Izolacja komórek nabłonka śliny z ludzkich gruczołów ślinowych do wzrostu in vitro w postaci ślikul lub monowarstw

Podsumowanie

Prezentujemy metodę izolowania i hodowli pierwotnych komórek nabłonkowych pochodzących z ludzkich gruczołów ślinowych. Komórki te wykazują wzorce ekspresji genów zgodne z tym, że pochodzą z nabłonka śliny i mogą być hodowane jako salisfery na matrycach błony podstawnej pochodzących z komórek nowotworowych Engelbreth-Holm-Swarm lub jako monowarstwy na traktowanych szalkach hodowlanych.

Streszczenie

Gruczoły ślinowe są miejscem o dużym zainteresowaniu badaczy zainteresowanych wieloma aspektami chorób ludzkich. Jednym z celów naukowców jest przywrócenie funkcji gruczołów uszkodzonych przez radioterapię lub z powodu patologii związanych z zespołem Sjögrena. Drugim celem naukowców jest zdefiniowanie mechanizmów, za pomocą których wirusy replikują się w tkance gruczołowej, gdzie mogą uzyskać dostęp do płynów ślinowych ważnych dla transmisji poziomej. Cele te podkreślają potrzebę solidnego i dostępnego modelu gruczołów ślinowych in vitro, który może być wykorzystany przez badaczy zainteresowanych wyżej wymienionymi, jak również pokrewnymi obszarami badawczymi. Tutaj omawiamy prosty protokół izolowania komórek nabłonkowych z ludzkich gruczołów ślinowych i rozmnażania ich in vitro. Nasz protokół może być dalej optymalizowany, aby sprostać potrzebom poszczególnych badań. Krótko mówiąc, tkanka ślinowa jest oddzielana mechanicznie i enzymatycznie w celu wyizolowania pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek. Selekcja komórek nabłonkowych odbywa się poprzez posiew na macierzy błony podstawnej w obecności pożywki zoptymalizowanej pod kątem wzrostu komórek nabłonkowych. Powstałe w ten sposób kultury mogą być utrzymywane jako trójwymiarowe skupiska, zwane "salisferami", lub hodowane jako monowarstwa na poddanych działaniu tworzywa sztucznego szalkach do hodowli tkankowych. Protokół ten powoduje wzrost niejednorodnej populacji głównie komórek nabłonkowych, które mogą być rozmnażane przez 5-8 pasaży (15-20 podwojeń populacji) przed przejściem starzenia komórkowego.

Wprowadzenie

U ssaków gruczoły ślinowe są zorganizowane w 3 pary głównych gruczołów ślinowych: śliniankę, śliniankę podżuchwową i gruczoły podjęzykowe. Istnieje również szereg mniejszych gruczołów zlokalizowanych na języku i rozsianych po całej jamie ustnej¹. Główne gruczoły są odpowiedzialne za dużą objętość produkowanej śliny². Oprócz zapewnienia ochrony przeciwbakteryjnej poprzez wydzielane czynniki, ślina jest ważna w procesie żucia i smarowania pokarmu, gdy przechodzi przez przełyk². W związku z tym dysfunkcja gruczołów ślinowych stanowi problem medyczny, w którym osoby cierpiące, które nie są w stanie wytworzyć wystarczającej ilości śliny, są bardziej podatne na rozwój chorób, takich jak ubytki w zębach lub kandydoza jamy ustnej³. Dodatkowo zmniejszona ilość śliny powoduje większe trudności w jedzeniu i trawieniu pokarmów, co ma znaczący wpływ na jakość życia.

