Przedstawiamy protokół do izolacji pierwotnych dorosłych fibroblastów w łatwy, szybki i niezawodny sposób, możliwy do wykonania przez początkujących (np. studentów). Zabieg łączy enzymatyczne trawienie tkanek i mechaniczne mieszanie z falami ultradźwiękowymi w celu uzyskania pierwotnych fibroblastów. Protokół można łatwo dostosować do konkretnych wymagań eksperymentalnych (np. tkanki ludzkiej).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wspomagana ultradźwiękami pierwotna izolacja fibroblastów dorosłych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pierwotne dorosłe fibroblasty stały się ważnym narzędziem do badania zwłóknień, interakcji fibroblastów i stanów zapalnych we wszystkich tkankach ciała. Ponieważ pierwotne fibroblasty nie mogą dzielić się w nieskończoność z powodu różnicowania miofibroblastów lub indukcji starzenia, należy regularnie zakładać nowe kultury. Istnieje jednak kilka przeszkód do pokonania podczas procesów opracowywania niezawodnego protokołu izolacji i samej pierwotnej izolacji fibroblastów: stopień trudności metody (szczególnie dla początkujących), ryzyko zanieczyszczenia bakteryjnego, wymagany czas do wykorzystania pierwotnych fibroblastów do eksperymentów oraz późniejsza jakość i żywotność komórek. W tym badaniu przedstawiono szybki, niezawodny i łatwy do nauczenia się protokół izolacji i hodowli pierwotnych dorosłych fibroblastów z serca, płuc, wątroby i nerek myszy, łączący trawienie enzymatyczne i mieszanie ultradźwiękowe.
Wprowadzenie
Fibroblasty to płaskie, wrzecionowate komórki z wieloma wyrostkami gwiaździstymi i rozległą, szorstką retikulum endoplazmatycznego1,2. Przeciętny fibroblast mierzy 30 - 100 μm i ma żywotność 57 ± 3 dni1,3. Średni czas trwania cyklu komórkowego ludzkich fibroblastów waha się od 16 do 48 godzin w zależności od warunków hodowli4. Istnieją dowody na to, że zdolność replikacyjna i jakość funkcjonalna hodowanych fibroblastów pierwotnych ujemnie koreluje z wiekiem dawcy, co sugeruje, że młodsi dawcy (zwierzęta lub pacjenci) powinni być preferowani, jeśli to możliwe5,6.
Fibroblasty stanowią dominujący typ komórek w tkankach większości ssaków. Pomimo ich wszechobecności, identyfikacja molekularna fibroblastów nadal stanowi wyzwanie7. Fibroblasty migrują do rozwijających się tkanek i narządów z różnych źródeł podczas rozwoju embrionalnego8. Z tego powodu istnieje mnóstwo białek markerowych, które można znaleźć w fibroblastach, podczas gdy nadal brakuje unikalnych białek markerowych, które są obecne w każdej populacji fibroblastów i są wyłączne dla fibroblastów. Tak więc wzorce ekspresji kilku uznanych markerów są zwykle używane do identyfikacji fibroblastów. Do najbardziej rozpoznawalnych markerów należą wimentyna, białko powierzchniowe ludzkiego fibroblastu (hFSP), receptor domeny dyskoidyny 2 (DDR2) i aktyna alfa mięśni gładkich (αSMA).
Fibroblasty są głównym typem komórek wytwarzających macierz zewnątrzkomórkową (ECM). W ten sposób fibroblasty utrzymują uporządkowaną architekturę tkanek i zapewniają mechaniczne wsparcie dla sąsiednich komórek1. Równowaga między syntezą a degradacją ECM jest dobrze uregulowanym procesem. Przesunięcia w kierunku syntezy oznaczają początek nadmiernego odkładania się ECM, które, jeśli nie zostanie zakończone, prowadzi do zwłóknienia. W zwłóknieniu pośredniczą miofibroblasty, które wywodzą się z aktywowanych fibroblastów ulegających zmianom molekularnym i fenotypowym. Jedną z cech charakterystycznych miofibroblastów jest zwiększone wydzielanie ECM i cytokin oraz ekspresja uporządkowanych mikrofilamentów αSMA9.
