Method Article

Ocena dostępności minerałów w paszach dla ryb przy użyciu metod uzupełniających zademonstrowanych na przykładzie w łososiu atlantyckim

DOI:

10.3791/59862

⸱

October 29th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Marine Research, 2Department of Biological Sciences, University of Bergen, 3National Food Institute, Technical University of Denmark, 4Metal metabolism group, Nutritional Sciences Division, King's College London

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł szczegółowo wyjaśnia systematyczne podejście do oceny dostępności mikrominerałów w łososiu atlantyckim. Metodologia obejmuje narzędzia i modele o rosnącej złożoności biologicznej: (1) analizę specjacji chemicznej, (2) rozpuszczalność in vitro, (3) badania absorpcji w liniach komórkowych oraz (4) badania in vivo na rybach.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena dostępności mikrominerałów w diecie jest głównym wyzwaniem w żywieniu mineralnym gatunków ryb. Niniejszy artykuł ma na celu opisanie systematycznego podejścia łączącego różne metodologie do oceny dostępności (Zn) w łososiu atlantyckim (Salmo salar). Biorąc pod uwagę, że w paszy dla łososia atlantyckiego może występować kilka związków chemicznych Zn, postawiono hipotezę, że na dostępność Zn mają wpływ obecne w paszy formy chemiczne Zn. Tak więc w tym badaniu pierwszy protokół dotyczy sposobu ekstrakcji różnych związków chemicznych Zn z paszy i analizowania ich metodą chromatografii wykluczającej z indukcyjnie sprzężoną spektroskopii mas plazmy (SEC-ICP-MS). Następnie opracowano metodę in vitro w celu oceny rozpuszczalności Zn w paszach dla łososia atlantyckiego. Trzeci protokół opisuje metodę badania wpływu zmiany składu chemicznego Zn na wychwyt Zn w modelu nabłonka jelitowego ryb przy użyciu linii komórkowej jelita pstrąga tęczowego (RTgutGC). Podsumowując, wyniki metod in vitro porównano z badaniem in vivo, w którym analizowano widoczną dostępność nieorganicznych i organicznych źródeł Zn uzupełnionych paszami dla łososia atlantyckiego. Wyniki pokazały, że w paszach można znaleźć kilka rodzajów chemicznych Zn, a wydajność organicznego źródła Zn zależy w dużej mierze od ligandu aminokwasowego używanego do chelatowania Zn. Wyniki badań in vitro wykazywały mniejszą korelację z wynikami badania in vivo. Niemniej jednak protokoły in vitro opisane w tym artykule dostarczyły kluczowych informacji na temat dostępności Zn i jego oceny w paszach dla ryb.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mączka rybna i olej rybny były tradycyjnie stosowane w paszy dla łososia atlantyckiego. Jednak składniki te są coraz częściej zastępowane składnikami pochodzenia roślinnego1. Wspomniana zmiana w składzie paszy spowodowała niską dostępność diety i zwiększone zapotrzebowanie na poprawę dostępności minerałów w paszach dla łososia atlantyckiego, zwłaszcza (Zn)2. Zmniejszona dostępność może wynikać ze zmiany poziomu Zn, związków chemicznych Zn lub czynników antyżywieniowych obecnych w matrycy paszowej. W tym scenariuszu pojawił się nowy szereg dodatków ogólnie uznawanych za "źródła organiczne", które mogą być lepiej dostępnym źródłem minerałów w diecie dla ryb. Dlatego ważne jest, aby zrozumieć podstawową chemię i fizjologię rządzącą dostępnością minerałów i ich źródeł dla ryb. jest niezbędnym pierwiastkiem śladowym dla wszystkich organizmów żywych3. Rola Zn jako cząsteczki sygnałowej została opisana zarówno na poziomie parakomórkowym, jak i wewnątrzkomórkowym w fish4. U łososia atlantyckiego niedobór Zn wiąże się z nieprawidłowościami szkieletowymi i zmniejszoną aktywnością różnych metaloenzymów Zn5,6.

To badanie opisuje systematyczne podejście do zrozumienia dostępności Zn poprzez kategoryzację go do czterech różnych przedziałów o zróżnicowanej złożoności chemicznej i biologicznej. Stosowane metody są opisane w czterech sekcjach, jak można zobaczyć w Rysunek 1: (1) ocena związków chemicznych Zn we frakcji rozpuszczalnej paszy dla łososia atlantyckiego przy użyciu chromatografii wykluczającej wielkość - spektroskopii mas ze sprzężoną indukcyjnie sprzężoną plazmą (SEC-ICP-MS)7; 2) rozpuszczalność in vitro suplementu Zn w paszy dla łososia atlantyckiego; (3) ocena absorpcji związków chemicznych Zn za pomocą modelu jelitowego in vitro (RTgutGC)8; oraz (4) pozorna dostępność Zn w łososiu atlantyckim (Salmo salar)9. Podobne protokoły można opracować dla innych minerałów (np. manganu, selenu, miedzi) o wartości odżywczej dla gatunków ryb akwakultury.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próba karmienia w sekcji 4 została przeprowadzona zgodnie z norweskim (FOR-2015-06 - 18-761) i europejskim prawodawstwem (dyrektywa 2010/63/UE).

