Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test bez przeciwciał do analizy aktywności metylotransferazy RNA

6.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59856

⸱

9 lipca 2019

 , 
1Department of Molecular Biosciences, University of Texas at Austin

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisany jest test in vitro bez przeciwciał do bezpośredniej analizy aktywności metylotransferazy na syntetycznym lub transkrybowanym in vitro RNA.

Streszczenie

Istnieje ponad 100 chemicznie odrębnych modyfikacji RNA, z których dwie trzecie składa się z metylacji. Zainteresowanie modyfikacjami RNA, a zwłaszcza metylacją, pojawiło się ponownie ze względu na ważną rolę, jaką odgrywają enzymy, które je zapisują i usuwają, w procesach biologicznych związanych z chorobami i rakiem. W tym miejscu zapewniony jest czuły test in vitro do dokładnej analizy aktywności składnika metylacji RNA na syntetycznych lub transkrybowanych in vitro RNA. W teście tym wykorzystuje się tritiowaną formę S-adenozylometioniny, co skutkuje bezpośrednim znakowaniem metylowanego RNA trytem. Niska energia promieniowania trytu sprawia, że metoda jest bezpieczna, a istniejące wcześniej metody wzmacniania sygnału trytu umożliwiają ilościowe określenie i wizualizację metylowanego RNA bez użycia przeciwciał, które są powszechnie podatne na artefakty. Chociaż ta metoda jest napisana dla metylacji RNA, kilka poprawek sprawia, że ma ona zastosowanie do badania innych modyfikacji RNA, które mogą być znakowane radioaktywnie, takich jak acetylacja RNA za pomocą 14C acetylokoenzymu A. Ogólnie rzecz biorąc, test ten pozwala szybko ocenić warunki metylacji RNA, hamowanie za pomocą inhibitorów drobnocząsteczkowych lub wpływ mutantów RNA lub enzymów, i zapewnia potężne narzędzie do walidacji i rozszerzania wyników uzyskanych w komórkach.

Wprowadzenie

DNA, RNA i białka podlegają modyfikacjom, które ściśle regulują ekspresję genów1. Wśród tych modyfikacji metylacje zachodzą na wszystkich trzech biopolimerach. Metylacja DNA i białek została bardzo dobrze przebadana w ciągu ostatnich trzech dekad. W przeciwieństwie do tego, zainteresowanie metylacją RNA zostało ponownie rozbudzone dopiero niedawno w świetle ważnej roli, jaką białka zapisujące, usuwające lub wiążące metylacje RNA odgrywają w rozwoju i chorobie2. Oprócz lepiej znanych funkcji w licznych rybosomalnych i transferowych RNA, szlaki metylacji RNA regulują specyficzną stabilność informacyjnego RNA3,4, splicing5 i translacja6,7, przetwarzanie miRNA8,9 oraz transkrypcja wstrzymywanie i zwalnianie10, 11.

Tutaj przedstawiono prostą i solidną metodę weryfikacji in vitro aktywności metylotransferazy RNA w warunkach laboratorium biologii molekularnej (podsumowane w Rysunek 1). W wielu badaniach oceniane jest działanie metylotransferazy RNA poprzez dot-blot z przeciwciałem przeciwko modyfikacji RNA, która jest przedmiotem zainteresowania. Jednak dot-blot nie weryfikuje integralności RNA po inkubacji z metylotransferazą RNA. Jest to ważne, ponieważ nawet niewielkie zanieczyszczenia rekombinowanych białek nukleazami mogą prowadzić do częściowej degradacji RNA i mylących wyników. Co więcej, nawet wysoce specyficzne przeciwciała modyfikujące RNA mogą rozpoznawać niezmodyfikowane RNA o określonych sekwencjach lub strukturach. Opisany tutaj test metylotransferazy RNA in vitro wykorzystuje fakt, że S-adenozylometionina może być tritiowana na donorze grupy metylowej (Rysunek 1), co pozwala na dokładne wykrycie metylowanego RNA bez użycia przeciwciał. Znajdują się w nich instrukcje dotyczące transkrypcji in vitro i oczyszczania transkryptu będącego przedmiotem zainteresowania oraz badania metylacji wspomnianego transkryptu przez enzym będący przedmiotem zainteresowania. Ta metoda jest elastyczna i solidna i można ją dostosować do potrzeb danego projektu. Na przykład można stosować RNA transkrybowane i oczyszczane in vitro, chemicznie syntetyzowane RNA, ale także komórkowe RNA. Test ten dostarcza informacji ilościowych w postaci liczby scyntylacji, a także informacji jakościowych, pokazując, gdzie dokładnie przebiega metylowany RNA na żelu. Może to zapewnić unikalny wgląd w funkcję metylotransferazy RNA, szczególnie w przypadku wykorzystania komórkowego RNA jako substratu, ponieważ zapewnia metodę bezpośredniej obserwacji wielkości RNA lub RNA, które są przeznaczone do metylacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Transkrypcja in vitro i żelowe oczyszczanie docelowego RNA