Pierwotne fibroblasty znalazły się w centrum uwagi ostatnich badań skupiających się na zwłóknieniu, stanach zapalnych tkanek i interakcjach fibroblast-rak-komórka10,11. Jednak, aby skutecznie badać właściwości fibroblastów w zdrowiu i chorobie, konieczne jest regularne izolowanie żywotnych pierwotnych dorosłych fibroblastów. Dostępnych jest kilka metod izolacji fibroblastów12,13,14. Trzy główne metody izolacji fibroblastów to wyrastanie z fragmentów tkanki12, enzymatyczne trawienie tkanek15 oraz enzymatyczna perfuzja pustych narządów9,13,16. Zaletą przerostu jest łagodny proces izolacji bez enzymatycznej degradacji komórek. Z drugiej strony, kultury wyrostkowe zwykle wymagają przedłużonych okresów hodowli, dopóki komórki nie będą mogły być wykorzystane do eksperymentów. Powszechne trawienie enzymatyczne jest szybkie, ale niesie ze sobą ryzyko zanieczyszczenia innymi typami komórek (np. komórkami śródbłonka) lub bakteriami w procesie mieszania, co jest niezbędne do mechanicznego rozpuszczenia tkanki. Co więcej, metody te są często skomplikowane i wymagają czasu i umiejętności do nauczenia się.
Jeśli chodzi o znaczenie pierwotnych fibroblastów w badaniach, nadal istnieje potrzeba optymalizacji istniejących metod izolacji komórek pod względem szybkości, prostoty i niezawodności. W tym przypadku zapewniona jest nowatorska metoda izolacji enzymatycznych fibroblastów oparta na ultradźwiękach, zapewniająca wysoką jakość komórek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi Technische Universität Dresden, Niemcy (numer pliku: T 2014/4), jak również międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami (FELASA)17. Rysunek 1 przedstawia proces izolacji komórek.
1. Przygotowanie zestawu, materiału i nośnika
- Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych, roztwór PBS, roztwór podstawowy mieszanki kolagenazy (rozpuść 50 mg liofilizowanej mieszanki kolagenazy w 12 ml sterylnej ultraczystej wody) i 0,25% roztwór trypsyny.
- Podgrzać pożywkę, PBS i roztwór trypsyny do temperatury 37 °C.
- Podgrzej ultradźwiękową łaźnię wodną do temperatury 37 °C.
- Zdezynfekuj kleszcze, szpatułkę ze stali nierdzewnej, skalpele (2x skalpele na narząd) i 2 szklane zlewki z 70% etanolem i umieść te materiały pod kapturem do hodowli komórkowych.
- Napełnij jedną zlewkę 70% etanolem, a drugą sterylną wodą lub roztworem PBS. Zlewki te są zobowiązane do dezynfekcji i mycia instrumentu po każdej procesji organowej.
- Umieść sterylne plastikowe probówki o pojemności 15 ml zawierające zimny PBS na mokrym lodzie. Liczba probówek zależy od liczby narządów, z których chcesz wyizolować fibroblasty.
2. Sekcja myszy i usuwanie organów
- Noś dwie pary rękawiczek jedna nad drugą, tak aby pierwszą parę można było zdjąć, gdy tylko zwierzę zostanie wypreparowane.
UWAGA: Ta procedura zapobiega rozprzestrzenianiu się bakterii z sierści i skóry zwierzęcia po narządach. - Poddaj mysz eutanazji (np. zwichnięcie szyjki macicy) i przypnij tuszę igłami do każdej kończyny do podkładki styropianowej.
- Zdezynfekuj tuszę myszy za pomocą sprayu 70% etanolu. Upewnij się, że futro jest nasączone etanolem, aby włosy nie wirowały.
- Obetnij futro tuż nad drogami moczowo-płciowymi za pomocą kleszczy chirurgicznych i atraumatycznych nożyczek. Przeciąć skórę wzdłuż środkowej linii od miejsca początkowego nacięcia do szyi (3 - 4 cm) i dodać reliefowe nacięcia na kończynach.
UWAGA: Na tym etapie nie należy perforować warstwy mięśniowej, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteryjnego! - Przypnij skórę do podkładki z pianki polistyrenowej, aby mieć optymalny dostęp do mięśni pokrywających jamę brzuszną.
- Dwukrotnie zdezynfekuj mięśnie brzucha przy użyciu 70% etanolu. Poczekaj, aż etanol wyschnie, zanim przejdziesz do następnego kroku.
- Zdejmij pierwszą parę rękawiczek. Użyj nowego, sterylnego zestawu kleszczy i nożyczek.
