Ten artykuł szczegółowo wyjaśnia systematyczne podejście do oceny dostępności mikrominerałów w łososiu atlantyckim. Metodologia obejmuje narzędzia i modele o rosnącej złożoności biologicznej: (1) analizę specjacji chemicznej, (2) rozpuszczalność in vitro, (3) badania absorpcji w liniach komórkowych oraz (4) badania in vivo na rybach.
Artykuł metodologiczny
Ocena dostępności minerałów w paszach dla ryb przy użyciu metod uzupełniających zademonstrowanych na przykładzie w łososiu atlantyckim
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ocena dostępności mikrominerałów w diecie jest głównym wyzwaniem w żywieniu mineralnym gatunków ryb. Niniejszy artykuł ma na celu opisanie systematycznego podejścia łączącego różne metodologie do oceny dostępności (Zn) w łososiu atlantyckim (Salmo salar). Biorąc pod uwagę, że w paszy dla łososia atlantyckiego może występować kilka związków chemicznych Zn, postawiono hipotezę, że na dostępność Zn mają wpływ obecne w paszy formy chemiczne Zn. Tak więc w tym badaniu pierwszy protokół dotyczy sposobu ekstrakcji różnych związków chemicznych Zn z paszy i analizowania ich metodą chromatografii wykluczającej z indukcyjnie sprzężoną spektroskopii mas plazmy (SEC-ICP-MS). Następnie opracowano metodę in vitro w celu oceny rozpuszczalności Zn w paszach dla łososia atlantyckiego. Trzeci protokół opisuje metodę badania wpływu zmiany składu chemicznego Zn na wychwyt Zn w modelu nabłonka jelitowego ryb przy użyciu linii komórkowej jelita pstrąga tęczowego (RTgutGC). Podsumowując, wyniki metod in vitro porównano z badaniem in vivo, w którym analizowano widoczną dostępność nieorganicznych i organicznych źródeł Zn uzupełnionych paszami dla łososia atlantyckiego. Wyniki pokazały, że w paszach można znaleźć kilka rodzajów chemicznych Zn, a wydajność organicznego źródła Zn zależy w dużej mierze od ligandu aminokwasowego używanego do chelatowania Zn. Wyniki badań in vitro wykazywały mniejszą korelację z wynikami badania in vivo. Niemniej jednak protokoły in vitro opisane w tym artykule dostarczyły kluczowych informacji na temat dostępności Zn i jego oceny w paszach dla ryb.
Wprowadzenie
Mączka rybna i olej rybny były tradycyjnie stosowane w paszy dla łososia atlantyckiego. Jednak składniki te są coraz częściej zastępowane składnikami pochodzenia roślinnego1. Wspomniana zmiana w składzie paszy spowodowała niską dostępność diety i zwiększone zapotrzebowanie na poprawę dostępności minerałów w paszach dla łososia atlantyckiego, zwłaszcza (Zn)2. Zmniejszona dostępność może wynikać ze zmiany poziomu Zn, związków chemicznych Zn lub czynników antyżywieniowych obecnych w matrycy paszowej. W tym scenariuszu pojawił się nowy szereg dodatków ogólnie uznawanych za "źródła organiczne", które mogą być lepiej dostępnym źródłem minerałów w diecie dla ryb. Dlatego ważne jest, aby zrozumieć podstawową chemię i fizjologię rządzącą dostępnością minerałów i ich źródeł dla ryb. jest niezbędnym pierwiastkiem śladowym dla wszystkich organizmów żywych3. Rola Zn jako cząsteczki sygnałowej została opisana zarówno na poziomie parakomórkowym, jak i wewnątrzkomórkowym w fish4. U łososia atlantyckiego niedobór Zn wiąże się z nieprawidłowościami szkieletowymi i zmniejszoną aktywnością różnych metaloenzymów Zn5,6.
To badanie opisuje systematyczne podejście do zrozumienia dostępności Zn poprzez kategoryzację go do czterech różnych przedziałów o zróżnicowanej złożoności chemicznej i biologicznej. Stosowane metody są opisane w czterech sekcjach, jak można zobaczyć w Rysunek 1: (1) ocena związków chemicznych Zn we frakcji rozpuszczalnej paszy dla łososia atlantyckiego przy użyciu chromatografii wykluczającej wielkość - spektroskopii mas ze sprzężoną indukcyjnie sprzężoną plazmą (SEC-ICP-MS)7; 2) rozpuszczalność in vitro suplementu Zn w paszy dla łososia atlantyckiego; (3) ocena absorpcji związków chemicznych Zn za pomocą modelu jelitowego in vitro (RTgutGC)8; oraz (4) pozorna dostępność Zn w łososiu atlantyckim (Salmo salar)9. Podobne protokoły można opracować dla innych minerałów (np. manganu, selenu, miedzi) o wartości odżywczej dla gatunków ryb akwakultury.
Protokół
Badanie żywieniowe opisane w sekcji 4 zostało przeprowadzone zgodnie z przepisami norweskimi (FOR-2015-06 - 18-761) oraz europejskimi (Dyrektywa 2010/63/EU).
1. Ocena form chemicznych Zn w frakcji rozpuszczalnej paszy dla łososia atlantyckiego przy użyciu metody SEC-ICP-MS
- Bufor ekstrakcyjny (100 mM Tris-HCl, pH 8,5)
- Przygotować bufor ekstrakcyjny, rozpuszczając odpowiednią ilość tris(hydroksymetyl)aminometanu w ultraczystej H2O, aby uzyskać pożądானą siłę jonową (100 mM).
- Dostosować pH roztworu do wartości 8,5 za pomocą roztworu HCl, monitorując zmianę pH za pomocą pH-metru.
