5 cm długości), aby odsłonić powierzchnię błony śluzowej.
    nuta: W razie potrzeby użyj kleszczy, aby delikatnie usunąć nadmiar kału pozostałego na odsłoniętej powierzchni błony śluzowej.
  9. Przykryj brzuch myszy wilgotnym Kimwiste, aby zapobiec odwodnieniu tkanki. Przenieś mysz do mikroskopu w zakrytym naczyniu.

3. Akwizycja obrazu za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem

  1. Odpipetować 150 μl 1 μM AlexaFluor 633 w HBSS na szklany, nasunięty spód naczynia o średnicy 35 mm. Ustaw mysz tak, aby otwarta powierzchnia błony śluzowej bezpośrednio stykała się ze szkiełkiem nakrywkowym.
  2. Przechyl głowicę mikroskopu do tyłu i umieść mysz na nakrytej czaszy na stoliku do obrazowania we wstępnie ogrzanym inkubatorze. Alternatywnie przykryj mysz kocem grzewczym, aby utrzymać temperaturę ciała.
  3. Uruchom oprogramowanie do obrazowania. Intensywność wzbudzenia i czas naświetlania dla każdego lasera nie powinny przekraczać odpowiednio 10–15 mW lub 120–150 ms, aby uniknąć fotowybielania i zminimalizować odstęp między punktami czasowymi. Ustaw średnią klatek na "2" i włącz funkcję wzmocnienia EM, aby zredukować szumy tła. Wybierz kalibrację obiektywu 63x, aby zapewnić prawidłowy pomiar rozmiaru piksela.
    nuta: Opisane powyżej ustawienia mają na celu zapewnienie wstępnego odniesienia, ale będą się różnić w zależności od indywidualnych konfiguracji mikroskopu.
  4. Korzystając z lasera 405 nm i obiektywu pneumatycznego 20x, wizualizuj jądra, aby zlokalizować pole kosmków, które nie mają zauważalnego ruchu lub dryfują okiem. Unikaj obszarów sztucznych ruchów spowodowanych oddychaniem, perystaltyką jelit lub biciem serca.
  5. Za pomocą skanu XY zapisz współrzędną XY pola zainteresowania i przełącz się na obiektyw 63X z zanurzeniem w glicerolu.
  6. Upewnij się, że kosmki w wybranym polu są stabilne, uzyskując obraz na żywo na kanale 405 nm przez maksymalnie 1 minutę.
  7. Uzyskując obraz na żywo na kanale 405 nm, dostosuj ostrość, aby znaleźć płaszczyznę ortogonalną tuż pod końcówką kosmków. Uzyskaj stosy Z, zaczynając od nabłonka tuż pod nabłonkiem końcówki kosmka w dół kosmków, aż trudno będzie rozdzielić jądra, około 15–20 μm, stosując krok 1,5 μm.
    nuta: W przypadku obrazowania z trzema kanałami (405, 488, 640 nm) przy użyciu opisanych powyżej czasów naświetlania, możliwe jest sekwencyjne rejestrowanie wszystkich trzech kanałów w odstępach około 20 s.
  8. Otwórz oprogramowanie w trybie analizy, 3–5 minut po rozpoczęciu akwizycji, aby potwierdzić stabilność obrazu i ruchliwość γδ IEL. Kontynuuj zbieranie obrazów przez 30–60 minut dla każdego pola kosmków. Zapisz 2–3 pola dla każdej myszy. Podczas obrazowania monitoruj mysz co 5 minut.
    nuta: Jeśli znieczulenie zacznie słabnąć, użyj kleszczy, aby delikatnie podrapać szyję myszy, aby podać jednorazowo 50 μl ketaminy/ksylazyny. Kontynuuj monitorowanie poziomu znieczulenia i podawaj je ponownie w razie potrzeby.
  9. Nie zaleca się obrazowania pojedynczej myszy dłużej niż 4 godziny. Po zakończeniu akwizycji obrazu należy złożyć myszy w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy, a następnie obustronną odmę opłucnową.