- Otwórz jamę brzuszną i klatkę piersiową, nacinając warstwę mięśniową nożyczkami chirurgicznymi, aby delikatnie usunąć wybrane narządy. Dlatego należy delikatnie przytrzymać narząd kleszczami chirurgicznymi (nie przekłuwać narządu, stosować minimalny nacisk) i przeciąć nożyczkami naczynia krwionośne w pobliżu punktu wejścia do narządu.
- Umieścić narządy w sterylnych probówkach zawierających zimny PBS. Zamknij szczelnie rurki. Umieść probówki na mokrym lodzie, aż przejdziesz do kroku 3.1.
3. Rozdrabnianie tkanek, trawienie i ekstrakcja komórek
- Przenieść probówki pod sterylny kaptur do hodowli komórek.
UWAGA: Załóż nową parę rękawiczek i zdezynfekuj probówki 70% etanolem przed przeniesieniem ich pod maskę! - Wyjąć narząd z probówki o pojemności 15 ml za pomocą sterylnych kleszczy. Umieścić narząd na jednej połowie sterylnej szalki Petriego o średnicy 6 cm i krótko umyć narząd PBS w celu usunięcia nadmiaru krwi. Przenieś narząd do drugiej połowy szalki Petriego, usuń nadmiar PBS.
- Zmiel tkankę za pomocą dwóch sterylnych skalpeli. Pozostałe fragmenty tkanki nie powinny być większe niż 1 - 2 mm.
- Przenieś zmieloną tkankę do nowej sterylnej probówki o pojemności 15 ml za pomocą sterylnej szpatułki i dodaj 2 ml 0,25% roztworu trypsyny. Umieścić probówkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C na 5 minut.
- Delikatnie obracaj rurkę (około 1400/min) przez 10 s.
- Zatrzymać reakcję trypsyny pod kapturem hodowli komórkowej, dodając 4 ml pożywki do hodowli komórkowych zawierającej FCS (np. zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM) firmy Dulbecco).
- Dodać 250 μl roztworu mieszanki kolagenazy do każdej probówki zawierającej tkankę serca lub płuc i 100 μl odpowiednio dla nerek lub wątroby.
- Umieścić probówki w ultradźwiękowej łaźni wodnej (37 °C) i aktywować ultradźwiękowy sonograf na 10 min.
UWAGA: Ultradźwiękowa łaźnia wodna stosowana w tym protokole ma częstotliwość pracy 35 kHz i maksymalną moc 320 W. - Delikatnie wirować rurki (około 1400/min) przez 10 s.
- Umieść probówki ponownie w ultradźwiękowej łaźni wodnej na 10 minut.
- Wiruj delikatnie (około 1400/min) przez 10 s.
- Zdezynfekuj probówki 70% etanolem i przenieś je pod sterylny kaptur do hodowli komórkowych.
- Przefiltrować roztwór z siatką 40 μm do nowej sterylnej probówki o pojemności 15 ml.
- Odwirować probówkę o sile 500 x g przez 5 minut.
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml świeżej pożywki.
- Przenieść komórki do odpowiedniego naczynia do hodowli komórkowej (np. płytki 6-dołkowej) i umieścić naczynie w inkubatorze do hodowli komórkowych na noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Następnego dnia usuń pożywkę, przemyj 3 razy PBS, a następnie dodaj świeżą pożywkę (dodana objętość zależy od wybranego naczynia do hodowli komórkowej, 2 ml na dołek płytki 6-dołkowej itp.).
- Zmieniaj podłoże co drugi dzień.
UWAGA: Fibroblasty mogą ulec rozszczepieniu po osiągnięciu zbieżności optycznej 90% (zwykle po 5-7 dniach).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wykazano skuteczność niniejszego protokołu w izolowaniu dojrzałych fibroblastów z litej tkanki mysiej. Uzyskano żywe fibroblasty, które mogą być wykorzystane w dalszych eksperymentach, takich jak barwienie immunofluorescencyjne czy badania proliferacji (Rysunek 2D-F, Rysunek 5A).
Dorosłe fibroblasty są płaskimi komórkami o wrzecionowatym kształcie z licznymi wypustkami komórkowymi, które zazwyczaj ros...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W porównaniu z unieśmiertelnionymi liniami komórkowymi fibroblastów, pierwotne fibroblasty mają kilka zalet. Można je izolować w sposób ekonomiczny w wysokiej jakości i ilości. Co więcej, hodowle pierwotne oferują możliwość badania komórek pochodzących od wielu osobników, co zwiększa wiarygodność uzyskanych wyników i zmniejsza prawdopodobieństwo samego badania artefaktów hodowli komórkowych. Ciągłe wytwarzanie nowych kultur pierwotnych zapobiega zmianom genetycznym, które często występują po wielokrotnym pasażowaniu
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie ma żadnych konfliktów interesów, które można by zadeklarować.