  1. Sklonuj interesującą sekwencję do plazmidów zawierających promotory T7 i/lub SP6 przy użyciu uznanych technik klonowania molekularnego12 lub zestawów.
  2. Linearyzacja matrycy DNA do transkrypcji in vitro
    1. Amplifikuj sekwencję zainteresowania plazmidu metodą PCR za pomocą starterów zaprojektowanych tak, aby obejmowały region promotora T7 przez insert, +20-30 bp przed i za nim, jak opisano wcześniej13.
    2. Alternatywnie, trawić 5 μg plazmidu za pomocą enzymu restrykcyjnego (RE) dostępnego za wkładką zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez dostawcę RE.
      UWAGA: Należy pamiętać o dwukrotnym sprawdzeniu, czy płytka nie została nacięta przez wybrany RE. Wybór RE użytego na tym etapie może znacząco wpłynąć na wydajność transkrypcji. Preferencyjnie linearyzuj z lub zwisającym 5' końcem, wytwarzając RE, aby uniknąć przełączania matrycy polimerazy RNA T7 na przeciwległą nić nici DNA14. Wypróbuj inną RE, jeśli początkowe plony są niewystarczające.
  3. Oczyść powstałe DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji i oczyszczania żelu agarozowego DNA. Odeluj DNA za pomocą 30 μl wody.
  4. Dobrze wymieszać przez wirowanie, odpipetować 1,5 μl i zmierzyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.
  5. Użyj 250 ng DNA, aby sprawdzić jakość i wielkość oczyszczonego DNA na 1% elektroforezie w żelu agarozowym w buforze 1x TBE migrowanym przez 1 godzinę przy 4 V/cm.
  6. Rozmrozić zamrożone odczynniki z zestawu do transkrypcji in vitro. Umieść mieszaninę polimerazy RNA T7 na lodzie, a pozostałe odczynniki na nutatorze w temperaturze pokojowej. Natychmiast po całkowitym rozmrożeniu szybko obracaj probówki rNTP przez 5 sekund, aby zebrać roztwór na dnie probówek i umieścić na lodzie. Utrzymuj 10x bufor reakcyjny w temperaturze pokojowej, aby uniknąć wytrącania się.
  7. Odpipetować do probówki o pojemności 1,5 ml następujące składniki 20 μl reakcji transkrypcji w temperaturze pokojowej we wskazanej kolejności: 6 μl wody, 2 μl (0,1 - 1 μg) liniowej matrycy DNA, 2 μl 75 mM roztworu ATP, 2 μl 75 mM roztworu GTP, 2 μL 75 mM roztworu CTP, 2 μL 75 mM roztworu UTP, 2 μL 10x buforu reakcyjnego i 2 μL mieszanki polimerazy RNA T7.
    UWAGA: W przypadku matrycy DNA wygenerowanej metodą PCR należy użyć 100 - 200 ng DNA; dla matrycy DNA generowanej przez trawienie enzymu restrykcyjnego plazmidu należy użyć ~1 μg. Aktywna rekombinowana polimeraza RNA T7 znakowana przez 6 może być oczyszczona w E. coli15.
  8. Dokładnie wymieszaj tubkę. Szybkie wirowanie przez 5 sekund w celu zebrania roztworu reakcyjnego na dnie probówki, następnie inkubacja w temperaturze 37 °C przez 2-4 godziny
    UWAGA: Każdy transkrypt będzie zachowywał się inaczej w zależności od matrycy DNA, jej długości, sekwencji lub struktury. Zoptymalizuj warunki transkrypcji in vitro, testując różne czasy inkubacji do 6 godzin; różne stężenia matrycy DNA, polimerazy RNA T7 lub NTP; lub dodanie uzupełniającego MgCl2 do tego, co jest obecne w mieszaninie polimeraz RNA T7.
  9. Pod koniec okresu inkubacji dodać 1 μl DNazy I na 20 μl reakcji i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 min.
    UWAGA: Reakcję transkrypcji można tymczasowo utrzymać na lodzie, dopóki żel poliakrylamidowy nie będzie gotowy.