Dysfunkcja gruczołów ślinowych występuje głównie u pacjentów cierpiących na zespół Sjögrena, chorobę autoimmunologiczną, lub u pacjentów z rakiem głowy i szyi, którzy przeszli radioterapię^3,4,5,6. Uszkodzone acini wydzielnicze w obrębie gruczołów w wyniku autoimmunizacji lub radioterapii nie ulegają samoodnowie, co powoduje, że pacjent żyje z nieodwracalnymi uszkodzeniami⁶. Badania nad gruczołami ślinowymi również przyciągnęły uwagę badaczy zainteresowanych mechanizmami patogenezy wirusa. Niektóre patogeny, takie jak ludzki wirus cytomegalii (HCMV), uporczywie replikują się w gruczołach ślinowych, co następnie umożliwia przeniesienie powstającego wirusa do nowego gospodarza za pośrednictwem śliny^7,8. W związku z tym istnieje niezaspokojona potrzeba opracowania solidnych i powtarzalnych modeli in vitro tkanki gruczołów ślinowych w celu rozwiązania i zrozumienia różnorodnych problemów medycznych.

Kilka modeli systemu mysich gruczołów ślinowych zostało wykorzystanych jako punkt wyjścia do zrozumienia i scharakteryzowania różnych komórek nabłonkowych, które tworzą gruczoły ślinowe^9,10. Istnieją oczywiste i główne różnice między ludzkimi i mysimi gruczołami ślinowymi¹¹. Przede wszystkim ludzka ślinianka przyuszna jest większa w stosunku do ślinianki podżuchwowej, podczas gdy mysz podżuchwowa i ślinianka przyuszna są znacznie podobne pod względem wielkości^1,2,11. Chociaż istnieją unieśmiertelnione ludzkie linie komórkowe podżuchwowe, istnieją poważne obawy, że unieśmiertelnione komórki nie utrzymują dokładnie fenotypu pierwotnej tkanki i drugorzędne obawy, że unieśmiertelnione komórki nie pochodzą w rzeczywistości z samego nabłonka śliny¹². Z tych powodów istnieje zainteresowanie i potrzeba zbadania pierwotnej tkanki ślinowej od ludzi.

Tutaj opisujemy protokół izolacji pierwotnych komórek nabłonkowych z ludzkich gruczołów ślinowych do hodowli tkankowej. Nasz protokół jest oparty na pracach Pringle'a i wsp. oraz Trana i wsp., z modyfikacjami wprowadzonymi w celu ogólnego uproszczenia ich procedur^13,14. Po pierwsze, podczas gdy protokół Trana i wsp. wymaga długiej, pięciogodzinnej inkubacji w celu enzymatycznego trawienia tkanki ślinowej, nasz zmodyfikowany protokół okazał się skuteczny przy zaledwie jednogodzinnej inkubacji, podobnie jak w przypadku Pringle i wsp. Po drugie, używamy różnych enzymów do trawienia tkanek, w szczególności nie używamy trypsyny, jak to jest używane w oryginalnym protokole Tran i wsp., ale zamiast tego używamy mieszaniny dypazy i kolagenazy. Wolimy unikać trypsyny w początkowych etapach trawienia, ponieważ ostatnie badania sugerują, że początkowe trawienie tkanki ślinowej przez trypsynę powoduje zmniejszoną żywotność komórek, prawdopodobnie przez utratę rzadkiej populacji komórek macierzystych¹⁵. Na koniec hodujemy salisfery na powierzchni macierzy błony podstawnej (BMM) przy użyciu komercyjnie dostępnej pożywki pierwotnie opracowanej do namnażania komórek nabłonka oskrzeli. Nasz protokół może być stosowany do izolowania komórek śliny z ślinianek przyusznych, podżuchwowych i podjęzykowych. Komórki te wyrażają amylazę ślinową i inne geny specyficzne dla śliny, co wskazuje, że utrzymują fenotyp podobny do komórek nabłonka groniastego śliny⁷. Udało nam się wygenerować posiewy śliny z >50 pierwotnych próbek tkanek ludzkich przy użyciu tej metodologii. Co więcej, pierwotne komórki śliny można łatwo poddać krioprezerwacji do wykorzystania w późniejszym terminie.

Protokół

Te protokoły i badania zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Institutional Review Board na Uniwersytecie w Cincinnati (Federal-wide Assurance #00003152, IRB protocol 2016-4183). Tkanka ślinowa jest powszechnie wycinana w wielu zabiegach chirurgicznych głowy i szyi i zwykle nie jest zaangażowana w proces złośliwy. Zazwyczaj świeżo wyciętą tkankę gruczołu ślinowego wykorzystuje się w ciągu 2-4 godzin po usunięciu od pacjenta (Ryc. 1A).

