Opracowanie modeli ksenoprzeszczepów i pierwszorzędowych linii komórkowych pochodzących od pacjentów z rakiem żołądka

Rak żołądka jest piątym najczęściej występującym nowotworem na świecie i trzecią najczęstszą przyczyną zgonów z powodu raka. W 2018 roku na całym świecie zdiagnozowano ponad 1 000 000 nowych przypadków raka żołądka, a szacuje się, że 783 000 osób zostało zabitych przez tę chorobę¹. Zachorowalność i śmiertelność z powodu raka żołądka pozostają bardzo wysokie w krajach Azji Północno-Wschodniej^2,3. Pomimo znacznego postępu w dziedzinie terapii przeciwnowotworowych, rokowania pacjentów z zaawansowanym rakiem żołądka pozostają złe, a pięcioletni wskaźnik przeżycia wynosi około 25%^4,5,6,7,. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania nowych strategii terapeutycznych w raku żołądka

Leczenie raka żołądka jest wyzwaniem ze względu na jego wysoką heterogeniczność^8,9. Tak więc, pytanie o to, jak poradzić sobie z wyzwaniami związanymi z heterogenicznością nowotworów, aby realizować medycynę precyzyjną, jest kluczowe dla badań nad rakiem. Modele in vitro i in vivo odgrywają kluczową rolę w wyjaśnianiu heterogenicznych mechanizmów i biologii raka żołądka. Jednakże, chociaż istnieje wiele linii komórkowych raka żołądka i wiele konwencjonalnych transgenicznych modeli myszy do badań przedklinicznych, wady tych modeli ograniczają ich zastosowania¹⁰. Ponieważ cechy tych modeli zmieniły się w kulturze, nie modelują one już heterogeniczności guza, a ich odpowiedzi nie były w stanie przewidzieć reakcji u ludzi¹¹. Kwestie te poważnie ograniczają możliwość identyfikacji podgrup pacjentów onkologicznych, które zareagują na leki celowane. Krótkoterminowa hodowla guzów pierwotnych zapewnia stosunkowo szybki i spersonalizowany sposób badania przeciwnowotworowych właściwości farmakologicznych, które prawdopodobnie będą znakiem rozpoznawczym spersonalizowanego leczenia raka.

Ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX) są preferowane jako alternatywny model przedkliniczny do profilowania odpowiedzi na leki¹². Ponadto modele PDX oferują potężne narzędzie do badania inicjacji i progresji raka^13,14. Modele PDX zachowują histologiczny wygląd komórek nowotworowych, zachowują heterogeniczność wewnątrznowotworową i lepiej odzwierciedlają istotne ludzkie składniki mikrośrodowiska guza^15,16. Jednak ograniczeniem szeroko stosowanych modeli PDX jest niski wskaźnik sukcesu w tworzeniu i seryjnym rozmnażaniu ludzkich guzów litych. W tym badaniu opisano przyzwoicie skuteczne metody tworzenia modeli PDX i pierwotnych linii komórkowych.

To badanie na ludziach zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Oceny Etyki Sun Yat-sen University Cancer Center (SYSUCC, Guangzhou, Chiny). Badanie na zwierzętach zostało zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Sun Yat-sen. Uwaga: wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z odpowiednimi przepisami i wytycznymi instytucjonalnymi, w tym z wytycznymi dotyczącymi ochrony przed narażeniem zawodowym przed patogenami przenoszonymi przez krew.

1. Przygotowanie próbki

1. Pobrać tkanki raka żołądka (P0 = pasaż 0) bezpośrednio z operacji. Próbka guza powinna być większa niż 0,5 cm³.
2. Przygotuj 3-4 ml roztworu podstawowego: na przykład pożywkę RPMI-1640 (1x) uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U/ml penicyliny i 0,1 mg/ml streptomycyny.
3. Umieścić świeżą próbkę guza w roztworze podstawowym w temperaturze 4 °C na nie dłużej niż 4 godziny.