4. Analiza 4D obrazów

  1. Bezpośrednie importowanie plików obrazowych do oprogramowania do renderowania 4D.
  2. Utwórz indywidualne powierzchnie dla IELs i lumenów, a następnie śledź powierzchnie w czasie, korzystając z parametrów opisanych w tabeli 1 jako początkowego odniesienia. W przypadku IELs włącz opcję Podziel dotykające się obiekty, używając wskazanej średnicy punktu początkowego.
  3. Użyj algorytmu śledzenia autoregresyjnego, aby określić ruchliwość IEL. Chociaż algorytm śledzenia jest stosunkowo dokładny, konieczne jest wizualne sprawdzenie ścieżek dla każdego indywidualnego IEL. Jeśli ścieżka jest nieprawidłowa, popraw ją za pomocą funkcji Rozłącz i Połącz na karcie Edytuj ścieżki.
  4. Aby określić odległość od każdego IEL do lumenu, wybierz powierzchnię strumienia świetlnego i wykonaj funkcję transformacji odległości w menu Narzędzie. Po wyświetleniu monitu wybierz opcję Powierzchnia zewnętrzna. Po obliczeniu transformacja odległości zostanie wyświetlona jako 4. kanał.
  5. Przefiltruj intensywność min 4. kanału, aby wybrać γδ IEL, które znajdują się w bocznej przestrzeni międzykomórkowej (LIS). Wartość ta powinna być bliska 15 μm, w oparciu o wysokość komórki nabłonka walcowatego. Odsetek całkowitych γδ IEL w tym zakresie jest podawany jako częstość γδ IELs w LIS.
  6. W celu dalszej analizy należy wyeksportować dane statystyczne, w tym: prędkość toru IEL, przemieszczenie toru, prostoliniowość toru i długość toru. Alternatywnie możesz analizować dane za pomocą modułu Vantage. W zależności od eksperymentu uzyskaj dodatkowe wskaźniki z uzyskanych danych, w tym czas przebywania w LIS lub interakcje IEL/nabłonek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykorzystując obrazowanie przyżyciowe myszy reporterowych TcrdEGFP, wykazaliśmy wcześniej, że limfocyty IEL γδ wykazują dynamiczne zachowania nadzorcze, polegające na patrolowaniu nabłonka poprzez migrację wzdłuż błony podstawnej oraz do bocznych przestrzeni międzykomórkowych (LIS) w stanie stacjonarnym (Rycina 2, Film 1).

Tę metodę można również wykorzystać do oceny, w jaki sposób hamowanie specyficznych szlaków sygnalizacyjnych komórek i/lub rec...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Rozwój technik mikroskopii przyżyciowej stworzył bezprecedensową okazję do obserwacji reorganizacji struktur subkomórkowych 8,9,22, interakcji komórka-komórka12,25 i zachowań migracyjnych komórek 13,14,15,16,26

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez NIH R21 AI143892, New Jersey Health Foundation Grant, Busch Biomedical Grant (KLE). Dziękujemy Madeleine Hu za pomoc w redagowaniu manuskryptu i udostępnieniu danych zawartych w reprezentatywnych wynikach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Talerz 35 mm, nr 1,5 szkiełko nakrywkoweMatTekP35G-1,5-14-C
Alexa Fluor 633 HydrazideInvitrogenA30634
BD PrecisionGlide Igły podskórne - 27 GThermo Fisher Scientific14-826-48
BD Sterylna strzykawka z końcówką - 1 mlThermo Fisher Scientific14-823-434
BD Strzykawka tuberkulinowaThermo Fisher Scientific14-829-9
Nożyczki preparacyjneThermo Fisher Scientific08-940
ElektrokoagulacjaThermo Fisher Scientific50822501
Zamknięta komora inkubacyjnamikroskopuOKOLAB
, rozmiar #3; 1/2 koła, punkt stożka, długość cięciwy 12 mmRobozRS-7983-3
Hank's Zrównoważony roztwór soliSigma-Aldrich55037C
Hoechst 33342InvitrogenH3570
Imaris (v. 9.2.1) z modułami Start, Track, XTOprogramowanieBitplane
Odwrócony mikroskop Leica
IQ3 (v. 3.6.3)Oprogramowanie Andor
KetaminaPutneyAnestezjo
KimwipesVWR21905-026
Nożyczki McPherson-Vannas 3" (7,5 cm) Długi 5 x 0,15 mm Prosty OstryRobozRS-5600
Niewchłanialny szew chirurgiczny, jedwabna szpula, plecionyKleszcze Fisher ScientificNC0798934
Nugent 4,25" (11 cm) Długa, kątowa, gładka końcówka 1,2 mmRobozRS-5228
Puralube Maść weterynaryjnaDechraSmarująca maść do oczu
diodowym 640 nmSystem konfokalny
AkornZnieczulenie
Igły do DMi8Wirujący dysk Yokogawa CSU-W1 z obiektywem zanurzeniowym 63x 1,3 N.A. HC PLAN APO glicerol, kamerą iXon Life 888 EMCCD, laserem diodowym 405 nm, laserem DPSS 488 nm, laserem Ksylazyna