1. Przygotowanie odczynnika

1. Pożywka do wzrostu komórek nabłonka oskrzeli (BEGM)
   1. Dodaj komponenty z zestawu dostarczonego przez producenta (patrz tabela materiałów).
   2. Umyj każdą probówkę raz za pomocą pożywki bazowej, aby zapewnić pełne przeniesienie składników. Następnie dodaj pozbawioną węgla węgla płodową surowicę bydlęcą, aby uzyskać końcowe stężenie 4% surowicy.
2. Bufor do lizy krwinek czerwonych (RBC)
   1. Aby przygotować 10x bulion, dodaj 40,15 g NH₄Cl, 5,0 g NaHCO₃ i 0,186 g kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i doprowadź do końcowej objętości 200 ml za pomocą dH₂O. Następnie przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   2. Przed użyciem rozcieńczyć do stężenia roboczego 1x w sterylnym_dH2O.
3. Rozwiązanie do dysocjacji
   1. Do 100 ml butelki z roztworem dypazy (patrz Tabela Materiałów) dodać 0,15 g kolagenazy typu III. Po całkowitym rozpuszczeniu kolagenazy przefiltrować wysterylizować nowy roztwór i podwielokrotność. Przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Trawienie tkanek

1. Używając płytki do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm, mechanicznie rozdrobnij tkankę na drobne kawałki o wielkości ~1-2 mm za pomocą sterylizowanych w autoklawie nożyczek preparacyjnych i kleszczy chirurgicznych (Rysunek 1B, C). Tkanka łączna między kawałkami powinna zostać przecięta, aby zapewnić odpowiednią separację i łatwość w dalszych krokach.
2. Dodać 6 ml roztworu dypazy/kolagenazy do tkanki mielonej. Następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez około 30 minut do 1 godziny.
3. Przerwać tkankę, pipetując pipetą serologiczną o pojemności 5 ml 15-20 razy.
4. Inkubować w temperaturze 37 °C przez kolejne 30 minut do 1 godziny.
5. Powtórz kroki 2.3 i 2.4 jeszcze dwa-trzy razy lub do momentu, gdy tkanka zacznie przypominać zawiesinę i będzie mogła łatwo przejść przez otwór pipety ( Rysunek 1D).
   nuta: Początkowy rozmiar próbki tkanki i stopień rozdrobnienia tkanki określą, ile razy należy powtórzyć kroki 2.3 i 2.4. Zazwyczaj otrzymujemy tkankę o wymiarach około 1 cm x 1 cm. Dodatkowo można monitorować dysocjację tkanek za pomocą standardowego mikroskopu do odwróconych kultur tkankowych, aby śledzić postęp dysocjacji komórek z tkanki. Małe skupiska komórek są idealne do początkowego wzrostu komórek ślinowych w postaci salkul.

3. Powlekanie studni matrycą membranową podstaw

UWAGA: Matryca membrany podstawnej (BMM) powinna być rozmrożona przez noc w temperaturze 4 °C na dzień przed jej użyciem. Po rozmrożeniu BMM powinien być stale przechowywany na lodzie lub w temperaturze 4 °C, ponieważ w wyższych temperaturach szybko zestala się (tj. tworzy żel). Ponadto należy zachować ostrożność, jeśli próbki zostały schłodzone na lodzie przed posiewem na BMM, ponieważ zimne próbki "stopią" BMM i wystawią komórki na działanie plastikowego naczynia.

1. Powoli pipetować BMM (patrz Tabela Materiałów) do każdej studzienki, która ma być pokryta. Równomiernie i powoli rozprowadź BMM na studni.
   UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, używamy 500 μl na każdy dołek płytki sześciodołkowej, ale objętość tę można dostosować do użycia na innych wariantach płytek, takich jak 12-dołkowe lub 24-dołkowe, lub w razie potrzeby dla grubszych lub cieńszych hydrożeli.
2. Inkubować powlekane płytki w temperaturze 37 °C przez co najmniej 15 minut przed użyciem, aby umożliwić BMM zestalenie się.