  10. Kontynuuj oczyszczanie za pomocą żelu poliakrylamidowego.
    UWAGA: Ponieważ RNA jest wrażliwe na zanieczyszczenie pH i RNazą, należy używać dedykowanego sprzętu RNA i odczynników wolnych od RNaz.
  11. Określić procentową zawartość poliakrylamidu w żelu w zależności od wielkości interesującego nas transkryptu: 3,5% dla 100-2000 nt (XC: 460 nt ; BB: 100 nt), 5% dla 80-500 nt (XC: 260 nt ; BB: 65 nt), 8% dla 60-400 nt (XC: 160 nt ; BB: 45 nt), 12% dla 40-200 nt (XC: 70 nt ; BB: 20 nt), 15% dla 25-150 nt (XC: 60 nt ; BB: 15 nt) i 20% dla 6-100 nt (XC: 45 nt ; BB: 12 nt).
  12. Przygotować żel poliakrylamidowy denaturujący mocznik, łącząc następujące odczynniki w stożkowej probówce o pojemności 50 ml: 9,6 g mocznika o czystości cząsteczkowej, 2 ml 10x TBE, x ml 40% mieszaniny akrylamidu: bis-akryloamidu (29:1) i wody do oznaczenia 20 ml na probówce, gdzie x = 20 ml / (40% / procent żelu %).
    UWAGA: Żele poliakryloamidowe często zawierają niespolimeryzowany akrylamid, który jest materiałem toksycznym, który może stanowić zagrożenie po wprowadzeniu do środowiska. Żele poliakrylamidowe należy utylizować w ramach programu odpadów chemicznych instytucji.
  13. Kuchenka mikrofalowa przez 15 s przy 30% mocy. Umieścić na nutatorze na 10 minut w temperaturze pokojowej lub do całkowitego rozpuszczenia mocznika.
  14. Gdy mieszanina żelu się obraca, wyjmij kasetę z żelem (18-dołkową, o grubości 1 mm; 13,3 x 8,7 cm (szer. x dł.)), wyjmij grzebień i ustaw kasetę do odlewania żelu.
  15. Szybko obracaj probówkę o pojemności 50 ml przez 5 sekund, aby zebrać roztwór żelu na dnie probówki. Dodać 125 μl 10% roztworu nadsiarczanu amonu (APS). Umieść na nutatorze na ~ 1 min. Szybkie wirowanie ponownie przez 5 s.
  16. Dodać 25 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) i ostrożnie wymieszać, pipetując 5 razy w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 25 ml, unikając pęcherzyków powietrza.
  17. Odpipetuj do odlewu żelowego i ostrożnie włóż grzebień żelowy, unikając pęcherzyków powietrza.
  18. Dokręć uszczelkę, dodając duży klips do segregatora na górze kasety.
  19. Pozostaw żel do polimeryzacji na 1 godzinę.
  20. Gdy żel zastygnie, usuń spinacz do segregatora. Włóż kasetę do pudełka do elektroforezy. Dodaj 1x bufor TBE do górnego i dolnego zbiornika.
  21. Odzyskaj reakcję transkrypcji. Dodaj wodę do 100 μL, a następnie dodaj 100 μL 2x Gel Loading Buffer. Przygotuj drabinkę, mieszając zalecaną ilość z wodą do 10 μl i 10 μl 2x buforu ładującego żel do oddzielnej probówki o pojemności 1,5 ml.
  22. Inkubować zarówno drabinkę, jak i reakcję transkrypcji in vitro w termomikserze w temperaturze 70 °C przez 15 minut.
  23. Podczas denaturacji próbek w temperaturze 70 °C ostrożnie wyjąć grzebień, oczyścić studzienki, pipetując w górę i w dół każdego dołka za pomocą pipety P1000 i natychmiast uruchomić wstępnie przez 10 minut przy napięciu 100 V.
  24. Po zakończeniu 15-minutowej denaturacji próbek w temperaturze 70 °C wyjąć probówki z termomiksera i natychmiast umieścić je na lodzie.
  25. Ponownie wyczyść każdą studzienkę żelu za pomocą pipety P1000. Załaduj 20 μl drabinki na pierwszą studzienkę po lewej stronie, 20 μl próbki RNA do 10 oddzielnych studzienek i 20 μl 1x buforu ładującego żel do niewykorzystanych studzienek.