- Przygotowanie próbek paszy
UWAGA: Wykorzystana próbka paszy została sformułowana na podstawie komercyjnej paszy dla łososia atlantyckiego, zawierającej źródła białka pochodzące głównie ze składników roślinnych (tj. około 5% białka rybiego, 10% oleju rybiego, 68% białka roślinnego i 12% oleju roślinnego). Do paszy dodano siarczan cynku.- Rozetrzeć ręcznie próbkę paszy, używając moździerza i tłuczka.
- Przesiać próbkę paszy, aby zapewnić przeprowadzenie ekstrakcji na frakcji paszy o podobnej wielkości cząstek (od 850 µm do 1,12 mm).
- Przejść do ekstrakcji Zn.
- Ekstrakcja cynku z próbki paszy
- Odważyć około 0,5 g paszy w trzech powtórzeniach do probówek stożkowych o pojemności 15 mL.
- Dodać do próbek bufor ekstrakcyjny (5 mL 100 mM Tris-HCl, pH 8,5).
- Ekstrahować próbki w rotatorze (20 rpm) w temperaturze 4 °C przez 24 h.
- Oddzielić frakcje rozpuszczalne i nierozpuszczalne poprzez wirowanie przez 10 min przy 3000 x g.
- Użyć jednorazowego filtra strzykawkowego 0,45 µm do przefiltrowania frakcji rozpuszczalnej.
- Przenieść przefiltrowane próbki do czystych probówek.
- Przeprowadzić analizę specjacji Zn we frakcjach rozpuszczalnych przy użyciu SEC-ICP-MS, zgodnie z opisem w kroku 1.6.
UWAGA: Podsumowanie procedury ekstrakcji Zn z próbki paszy przedstawiono na Rysunku 2.
- Roztwór fazy ruchomej (50 mM Tris-HCl + 3% MeOH, pH 7,5)
- Przygotować roztwór fazy ruchomej, rozpuszczając 6,057 g tris(hydroksymetyl)aminometanu w 1 L 3% roztworu MeOH (v/v).
- Dostosować pH roztworu do wartości 7,5 za pomocą roztworu HCl, monitorując zmianę pH za pomocą pH-metru.
- Przefiltrować roztwór fazy ruchomej przez filtr membranowy 0,45 μm.
- Kalibracja masy cząsteczkowej zakresu rozdziału kolumny SEC
- Zkalibrować zakres rozdziału, wykonując kalibrację masy cząsteczkowej.
UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystano tyreoglobulinę (660 kDa), dysmutazę ponadtlenkową Zn/Cu (32 kDa), mioglobinę (17 kDa) i witaminę B12 (1,36 kDa). - Przygotować każdy ze standardów o znanym stężeniu w ultraczystej H2O.
- Przygotować fiolkę do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), dodając do niej 250 µL standardu.
- Wprowadzić fiolki ze standardami do sekwencji pomiarowej próbek.
- Przeprowadzić kalibrację masy cząsteczkowej na początku i na końcu sekwencji analitycznej, monitorując 127I (tyreoglobulina), 66Zn (dysmutaza ponadtlenkowa Zn/Cu), 57Fe (mioglobina) oraz 59Co (witamina B12).
UWAGA: Kalibracja masy cząsteczkowej jest wykonywana jednocześnie z analizą specjacji Zn.
- Zkalibrować zakres rozdziału, wykonując kalibrację masy cząsteczkowej.
- Analiza specjacji cynku przy użyciu SEC-ICP-MS
UWAGA: Analiza specjacji Zn metodą SEC-ICP-MS została opracowana w oparciu o zasady opisane w innych publikacjach10,11, a następnie zoptymalizowana pod kątem analizy paszy dla łososia atlantyckiego7.- Przeprowadzić analizę specjacji Zn we frakcjach rozpuszczalnych, używając kolumny do chromatografii wykluczania rozmiarów (SEC) oraz układu HPLC sprzężonego ze spektrometrią mas z plazmą indukcyjnie sprzężoną (ICP-MS).
- Przygotować fiolkę HPLC, dodając do niej 250 µL frakcji rozpuszczalnej.
- Przed analizą wzbogacić wszystkie próbki 0,5 µL witaminą B12. Krok ten pozwala na korekcję przesunięć czasów retencji poprzez monitorowanie 59Co.
- Rozcieńczyć frakcję rozpuszczalną buforem ekstrakcyjnym (100 mM Tris-HCl, pH 8,5) i doprowadzić do końcowej objętości 1 mL.
- Przygotować sekwencję pomiarową próbek w kolejności losowej.
- Dostroić ICP-MS zgodnie z instrukcjami producenta.
- Zastosować ustawienia instrumentów dla HPLC i ICP-MS do przeprowadzenia analizy specjacji Zn (patrz Tabela 1).
2. Rozpuszczalność in vitro suplementowanego Zn w paszy dla łososia atlantyckiego
UWAGA: Użyta próbka paszy została sformułowana na podstawie komercyjnej paszy dla łososia atlantyckiego, zawierającej źródła białka pochodzące głównie ze składników roślinnych (tj. około 5% mączki rybnej, 10% oleju rybiego, 68% składników roślinnych i 12% oleju roślinnego).
- Zmielić próbki paszy dla łososia atlantyckiego przez 10 s przy 3000 rpm za pomocą młyna nożowego i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszych analiz.
- Odważyć ~0.2 g próbek paszy zmielonych w kroku 2.1 i dodać radioizotop Zn (65Zn) o znanej aktywności swoistej do probówki o pojemności 5 mL (z nakrętką).