1. Ocena związków chemicznych Zn we frakcji rozpuszczalnej paszy dla łososia atlantyckiego przy użyciu metody SEC-ICP-MS

  1. Bufor ekstrakcyjny (100 mM Tris-HCl, pH 8,5)
    1. Przygotować bufor ekstrakcyjny, rozpuszczając odpowiednią ilość tris(hydroksymetylo)aminometanu, aby osiągnąć pożądaną siłę jonową (100 mM) w ultraczystymH2O.
    2. Dostosuj pH roztworu do pH 8,5 za pomocą roztworu HCl, monitorując zmianę pH za pomocą pH-metru.
  2. Przygotowanie próbek pasz<br /> UWAGA: Zastosowana próbka paszy została opracowana w oparciu o komercyjną paszę dla łososia atlantyckiego, zawierającą źródła białka głównie ze składników pochodzenia roślinnego (tj. około 5% białka rybnego, 10% oleju rybnego, 68% białka roślinnego i 12% oleju roślinnego). Do paszy dodano siarczan.
    1. Próbkę paszy zmielić ręcznie za pomocą tłuczka i moździerza.
    2. Przesiać próbkę paszy, aby upewnić się, że ekstrakcja odbywa się we frakcji paszowej o podobnej wielkości cząstek (od 850 μm do 1,12 mm).
    3. Przystąp do ekstrakcji Zn.
  3. Ekstrakcja z próbki paszy
    1. Odważyć około 0,5 g paszy w trzech egzemplarzach do stożkowych probówek o pojemności 15 ml.
    2. Dodać bufor ekstrakcyjny (5 ml 100 mM Tris-HCl, pH 8,5) do próbek.
    3. Ekstrahować próbki w rotatorze (20 obr./min) w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.
    4. Oddzielić frakcje rozpuszczalne i nierozpuszczalne przez odwirowanie przez 10 minut przy 3000 x g.
    5. Użyj jednorazowego filtra strzykawkowego 0,45 μm, aby przefiltrować frakcję rozpuszczalną.
    6. Przefiltrowane próbki przenieść do czystych probówek.
    7. Przeprowadzić analizę specjacji Zn we frakcjach rozpuszczalnych przy użyciu SEC-ICP-MS, zgodnie z opisem w kroku 1.6.
      UWAGA: Podsumowanie procedury ekstrakcji Zn z próbki paszy jest opisane w Rysunek 2.
  4. Roztwór fazy ruchomej (50 mM Tris-HCl + 3% MeOH, pH 7,5)
    1. Przygotować roztwór fazy ruchomej, rozpuszczając 6,057 g tris(hydroksymetylo)aminometanu w 1 l 3% roztworu MeOH (v/v).
    2. Dostosuj pH roztworu do pH do 7,5 za pomocą roztworu HCl, monitorując zmianę pH za pomocą pH-metru.
    3. Przefiltrować roztwór fazy ruchomej przez filtr membranowy 0,45 μm.
  5. Wzorcowanie masy cząsteczkowej w zakresie separacji kolumn SEC
    1. Skalibruj zakres separacji, wykonując kalibrację masy cząsteczkowej.
      UWAGA: W tym badaniu zastosowano tyreoglobulinę (660 kDa), dysmutazę ponadtlenkową Zn/Cu (32 kDa), mioglobinę (17 kDa) i witaminę B12 (1,36 kDa).
    2. Przygotować każdy z wzorców o znanym stężeniu w ultraczystymH2O.
    3. Przygotować fiolkę z wysokosprawną chromatografią cieczową (HPLC), dodając do niej 250 μl wzorca.
    4. Załadować fiolki z wzorcami do sekwencji próbek.
    5. Przeprowadzić kalibrację masy cząsteczkowej na początku i na końcu sekwencji analitycznej, monitorując 127I (tyreoglobulina), 66Zn (dysmutaza ponadtlenkowa Zn/Cu), 57Fe (mioglobina) i 59Co (witamina B12).
      UWAGA: Kalibracja masy cząsteczkowej jest wykonywana jednocześnie z analizą specjacji Zn.
  6. Analiza specjacji przy użyciu SEC-ICP-MS
    UWAGA: Analiza specjacji Zn metodą SEC-ICP-MS została opracowana w oparciu o zasady opisane w innym miejscu10,11, a dalsza optymalizacja została przeprowadzona na potrzeby analizy paszy dla łososia atlantyckiego7.
    1. Przeprowadzić analizę specjacji Zn na frakcjach rozpuszczalnych przy użyciu kolumny do chromatografii wykluczającej wielkość (SEC) i HPLC sprzężonej ze spektroskopią mas w plazmie sprzężonej indukcyjnie (ICP-MS).
    2. Przygotować fiolkę HPLC, dodając do niej 250 μl frakcji rozpuszczalnej.
    3. Przed analizą należy dodać do wszystkich próbek 0,5 μl witaminy B12. Ten krok pozwala na skorygowanie przesunięć czasów retencji, monitorując 59Co.
    4. Rozcieńczyć rozpuszczalną frakcję buforem ekstrakcyjnym (100 mM Tris-HCl, pH 8,5) i dostosować do końcowej objętości 1 ml.
    5. Przygotować sekwencję próbek w kolejności losowej.
    6. Dostrój ICP-MS zgodnie z instrukcjami producenta.
    7. Postępuj zgodnie z ustawieniami przyrządów dla HPLC i ICP-MS wykonując analizę specjacji Zn (patrz Tabela 1).

2. Rozpuszczalność in vitro suplementowanego Zn w paszy dla łososia atlantyckiego

UWAGA: Użyta próbka paszy została opracowana na podstawie komercyjnej paszy dla łososia atlantyckiego, zawierającej źródła białka głównie z surowców roślinnych (tj. około 5% mączki rybnej, 10% oleju rybnego, 68% składników roślinnych i 12% oleju roślinnego).