  26. Uruchom żel pod napięciem 100 V przez 60 -240 minut, w zależności od % poliakrylamidu w żelu.
    UWAGA: Barwniki w buforze ładującym żel rozdzielą się na dwa pasma podczas przechodzenia przez żel, wolno migrujący niebieski pasek błękitu bromofenolowego (BB) i szybko migrujący błękit ksylenowy (XC) cyjan pasek. Przybliżona migracja tych prążków w różnych % żelach poliakryloamidowych jest dobrze znana (patrz krok 1.11) i może być wykorzystana do oszacowania migracji RNA w żelu.
  27. Po zatrzymaniu żelu ostrożnie wyjmij żel z kasety.
  28. Umieść żel w czystym pudełku zawierającym roztwór 50 ml 1x buforu TBE z 50 μl barwnika żelowego z kwasem nukleinowym i inkubuj przez 5 minut na kołysce w celu wybarwienia RNA.
  29. Zrób zdjęcie żelu przed i po wycięciu pasma w systemie obrazowania żelu, najlepiej przy użyciu światła niebieskiego zamiast transoświetlenia UV.
  30. Wytnij każdy interesujący nas pasmo za pomocą jednorazowej końcówki do cięcia żelu bez nukleazy. Po każdym dołku przenieś końcówkę zawierającą plasterek żelu do probówki o pojemności 1,5 ml i krótko zakręć, aby zebrać plasterek żelu. Powtarzaj, aż wszystkie prążki zostaną zebrane w tej samej probówce o pojemności 1,5 ml.
  31. Po zebraniu wszystkich plastrów żelu dodaj 100 μl wody wolnej od nukleaz lub buforu TE do probówki o pojemności 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez ~48 godzin. Dzięki temu RNA może opuścić plastry żelu do roztworu.
  32. Po 48 godzinach odpipetować wodę lub bufor TE do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml. Wyrzuć pozostałe plastry żelu. Oczyść RNA za pomocą zestawu do czyszczenia w następujący sposób.
    1. Utrzymuj kolumnę wirową w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut.
    2. Do 100 μl roztworu RNA w nowej probówce o pojemności 1,5 ml z kroku 1.32 dodaj 350 μl buforu RLT i dobrze mieszaj przez 2 minuty na nutatorze. Wirować przez 1 s przy 200 x g, aby zebrać roztwór na dnie probówki.
    3. Dodaj 675 μl 100% EtOH i dobrze mieszaj przez 2 minuty na nutatorze. Wirować przez 1 s przy 200 x g i natychmiast przejść do następnego kroku.
    4. Przenieść 565 μl mieszaniny na kolumnę wirową i wirować przez 1 minutę w temperaturze 15 000 x g. Opróżnij probówkę zbiorczą przez aspirację.
    5. Powtórzyć poprzedni krok z drugą połową próbki.
    6. Dodać 500 μl buforu RPE do kolumny i wirować przez 1 minutę w temperaturze 15 000 x g. Opróżnij probówkę zbiorczą przez aspirację.
    7. Dodaj 750 μl 80% etanolu do kolumny i wiruj przez 1 minutę w temperaturze 15 000 x g. Opróżnij probówkę zbiorczą przez aspirację.
    8. Umieścić kolumnę w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml z otwartą pokrywką i wirować z prędkością 15 000 x g przez 5 minut.
    9. Przenieść kolumnę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
    10. Dodaj 17 μl wody na środek kolumny i wiruj z prędkością 15 000 x g przez 1 minutę do elucji. Ponownie eluować za pomocą kolejnych 17 μl wody. Całkowita odzyskana objętość powinna wynosić 32 μl.
  33. Dobrze wymieszać przez wirowanie, odpipetować 1,5 μl i zmierzyć stężenie RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.
  34. Sprawdź jakość oczyszczania RNA za pomocą żelu poliakryloamidowego denaturującego mocznik, jak w krokach 1.11-1.29.