UWAGA: Procedurę tę należy przeprowadzić w pomieszczeniu do pracy z radionuklidami. Osoba wykonująca ten krok powinna być przeszkolona i certyfikowana do pracy z izotopami promieniotwórczymi. Należy ściśle przestrzegać środków bezpieczeństwa i środków ostrożności zalecanych przez administrację ds. bezpieczeństwa radiologicznego instytutu. - Następnie przygotować bufor luminalny jelita dla ryb słodkowodnych zgodnie z poniższym opisem.
- W celu przygotowania roztworu soli A, odważyć 11.65 g NaNO3, 0.55 g KNO3 oraz 0.4 g MgSO4. Rozpuścić sole w ultra czystej H2O i doprowadzić do końcowej objętości 60 mL.
- W celu przygotowania roztworu soli B, odważyć 0.31 g Ca(NO3)2·4H2O. Rozpuścić sole w ultra czystej H2O i doprowadzić do końcowej objętości 10 mL.
- Jako roztwór soli C zastosować roztwór stokowy HEPES 500 mM.
- W celu przygotowania roztworu soli D, odważyć 1.2 g MgCl2, rozpuścić sól w ultra czystej H2O i doprowadzić do końcowej objętości 20 mL.
- W celu przygotowania roztworu soli E, odważyć 0.9 g MgSO4, rozpuścić sól w ultra czystej H2O i doprowadzić do końcowej objętości 20 mL.
- Przygotować roztwór pirogronianu, rozpuszczając 0.55 g CH3COCOONa w 10 mL ultra czystej H2O.
- Rozpuścić 0.9 g galaktozy (C6H12O6) w ultra czystej H2O.
- Dokładnie wymieszać za pomocą mieszadła magnetycznego; roztwory soli A, B, D i E wysterylizować w autoklawie, a roztwór C, pirogronian i galaktozę poprzez filtrację przez filtr strzykawkowy 200 µm.
- Po przygotowaniu poszczególnych roztworów stokowych, w celu sporządzenia 100 mL roztworu roboczego buforu, zmieszać powyższe roztwory w następujących proporcjach: 6.8 mL roztworu soli A, 4.14 mL B, 5 mL C, 2.5 mL D, 1.5 mL E oraz po 1.14 mL pirogronianu i galaktozy. Uzupełnić objętość do 100 mL wodą dejonizowaną.
UWAGA: Powyższy bufor reprezentuje skład jonowy światła jelit występujący u łososiowatych słodkowodnych.
- Przygotować sześć kolejnych alikwotów buforu opisanego w kroku 2.6 i dodać jeden z następujących aminokwasów (cysteiny, metioniny, glicyny, histydyny, lizyny i argininy), aby osiągnąć końcowe stężenie molowe 5 mM.
- Dodać bufor luminalny jelita dla ryb słodkowodnych (objętość reakcji = 3 mL; pH 7.4) do próbki paszy.
- Powtórzyć krok 2.5 z buforami opisanymi w 2.4 (w obecności różnych aminokwasów o stężeniu 5 mM).
- Zamknąć probówki i inkubować je w rotacyjnym mieszadle przez 30 min przy 25 rpm.
- Oddzielić frakcje rozpuszczalne i nierozpuszczalne poprzez wirowanie przez 10 min przy 1157 x g.
- Użyć licznika gamma do pomiaru liczby impulsów na minutę (cpm) 65Zn we frakcjach rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych.
- Obliczyć proporcję izotopów promieniotwórczych Zn (65Zn) obecnych we frakcjach rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych.
3. Ocena poboru chemicznych form Zn z wykorzystaniem modelu jelitowego in vitro (RTgutGC)
- Hodowla komórek RTgutGC
UWAGA: Wszystkie materiały robocze używane na tym etapie powinny być sterylne.- Ostrożnie rozmrozić zamrożone komórki RTgutGC w kąpieli wodnej ustawionej na 20 °C.
- Ostrożnie odpipetować roztwór zawierający komórki i zawiesić je w 10 mL pożywki L15 zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
UWAGA: 10% FBS jest stosowane wyłącznie do rozmrażania zamrożonych komórek. W kolejnych pasażach FBS stosuje się w stężeniu 5%. Skład FBS może się różnić między partiami, dlatego zaleca się zakup i zgromadzenie zapasu z jednej partii w ilości wystarczającej na cały okres badań, aby uniknąć zmienności międzypartyjnej w składzie surowicy. - Przenieść zawiesinę komórkową do kolb hodowlanych o powierzchni 75 cm2 i inkubować w inkubatorze ustawionym na 19 °C w normalnej atmosferze.
- Kontrolować stan komórek i po osiągnięciu konfluencji (80% konfluencji, oceniać wizualnie badając gęstość powierzchni komórek pod mikroskopem), przenieść komórki do nowych kolb (kolejny pasaż) lub zebrać do wykorzystania w eksperymentach.
UWAGA: Przykład komórek RTgutGC 1 h i 1 tydzień po wysianiu do kolb hodowlanych przedstawiono na Rysunku 3.
- Zbiór komórek i przygotowanie do eksperymentów z ekspozycją
- Przemyć komórki dwukrotnie 1 mL roztworu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Po każdym przemyciu odessać roztwór EDTA za pomocą sterylnej rurki ssącej.
- Potraktować komórki trypsyną (0,7 mL trypsyny w stężeniu 0,25% w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo [PBS]).
- Ostrożnie obracać kolbą pod ostrym kątem, aby rozprowadzić trypsynę po całej powierzchni kolby.
- Kontynuować obracanie przez 2 min, aż komórki się odkleją.
- Po 2 min delikatnego obracania dodać 10 mL pożywki L15/FBS w celu neutralizacji trypsyny.
- Przenieść powstałą zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej z dnem stożkowym za pomocą sterylnej pipety i wirować przez 3 min przy 130 x g.
