Opracowanie modeli ksenoprzeszczepów i pierwszorzędowych linii komórkowych pochodzących od pacjentów z rakiem żołądka

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje metody tworzenia modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta (PDX) i pierwotnych linii komórek rakowych z próbek chirurgicznego raka żołądka. Metody te stanowią użyteczne narzędzie do opracowywania leków i badań w zakresie biologii nowotworów.

Streszczenie

Wykorzystanie modeli przedklinicznych do poszerzenia naszego zrozumienia biologii nowotworów i zbadania skuteczności środków terapeutycznych jest kluczowe dla badań nad rakiem. Chociaż istnieje wiele uznanych linii komórkowych raka żołądka i wiele konwencjonalnych transgenicznych modeli myszy do badań przedklinicznych, wady tych modeli in vitro i in vivo ograniczają ich zastosowania. Ponieważ cechy tych modeli zmieniły się w kulturze, nie modelują one już heterogeniczności guza, a ich odpowiedzi nie były w stanie przewidzieć reakcji u ludzi. W związku z tym opracowywane są alternatywne modele, które lepiej reprezentują heterogeniczność guza. Modele ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX) zachowują histologiczny wygląd komórek nowotworowych, zachowują niejednorodność wewnątrznowotworową i lepiej odzwierciedlają istotne ludzkie składniki mikrośrodowiska guza. Jednak opracowanie modelu PDX zajmuje zwykle 4-8 miesięcy, co jest czasem dłuższym niż oczekiwane przeżycie wielu pacjentów z żołądkiem. Z tego powodu ustalenie pierwotnych linii komórek nowotworowych może być skuteczną metodą uzupełniającą badania odpowiedzi na leki. Obecny protokół opisuje metody ustalania modeli PDX i pierwotnych linii komórek rakowych na podstawie próbek chirurgicznego raka żołądka. Metody te stanowią użyteczne narzędzie do opracowywania leków i badań nad biologią nowotworów.

Wprowadzenie

Rak żołądka jest piątym najczęściej występującym nowotworem na świecie i trzecią najczęstszą przyczyną zgonów z powodu raka. W 2018 roku na całym świecie zdiagnozowano ponad 1 000 000 nowych przypadków raka żołądka, a szacuje się, że 783 000 osób zostało zabitych przez tę chorobę¹. Zachorowalność i śmiertelność z powodu raka żołądka pozostają bardzo wysokie w krajach Azji Północno-Wschodniej^2,3. Pomimo znacznego postępu w dziedzinie terapii przeciwnowotworowych, rokowania pacjentów z zaawansowanym rakiem żołądka pozostają złe, a pięcioletni wskaźnik przeżycia wynosi około 25%^4,5,6,7,. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania nowych strategii terapeutycznych w raku żołądka

Leczenie raka żołądka jest wyzwaniem ze względu na jego wysoką heterogeniczność^8,9. Tak więc, pytanie o to, jak poradzić sobie z wyzwaniami związanymi z heterogenicznością nowotworów, aby realizować medycynę precyzyjną, jest kluczowe dla badań nad rakiem. Modele in vitro i in vivo odgrywają kluczową rolę w wyjaśnianiu heterogenicznych mechanizmów i biologii raka żołądka. Jednakże, chociaż istnieje wiele linii komórkowych raka żołądka i wiele konwencjonalnych transgenicznych modeli myszy do badań przedklinicznych, wady tych modeli ograniczają ich zastosowania¹⁰. Ponieważ cechy tych modeli zmieniły się w kulturze, nie modelują one już heterogeniczności guza, a ich odpowiedzi nie były w stanie przewidzieć reakcji u ludzi¹¹. Kwestie te poważnie ograniczają możliwość identyfikacji podgrup pacjentów onkologicznych, które zareagują na leki celowane. Krótkoterminowa hodowla guzów pierwotnych zapewnia stosunkowo szybki i spersonalizowany sposób badania przeciwnowotworowych właściwości farmakologicznych, które prawdopodobnie będą znakiem rozpoznawczym spersonalizowanego leczenia raka.

Ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX) są preferowane jako alternatywny model przedkliniczny do profilowania odpowiedzi na leki¹². Ponadto modele PDX oferują potężne narzędzie do badania inicjacji i progresji raka^13,14. Modele PDX zachowują histologiczny wygląd komórek nowotworowych, zachowują heterogeniczność wewnątrznowotworową i lepiej odzwierciedlają istotne ludzkie składniki mikrośrodowiska guza^15,16. Jednak ograniczeniem szeroko stosowanych modeli PDX jest niski wskaźnik sukcesu w tworzeniu i seryjnym rozmnażaniu ludzkich guzów litych. W tym badaniu opisano przyzwoicie skuteczne metody tworzenia modeli PDX i pierwotnych linii komórkowych.

Protokół

To badanie na ludziach zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Oceny Etyki Sun Yat-sen University Cancer Center (SYSUCC, Guangzhou, Chiny). Badanie na zwierzętach zostało zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Sun Yat-sen. Uwaga: wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z odpowiednimi przepisami i wytycznymi instytucjonalnymi, w tym z wytycznymi dotyczącymi ochrony przed narażeniem zawodowym przed patogenami przenoszonymi przez krew.

1. Przygotowanie próbki

1. Pobrać tkanki raka żołądka (P0 = pasaż 0) bezpośrednio z operacji. Próbka guza powinna być większa niż 0,5 cm³.
2. Przygotuj 3-4 ml roztworu podstawowego: na przykład pożywkę RPMI-1640 (1x) uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U/ml penicyliny i 0,1 mg/ml streptomycyny.
3. Umieścić świeżą próbkę guza w roztworze podstawowym w temperaturze 4 °C na nie dłużej niż 4 godziny.

2. Ustanowienie modelu PDX (Rysunek 1)

1. Aby zapewnić sterylne pole operacyjne, należy dezynfekować wszystkie materiały światłem ultrafioletowym przez ponad 30 minut przed przeniesieniem do laboratorium dla zwierząt.
   Uwaga: salę operacyjną należy zdezynfekować światłem ultrafioletowym przez 30 minut, zanim wyczyścimy biurko środkiem dezynfekującym supozytoria kwasu dichloroizocyjanurowego. Następnie powidon-jod jest używany do dezynfekcji skóry.
2. Za pomocą kleszczy i nożyczek ostrożnie wypreparuj tkanki nowotworowe i przytnij je na kilka małych kawałków (około 1 mm³ kostki) w sterylnych warunkach.
3. Znieczulenie samic myszy NOD-SCID-IL2rg (NSG) w wieku od 5 do 7 tygodni przez wystawienie na działanie 1-1,5% izofluranu za pomocą aparatu do znieczulenia.
   1. Znieczulaj mysz, aż przestanie się szarpać, ale utrzyma równomierny oddech.
      UWAGA: Probówka o pojemności 50 ml to prosty sprzęt, który działa podobnie do aparatu do znieczulenia. Stosowanie weterynaryjnej maści do oczu, aby zapobiec wysuszeniu, nie jest konieczne ze względu na krótki czas działania.
4. Wykonaj 1 cm nacięcie na obu bokach grzbietu za pomocą sterylnych nożyczek i wszczep jeden kawałek guza w każdy bok myszy.
   1. Aby upewnić się, że kawałek guza nie wysunie się, użyj sterylnych kleszczy, aby rozbić tkankę podskórną. Następnie przytnij kawałek tkanki nowotworowej i umieść go w głębokim miejscu.
5. Zamknij obszar implantu szwem podskórnym za pomocą igieł chirurgicznych do szwów i oznacz uszy myszy oznaczonymi kolczykami
6. Wysterylizuj ranę jodem.
7. Po operacji delikatnie umieść myszy w pustej klatce, zachowując leżącą mostek. Zwróć szczególną uwagę na stan myszy; Budzą się i zaczynają chodzić około 3-4 minuty później. Umieść myszy, które przeszły operację, w innej nowej klatce, oddzielone od tych, które nie zostały poddane operacji.
8. Oceń wielkość guza za pomocą badania palpacyjnego miejsca implantacji. Mierz guzy suwmiarką z noniuszem dwa razy w tygodniu.
9. Gdy guz osiągnie średnicę 10 mm, stan zwierzęcia pogarsza się lub guz owrzodzenia, należy poddać mysz eutanazji metodą zatwierdzoną przez IRB. Reimplantacja pobranych świeżych fragmentów guza do 2 nowych myszy w celu pasażowania lub tymczasowe przechowywanie próbek w PBS na lodzie w celu wyizolowania pierwotnych linii komórkowych.