2. Test metylotransferazy RNA in vitro

  1. Ustawić test metylotransferazy RNA 100 μl w probówce o pojemności 1,5 ml na lodzie w następujący sposób: 23 μL wody, 10 μL 10x TBS (500 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1,5 M NaCl), 2 μL 0,05 M EDTA, 5 μL 100 mM DTT, 40 μL 50% glicerolu, 4 μL 58 μM 3H-SAM, 5 μL 20x koktajlu inhibitorów proteazy, 1 μL RNaseOUT (opcjonalnie), 5 μL RNA i 5 μL metylotransferazy.
    UWAGA: Radioaktywny materiał trytytowany jest niebezpieczny i należy się z nim obchodzić wyłącznie w rękawicach, fartuchu laboratoryjnym i innych niezbędnych środkach ochrony osobistej. Wszystkie końcówki i rurki do pipet mające kontakt z materiałem promieniotwórczym są uważane za stałe odpady promieniotwórcze. Wszystkie stałe i ciekłe odpady promieniotwórcze należy utylizować zgodnie z zatwierdzonym przez laboratorium protokołem dotyczącym odpadów promieniotwórczych.
    UWAGA: Uwzględnij próbki kontrolne bez metylotransferazy i bez RNA. Stężenia odczynników mogą wymagać optymalizacji i/lub włączenia dwuwartościowych soli kationowych, takich jak MgCl2 lub nieznakowany SAM. Optymalny zakres końcowego stężenia RNA wynosi od 50 nM do 1 μM, natomiast stężenie metylotransferazy wynosi od 25 nM do 300 nM.
  2. Dokładnie wymieszaj, delikatnie obracając rurkę. Wirować 5 s przy 200 x g, aby zebrać roztwór na dnie probówki. Inkubować probówkę (probówki) w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
  3. Oczyść reakcję, stosując oczyszczanie kolumny, jak w kroku 1.32.
    UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność, aby prawidłowo zutylizować wszelkie materiały radioaktywne, szczególnie podczas mycia kolumny (pipetowanie zamiast zasysania odpadów z probówek).
  4. Przeprowadzanie zliczania scyntylacji cieczy
    1. Ustaw stojak do zliczania scyntylacji z jedną fiolką na próbkę, jedną fiolką do pomiaru tła i jedną fiolką do testu machnięcia. Napełnić fiolki 5 ml roztworu do liczenia scyntylacji.
    2. Dodać 10 μl każdej eluowanej próbki radioaktywnego RNA do 1 fiolki, dokręcić pokrywkę i delikatnie wymieszać.
    3. Przygotuj fiolki testowe z przeciągnięciem. Dokładnie przetrzyj wacikami wszystkie powierzchnie i sprzęt używany podczas protokołu. Dodaj waciki do fiolek wypełnionych 5 ml roztworu scyntylacyjnego i dokręć pokrywkę.
    4. Uruchomić próbki na liczniku scyntylacyjnym w następujący sposób. Otwórz pokrywę licznika, włóż stojak do maszyny i zamknij pokrywę. Wybierz opcję Policz pojedynczy stojak. Wybierz opcję Wybierz program użytkownika. Wybierz lub utwórz program, który mierzy tryt (3H) przez 60 s. Uderz w stojak hrabiowski. Powtórz liczenie scyntylacji trzy razy.
      UWAGA: Urządzenie zmierzy liczbę scyntylacji każdej próbki i wyśle ją zarówno na ekran, jak i na wydruk. W razie potrzeby protokół można w tym miejscu wstrzymać. Pozostałe próbki RNA z kroku 2.3 należy zamrozić w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.
  5. Kontynuuj autoradiogram
    1. Przygotować i wstępnie uruchomić żel poliakrylamidowy denaturujący mocznik, jak w krokach 1.11-1.20.
    2. Odpipetować 20 μl radioaktywnego materiału RNA do nowej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 20 μl 2x buforu ładującego żel. Dobrze wymieszaj. Przygotuj drabinę jak w kroku 1.21. Inkubować próbki w temperaturze 70 °C przez 15 minut.
    3. Umyć dołki żelu jeszcze raz bezpośrednio przed załadowaniem próbki. Na pozostałe pasy załadować 20 μl przygotowanej drabinki, 20 μl próbek i 20 μl 1x żelowego buforu ładującego. Uruchom żel pod napięciem 100 V przez 60-180 minut, w zależności od procentowej zawartości poliakrylamidu.
    4. Gdy żel skończy działać, wyjmij żel z kasety i umieść go w pudełku zawierającym 50 ml 1x buforu TBE z 5 μl ultraczułego barwnika żelowego kwasu nukleinowego.
    5. Inkubuj przez 5 minut na kołysce, aby wybarwić RNA.
    6. Ostrożnie wyjmij żel z pudełka i umieść go na transiluminatorze UV systemu obrazowania żelu z dołami do góry i drabinką po lewej stronie.