- Określić gęstość zebranych komórek poprzez ręczne liczenie z użyciem hemocytometru.
- Dodać wymaganą objętość pożywki L15/FBS, aby uzyskać gęstość komórek 5 x 104 komórek/mL.
- Wysiać komórki na płytki 24-dołkowe, pipetując 1 mL zawiesiny komórkowej do każdego dołka, aby uzyskać końcową gęstość 5 x 104 komórek/dołek.
UWAGA: Zaleca się stosowanie pipet wielokrotnego dozowania, aby zminimalizować zmienność i skrócić czas pracy. - Umieścić wysiane płytki w inkubatorze w normalnej atmosferze w temperaturze 19 °C na 48 h przed rozpoczęciem eksperymentów.
UWAGA: Trypsynę przechowywać w -20 °C; roztwór EDTA i pożywki L15/FBS w 4 °C. Temperaturę wszystkich roztworów roboczych i pożywek dostosować do 19 °C bezpośrednio przed użyciem.
- Przygotowanie pożywek do ekspozycji
UWAGA: Ten etap musi być wykonany w dygestorium w warunkach aseptycznych i sterylnych.- Przygotować L15/ex, mieszając 6,8 mL roztworu soli A (krok 2.3.1), 1,14 mL B (krok 2.3.2), 5 mL C (krok 2.3.3) oraz po 1,14 mL pirogronianu (krok 2.3.6) i galaktozy (krok 2.3.7). Uzupełnić objętość do 100 mL sterylną wodą destylowaną klasy hodowlanej.
- Przygotować FW, mieszając 6,8 mL roztworu soli A (2.3.1), 4,14 mL B (2.3.2), 5 mL C (2.3.3), 2,5 mL D (2.3.4), 1,5 mL E (2.3.5) oraz po 1,14 mL pirogronianu (2.3.6) i galaktozy (2.3.7). Uzupełnić objętość do 100 mL sterylną wodą destylowaną klasy hodowlanej.
- Oznaczyć stężenia jonów w pożywkach do ekspozycji za pomocą ICP-MS zgodnie z opisem w innym opracowaniu12.
UWAGA: Stężenia jonowe przeanalizowane w przygotowanych pożywkach przedstawiono w Tabeli 2.
- Testy napływu cynku (65Zn)
- Wysiać komórki RTgutGC na płytki 24-dołkowe (5 x 104 komórek/dołek) w pełnej pożywce L15/FBS.
- Inkubować przez 48 h w inkubatorze w normalnej atmosferze w temperaturze 19 °C.
- Dostosować pH wszystkich przygotowanych pożywek eksperymentalnych do pH 7,4 za pomocą 0,5 M NaOH w obecności lub braku L-metioniny (L-Met) lub DL-metioniny (DL-Met) w stężeniu 2 mM.
UWAGA: Regulację pH buforów opisanych w punkcie 3.4.3 należy przeprowadzić bezpośrednio przed potraktowaniem komórek w kroku 3.4.5. - Po zakończeniu okresu inkubacji usunąć pożywkę z dołków i dokładnie wypłukać PBS.
- Dodać eksperymentalne pożywki FW z dostosowanym pH i pozostawić na 20 min w celu aklimatyzacji.
- Poddać komórki RTgutGC ekspozycji na nominalne stężenia 3,07, 6,14, 12,27 i 24,55 µM 65Zn(II) (jako ZnCl2; ~4 kBq/mL) w pożywkach opisanych w kroku 3.4.3.
- Następnie natychmiast utrzymać komórki w inkubatorze w 19 °C przez 15 min.
- Po zakończeniu 15-minutowej inkubacji odessać nadsącz hodowlany z dołka.
- Przepłukać komórki lodowatą pożywką FW (z 200 µM Zn, pH 7,4), a następnie przeprowadzić quenching, dodając bufor 5 mM glikolu etylenowego-bis(β-aminoetylu eteru)-N,N,N',N'-tetraoctowego (EGTA) (pH 7,4) na 5 min, aby usunąć zaadsorbowany 65Zn(II).
- Poddać komórki ekspozycji na powyższe preparaty pożywek w obecności lub braku 10 mM kwasu 2-aminobicyklo[2.2.1]heptano-2-karboksylowego (BCH), inhibitora transportu aminokwasów.
- Po 15-minutowym okresie ekspozycji powtórzyć kroki 3.4.8 i 3.4.9.
- Komórki RTgutGC będą przylegać do dna dołków w formie monowarstwy. Przetrawić komórki, używając 0,2% gorącego detergentu dodecylosiarczanu sodu (SDS) (100 µL/dołek).
UWAGA: Roztwór SDS należy umieścić na 1 h w kąpieli wodnej ustawionej na 90 ˚C przed użyciem. - Odessać i odzyskać digest komórkowy do probówki 1,5 mL.
- Zmierzyć radioaktywność digestów komórkowych za pomocą licznika gamma.
UWAGA: Liczbę zliczeń na minutę (cpm) należy skorygować o rozpad promieniotwórczy oraz tło, a następnie poddać obliczeniom aktywności swoistej zgodnie z formułami opisanymi przez Glovera i Hogstranda13. - W celu ilościowego oznaczenia stężenia białek w komórkach, zhomogenizować komórki z 500 µL 0,5 M NaOH.
- Użyć zestawu do testu Bradforda w celu pomiaru stężenia białek w próbce komórkowej, stosując albuminę surowicy bydlęcej (BSA) jako standard.
UWAGA: Po oznaczeniu stężenia białek szybkość poboru Zn przez komórki RTgutGC można wyrazić jako pmoles Zn min-1 mg-1 białka.