4. Filtrowanie niestrawionej tkanki, liza RBC i posiewanie komórek

1. Przenieść homogenat tkankowy z etapu 2,5 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umyj płytkę raz 6 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco w celu przeniesienia pozostałych komórek.
2. Przefiltrować homogenat do stożkowej probówki o pojemności 50 ml przez sitko do komórek z nylonowej siatki o średnicy 70 μm, aby usunąć niestrawioną tkankę. Odcedzone komórki odwirowywać przez 5 minut przy 500 x g.
3. Rozcieńczyć 10x bufor do lizy RBC w sterylnym dH₂O, aby uzyskać 1x roztwór roboczy.
4. Odessać supernatant. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w 10 ml 1x buforu do lizy RBC. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
5. Dodaj 20-25 ml DPBS, aby zneutralizować bufor do lizy RBC i zminimalizować lizę komórek śliny. Wirować przez 5 minut przy 500 x g.
   UWAGA: Po leczeniu buforem do lizy RBC osad komórkowy powinien być biały. Czerwony kolor w granulkach oznacza, że nie wszystkie RBC zostały w pełni zmielone. W razie potrzeby powtórz kroki od 4.4 do 4.5, aby uzyskać całkowitą lizę wszystkich RBC.
6. Odessać supernatant. Ponownie zawiesić osad w 1-2 ml BEGM na studzienkę, a następnie umieścić zawieszone komórki w studzienkach pokrytych BMM. Inkubować w temperaturze 37 °C.
7. Po posianiu na BMM komórki uformują się w kuliste struktury lub "salisfery" w ciągu 2-3 dni. Komórki mogą być utrzymywane jako salisfery przez około 5-7 dni, zanim BMM zacznie ulegać degradacji, umożliwiając komórkom dostęp i przyleganie do plastiku i wzrost jako monowarstwa.

5. Hodowla salisfer i utrzymanie na BMM

1. Odessać pożywkę z dołków, następnie dodać 1 ml roztworu dypazy/kolagenazy do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C przez ~15 minut lub do momentu, gdy BMM w większości się rozpuści.
2. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i przemyj studzienki raz DPBS, aby uzyskać pozostałe komórki. Wirować przez 5 minut przy 500 x g.
3. Odessać supernatant. Zawiesić osad w 2 ml trypsyny, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
4. Zneutralizuj trypsynę za pomocą dowolnej kompletnej pożywki zawierającej 10% surowicy. Wirować przez 5 minut przy 500 x g.
5. Odessać supernatant. Ponownie zawieś komórki w DPBS, aby usunąć resztki pożywki, trypsynę i surowicę. Wirować przez 5 minut przy 500 x g.
6. Odessać supernatant. Ponownie zawiesić w BEGM i umieścić zawieszone komórki na zestalonych szalkach hodowlanych pokrytych BMM. Zawieszone komórki można również posiewać bezpośrednio na szalkach poddanych działaniu kultur komórkowych w celu proliferacji jako monowarstwa. Więcej informacji na temat wzrostu komórek ślinowych w postaci monowarstwowej, patrz punkt 6. Komórki wyhodowane na BMM lub na plastiku powinny być karmione świeżym BEGM co 2-3 dni.
7. Hodować komórki w wilgotnym inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .

6. Hodowla salisfer na potraktowanych plastikowych naczyniach do hodowli tkanek

UWAGA: Jeśli utrzymujesz komórki jako monowarstwę na plastiku, zacznij od tego kroku. Poniższy protokół dotyczy komórek rosnących w naczyniu o średnicy 100 mm.

1. Zassać media. Umyj raz DPBS, aby usunąć resztki mediów.
2. Dodać 2 ml trypsyny, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut lub do całkowitego odłączenia komórek.
3. Zneutralizuj trypsynę za pomocą 4 ml dowolnej kompletnej pożywki zawierającej 10% surowicy. Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
4. Umyć płytkę raz około 5 ml DPBS w celu zebrania pozostałych komórek. Wirować przez 5 minut przy 500 x g.
5. Odessać supernatant. Ponownie zawieś komórki w 6-10 ml DPBS, aby usunąć resztki pożywki.
6. Wirować przez 5 minut przy 500 x g.
7. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w BEGM. Umieść komórki na poddanych działaniu środka plastikowych szalkach do hodowli tkankowych. Karm świeżym BEGM co 2-3 dni.
8. Hodować komórki w wilgotnym inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .

7. Kriokonserwacja komórek

UWAGA: Kriokonserwacja komórek może być wykonana z pojedynczej zawiesiny komórkowej pochodzącej zarówno z komórek salisfery, jak i z komórek hodowanych jednowarstwowo.

1. Policz komórki na hematocytometrze, aby obliczyć całkowitą ilość obecnych komórek.
2. Wirować przez 5 minut przy 500 x g.
3. Odessać supernatant. Zawiesić osad w BEGM z 10% dimetylosulfotlenkiem (DMSO). Koncentracja komórek powinna wynosić od 2 x 10⁶ komórek/ml do 10 x 10⁶ komórek/ml.
4. Podwielokrotne komórki do sterylnych kriogenicznych probówek do przechowywania. Umieść probówki w izolowanym stojaku piankowym i inkubuj w temperaturze -80 °C przez noc, aby powoli zamrozić komórki.
5. Następnego dnia umieść probówki w ciekłym azocie w celu długotrwałego przechowywania.
   UWAGA: Komórki należy szybko rozmrozić w temperaturze 37 °C. Po rozmrożeniu komórki należy granulować w ilości 500 x g, a pożywkę zawierającą DMSO usunąć przed posiewem.

Wyniki

Dwa do trzech dni po wysianiu komórek z trawionej tkanki na BMM, komórki szybko zaczną tworzyć małe skupiska, które będą nadal zwiększać swój rozmiar, osiągając od 15 do 20 komórek na skupisko (Rysunek 2A). Zazwyczaj widoczne są resztki komórkowe oraz oddzielone martwe komórki, które należy usunąć poprzez aspirację i uzupełnienie świeżym medium. Komórki będą nadal proliferować w formie salisfer przez około 3-10 dni lub tak długo, jak warstwa BMM pozostanie ni...

Dyskusja

Dysfunkcja śliny stanowi problem dla jakości życia osób cierpiących na zespół Sjögrena, a także osób poddawanych radioterapii z powodu nowotworów sąsiadujących z gruczołami ślinowymi 3,4,5,16. Jedną z proponowanych terapii w leczeniu tych pacjentów jest hodowla funkcjonalnych komórek macierzystych śliny lub organoidów in vitro, które można następnie wprowadzić do uszkodzonego gruczołu ślinowego...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Naczynia hodowlane 100 mm	Thermo Scientific 172931
Probówki stożkowe 15 ml	Thermo Scientific	339651
Rurki stożkowe 50 ml	Thermo Scientific	339653
Bronchial Epithelial Cell Growth Media	Lonza	CC-3171	Dodaj zestaw pocisków zgodnie z instrukcjami producenta. Uzupełnij 20 ml surowicy pozbawionej węgla drzewnego.
Sitko do komórek 70 i mikro; m siatka nylonowa	Fisher	22-363-548
Węgiel pozbawiony płodowej surowicy bydlęcej	Gibco	12676-029
Kolagenaza typu III	Worthington	LS004182	Przechowywać w 4 & st. C.
Rurka kriogeniczna	Fisher	5000-0020
Zastosowania komórek	do dyspazy	07923	Rozpuść kolagenazę, aby uzyskać 0,15% (w/v) zapasu. Filtruj sterylizację, a następnie przechowuj w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Nożyczki preparacyjne	Fisher	08-940
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco	Corning	55-031-PC
General Chemicals	Sigma
PathClear Ekstrakt z błony podstawnej	Cultrex	3432-005-01	Rozmrozić w 4 & stopni; C co najmniej 24 godziny przed użyciem. Zawsze obchodź się z lodem.
Sześciodołkowe naczynia	hodowlane Falcon	353046
Kleszcze chirurgiczne	Fisher	22-079-742
Roztwór trypsyny-EDTA	Corning	25-052-CI