    7. Ustaw ostrość aparatu na żelu, włącz światło UV, a następnie zrób zdjęcie żelu, naświetlając go od 50 ms do 1 s w zależności od intensywności sygnału.
    8. Wyłącz ekspozycję UV i zapisz obraz jako plik TIFF.
    9. Umieść żel z powrotem w pudełku. Usunąć KZM. Utrwal żel za pomocą 50 ml roztworu utrwalającego (50% metanolu, 10% kwasu octowego, 40% ultraczystej wody) przez 30 minut w temperaturze pokojowej na bujaku.
    10. Delikatnie przenieś żel ponownie do świeżego czarnego pudełka zawierającego 25 ml roztworu wzmacniającego autoradiografię. W przypadku braku czarnego pudełka przykryj je folią aluminiową, aby chronić roztwór przed światłem.
    11. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na bujaku.
    12. Delikatnie podnieś żel i połóż go ekranem do dołu na arkuszu folii z dołkami do góry i drabiną po prawej stronie. Umieścić dwa arkusze bibuły chromatograficznej na odwrocie żelu. Delikatnie odwróć cały stos.
    13. Rozgrzej suszarkę do żelu do 80 °C. Odsuń plastikową osłonę suszarki do żelu. Włóż folię, żel i stos papieru chromatograficznego pod plastikową pokrywę i przesuń plastikową osłonę z powrotem w dół, aby utworzyć uszczelnienie.
    14. Suszyć przez 1 godzinę w temperaturze 80 °C w suszarce do żelu.
    15. Wyłącz suszarkę do żelu i delikatnie wyjmij stos. Zdjąć folię i drugą bibułę chromatograficzną. Zaklej pozostałą bibułę chromatograficzną wysuszonym żelem w kasecie z autoradiogramem.
    16. Dodaj 1 arkusz filmu autoradiograficznego w ciemnym pokoju.
    17. Umieść kasetę w temperaturze -80 °C i wywołaj film po 1 godzinie do 4 tygodni w zależności od intensywności sygnału, którą można ocenić na podstawie wcześniej zmierzonej liczby scyntylacji: 1-4 tygodnie dla 250-1 000 cpm, 24 h do 1 tydzień dla 1 000-10 000 cpm i 1 h do 24 h dla >10 000 cpm.
    18. Po wywołaniu filmu umieść go na kasecie i ostrożnie zaznacz markerem laboratoryjnym 4 krawędzie żelu, każdą studzienkę oraz położenie barwników XC i BB.
    19. Zeskanuj film w rozdzielczości 300 lub 600 pikseli na cal i zapisz obraz jako plik TIFF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reakcja transkrypcji in vitro
Rysunek 2A przedstawia typowy przebieg reakcji transkrypcji in vitro z użyciem polimerazy RNA T7 dla snRNA 7SK, która jest stosunkowo krótkim (331 nt) i silnie ustrukturyzowanym RNA. Jak widać na surowym obrazie, obecne są liczne niepożądane prążki, zarówno krótsze, jak i dłuższe od 7SK, co prawdopodobnie wynika z przypadkowych zdarzeń inicjacji lub terminacji transkrypcji. Z tego powodu oczyszczanie żelowe po reakcji transk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiono prostą i solidną metodę weryfikacji in vitro aktywności metylotransferazy RNA w stosunku do określonych transkryptów. Test wykorzystuje fakt, że S-adenozylometionina może być trytiowana na donorze grupy metylowej (ryc. 1), co pozwala na dokładne wykrycie metylowanego RNA bez użycia przeciwciał. Należy jednak zauważyć, że test ten nie może wskazać, która reszta lub grupa chemiczna jest metylowana przez enzym. Aby zidentyfikować lub zweryfikować, czy określona reszt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Turja Kanti Debnath za pomoc w tworzeniu ChemDraw. Badania w laboratorium Xhemalçe są wspierane przez Departament Obrony - Kongresionally Directed Medical Research Program - Breast Cancer Breakthrough Award (W81XWH-16-1-0352), NIH Grant R01 GM127802 oraz fundusze startowe z Instytutu Biologii Komórkowej i Molekularnej oraz College of Natural Sciences na University of Texas w Austin, USA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 bp DNA LadderInvitrogen10821-01510 bp Zestaw drabinek DNA.
10% nadsiarczan amonu (APS) NieNie dotyczyDo żelu poliakryloamidowego denaturującego mocznik (Na 10 ml rozpuść 1 g w 8 ml wody miliQ; dostosuj objętość do 10 ml wodą miliQ; przefiltruj roztwór za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml wyposażonej w 0,45 &mikro; m filtra).