4. Pozorna dostępność pokarmowego Zn u łososia atlantyckiego (Salmo salar)
UWAGA: Pasze dla łososia atlantyckiego zostały sformułowane na podstawie pasz komercyjnych, zawierających źródła białka pochodzące głównie ze składników roślinnych (t.j. około 5% białka rybiego, 10% oleju rybiego, 68% białka roślinnego i 12% oleju roślinnego). Dwie pasze zostały uzupełnione nieorganicznym źródłem (siarczan Zn) lub organicznym źródłem (chelat Zn z glicyną), aby uzyskać stężenie Zn na poziomie 150 mg/kg paszy. Dodatkowo do paszy dodano tlenek itru (klasy paszowej) w ilości 0,01% jako marker obojętny, aby umożliwić obliczenie pozornego współczynnika przyswajalności.
- Aklimatyzuj łososia atlantyckiego (szczep SalmoBreed, wiek 1+ rok, grupy mieszane płciowo) w odpowiednich zbiornikach do czasu przyzwyczajenia ryb do warunków eksperymentalnych.
- Oceń aklimatyzację łososia atlantyckiego poprzez monitorowanie dziennego spożycia paszy.
UWAGA: Próba ta została przeprowadzona w trzech powtórzeniach w zbiornikach, zatem łącznie wykorzystano sześć zbiorników. Podczas próby żywieniowej temperatura wody wynosiła 11,9 ± 0,3 °C, a nasycenie tlenem rozpuszczonym wynosiło 101 ± 5%. - Karmij ryby paszami eksperymentalnymi przez 11 dni.
- Uśmierć ryby poprzez przedawkowanie, stosując 6 mL roztworu stokowego metansulfonianu trikainy na litr wody.
- Zbierz zbiorczą próbkę kału od ryb z tego samego zbiornika na płytkę, wykonując wycieranie od płetwy brzusznej do odbytu.
- Przenieś kał z płytki za pomocą szpatułki do probówki stożkowej 50 mL i natychmiast przechowuj próbki w temperaturze -20 °C.
UWAGA: Próbki były przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu dalszej analizy. - Liofilizuj próbki kału przez 72 h w temperaturze -80 °C.
- Homogenizuj ręcznie próbkę kału do postaci drobnego proszku, używając moździerza i tłuczka.
- Oznacz stężenie Zn i itru w próbkach paszy i kału za pomocą ICP-MS (zgodnie z opisem w innym opracowaniu9).
- Oblicz pozorny współczynnik dostępności (AAC, %) korzystając z poniższego wzoru:
Wyniki
Ocena form chemicznych Zn w frakcji rozpuszczalnej paszy dla łososia atlantyckiego przy użyciu metody SEC-ICP-MS
Metoda SEC-ICP-MS dostarcza danych na temat form chemicznych Zn występujących w frakcji rozpuszczalnej paszy dla łososia atlantyckiego. Rycina 4 przedstawia profil chromatograficzny Zn znalezionego w frakcji rozpuszczalnej. Chromatogram ten uzyskano za pomocą metody SEC-ICP-MS. W frakcjach rozpuszczalnych paszy dla łososia atlantyckiego zidentyfikowano pięć pików zawierających Zn. Każdy pik ma inną masę cząsteczkową: pik pierwszy (~ 600 kDa), pik drugi i pik trzeci (od 32 do 17 kDa), pik czwarty (od 17 do 1,36 kDa) oraz pik piąty (> 1,36 kDa). Najliczniejszy był pik czwarty, a następnie kolejno pik drugi, trzeci, piąty i pierwszy. Formy chemiczne Zn obecne w frakcji rozpuszczalnej mogą pochodzić z różnych źródeł, ponieważ stosowana pasza zawiera składniki pochodzenia morskiego i roślinnego oraz formę suplementacyjną (tj. siarczan Zn). Zakres masy cząsteczkowej form chemicznych Zn sugeruje, że związki te mogą być metaloproteinami.
Rozpuszczalność in vitro suplementowanego Zn w paszy dla łososia atlantyckiego
Rozpuszczalność suplementowanego 65Zn wzrosła w obecności aminokwasów. Wszystkie przetestowane aminokwasy zwiększyły rozpuszczalność suplementowanego 65Zn. Metionina, glicyna, cysteina, histydyna i lizyna poprawiły rozpuszczalność 65Zn; wyższą rozpuszczalność odnotowano w przypadku histydyny i lizyny (Rysunek 5).
Ocena poboru form Zn z wykorzystaniem modelu jelitowego in vitro (RTgutGC)
Apikalny pobór cynku w komórkach RTgutGC był istotnie modyfikowany przez obecność L-Met lub DL-Met w stężeniach 2 mM. Ponadto wpływ metioniny na pobór Zn w komórkach RTgutGC był negatywnie oddziaływany przez obecność BCH (blokera systemu transportu aminokwasów) w porównaniu z komórkami niepoddanymi działaniu BCH (Rysunek 6).
Pozorna dostępność cynku (Zn) w diecie łososia atlantyckiego (Salmo salar)
W praktycznych paszach dla łososia atlantyckiego pozorna dostępność Zn była taka sama przy suplementacji źródłem nieorganicznym (siarczan Zn) lub źródłem organicznym (chelat Zn z glicyną). Szacowane wartości pozornej dostępności Zn (%, n = 3) u łososia atlantyckiego wynosiły 31% ± 12% przy suplementacji źródłem nieorganicznym (siarczan Zn) oraz 31% ± 3% przy suplementacji źródłem organicznym (chelat Zn z glicyną).