2. Ustanowienie modelu PDX (Rysunek 1)

1. Aby zapewnić sterylne pole operacyjne, należy dezynfekować wszystkie materiały światłem ultrafioletowym przez ponad 30 minut przed przeniesieniem do laboratorium dla zwierząt.
   Uwaga: salę operacyjną należy zdezynfekować światłem ultrafioletowym przez 30 minut, zanim wyczyścimy biurko środkiem dezynfekującym supozytoria kwasu dichloroizocyjanurowego. Następnie powidon-jod jest używany do dezynfekcji skóry.
2. Za pomocą kleszczy i nożyczek ostrożnie wypreparuj tkanki nowotworowe i przytnij je na kilka małych kawałków (około 1 mm³ kostki) w sterylnych warunkach.
3. Znieczulenie samic myszy NOD-SCID-IL2rg (NSG) w wieku od 5 do 7 tygodni przez wystawienie na działanie 1-1,5% izofluranu za pomocą aparatu do znieczulenia.
   1. Znieczulaj mysz, aż przestanie się szarpać, ale utrzyma równomierny oddech.
      UWAGA: Probówka o pojemności 50 ml to prosty sprzęt, który działa podobnie do aparatu do znieczulenia. Stosowanie weterynaryjnej maści do oczu, aby zapobiec wysuszeniu, nie jest konieczne ze względu na krótki czas działania.
4. Wykonaj 1 cm nacięcie na obu bokach grzbietu za pomocą sterylnych nożyczek i wszczep jeden kawałek guza w każdy bok myszy.
   1. Aby upewnić się, że kawałek guza nie wysunie się, użyj sterylnych kleszczy, aby rozbić tkankę podskórną. Następnie przytnij kawałek tkanki nowotworowej i umieść go w głębokim miejscu.
5. Zamknij obszar implantu szwem podskórnym za pomocą igieł chirurgicznych do szwów i oznacz uszy myszy oznaczonymi kolczykami
6. Wysterylizuj ranę jodem.
7. Po operacji delikatnie umieść myszy w pustej klatce, zachowując leżącą mostek. Zwróć szczególną uwagę na stan myszy; Budzą się i zaczynają chodzić około 3-4 minuty później. Umieść myszy, które przeszły operację, w innej nowej klatce, oddzielone od tych, które nie zostały poddane operacji.
8. Oceń wielkość guza za pomocą badania palpacyjnego miejsca implantacji. Mierz guzy suwmiarką z noniuszem dwa razy w tygodniu.
9. Gdy guz osiągnie średnicę 10 mm, stan zwierzęcia pogarsza się lub guz owrzodzenia, należy poddać mysz eutanazji metodą zatwierdzoną przez IRB. Reimplantacja pobranych świeżych fragmentów guza do 2 nowych myszy w celu pasażowania lub tymczasowe przechowywanie próbek w PBS na lodzie w celu wyizolowania pierwotnych linii komórkowych.

3. Kriokonserwacja tkanek

UWAGA: Ta część odnosi się głównie do metod stosowanych w zestawie Cryo Kit do żywych tkanek. Główne zestawy i wyposażenie są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Poddaj myszy eutanazji metodą zatwierdzoną przez IRB, gdy guz ma średnicę większą niż 10 mm.
2. Za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek powoli izoluj guz od myszy.
3. Umyj tkanki nowotworowe za pomocą DPBS w naczyniu o średnicy 10 cm. Wypreparuj i usuń martwicze obszary, tkankę tłuszczową, skrzepy krwi i tkankę łączną za pomocą kleszczy i nożyczek.
4. Wytnij tkanki nowotworowe do maksymalnej grubości 1 mm za pomocą formy.
5. Umyj plastry z DPBS w naczyniu o średnicy 10 cm.
   UWAGA: Proces witryfikacji polega na użyciu probówek oznaczonych V1/V2/V3 w krokach 3.6-3.8. Głównymi składnikami są DMSO i sacharoza.
6. Przenieść plastry do probówki V1 za pomocą kleszczyków i inkubować probówkę w temperaturze 4 °C przez 4 minuty. Zwinąć i krótko odwrócić probówkę, a następnie umieścić ją w temperaturze 4 °C na kolejne 4 minuty.
7. Wlej roztwór V1 i plastry do naczynia o średnicy 10 cm. Przenieść plastry do probówki V2 za pomocą kleszczyków i inkubować probówkę V2 w temperaturze 4 °C przez 4 minuty. Zwiń i odwróć rurkę na krótko, a następnie umieść ją w temperaturze 4 °C na kolejne 4 minuty.
8. Wlej roztwór V2 i plastry do naczynia o średnicy 10 cm. Przenieść plastry do probówki V3 za pomocą kleszczyków i inkubować probówkę w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Zwinąć i krótko odwrócić probówkę i umieścić ją w temperaturze 4 °C na co najmniej 5 minut. Upewnij się, że wszystkie plastry opadają na dno tuby.
   1. Jeżeli kilka plasterków pozostaje na wodzie, zwinąć i na krótko odwrócić rurkę, a następnie ponownie umieścić probówkę w temperaturze 4 °C, aż wszystkie plastry całkowicie opadną; jeśli to konieczne, wyrzucić pływające plastry
   .
9. Wlej roztwór V3 i plastry do naczynia o średnicy 10 cm.
10. Przytnij uchwyty na chusteczki do odpowiedniej długości i umieść je na sterylnej gazie. Przełóż plastry na uchwyty. Owiń uchwyty gazą i umieść je w ciekłym azocie za pomocą kleszczy, a następnie inkubuj przez 5 minut.
11. Oznacz fiolki kriogeniczne informacjami o tkankach.
12. Przenieś posiadacze z plastrami tkanek do fiolek kriogenicznych, które są przechowywane w ciekłym azocie.