  1. Próbki paszy dla łososia atlantyckiego mielić przez 10 s z prędkością 3000 obr./min za pomocą młyna nożowego i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszej analizy.
  2. Zważyć ~0,2 g próbek paszy zmielonych w kroku 2.1 i dodać radioznacznik Zn (65Zn) o znanej aktywności specyficznej do probówki z próbką o objętości 5 ml (z nakrętką).
    UWAGA: Procedura ta musi być wykonywana wewnątrz zestawu radionuklidów. Osoba wykonująca ten krok powinna być przeszkolona i certyfikowana do obchodzenia się z izotopami promieniowymi. Należy ściśle przestrzegać środków bezpieczeństwa i środków ostrożności zalecanych przez administrację ds. bezpieczeństwa radiologicznego instytutu.
  3. Następnie należy przygotować słodkowodny roztwór buforowy światła jelitowego, jak opisano poniżej.
    1. Dla roztworu soli A odważyć 11,65 g NaNO3, 0,55 g KNO3 i 0,4 gMgSO4. Rozpuścić sole w ultraczystymH2Oi dostosować do końcowej objętości 60 ml.
    2. Dla roztworu soli B odważyć 0,31 g Ca(NO3)2·4H2O. Rozpuścić sole w ultraczystymH2Oi dostosować do końcowej objętości 10 ml.
    3. Użyj 500 mM roztworu podstawowego HEPES jako roztworu soli C.
    4. Dla roztworu soli D odważyć 1,2 g MgCl2, rozpuścić sól w ultraczystymH2Oi dostosować do końcowej objętości 20 ml.
    5. Dla roztworu soli E odważyć 0,9 gMgSO4, rozpuścić sól w ultraczystymH2Oi dostosować do końcowej objętości 20 ml.
    6. Przygotować roztwór pirogronianu, rozpuszczając 0,55 gCH3COCOONa w 10 ml ultraczystegoH2O.
    7. Rozpuścić 0,9 g galaktozy (C6H12O6) w ultraczystym H2O.
    8. Dobrze rozpuścić za pomocą mieszadła magnetycznego i wysterylizować roztwory soli A, B, D i E przez autoklawowanie, a roztwór C, pirogronian i galaktozę przez filtr strzykawkowy o średnicy 200 μm.
    9. Po przygotowaniu różnych roztworów podstawowych, w celu przygotowania 100 ml roztworu roboczego buforu, należy wymieszać wyżej przygotowane roztwory w następującej proporcji: 6,8 ml roztworu soli A, 4,14 ml roztworu B, 5 ml C, 2,5 ml D, 1,5 ml E i po 1,14 ml pirogronianu i galaktozy. Uzupełnić objętość do 100 ml wodą dejonizowaną.
      UWAGA: Powyższy bufor będzie teraz reprezentował skład jonowy światła jelita występującego u słodkowodnych ryb łososiowatych.
  4. Przygotować sześć innych podwielokrotności buforu opisanego w kroku 2.6 i dodać jeden z następujących aminokwasów (cysteinę, metioninę, glicynę, histydynę, lizynę i argininę), aby osiągnąć końcowe stężenie molowe 5 mM.
  5. Dodać słodkowodny bufor luminalny jelita (objętość reakcji = 3 ml; pH 7,4) do próbki paszy.
  6. Powtórzyć krok 2.5 z opisanymi w ppkt 2.4 (w obecności różnych aminokwasów przy stężeniu 5 mM).
  7. Zamknij rurki i pozwól im obracać się w obrotowej przędzarce przez 30 minut przy 25 obr./min.
  8. Oddzielić frakcje rozpuszczalne i nierozpuszczalne przez odwirowywanie przez 10 minut przy 1157 x g.
  9. Użyj kasjera gamma, aby zmierzyć liczbę na minutę (cpm) 65Zn we frakcjach rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych.
  10. Obliczyć proporcję izotopów promieniotwórczych Zn (65Zn) obecnych we frakcjach rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych.