Rysunek 1: Podsumowanie systematycznego podejścia do oceny dostępności minerałów z wykorzystaniem metod komplementarnych. Podejście to zostało zastosowane do badania dostępności Zn u łososia atlantyckiego, obejmując specjację Zn, rozpuszczalność Zn w środowisku jelitowym, wchłanianie Zn przez komórki jelitowe oraz pozorną dostępność Zn. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Podsumowanie procedury ekstrakcji Zn z próbki paszy. Cynk jest ekstrahowany z próbki paszy w łagodnych warunkach ekstrakcji. Po ekstrakcji przeprowadzana jest analiza specjacji Zn. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Przykład komórek RTgutGC 1 h (lewo) i 1 tydzień (prawo) po wysianiu do kolb hodowlanych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Chromatogram przedstawiający piki zawierające Zn z frakcji rozpuszczalnej paszy dla łososia atlantyckiego, analizowanej metodą SEC-ICP-MS. Trzy powtórzenia są oznaczone liniami niebieską, czerwoną i czarną. Kalibracja masy cząsteczkowej została przeprowadzona z użyciem tyroglobuliny (660 kDa, monitorowanie 127I), dysmutazy ponadtlenkowej Zn/Cu (32 kDa, monitorowanie 66Zn), mioglobiny (17 kDa, monitorowanie 57Fe) oraz witaminy B12 (1,36 kDa, monitorowanie 59Co); Pik 1 (P1): ~600 kDa, czas retencji (RT) 8,2 min; Pik 2+3 (P2+3): od 32 do 17 kDa, RT 14,2 + 15,3 min; Pik 4 (P4): od 17 do 1,36 kDa, RT 16,3 min; Pik 5 (P5): > 1,36 kDa, RT 23,2 min. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 5: Wpływ aminokwasów na rozpuszczalność in vitro suplementowanego Zn w karmie dla łososia atlantyckiego. Dane przedstawiono jako średnia ± SD (n = 3). Dane analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu porównań wielokrotnych Dunnetta, porównując średnią każdej grupy AA ze średnią grupy kontrolnej (brak AA). Gwiazdki oznaczają poziom istotności ANOVA (wartości P < 0,05 (*), < 0,01 (**), < 0,001 (***) i < 0,0001 (****)). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 6: Wpływ metioniny i inhibitora transportu aminokwasów (kwas 2-aminobicyklo [2.2.1] heptano-2-karboksylowy, BCH, 10 mM). Dane przedstawiono jako średnia ± SD (n = 3). Dane przeanalizowano za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu wielokrotnych porównań Tukeya z poziomem istotności p < 0,05. Różnice post-hoc między grupami przedstawiono jako litery nad słupkami; słupki z różnymi literami różnią się istotnie statystycznie (p < 0,05). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Ustawienia HPLC | |
| Kolumna | kolumna SEC (30 cm x 7,8 mm, 5 µm wielkość cząstek) + kolumna ochronna (7 µm wielkość cząsteczek) |
| Zakres kalibracji | 1.0 × 104 - 5.0 × 105 Da |
| Faza ruchoma | 50 mM Tris-HCl + 3% MeOH (pH 7,5) |
| Przepływ | 0,7 ml/min−1 |
| Objętość iniekcji | 50 μL |
| Ustawienia ICP–MS | |
| Moc przednia | 1550 W |
| Przepływ gazu plazmowego | 15,0 l/min−1 |
| Przepływ gazu nośnego | 0,86 l/min−1 |
| Przepływ gazu uzupełniającego | 0,34 L min-1−1 |
| Czas przebywania | 0,1 s na izotop |
| Monitorowane izotopy | 127Ja, 66Zn, 59Co, 57Fe |
Tabela 1. Przegląd ustawień aparatury dla HPLC i ICP-MS.
| Skład chemiczny (mM) | L15/ex | Pożywka eksperymentalna (L15/FW) |
| Azotan sodu | 155 | 155 |
| Azotan potasu | 6.2 | 6.2 |
| Siarczan magnezu | 3.8 | 19.5 |
| Azotan wapnia | 1.5 | 5.4 |
| HEPES | 5 | 5 |
| Chlorek magnezu | - | 15 |
| Pirowinian sodu | 5.7 | 5.7 |
| Galaktoza | 5.7 | 5.7 |
| pH | 7.1 | 7.4 |
| Siła jonowa | 178 | 258 |
| Skład jonowy (mM) | ||
| Wapń, Ca2+ * | 1.6 ± 0.1 | 5.3 ± 0.2 |
| Magnez, Mg2+ * | 3.9 ± 0.3 | 32.5 ± 0.7 |
| Potas, K+ * | 8.2 ± 1.2 | 8.6 ± 1.1 |
| Sód, Na+ * | 160 ± 3 | 157 ± 2 |
| Azotan, NO3- ** | 164 | 172.4 |
| Siarczan, SO₄²⁻4- ** | 3.8 | 18.7 |
| Chlorek, Cl- ** | 1.5 | 31.5 |
Tabela 2. Skład chemiczny i jonowy testowanych mediów eksperymentalnych.
Dyskusja
Wydaje się, że na wchłanianie jelitowe Zn ma wpływ forma chemiczna gatunku Zn13. W związku z tym zastosowanie protokołów opisanych w niniejszym artykule umożliwiło sekwencyjne badanie chemicznych i biologicznych aspektów leżących u podstaw "dostępności" Zn w łososiu atlantyckim.