3. Kriokonserwacja tkanek

UWAGA: Ta część odnosi się głównie do metod stosowanych w zestawie Cryo Kit do żywych tkanek. Główne zestawy i wyposażenie są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Poddaj myszy eutanazji metodą zatwierdzoną przez IRB, gdy guz ma średnicę większą niż 10 mm.
2. Za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek powoli izoluj guz od myszy.
3. Umyj tkanki nowotworowe za pomocą DPBS w naczyniu o średnicy 10 cm. Wypreparuj i usuń martwicze obszary, tkankę tłuszczową, skrzepy krwi i tkankę łączną za pomocą kleszczy i nożyczek.
4. Wytnij tkanki nowotworowe do maksymalnej grubości 1 mm za pomocą formy.
5. Umyj plastry z DPBS w naczyniu o średnicy 10 cm.
   UWAGA: Proces witryfikacji polega na użyciu probówek oznaczonych V1/V2/V3 w krokach 3.6-3.8. Głównymi składnikami są DMSO i sacharoza.
6. Przenieść plastry do probówki V1 za pomocą kleszczyków i inkubować probówkę w temperaturze 4 °C przez 4 minuty. Zwinąć i krótko odwrócić probówkę, a następnie umieścić ją w temperaturze 4 °C na kolejne 4 minuty.
7. Wlej roztwór V1 i plastry do naczynia o średnicy 10 cm. Przenieść plastry do probówki V2 za pomocą kleszczyków i inkubować probówkę V2 w temperaturze 4 °C przez 4 minuty. Zwiń i odwróć rurkę na krótko, a następnie umieść ją w temperaturze 4 °C na kolejne 4 minuty.
8. Wlej roztwór V2 i plastry do naczynia o średnicy 10 cm. Przenieść plastry do probówki V3 za pomocą kleszczyków i inkubować probówkę w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Zwinąć i krótko odwrócić probówkę i umieścić ją w temperaturze 4 °C na co najmniej 5 minut. Upewnij się, że wszystkie plastry opadają na dno tuby.
   1. Jeżeli kilka plasterków pozostaje na wodzie, zwinąć i na krótko odwrócić rurkę, a następnie ponownie umieścić probówkę w temperaturze 4 °C, aż wszystkie plastry całkowicie opadną; jeśli to konieczne, wyrzucić pływające plastry
   .
9. Wlej roztwór V3 i plastry do naczynia o średnicy 10 cm.
10. Przytnij uchwyty na chusteczki do odpowiedniej długości i umieść je na sterylnej gazie. Przełóż plastry na uchwyty. Owiń uchwyty gazą i umieść je w ciekłym azocie za pomocą kleszczy, a następnie inkubuj przez 5 minut.
11. Oznacz fiolki kriogeniczne informacjami o tkankach.
12. Przenieś posiadacze z plastrami tkanek do fiolek kriogenicznych, które są przechowywane w ciekłym azocie.