3. Ocena absorpcji związków chemicznych Zn za pomocą modelu jelitowego in vitro (RTgutGC)

  1. Hodowla komórek RTgutGC
    UWAGA: Wszystkie materiały robocze użyte na tym etapie powinny być sterylne.
    1. Delikatnie ożywić zamrożone komórki RTgutGC w łaźni wodnej o temperaturze 20 °C.
    2. Delikatnie odpipetować roztwór zawierający komórki i zawiesić je w 10 ml pożywki L15 zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
      UWAGA: 10% FBS służy tylko do ożywiania zamrożonych komórek. Do późniejszego przejścia FBS jest używany na poziomie 5%. Skład FBS może się różnić w zależności od partii, dlatego zaleca się kupowanie i magazynowanie takiej ilości, jaka jest potrzebna z jednej partii, aby uniknąć różnic między partiami w składzie surowicy.
    3. Dodać zawiesinę komórkową do kolb do hodowli komórkowych o długości 75cm2 i inkubować w inkubatorze ustawionym w temperaturze 19 °C w normalnej atmosferze.
    4. Sprawdź komórki, a gdy się zlewają (80% konfluencji, oceń wizualnie, badając gęstość powierzchni komórki pod mikroskopem), podziel komórki na nowe kolby (kolejne pasaże) lub zbierz do wykorzystania w eksperymentach.
      UWAGA: Przykład komórek RTgutGC 1 h i 1 tydzień po wysiewie do kolb do hodowli komórkowych jest pokazany w Rysunek 3.
  2. Pobieranie komórek i przygotowanie do eksperymentów z ekspozycją
    1. Przemyć komórki dwukrotnie 1 ml roztworu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Po każdym praniu odsysać roztwór EDTA za pomocą sterylnej rurki ssącej.
    2. Potraktuj komórki trypsyną (0,7 ml trypsyny, w 0,25% w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami [PBS]).
    3. Delikatnie obrócić kolbę pod ostrymi kątami, aby rozprowadzić trypsynę po całej powierzchni kolby.
    4. Kontynuuj obracanie przez 2 minuty, aż komórki się odłączą.
    5. Po delikatnym obracaniu przez 2 minuty dodaj 10 ml pożywki L15/FBS, aby zneutralizować trypsynę.
    6. Zdekantować powstałą zawiesinę komórkową do stożkowej dolnej probówki wirówkowej za pomocą sterylnej pipety i odwirowywać przez 3 minuty przy 130 x g.
    7. Określ gęstość zebranych komórek przez ręczne liczenie za pomocą hemocytometru.
    8. Dodaj wymaganą objętość pożywki L15/FBS, aby uzyskać gęstość komórek 5 x 104 komórek/ml.
    9. Wysiewaj komórki na 24-dołkowe płytki, pipetując 1 ml zawiesiny komórek na studzienkę, aby uzyskać końcową gęstość komórek 5 x 104 komórek/basenik.
      UWAGA: Zaleca się stosowanie pipet z wieloma dozownikami, aby zminimalizować zmienność i skrócić czas.
    10. Umieścić płytki z nasionami w inkubatorze w normalnej atmosferze w temperaturze 19 °C na 48 godzin przed eksperymentami.
      UWAGA: Trypsyna należy przechowywać w temperaturze -20 °C; Roztwór EDTA i pożywki L15/FBS w temperaturze 4 °C. Temperaturę wszystkich roztworów roboczych i pożywek należy dostosować do 19 °C tuż przed użyciem.
  3. Przygotowanie podłoża ekspozycyjnego
    UWAGA: Ten krok należy wykonać pod wyciągiem w warunkach aseptycznych i sterylnych.
    1. Przygotować L15/ex, mieszając po 6,8 ml roztworu soli A (etap 2.3.1), 1,14 ml roztworu B (etap 2.3.2), 5 ml C (etap 2.3.3) i po 1,14 ml pirogronianu (etap 2.3.6) i galaktozy (etap 2.3.7). Uzupełnić objętość do 100 ml przy użyciu sterylnej wody destylowanej do hodowli komórkowych.
    2. Przygotować FW, mieszając 6,8 ml roztworu soli A (2.3.1), 4,14 ml B (2.3.2), 5 ml C (2.3.3), 2,5 ml D (2.3.4), 1,5 ml E (2.3.5) i po 1,14 ml pirogronianu (2.3.6) i galaktozy (2.3.7). Uzupełnić objętość do 100 ml sterylną wodą destylowaną przeznaczoną do hodowli komórkowych.
    3. Określ ilościowo stężenia jonów w pożywce ekspozycyjnej za pomocą ICP-MS, jak opisano w innym miejscu12.
      UWAGA: Stężenia jonowe analizowane w preparatach pożywek przedstawiono w tabeli 2.
  4. Oznaczanie napływu (65Zn)
    1. Wysiewaj komórki RTgutGC na 24-dołkowych płytkach (5 x 104 komórki/dołek) w kompletnym pożywce L15/FBS.
    2. Inkubować przez 48 godzin w inkubatorze w normalnej atmosferze w temperaturze 19 °C.
    3. Dostosować wszystkie preparaty pożywek doświadczalnych do pH 7,4 przy użyciu 0,5 M NaOH w obecności lub bez L-metioniny (L-Met) lub DL-metioniny (DL-Met) przy stężeniu 2 mM.
      UWAGA: Dostosowanie pH opisanych w ppkt 3.4.3 musi być wykonane na świeżo przed poddaniem komórek działaniu substancji w kroku 3.4.5.
    4. Po zakończeniu okresu inkubacji usunąć pożywkę z dołków i dokładnie spłukać PBS.
    5. Dodać eksperymentalną pożywkę FW o dostosowanym pH i pozostawić do aklimatyzacji na 20 minut.
    6. Wystawić komórki RTgutGC na działanie nominalnych stężeń 3,07, 6,14, 12,27 i 24,55 μM 65Zn(II) (jako ZnCl2; ~4 kBq/mL) w pożywce opisanej w kroku 3.4.3.
    7. Bezpośrednio po tym należy przechowywać komórki w inkubatorze w temperaturze 19 °C przez 15 minut.
    8. Po zakończeniu 15-minutowej inkubacji odessać supernatant kultury i wyjąć z dołka.
    9. Przepłukać komórki lodowatym pożywką FW (o 200 μM Zn, pH 7,4), a następnie schłodzić, dodając 5 mM buforu kwasu β N,N,N',N',N'-N'-tetraoctowego (pH 7,4) (pH 7,4) glikolu etylenowego, dodając 5 mM glikolu etylenowego
      10. .
    10. Wystawić komórki na działanie powyższych preparatów pożywki w obecności lub bez 10 mM kwasu 2-aminobicyklo-[2.2.1] heptano-2-karboksylowego (BCH), inhibitora transportu aminokwasów.
    11. Po upływie 15 minut należy powtórzyć czynności 3.4.8 i 3.4.9.
    12. Ogniwa RtgutGC zostaną przyklejone do dna studzienek jako monowarstwa. Trawić komórki za pomocą 0,2% gorącego detergentu z dodecylosiarczanu sodu (SDS) (100 μl/dołek).
      UWAGA: Przed użyciem roztwór SDS należy umieścić na 1 godzinę w łaźni wodnej ustawionej na 90 °C.
    13. Odessać i odzyskać poferment komórkowy do probówki o pojemności 1,5 ml.
    14. Zmierz radioaktywność trawienia komórki za pomocą licznika gamma.
      UWAGA: Liczby na minutę (cpm) muszą zostać skorygowane o rozpad promieniotwórczy, aktywność tła i są poddawane specyficznym obliczeniom aktywności zgodnie ze wzorami opisanymi przez Glovera i Hogstranda13.
    15. Aby określić ilościowo stężenie białka w komórkach, homogenizuj komórki za pomocą 500 μl 0,5 M NaOH.
    16. Użyj zestawu testowego Bradforda, aby zmierzyć stężenie białka w próbce komórki, z albuminą surowicy bydlęcej (BSA) jako standardem.
      UWAGA: Po ilościowym określeniu stężenia białka, szybkość wychwytu Zn przez komórki RTgutGC może być wyrażona jako białko pmoles Zn min-1 mg-1.

4. Pozorna dostępność dietetycznego Zn w łososiu atlantyckim (Salmo salar)

UWAGA: Karmy dla łososia atlantyckiego zostały opracowane na podstawie komercyjnych pasz, zawierających źródła białka głównie ze składników pochodzenia roślinnego (tj. około 5% białka rybnego, 10% oleju rybnego, 68% białka roślinnego i 12% oleju roślinnego). Dwie pasze uzupełniono źródłem nieorganicznym (siarczan Zn) lub źródłem organicznym (chelat Zn glicyny) w celu osiągnięcia stężenia Zn 150 mg/kg paszy. Ponadto tlenek itru (gatunek paszowy) został dodany do paszy w ilości 0,01% jako obojętny marker, aby umożliwić obliczenie współczynnika pozornej dostępności.