4. Izolacja komórek pierwotnych (Rysunek 2)

1. Sterylizować kleszcze i nożyczki parą pod wysokim ciśnieniem w temperaturze 121 °C przez 30 min.
2. Wyciąć próbki raka żołądka z wyciętych próbek lub pobranych tkanek PDX. Umieść tkanki na lodzie, a następnie przenieś je do sterylnego naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm.
3. Wypreparuj i usuń martwicze obszary, tkankę tłuszczową, skrzepy krwi i tkankę łączną za pomocą kleszczy i nożyczek.
4. Umyj tkanki nowotworowe raz DPBS zawierającym 100 U/ml penicyliny i 0,1 mg/ml streptomycyny w naczyniu o średnicy 10 cm.
5. Pokrój tkankę nowotworową na 1 mm³ kawałki na pokrywie naczynia; maksymalna grubość każdego kawałka powinna wynosić 1 mm.
6. Przenieść tkanki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml z około 7 ml roztworu kolagenazy typu 1 i trypsyny (1:14). Krótko zmieszaj mieszaninę.
7. Inkubować probówkę w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 30-40 minut. Mieszać mieszaninę co 5 minut.
8. Dodaj równą objętość pożywki RPMI-1640 (1x) uzupełnionej o 10% FBS do probówki. Dokładnie wymieszaj mieszaninę.
9. Przenieść mieszaninę do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml przez powolną filtrację przez filtr 40 μm.
   UWAGA: Użyj filtrów 40 μm, aby zapewnić wyższy stosunek komórek rakowych. W razie potrzeby można zastosować filtry 100 μm do zachowania większej liczby typów komórek, takich jak komórki immunologiczne.
10. Odwirować filtraty przy 113-163 x g przez 5-7 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant.
11. Przemyć osad 5 ml PBS i ostrożnie usunąć supernatant.
12. Jeśli osad jest czerwony, zawiera wiele erytrocytów. Delikatnie zawiesić osad z 500 μl buforu do lizy czerwonych krwinek. Po 5 minutach inkubacji dodać 5 ml PBS i ostrożnie usunąć supernatant.
13. Zawiesić osad z pożywką hodowlaną i przenieść mieszaninę do sterylnego naczynia o średnicy 10 cm.
14. Zastąp pożywkę pożywką zawierającą surowicę co 2-3 dni.
15. Przejdź przez komórki pierwotne za pomocą trypsyny/EDTA, gdy osiągną 50% konfluencji.