4. Izolacja komórek pierwotnych (Rysunek 2)

1. Sterylizować kleszcze i nożyczki parą pod wysokim ciśnieniem w temperaturze 121 °C przez 30 min.
2. Wyciąć próbki raka żołądka z wyciętych próbek lub pobranych tkanek PDX. Umieść tkanki na lodzie, a następnie przenieś je do sterylnego naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm.
3. Wypreparuj i usuń martwicze obszary, tkankę tłuszczową, skrzepy krwi i tkankę łączną za pomocą kleszczy i nożyczek.
4. Umyj tkanki nowotworowe raz DPBS zawierającym 100 U/ml penicyliny i 0,1 mg/ml streptomycyny w naczyniu o średnicy 10 cm.
5. Pokrój tkankę nowotworową na 1 mm³ kawałki na pokrywie naczynia; maksymalna grubość każdego kawałka powinna wynosić 1 mm.
6. Przenieść tkanki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml z około 7 ml roztworu kolagenazy typu 1 i trypsyny (1:14). Krótko zmieszaj mieszaninę.
7. Inkubować probówkę w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 30-40 minut. Mieszać mieszaninę co 5 minut.
8. Dodaj równą objętość pożywki RPMI-1640 (1x) uzupełnionej o 10% FBS do probówki. Dokładnie wymieszaj mieszaninę.
9. Przenieść mieszaninę do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml przez powolną filtrację przez filtr 40 μm.
   UWAGA: Użyj filtrów 40 μm, aby zapewnić wyższy stosunek komórek rakowych. W razie potrzeby można zastosować filtry 100 μm do zachowania większej liczby typów komórek, takich jak komórki immunologiczne.
10. Odwirować filtraty przy 113-163 x g przez 5-7 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant.
11. Przemyć osad 5 ml PBS i ostrożnie usunąć supernatant.
12. Jeśli osad jest czerwony, zawiera wiele erytrocytów. Delikatnie zawiesić osad z 500 μl buforu do lizy czerwonych krwinek. Po 5 minutach inkubacji dodać 5 ml PBS i ostrożnie usunąć supernatant.
13. Zawiesić osad z pożywką hodowlaną i przenieść mieszaninę do sterylnego naczynia o średnicy 10 cm.
14. Zastąp pożywkę pożywką zawierającą surowicę co 2-3 dni.
15. Przejdź przez komórki pierwotne za pomocą trypsyny/EDTA, gdy osiągną 50% konfluencji.

Wyniki

W tym przypadku tkanki nowotworowe pobrane podczas operacji przechowywano w roztworze zapasowym do momentu wykonania kolejnego kroku. W ciągu 4 godzin tkanki nowotworowe pocięto na małe fragmenty i wszczepiono w okolice grzbietowe myszy NSG, które znieczulono za pomocą waty nasączonej izofluranem. Guzy o objętości przekraczającej 1 cm³ można było wyciąć w celu wszczepienia nowym myszom (Rycina 1) lub ostrożnie pokroić i przechować w ciekłym azocie zgodnie z protokołem. W niniejszy...

Dyskusja

Rak żołądka jest agresywną chorobą o ograniczonych możliwościach terapeutycznych; W ten sposób modele raka żołądka stały się kluczowym zasobem umożliwiającym funkcjonalne badania naukowe z bezpośrednim przełożeniem na praktykę kliniczną ^4,8,17. W tym miejscu opisaliśmy metody i protokół tworzenia modeli PDX raka żołądka i pierwotnych linii komórkowych. Co ważne, zarówno cechy morfologiczne, jak i biologiczne wycinków raka żołądk...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
40 μ m Sitko do komórek	Biologix, Shandong, Chiny	15-1040
Mikroskop biologiczny	OLYMPUS, Tokio, Japonia	Wirówka OLYMPUS CKX41
	Eppendorf, Mittelsachsen, Niemcy.	5427R
	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, Kalifornia, USA	HERACELL 150i
DPBS	Basalmedia Technology, Szanghaj, Chiny	L40601
Elektrotermostatyczna szafka na wodę	Yiheng, Szanghaj, Chiny	DK-8AXX
Płodowa surowica bydlęca	Biotechnologia żubrów, Vancouver, Kanada	86150040
Isoflurane	Baxter, Chiny	CN2L9100
Zestaw żywych tkanek Zestaw kriogeniczny	Celliver Biotechnology, Szanghaj, Chiny	LT2601
Zestaw do rozmrażania żywych tkanek	Celliver Biotechnology, Szanghaj, Chiny	LT2602
NSG	Biocytogen, Pekin, Chiny	B-CM-002-4-5W
Penicilin& streptomycyna	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, Kalifornia, USA	15140122
Bufor do lizy czerwonych krwinek	Solarbio, Pekin, Chiny	R1010
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, Kalifornia, USA	8118367
Igły do szwów chirurgicznych z gwintem	LingQiao, Ningbo, Chiny	3/8 łuku 4 razy; 10
Formy i ostrza pomocnicze przetworzone tkankowo	Celliver Biotechnology, Szanghaj, Chiny	LT2603
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, Kalifornia, USA	2003779
Kolagenaza typu 1	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, Kalifornia, USA	17100017

Inkubator CO2