Podziękowania
Dziękujemy Pani Romy Kempe i Pani Annett Opitz za fachowe wsparcie techniczne. Dziękujemy również Panu Bjoernowi Binnewergowi za wsparcie informatyczne. Prace te były wspierane przez granty a) Förderkreis Dresdner Herz-Kreislauf-Tage e.V., b) "Habilitationsförderprogramm für Frauen", Wydział Lekarski Carl Gustav Carus Dresden oraz c) Else Kröner-Forschungskolleg (EKFK) Wydział Lekarski Carl Gustav Carus Dresden. Jesteśmy wdzięczni za dofinansowanie i wsparcie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,25% Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T4049-100ML | |
| Antybiotyki | Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA | Gibco LS15140148 | Penicylina/ Streptomycyna (10 000 U/ml) |
| Kaptur do hodowli komórkowych | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stany Zjednoczone | 51023608 | HeraSafe KSP15 |
| Inkubator do hodowli komórkowych | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 50049176 | BBD 6220 |
| Płytki do hodowli komórkowych | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | w zależności od naczynia | 6-, 12-, 24-dołkowego Powierzchnia nunclon |
| Odsysanie kultur komórkowych | VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Niemcy | 20727400 | BVC profesjonalny |
| sitko do komórek ssących (siatka) | Corning, Tewksbury, USA | 431750 | 40 & mikro; m Wirówka nylonowa |
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stany | Zjednoczone 75007213 | Megafuge 8R | |
| Bezprzewodowy kontroler pipetowania | Hirschmann, Eberstadt, Niemcy | 9907200 | Pipetus |
| Jednorazowe końcówki do pipet | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | w zależności od objętości | Końcówki SafeSeal do pipet (10 &mikro; L, 20 i mikro; L, 100 i mikro; L, 200 i mikro; L, 1000 i mikro; L) |
| Jednorazowe pipety plastikowe | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | w zależności od objętości | 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 ml |
| Jednorazowy sterylny skalpel | Myco Medical, Cary, USA | n.a.Techno | cut |
| Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 41965-062 | |
| Probówki Eppendorfa | Eppendorf, Hamburg, Niemcy | w zależności od objętości | 50 i mikro; L, 500 i mikro; L, 1.500&mikro; L, 2.000 &mikro; L |
| Płodowa surowica cielęca (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F2442-50ML | |
| Mieszanka kolagenazy | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 5401020001 | Liberase TL Research |
| Grade szalka Petriego 6 cm | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P5481-500EA | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D8537-500ML | 500 ml |
| Zestaw do wykrywania starzenia | Abcam, Cambridge, Wielka Brytania | ab65351 | |
| Shaker/ Vortex | IKA, Staufen im Breisgau, Niemcy | n.a.MS2 | Minishaker (kolejny model: Ident-Nr.: 0020016017) |
| Sterylne probówki z tworzywa sztucznego | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | Probówki Falcon 352095 | BD Falcon (15 mL, 50 mL) |
| Ultradźwiękowa kąpiel wodna | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Niemcy | 312 | Sonorex RK100H |
| (atraumatyczne) | Aesculap AG, Tuttlingen, Niemcy | NR 82 | |
| Nożyczki chirurgiczne | Aesculap AG, Tuttlingen, Niemcy | eq 1060.09 | |
| Kleszcze chirurgiczne | Aesculap AG, Tuttlingen, Niemcy | BD577 |
Bibliografia
- Baum, J., Duffy, H. S. Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).
- Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. Redefining the identity of cardiac fibroblasts. Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).
- Weissman-Shomer, P., Fry, M. Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density. Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).
- Angello, J. C. Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor. Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).
- Serra, V., von Zglinicki, T. Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length. FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).
- Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. International Journal of Molecular Medicine. 38 (4), 1063-1074 (2016).
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260(2016).
- Kuenzel, S. R., et al. Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation. bioRxiv. , 445098(2018).
- Van Linthout, S., Miteva, K., Tschöpe, C. Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells. Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Poulet, C., Künzel, S., Büttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation. Physiological Reports. 4 (2), (2016).
- Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601(2017).
- Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).
- Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).
- El-Armouche, A., et al. Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy. Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).
- Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), 2033(2010).
- Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).
- Rohr, S. Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).
- Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484 (2019).
- Coppé, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).
- Singh, M., Sharma, A. K. Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).
- Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems. Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