Tutaj tkanki nowotworowe z operacji zostały zachowane w roztworze podstawowym do następnego kroku. W ciągu 4 godzin tkanki nowotworowe pocięto na małe kawałki i wszczepiono w grzbietowe boki myszy NSG, które zostały znieczulone przy użyciu bawełny nasączonej izofluranem. Guzy większe niż 1cm3 mogą być wycięte w celu implantacji nowym myszom (Ryc. 1) lub ostrożnie pokrojone i zakonserwowane w ciekłym azocie zgodnie z protokołem. W tym badaniu guzy pierwszej generacji rosły wolniej niż te w późniejszych pokoleniach, potrzebując 3 tygodni lub dłużej, aby osiągnąć odpowiedni rozmiar. Wskaźnik powodzenia tworzenia guza podskórnego pierwszej generacji był większy niż 80%. Potwierdziliśmy tożsamość komórek rakowych z modeli PDX poprzez barwienie H&E pod mikroskopem (Rysunek 3C). Wreszcie, wskaźnik powodzenia tworzenia guza z kriokonserwowanej tkanki nowotworowej wynosił około 95%.

Pierwotne komórki rakowe zostały wyizolowane jako kolejny sposób badania pojedynczego guza. Komórki wyizolowano albo z próbek operacyjnych, albo z modeli PDX. Tkanki nowotworowe przemyto DPBS i pocięto na kawałki. Fragmenty tkanek zostały dokładnie strawione kolagenazą typu 1 i trypsyną (1:14) przed filtracją. Po usunięciu erytrocytów komórki hodowano w taki sam sposób, jak inne komórki nowotworowe. Komórki, które przeżyły, umierają w kolejnych pasażach (Ryc. 2). Na podstawie różnic w morfologii możemy łatwo rozpoznać komórki nowotworowe. Normalne komórki mają jednolity kształt i rozmiar, ale komórki rakowe występują w różnych rozmiarach i kształtach. Dodatkowo w komórkach nowotworowych jądro ma nieregularną strukturę i stosunkowo małą cytoplazmę. W związku z tym pierwotne komórki zostały uwierzytelnione niezależnie przez dwóch patologów pod mikroskopem (Ryc. 3A). Dla dalszego potwierdzenia, barwienie H&E zastosowano do obserwacji morfologii komórek rakowych po fiksacji (Rysunek 3B). Wskaźnik udanej izolacji pierwszorzędowych linii komórkowych wynosił około 40%. Komórki pierwotne muszą być pasażowane 4 lub 5 razy po izolacji i konieczne jest uwierzytelnienie patologiczne. Te kroki mogą potrwać około 20 dni.

Rysunek 1. Schemat tworzenia modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta (PDX).
Aby pomyślnie ustalić modele PDX, należy wyciąć masy guza na sali operacyjnej w celu natychmiastowego przetworzenia. Podziel guz na kilka małych kawałków. Umieść waciki nasączone izofluranem w probówce o pojemności 50 ml, aby znieczulić myszy i przeciąć rany w bokach grzbietu. Tępo wypreparuj tkanki podskórne za pomocą kleszczy i użyj kleszczy, aby umieścić jeden kawałek guza podskórnie z dala od rany. Zszyj i wysterylizuj rany. Proces znieczulenia wymaga starannego monitorowania parametrów życiowych myszy, takich jak częstość oddechów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Schemat izolacji komórek pierwotnych.
Pobrać próbki guza z sali operacyjnej. Szybko umyj tkanki nowotworowe i pokrój je na kawałki. Trawić próbki guza kolagenazą typu 1 i trypsyną w temperaturze 37 °C przez 30-40 minut, mieszając probówkę co 5 minut. Następnie dodać równą objętość pożywki z 10% FBS, odwirować mieszaninę i umieścić filtrat w nowej probówce. Usunąć supernatant i umyć osad. Na podstawie koloru granulki zdecyduj, czy lizować czerwone krwinki. Przenieś osad do nowego sterylnego naczynia o średnicy 10 cm i hoduj komórki przez kilka pasaży przed badaniem przesiewowym komórek rakowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Uwierzytelnianie pierwotnych komórek nowotworowych.
(A) Obrazy komórek pierwotnych od pacjentów z GC. Komórki wyizolowano bezpośrednio ze świeżych tkanek i poddano pasażom więcej niż 5 razy. Podziałka: 200 μm (po lewej), 100 μm (w środku) i 50 μm (po prawej). (B) Zdjęcia komórek pierwotnego raka żołądka barwionych H&E. Podziałka: 500 μm (po lewej), 200 μm (w środku) i 100 μm (po prawej). (C) Zdjęcia guzów PDX barwionych H&E. Podziałka: 500 μm (po lewej), 200 μm (w środku) i 100 μm (po prawej). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.