  1. Zaaklimatyzuj łososia atlantyckiego (szczep SalmoBreed, wiek 1+ lat, grupy mieszane płci) w odpowiednich zbiornikach, dopóki ryby nie przyzwyczają się do warunków eksperymentalnych.
  2. Oceń aklimatyzację łososia atlantyckiego, monitorując jego dzienne pobranie paszy.
    UWAGA: Próba ta została przeprowadzona w zbiornikach potrójnych, w związku z czym użyto w sumie sześciu zbiorników. Podczas próby karmienia temperatura wody wynosiła 11,9 ± 0,3 °C, a nasycenie rozpuszczonym tlenem 101 ± 5%.
  3. Karm ryby eksperymentalnymi paszami przez 11 dni.
  4. Poddaj rybę eutanazji przez przedawkowanie, używając 6 ml roztworu podstawowego metanosulfonianu trikainy na litr wody.
  5. Zebrać zbiorczą próbkę kału od ryb z tego samego zbiornika na płytkę, paskując od płetwy brzusznej do odbytu.
  6. Usunąć kał z płytki za pomocą szpatułki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i natychmiast przechowywać próbki w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Próbki utrzymywano w temperaturze -20 °C do czasu dalszej analizy.
  7. Próbki kału liofilizować przez 72 godziny w temperaturze -80 °C.
  8. Ręcznie homogenizować próbkę kału na drobny proszek za pomocą tłuczka i moździerza.
  9. Określić stężenie Zn i itru w próbkach paszy i kału za pomocą ICP-MS (zgodnie z opisem w innym miejscu9).
  10. Współczynnik dostępności pozornej (AAC, %) należy określić za pomocą następującego wzoru:
    figure-protocol-1

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena związków chemicznych Zn w rozpuszczalnej frakcji paszy dla łososia atlantyckiego przy użyciu metody SEC-ICP-MS
Metoda SEC-ICP-MS dostarcza danych na temat związków chemicznych Zn występujących we frakcji rozpuszczalnej paszy dla łososia atlantyckiego. Rysunek 4 ilustruje profil chromatograficzny Zn znajdujący się we frakcji rozpuszczalnej. Chromatogram ten uzyskano metodą SEC-ICP-MS. Pięć pików zawierających Zn znaleziono we frakcjach rozpuszczalnych paszy dla łososia atlantyckiego. Każdy pik ma inną masę cząsteczkową; pik pierwszy (~ 600 kDa), pik drugi i szczyt trzeci (od 32 do 17 kDa), szczyt czwarty (od 17 do 1,36 kDa) i szczyt piąty (> 1,36 kDa). Szczyt czwarty był najliczniejszy, a następnie szczyt drugi, trzeci, piąty i pierwszy. Związki chemiczne Zn znajdujące się we frakcji rozpuszczalnej mogą mieć różne źródła, ponieważ stosowana pasza zawiera zarówno składniki pochodzenia morskiego, jak i roślinnego oraz formę uzupełnioną (tj. siarczan Zn). Zakres masy cząsteczkowej związków chemicznych Zn sugerował, że związki te mogą być metaloproteinami.

Rozpuszczalność in vitro suplementowanego Zn w paszy dla łososia atlantyckiego
Rozpuszczalność suplementowanego 65Zn zwiększyła się w obecności aminokwasów. Wszystkie badane aminokwasy zwiększały rozpuszczalność suplementowanych 65Zn. Metionina, glicyna, cysteina, histydyna i lizyna poprawiły rozpuszczalność 65Zn; wyższą rozpuszczalność stwierdzono w przypadku histydyny i lizyny (Ryc. 5).

Ocena absorpcji gatunków Zn za pomocą modelu jelitowego in vitro (RTgutGC)
Na wierzchołkowy wychwyt w komórkach RTgutGC istotny wpływ miała obecność L-Met lub DL-Met w stężeniach 2 mM. Ponadto na wpływ metioniny na wychwyt Zn w komórkach RTgutGC negatywnie wpłynęła obecność BCH (blokera systemu transportu aminokwasów) w porównaniu z komórkami nieleczonymi BCH (Figura 6).

Pozorna dostępność dietetycznego Zn w łososiu atlantyckim (Salmo salar)
W praktycznych paszach dla łososia atlantyckiego pozorna dostępność Zn była taka sama w przypadku suplementacji źródłem nieorganicznym (siarczan Zn) lub źródłem organicznym (chelat Zn glicyny). Szacunkowe wartości pozornej dostępności Zn (%, n = 3) w łososiu atlantyckim wynosiły 31% ± 12% w przypadku suplementacji źródłem nieorganicznym (siarczanem Zn) i 31% ± 3% w przypadku suplementacji źródła organicznego (chelat Zn glicyny).