W badaniu tym opisano zastosowanie metody analizy specjacji Zn. Metoda SEC-ICP-MS dostarczyła danych jakościowych dotyczących masy cząsteczkowej związków chemicznych Zn obecnych we frakcji rozpuszczalnej paszy dla łososia atlantyckiego. Osiągnięto to poprzez porównanie czasów retencji wzorców kalibracji masy cząsteczkowej (tj. tyreoglobuliny (660 kDa), dysmutazy ponadtlenkowej Zn/Cu (32 kDa), mioglobiny (17 kDa) i witaminy B12 (1,36 kDa)) z czasami retencji pików zawierających Zn. Wyzwaniem wykrytym w analizie specjacji Zn była identyfikacja nieznanego gatunku chemicznego Zn ze względu na brak standardów analitycznych. W SEC separacja cząsteczek opiera się na ich rozmiarach w stosunku do porów w fazie stacjonarnej. Zasadniczo większe cząsteczki będą poruszać się szybciej, najpierw eluując, a mniejsze cząsteczki będą podróżować wolniej, eluując później14. W związku z tym każdy pik zawierający Zn może zawierać kilka związków o podobnej masie cząsteczkowej15. Przyczynia się to również do wyzwania związanego z identyfikacją nieznanych związków chemicznych Zn. Ponadto przetestowano kilka łagodnych warunków ekstrakcji pod kątem ekstrakcji Zn. Wyekstrahowany Zn był niski (~10%). Zastosowano łagodne warunki ekstrakcji, aby utrzymać nienaruszoną substancję chemiczną Zn, ale mogło to zagrozić wydajności ekstrakcji7.
W teście rozpuszczalności in vitro rozpuszczalność uzupełnionego Zn (jako radioizotopu 65ZnCl2) wykazała, że aminokwasy, zwłaszcza histydyna i lizyna, zwiększają rozpuszczalność Zn (ryc. 5). Wykorzystanie próbek paszy bezpośrednio do testów rozpuszczalności in vitro w symulowanych warunkach żołądkowo-jelitowych opiera się na wiedzy, że zmiana specjacji Zn jest zależna od pH16. Jednak kwaśne warunki na początku przewodu pokarmowego mogą powodować pewne zmiany w specjacji, które mogą być nieodwracalne (np. ZnO -> ZnCl2 w obecności HCl w kwaśnych warunkach w żołądku). Niemniej jednak zastosowanym tutaj źródłem Zn jestZnSO4 , którego rozpuszczalność została poprawiona przez aminokwasy w pożywce. Kolejnym pytaniem, na które należało odpowiedzieć, było to, czy zwiększoną rozpuszczalność można przełożyć na dostępność? Do zbadania tego zagadnienia wykorzystano linię komórek jelitowych RTgutGC. W kontekście żywienia zwierząt w minerały termin "dostępność" jest trudny do zdefiniowania i może być regulowany inaczej w komórkach (in vitro) w porównaniu ze zwierzęciem (in vivo). W związku z tym termin "wychwyt" został użyty w odniesieniu do oceny in vitro z wykorzystaniem linii komórek jelitowych. Linia komórkowa dostarczyła użytecznych informacji na temat mechanizmów wychwytu Zn w nabłonku jelitowym, który jest częścią złożonego procesu regulacyjnego regulującego dostępność minerałów u zwierząt. Komórki RTgutGC wywołały lepszą zdolność do wierzchołkowego wychwytu Zn w obecności aminokwasu (tj. metioniny; Rysunek 6). Jednak pozorna dostępność in vivo nie różniła się istotnie między nieorganicznymi i organicznymi źródłami Zn w łososiu atlantyckim. W badaniu dostępności in vivo porównano źródło Zn przy poziomach Zn w diecie znacznie przekraczających znane zapotrzebowanie na Zn łososiaatlantyckiego 17, przy całkowitym stężeniu Zn wynoszącym 150 mg/kg paszy. Różnice w dostępności są lepiej uwidocznione, gdy badane poziomy diety mieszczą się w liniowym zakresie dynamiki, zanim zwierzę osiągnie saturację. W obecnym badaniu in vivo możliwe jest, że łosoś atlantycki był dobrze wysycony do obserwowanych różnic w absorpcji Zn między wykorzystanymi źródłami.
Podsumowując, pierwsza metoda dostarczyła informacji jakościowych dotyczących różnych związków chemicznych Zn występujących we frakcji rozpuszczalnej paszy dla łososia atlantyckiego; druga metoda, polegająca na poprawie rozpuszczalności in vitro suplementowanego Zn w obecności ligandów aminokwasowych; Trzecia metoda potwierdziła, że lepsza rozpuszczalność aminokwasów może poprawić wychwyt w nabłonku jelitowym; Z drugiej strony, czwarta metoda nie wykazała różnic w dostępności Zn ze źródła nieorganicznego lub organicznego dla łososia atlantyckiego. Podsumowując, protokoły in vitro, choć nie są zgodne z ustaleniami in vivo, dostarczyły interesujących informacji na temat zrozumienia różnych składników dostępności Zn.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca została wykonana w ramach projektu APREMIA (Pozorna dostępność i zapotrzebowanie na minerały w łososiu atlantyckim, grant nr 244490) finansowanego przez Norweską Radę ds. Badań Naukowych.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,45 &mikro; m filtr strzykawkowy | Sartorius | ||
| 0,45 μ m filtr membranowy | Pall | ||
| 10 % płodowa surowica bydlęca | Eurobio | ||
| 1282 Compugamma Laboratory Gamma Counter | LKB Wallac | ||
| 24-dołkowe płytki (Falcon, mikropłytki TPP) | Thermo Fisher Naukowy | ||
| Kwas 2-aminobicyklo(2.2.1)heptano-2-karboksylowy | Sigma Aldrich | A7902 | |
| 75 cm2 kolby do hodowli komórkowych (Falcon, TPP kolby do hodowli tkankowych) | TPP Techno Plastic Products AG | 90075 | |