10X Bufor TBEN/AN/ADo żelu poliakrylamidowego denaturującego mocznik (Dla 1L dodaj 108 g zasady Tris, 55 g kwasu borowego do cylindra z mieszadłem; dodaj 800 ml wody destylowanej i pozwól się rozpuścić; dodać 40 ml 0,5 M Na2EDTA (pH 8,0); dostosuj objętość do 1 l za pomocą wody miliQ; przefiltruj roztwór za pomocą 0,22&Micro; m filtra).
10X TBSN/AN/DDla 1L dodać 60,5 g Tris Base, 87,6 g NaCl do cylindra z mieszadłem; dodać 800 ml wody destylowanej i pozostawić do rozpuszczenia; dostosować pH do 7,5 za pomocą stężonego HCl; dostosować objętość do 1 l za pomocą wody miliQ; przefiltrować roztwór za pomocą 0,22 &mikro; Filtr M. 
Akrylamid: Bis-Akrylamid 29:1 (40% roztwór/elektroforeza), Fisher BioReagentsFisherBP1408-1Do żelu poliakryloamidowego denaturującego mocznik.
ADENOZYLO-L-METIONINA, S-[METYLO-3H]; (SAM[3H])Perkin ElmerNET155V250UCDo metylacji RNA in vitro; Stężenie = 1,0 mCi/ml; Aktywność właściwa = 17,1 Ci/mmol; Molarność=
(1,0 Ci/L)/(83,2 Ci/mmol) = 0,0584 mmol/L = 58,4 &mikro;M.    Po otrzymaniu zamrożonej rurki 3H-SAM rozmrozić ją w temperaturze 4° C, zrób 20 i mikro; L i zamrozić je w temperaturze -30°C. Nigdy nie zamrażaj ponownie i nie używaj ponownie częściowo wykorzystanej podwielokrotności.
Kasety autoradiograficzne Amersham HypercassetteGE HealthcareRPN11649Do ekspozycji żelu autoradiogramowego.
Amersham Hyperfilm MPGE Healthcare28906846Do naświetlania żelem autoradiogramowym.
Licznik scyntylacyjnyBeckmanLS6500Do zliczania płynów.
Biorad Mini System Elektroforezy PoziomejBiorad1704466Mini System Elektroforezy Poziomej.
cOmplete Mini Tabletki koktajlowe z inhibitorem proteazy bez EDTA RocheApplied Science4693159001Aby uzyskać roztwór 20X, rozpuść 1 tabletkę w 0,525 ml wody wolnej od nukleaz.
Criterion CellBiorad345-9902Pusta kaseta wolna od RNaz do żelu poliakrylamidowego.
Kryterium puste KasetyBiorad1656001Pionowe ogniwo do elektroforezy w formacie midi.
Spektrofotometr mikroobjętościowy DeNovix DS-11 Spektrofotometr mikroobjętościowyDeNovixDS-11-Sdo pomiaru stężenia DNA i RNA.
Ecoscint OriginalNational DiagnosticsLS-271Do zliczania cieczy.
Fiolki scyntylacyjne Fisherbrand 7 ml HDPEFisher03-337-1Do zliczania płynów.
Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography EnhancerRPI CORP112600Do wstępnej obróbki żelem autoradiogramowym.
Suszarka do żeluBiorad1651745Do suszenia żelu.
Gel Loading Buffer IIAmbionAM8547Do ładowania RNA w denaturującym żelu mocznikowym z poliakrylamidu (skład: 95% Formamid, 18 mM EDTA i 0,025% SDS, Xylene Cyanol i Bromophenol Blue).
GeneCatcher jednorazowe końcówki do wycinania żeluFirma Gel NC9431993Do usuwania pasków z żeli agarozowych i poliakrylamidowych.
Zestaw MegascriptAmbion AM1333Do transkrypcji in vitro polimerazą RNA T7. 
Perfectwestern Extralarge ContainerGenhunter CorporationNC9226382 (przezroczysty) / NC9965364 ()Żelowe pudełko do barwienia.
pRZAddgene#27663Plazmid do wytwarzania transkryptów in vitro z jednorodnymi końcami
Qiagen RNeasy MinElute CleanupQiagen74204Do oczyszczania RNA należy użyć zmodyfikowanego protokołu zawartego w protokole.
QIAquick Gel Extraction Kit (50)Qiagen28704Zestaw do ekstrakcji żelu i oczyszczania fragmentu dsDNA używanego do transkrypcji in vitro.
Saran Premium Plastic WrapSaran WrapAmazon Dosuszenia żelu.
SYBR GoldInvitrogenS11494Ultra czuła barwnik żelowa z kwasem nukleinowym.
SYBR SafeInvitrogenS33102Barwnik w żelu z kwasem nukleinowym.
TESigma93283-100ML10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA disodowy, pH 8,0
TEMEDFisher110-18-9Do żelu poliakrylamidowego denaturującego mocznik.
Termomikser z probówkami SMARTBLOCK 24X 1,5 mleppendorf5382000023/5361000038Do inkubacji probówek o pojemności 1,5 ml w kontrolowanej temperaturze.
TOPO TA Cloning Kitlife technologiesZestawy do szybkiego klonowania polimerazy Taq– amplifikowane produkty PCR do wektorów zawierających promotory T7 i/lub SP6 do transkrypcji RNA in vitro.
TURBO DNaza (2 U⁄ &mikro; L)AmbionAM2238Do usuwania DNA z reakcji transkrypcji in vitro.
MocznikSigma51456-500GDo żelu poliakrylamidowego denaturującego mocznik.
Papier Whatman 3MMGE Healthcare3030-154Bibuła chromatograficzna do suszenia żelu.
dotyczy