figure-results-1
Rysunek 1: Podsumowanie systematycznego podejścia do oceny dostępności minerałów przy użyciu metod uzupełniających. Podejście to wykorzystano do zbadania dostępności w łososiu atlantyckim, w tym specjacji Zn, rozpuszczalności Zn w środowisku jelitowym, wychwytu Zn przez komórki jelitowe i pozornej dostępności Zn. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Podsumowanie procedury ekstrakcji Zn z próbki paszy. jest ekstrahowany z próbki paszy w łagodnych warunkach ekstrakcji. Po ekstrakcji przeprowadza się analizę specjacji Zn. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Przykład komórek RTgutGC 1 h (po lewej) i 1 tydzień (po prawej) po wysianiu w kolbach do hodowli komórkowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Chromatogram przedstawiający piki zawierające Zn z rozpuszczalnej frakcji paszy dla łososia atlantyckiego i analizowany przez SEC-ICP-MS. Trzy repliki charakteryzują się niebieskimi, czerwonymi i czarnymi liniami. Kalibrację masy cząsteczkowej przeprowadzono przy użyciu tyreoglobuliny (660 kDa, monitorowanie 127I), dysmutazy ponadtlenkowej Zn/Cu (32 kDa, monitorowanie 66Zn), mioglobiny (17 kDa, monitorowanie 57Fe), witaminy B12 (1,36 kDa, monitorowanie 59Co); Szczyt 1 (P1): ~600 kDa, czas retencji (RT) 8,2 min; Szczyt 2+3 (P2+3): od 32 do 17 kDa, RT 14,2 + 15,3 min; Szczyt 4 (P4): od 17 do 1,36 kDa, RT 16,3 min; Szczyt 5 (P5): > 1,36 kDa, Rt 23,2 min. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Wpływ aminokwasów na rozpuszczalność in vitro suplementowanego Zn w paszy dla łososia atlantyckiego. Dane przedstawiono jako średnią ± SD (n = 3). Dane przeanalizowano za pomocą jednoczynnikowej ANOVA, a następnie przeprowadzono test wielokrotnych porównań Dunneta, porównując średnią każdej grupy AA z średnią grupy kontrolnej (nr AA). Gwiazdki oznaczają poziom istotności ANOVA (wartości P < 0,05 (*), < 0,01 (**), < 0,001 (***) i < 0,0001 (****)). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Wpływ metioniny i inhibitora transportu aminokwasów (kwas 2-aminobicyclo [2.2.1] heptano-2-karboksylowy, BCH, 10 mM). Dane przedstawiono jako średnią ± SD (n = 3). Dane analizowano za pomocą dwukierunkowej ANOVA, a następnie testu wielokrotnego porównania Tukeya z poziomem istotności p < 0,05. Różnice post-hoc między grupami są reprezentowane przez literę indeksu górnego nad słupkami; Słupki z różnymi indeksami górnymi różnią się statystycznie (p < 0,05). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ustawienia HPLC kolumna SEC kolumna
(30 cm x 7,8 mm, wielkość cząstek 5 μm) + kolumna ochronna (wielkość cząstek 7 μm) Zakres kalibracji 1.0 ×10 4 - 5.0 × 105 Da Faza ruchoma 50 mM Tris-HCl + 3% MeOH (pH 7,5) Przepływ 0,7 ml min−1 Objętość wtrysku 50 μL Ustawienia ICP–MS Moc przewodzenia 1550 W Przepływ gazu plazmowego 15,0 l min−1 Przepływ gazu nośnego 0,86 l min−1 Przepływ gazu do makijażu 0,34 l min−1 Czas przebywania 0,1 s na izotop Monitorowane izotopy 127I, 66Zn, 59Co, 57Fe

Tabela 1. Przegląd ustawień przyrządów dla HPLC i ICP-MS.

Skład chemiczny (mM) L15/ex Pożywka doświadczalna (L15/FW) azotan sodu Rozdział 155 Rozdział 155 Azotan potasu 6.2 6.2 Siarczan magnezu 3.8 19,5 Azotan wapnia 1,5 5.4 HEPESY 5 5 Chlorek magnezu - 15 Pirogronian sodu 5,7 5,7 galaktoza 5,7 5,7 ph 7,1 7,4 Siła jonowa Rozdział 178 Rozdział 258 Skład jonowy (mM) Wapń, Ca2+ * 1,6 ± 0,1 5,3 ± 0,2 Magnez, Mg2+ * 3,9 ± 0,3 32,5 ± 0,7 Potas, K+ * 8,2 ± 1,2 8,6 ± 1,1 Sód, Na+ * 160 ± 3 157 ± 2 Azotan, NO3- ** Rozdział 164 172,4 pkt. Siarczan, SO4- ** 3.8 Rozdział 18,7 Chlorek, Cl- ** 1,5 31,5 pkt.

Tabela 2. Skład chemiczny i jonowy badanych pożywek doświadczalnych.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wydaje się, że na wchłanianie jelitowe Zn ma wpływ forma chemiczna gatunku Zn13. W związku z tym zastosowanie protokołów opisanych w niniejszym artykule umożliwiło sekwencyjne badanie chemicznych i biologicznych aspektów leżących u podstaw "dostępności" Zn w łososiu atlantyckim.

W badaniu tym opisano zastosowanie metody analizy specjacji Zn. Metoda SEC-ICP-MS dostarczyła danych jakościowych dotyczących masy cząsteczkowej związków chemicznych Zn obecnych we frakcji rozpuszczalnej paszy dla łososia atlantyckiego. Osiągnięto to poprzez porównanie czasów retencji wzorców kalibracji masy cząsteczkowej (tj. tyreoglobuliny (660 kDa), dysmutazy ponadtlenkowej Zn/Cu (32 kDa), mioglobiny (17 kDa) i witaminy B12 (1,36 kDa)) z czasami retencji pików zawierających Zn. Wyzwaniem wykrytym w analizie specjacji Zn była identyfikacja nieznanego gatunku chemicznego Zn ze względu na brak standardów analitycznych. W SEC separacja cząsteczek opiera się na ich rozmiarach w stosunku do porów w fazie stacjonarnej. Zasadniczo większe cząsteczki będą poruszać się szybciej, najpierw eluując, a mniejsze cząsteczki będą podróżować wolniej, eluując później14. W związku z tym każdy pik zawierający Zn może zawierać kilka związków o podobnej masie cząsteczkowej15. Przyczynia się to również do wyzwania związanego z identyfikacją nieznanych związków chemicznych Zn. Ponadto przetestowano kilka łagodnych warunków ekstrakcji pod kątem ekstrakcji Zn. Wyekstrahowany Zn był niski (~10%). Zastosowano łagodne warunki ekstrakcji, aby utrzymać nienaruszoną substancję chemiczną Zn, ale mogło to zagrozić wydajności ekstrakcji7.