Bibliografia

  1. Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 11 (7), 445-456 (2011).
  2. Hu, M. D., Edelblum, K. L. Sentinels at the frontline: the role of intraepithelial lymphocytes in inflammatory bowel disease. Current Pharmacology Reports. 3 (6), 321-334 (2017).
  3. Chen, Y., Chou, K., Fuchs, E., Havran, W. L., Boismenu, R. Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (22), 14338-14343 (2002).
  4. Swamy, M., et al. Intestinal intraepithelial lymphocyte activation promotes innate antiviral resistance. Nature Communications. 6, 7090(2015).
  5. Dalton, J. E., et al. Intraepithelial gammadelta+ lymphocytes maintain the integrity of intestinal epithelial tight junctions in response to infection. Gastroenterology. 131 (3), 818-829 (2006).
  6. Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75 (2), 274-282 (1993).
  7. Willcox, B. E., Willcox, C. R. gammadelta TCR ligands: the quest to solve a 500-million-year-old mystery. Nature Immunology. 20 (2), 121-128 (2019).
  8. Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), e1201-e1202 (2011).
  9. Marchiando, A. M., et al. Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is required for TNF-induced tight junction regulation in vivo. Journal of Cell Biology. 189 (1), 111-126 (2010).
  10. Yu, D., et al. MLCK-dependent exchange and actin binding region-dependent anchoring of ZO-1 regulate tight junction barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (18), 8237-8241 (2010).
  11. Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. Journal of Experimental Medicine. 203 (13), 2841-2852 (2006).
  12. McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
  13. Edelblum, K. L., et al. Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (18), 7097-7102 (2012).
  14. Edelblum, K. L., et al. gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice. Gastroenterology. 148 (7), 1417-1426 (2015).
  15. Hu, M. D., et al. Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa. Journal of Immunology. 201 (2), 747-756 (2018).
  16. Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
  17. Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nature Immunology. 7 (9), 995-1003 (2006).
  18. Sandrock, I., et al. Genetic models reveal origin, persistence and non-redundant functions of IL-17-producing gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (12), 3006-3018 (2018).
  19. Wang, X., Sumida, H., Cyster, J. G. GPR18 is required for a normal CD8alphaalpha intestinal intraepithelial lymphocyte compartment. Journal of Experimental Medicine. 211 (12), 2351-2359 (2014).
  20. Sumida, H., et al. GPR55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage. Sci Immunol. 2 (18), (2017).
  21. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), (2011).
  22. Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
  23. Lodolce, J. P., et al. IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity. 9 (5), 669-676 (1998).
  24. Ma, L. J., Acero, L. F., Zal, T., Schluns, K. S. Trans-presentation of IL-15 by intestinal epithelial cells drives development of CD8alphaalpha IELs. Journal of Immunology. 183 (2), 1044-1054 (2009).
  25. Knoop, K. A., et al. Antibiotics promote the sampling of luminal antigens and bacteria via colonic goblet cell associated antigen passages. Gut Microbes. 8 (4), 400-411 (2017).
  26. Sujino, T., et al. Tissue adaptation of regulatory and intraepithelial CD4(+) T cells controls gut inflammation. Science. 352 (6293), 1581-1586 (2016).
  27. Zhang, B., et al. Differential Requirements of TCR Signaling in Homeostatic Maintenance and Function of Dendritic Epidermal T Cells. Journal of Immunology. 195 (9), 4282-4291 (2015).
  28. Chennupati, V., et al. Intra- and intercompartmental movement of gammadelta T cells: intestinal intraepithelial and peripheral gammadelta T cells represent exclusive nonoverlapping populations with distinct migration characteristics. Journal of Immunology. 185 (9), 5160-5168 (2010).
  29. Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

IEL gamma deltakonfokalny mikroskop z dyskiem wiruj cymledzenie kom rekmikroskopia fluorescencyjnalimfocyty T gamma deltaodporno luz wkowaobrazowanie ywych kom rek
Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.