Bibliografia

  1. Xhemalce, B. From histones to RNA: role of methylation in cancer. Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).
  2. Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway. PLoS Genetics. 12 (7), 1006139(2016).
  3. Mauer, J., et al. Reversible methylation of m(6)Am in the 5' cap controls mRNA stability. Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).
  4. Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
  5. Pendleton, K. E., et al. The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention. Cell. 169 (5), 824-835 (2017).
  6. Meyer, K. D., et al. 5' UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation. Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).
  7. Wang, X., et al. N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency. Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).
  8. Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing. Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).
  9. Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing. Cell. 151 (2), 278-288 (2012).
  10. Jeronimo, C., et al. Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme. Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).
  11. Liu, W., et al. Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release. Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).
  12. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visual Experimentation. , Cambridge, MA. (2019).
  13. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visual Experimentation. (63), e3998(2012).
  14. Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. Template strand switching by T7 RNA polymerase. Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).
  15. Rio, D. C. Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli. Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).
  16. Shelton, S. B., et al. Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin. Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).
  17. Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends. Nucleic Acids Research. 31 (15), 82(2003).
  18. Blazer, L. L., et al. A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D. SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).
  19. Arango, D., et al. Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency. Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).
  20. Ito, S., et al. Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA). Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

metylacja RNAtest in vitrozliczanie scyntylacyjneoczyszczanie w elufilm do autoradiografiiel poliakrylamidowymodyfikacje RNAma ocz steczkowe inhibitory
Test bez przeciwciał do analizy aktywności metylotransferazy RNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.