| L-arginina | Sigma Aldrich | A5006 | |
| Zestaw testowy Bradford | Wirówka Bio-Rad | 5000001 | |
| Wirówka Eppendorf 5702 | |||
| L-cysteina | Sigma Aldrich | 30089 | |
| DL-metionina | Alfa Aesar | 59-51-8 | |
| D-metionina | Sigma Aldrich | M9375 | |
| Eksperymentalne pasze dla ryb | Skretting | ||
| Glycine | Sigma Aldrich | ||
| Kolumna ochronna, TSKgel SWxl Typ (7 μ m wielkość cząstek) | Tosoh | ||
| L-histydyna | Sigma Aldrich | 53319 | |
| HPLC w połączeniu z 7500ce ICP-MS | Agilent Technologies | ||
| Kwas solny | Emsure ACS, ISO, 37% w/w, Merck | 1.00317 | |
| Młyn nożowy | GM 300, Retsch Gmbh | ||
| L-15 medium | Invitrogen/Gibco | ||
| L-metionina | Sigma Aldrich | M9625 | |
| L-Lizyna | Sigma Aldrich | 23128 | |
| Metanol | LiChrosolv, klasa HPLC, Merck | 1.06035 | |
| Mili-Q woda (18.2 MΩ cm) | EMD Millipore Corporation | ||
| Mioglobina | Sigma Aldrich | M1882 | |
| NexION 350D ICP-MS | Perkin Elmer | ||
| Pipeta Pasteur pH-metr | VWR | ||
| inoLab | |||
| Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Sigma Aldrich | ||
| Ogniwa RTgutGC | Otrzymane w naturze od profesor dr Kristin Schirmer, Wydziału Toksykologii Środowiskowej, Eawag, Szwajcarski Federalny Instytut Nauk i Technologii Wodnych, Szwajcaria Kolumna | ||
| SEC, TSKgel G3000SWxl | Tosoh | ||
| Sito ze stali nierdzewnej (850?μ m - 1,12?mm) | Retsch | ||
| Dodecylosiarczan sodu (SDS) | Sigma Aldrich | ||
| Dysmutaza ponadtlenkowa | Sigma Aldrich | S7571 | |
| Tyreoglobulina | Sigma Aldrich | T1001 | |
| Metanosulfonian trikainy | PharmaQ | ||
| Tris(hydroksymetylo)aminometan | Sigma Aldrich | ||
| Trypsyna w 0,25% w roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym | Biowest | L0910 | |
| Versene EDTA roztwór | Invitrogen/Gibco | 15040-033 | |
| Witamina B12 | Sigma Aldrich | V2876 | |
| Chelat glicyny | Fitobiotyki | ||
| Siarczan | Vilomix |
Bibliografia
- Ytrestoyl, T., Aas, T. S., Asgard, T. Utilisation of feed resources in production of Atlantic salmon (Salmo salar) in Norway. Aquaculture. 448, 365-374 (2015).
- Prabhu, P. A. J., et al. Evaluating dietary supply of microminerals as a premix in a complete plant ingredient-based diet to juvenile rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture Nutrition. 24 (1), 539-547 (2018).
- Maret, W. Zinc biochemistry: from a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in nutrition. 4 (1), Bethesda, MD. 82-91 (2013).
- Hogstrand, C. Fish Physiology. Wood, C. M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. 31, Academic Press. 135-200 (2011).
- Baeverfjord, G., et al. Mineral nutrition and bone health in salmonids. Reviews in Aquaculture. , (2018).
- Maage, A., Julshamn, K. Assessment of zinc status in juvenile Atlantic salmon (Salmo salar) by measurement of whole body and tissue levels of zinc. Aquaculture. 117 (1), 179-191 (1993).
- Silva, M. S., Sele, V., Sloth, J. J., Araujo, P., Amlund, H. Speciation of zinc in fish feed by size exclusion chromatography coupled to inductively coupled plasma mass spectrometry – Using fractional factorial design for method optimization and mild extraction conditions. Journal of Chromatography B. , (2018).
- Prabhu, A. J., et al. Zinc uptake in fish intestinal epithelial model RTgutGC: Impact of media ion composition and methionine chelation. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 50, 377-383 (2018).
- Silva, M. S., et al. Apparent availability of zinc, selenium and manganese as inorganic metal salts or organic forms in plant-based diets for Atlantic salmon (Salmo salar). Aquaculture. 503, 562-570 (2019).
- Persson, D. P., Hansen, T. H., Laursen, K. H., Schjoerring, J. K., Husted, S. Simultaneous iron, zinc, sulfur and phosphorus speciation analysis of barley grain tissues using SEC-ICP-MS and IP-ICP-MS. Metallomics. 1 (5), 418-426 (2009).
- Lothian, A., Roberts, B. R. Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
- Minghetti, M., Schirmer, K. Effect of media composition on bioavailability and toxicity of silver and silver nanoparticles in fish intestinal cells (RTgutGC). Nanotoxicology. 10 (10), 1526-1534 (2016).
- Glover, C. N., Hogstrand, C. Amino acid modulation of in vivo intestinal zinc absorption in freshwater rainbow trout. Journal of Experimental Biology. 205 (1), 151-158 (2002).
- Ekman, R. Mass spectrometry: Instrumentation, interpretation, and applications. Wiley Series on Mass Spectrometry. Ekman, R. , John Wiley & Sons. 105-115 (2009).
- Hong, P., Koza, S., Bouvier, E. S. P. A Review Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and Their Aggregates. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 35 (20), 2923-2950 (2012).
- Krezel, A., Maret, W. The biological inorganic chemistry of zinc ions. Archives of Biochemistry and Biophysics. 611, 3-19 (2016).
- National Research Council. Nutrient Requirements of Fish and Shrimp. , The National Academies Press. (2011).
Przedruki i uprawnienia