W teście rozpuszczalności in vitro rozpuszczalność uzupełnionego Zn (jako radioizotopu 65ZnCl2) wykazała, że aminokwasy, zwłaszcza histydyna i lizyna, zwiększają rozpuszczalność Zn (ryc. 5). Wykorzystanie próbek paszy bezpośrednio do testów rozpuszczalności in vitro w symulowanych warunkach żołądkowo-jelitowych opiera się na wiedzy, że zmiana specjacji Zn jest zależna od pH16. Jednak kwaśne warunki na początku przewodu pokarmowego mogą powodować pewne zmiany w specjacji, które mogą być nieodwracalne (np. ZnO -> ZnCl2 w obecności HCl w kwaśnych warunkach w żołądku). Niemniej jednak zastosowanym tutaj źródłem Zn jestZnSO4 , którego rozpuszczalność została poprawiona przez aminokwasy w pożywce. Kolejnym pytaniem, na które należało odpowiedzieć, było to, czy zwiększoną rozpuszczalność można przełożyć na dostępność? Do zbadania tego zagadnienia wykorzystano linię komórek jelitowych RTgutGC. W kontekście żywienia zwierząt w minerały termin "dostępność" jest trudny do zdefiniowania i może być regulowany inaczej w komórkach (in vitro) w porównaniu ze zwierzęciem (in vivo). W związku z tym termin "wychwyt" został użyty w odniesieniu do oceny in vitro z wykorzystaniem linii komórek jelitowych. Linia komórkowa dostarczyła użytecznych informacji na temat mechanizmów wychwytu Zn w nabłonku jelitowym, który jest częścią złożonego procesu regulacyjnego regulującego dostępność minerałów u zwierząt. Komórki RTgutGC wywołały lepszą zdolność do wierzchołkowego wychwytu Zn w obecności aminokwasu (tj. metioniny; Rysunek 6). Jednak pozorna dostępność in vivo nie różniła się istotnie między nieorganicznymi i organicznymi źródłami Zn w łososiu atlantyckim. W badaniu dostępności in vivo porównano źródło Zn przy poziomach Zn w diecie znacznie przekraczających znane zapotrzebowanie na Zn łososiaatlantyckiego 17, przy całkowitym stężeniu Zn wynoszącym 150 mg/kg paszy. Różnice w dostępności są lepiej uwidocznione, gdy badane poziomy diety mieszczą się w liniowym zakresie dynamiki, zanim zwierzę osiągnie saturację. W obecnym badaniu in vivo możliwe jest, że łosoś atlantycki był dobrze wysycony do obserwowanych różnic w absorpcji Zn między wykorzystanymi źródłami.

Podsumowując, pierwsza metoda dostarczyła informacji jakościowych dotyczących różnych związków chemicznych Zn występujących we frakcji rozpuszczalnej paszy dla łososia atlantyckiego; druga metoda, polegająca na poprawie rozpuszczalności in vitro suplementowanego Zn w obecności ligandów aminokwasowych; Trzecia metoda potwierdziła, że lepsza rozpuszczalność aminokwasów może poprawić wychwyt w nabłonku jelitowym; Z drugiej strony, czwarta metoda nie wykazała różnic w dostępności Zn ze źródła nieorganicznego lub organicznego dla łososia atlantyckiego. Podsumowując, protokoły in vitro, choć nie są zgodne z ustaleniami in vivo, dostarczyły interesujących informacji na temat zrozumienia różnych składników dostępności Zn.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wykonana w ramach projektu APREMIA (Pozorna dostępność i zapotrzebowanie na minerały w łososiu atlantyckim, grant nr 244490) finansowanego przez Norweską Radę ds. Badań Naukowych.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,45 &mikro; m filtr strzykawkowySartorius
0,45 μ m filtr membranowyPall
10 % płodowa surowica bydlęcaEurobio
1282 Compugamma Laboratory Gamma CounterLKB Wallac
24-dołkowe płytki (Falcon, mikropłytki TPP) Thermo Fisher Naukowy 
Kwas 2-aminobicyklo(2.2.1)heptano-2-karboksylowySigma Aldrich A7902
75 cm2 kolby do hodowli komórkowych (Falcon, TPP kolby do hodowli tkankowych)TPP Techno Plastic Products AG 90075
L-argininaSigma Aldrich A5006
Zestaw testowy BradfordWirówka Bio-Rad5000001
Wirówka Eppendorf 5702
L-cysteinaSigma Aldrich 30089
DL-metioninaAlfa Aesar59-51-8
D-metioninaSigma Aldrich M9375
Eksperymentalne pasze dla rybSkretting
GlycineSigma Aldrich 
Kolumna ochronna, TSKgel SWxl Typ (7 μ m wielkość cząstek)Tosoh
L-histydynaSigma Aldrich 53319
HPLC w połączeniu z 7500ce ICP-MSAgilent Technologies
Kwas solnyEmsure ACS, ISO, 37% w/w, Merck1.00317
Młyn nożowyGM 300, Retsch Gmbh
L-15 mediumInvitrogen/Gibco 
L-metionina Sigma Aldrich M9625
L-LizynaSigma Aldrich 23128
MetanolLiChrosolv, klasa HPLC, Merck 1.06035
Mili-Q woda (18.2  MΩ   cm) EMD Millipore Corporation
Mioglobina Sigma Aldrich M1882
NexION 350D ICP-MSPerkin Elmer
Pipeta Pasteur pH-metrVWR
 inoLab
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma Aldrich 
Ogniwa RTgutGC Otrzymane w naturze od profesor dr Kristin Schirmer, Wydziału Toksykologii Środowiskowej, Eawag, Szwajcarski Federalny Instytut Nauk i Technologii Wodnych, Szwajcaria Kolumna
SEC, TSKgel G3000SWxlTosoh
Sito ze stali nierdzewnej (850?μ m - 1,12?mm)Retsch
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Sigma Aldrich 
Dysmutaza ponadtlenkowa Sigma Aldrich S7571
Tyreoglobulina Sigma Aldrich T1001
Metanosulfonian trikainyPharmaQ
Tris(hydroksymetylo)aminometan Sigma Aldrich 
Trypsyna w 0,25% w roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowymBiowestL0910
Versene EDTA roztwórInvitrogen/Gibco15040-033
Witamina B12Sigma Aldrich V2876
Chelat glicynyFitobiotyki
SiarczanVilomix
1004876041022521083027806552436143252859

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Utilisation of feed resources in production of Atlantic salmon (Salmo salar) in Norway. Aquaculture. 448, 365-374 (2015).">Ytrestoyl, T., Aas, T. S., Asgard, T. Utilisation of feed resources in production of Atlantic salmon (Salmo salar) in Norway. Aquaculture. 448, 365-374 (2015).
  2. Evaluating dietary supply of microminerals as a premix in a complete plant ingredient-based diet to juvenile rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture Nutrition. 24 (1), 539-547 (2018).">Prabhu, P. A. J., et al. Evaluating dietary supply of microminerals as a premix in a complete plant ingredient-based diet to juvenile rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture Nutrition. 24 (1), 539-547 (2018).
  3. Zinc biochemistry: from a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in nutrition. 4 (1), Bethesda, MD. 82-91 (2013).">Maret, W. Zinc biochemistry: from a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in nutrition. 4 (1), Bethesda, MD. 82-91 (2013).
  4. Fish Physiology. Wood, C. M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. 31, Academic Press. 135-200 (2011).">Hogstrand, C. Fish Physiology. Wood, C. M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. 31, Academic Press. 135-200 (2011).
  5. Mineral nutrition and bone health in salmonids. Reviews in Aquaculture. , (2018).">Baeverfjord, G., et al. Mineral nutrition and bone health in salmonids. Reviews in Aquaculture. , (2018).
  6. Assessment of zinc status in juvenile Atlantic salmon (Salmo salar) by measurement of whole body and tissue levels of zinc. Aquaculture. 117 (1), 179-191 (1993).">Maage, A., Julshamn, K. Assessment of zinc status in juvenile Atlantic salmon (Salmo salar) by measurement of whole body and tissue levels of zinc. Aquaculture. 117 (1), 179-191 (1993).
  7. Speciation of zinc in fish feed by size exclusion chromatography coupled to inductively coupled plasma mass spectrometry – Using fractional factorial design for method optimization and mild extraction conditions. Journal of Chromatography B. , (2018).">Silva, M. S., Sele, V., Sloth, J. J., Araujo, P., Amlund, H. Speciation of zinc in fish feed by size exclusion chromatography coupled to inductively coupled plasma mass spectrometry – Using fractional factorial design for method optimization and mild extraction conditions. Journal of Chromatography B. , (2018).
  8. Zinc uptake in fish intestinal epithelial model RTgutGC: Impact of media ion composition and methionine chelation. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 50, 377-383 (2018).">Prabhu, A. J., et al. Zinc uptake in fish intestinal epithelial model RTgutGC: Impact of media ion composition and methionine chelation. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 50, 377-383 (2018).
  9. Apparent availability of zinc, selenium and manganese as inorganic metal salts or organic forms in plant-based diets for Atlantic salmon (Salmo salar). Aquaculture. 503, 562-570 (2019).">Silva, M. S., et al. Apparent availability of zinc, selenium and manganese as inorganic metal salts or organic forms in plant-based diets for Atlantic salmon (Salmo salar). Aquaculture. 503, 562-570 (2019).
  10. Simultaneous iron, zinc, sulfur and phosphorus speciation analysis of barley grain tissues using SEC-ICP-MS and IP-ICP-MS. Metallomics. 1 (5), 418-426 (2009).">Persson, D. P., Hansen, T. H., Laursen, K. H., Schjoerring, J. K., Husted, S. Simultaneous iron, zinc, sulfur and phosphorus speciation analysis of barley grain tissues using SEC-ICP-MS and IP-ICP-MS. Metallomics. 1 (5), 418-426 (2009).
  11. Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).">Lothian, A., Roberts, B. R. Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
  12. Effect of media composition on bioavailability and toxicity of silver and silver nanoparticles in fish intestinal cells (RTgutGC). Nanotoxicology. 10 (10), 1526-1534 (2016).">Minghetti, M., Schirmer, K. Effect of media composition on bioavailability and toxicity of silver and silver nanoparticles in fish intestinal cells (RTgutGC). Nanotoxicology. 10 (10), 1526-1534 (2016).
  13. Amino acid modulation of in vivo intestinal zinc absorption in freshwater rainbow trout. Journal of Experimental Biology. 205 (1), 151-158 (2002).">Glover, C. N., Hogstrand, C. Amino acid modulation of in vivo intestinal zinc absorption in freshwater rainbow trout. Journal of Experimental Biology. 205 (1), 151-158 (2002).
  14. Mass spectrometry: Instrumentation, interpretation, and applications. Wiley Series on Mass Spectrometry. Ekman, R. , John Wiley & Sons. 105-115 (2009).">Ekman, R. Mass spectrometry: Instrumentation, interpretation, and applications. Wiley Series on Mass Spectrometry. Ekman, R. , John Wiley & Sons. 105-115 (2009).
  15. A Review Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and Their Aggregates. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 35 (20), 2923-2950 (2012).">Hong, P., Koza, S., Bouvier, E. S. P. A Review Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and Their Aggregates. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 35 (20), 2923-2950 (2012).
  16. The biological inorganic chemistry of zinc ions. Archives of Biochemistry and Biophysics. 611, 3-19 (2016).">Krezel, A., Maret, W. The biological inorganic chemistry of zinc ions. Archives of Biochemistry and Biophysics. 611, 3-19 (2016).
  17. Nutrient Requirements of Fish and Shrimp. , The National Academies Press. (2011).">National Research Council. Nutrient Requirements of Fish and Shrimp. , The National Academies Press. (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mineral AvailabilityFish FeedsZinc UptakeAtlantic SalmonSize Exclusion ChromatographyInductively Coupled PlasmaIn Vitro MethodsIntestinal Cell LineAmino Acid ChelationMetalloproteins

Related Articles