Artykuł metodologiczny

Półautomatyczna charakterystyka i liczenie krążących komórek nowotworowych PD-L1 od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca za pomocą immunofluorescencji

DOI:

10.3791/59873

⸱

14 sierpnia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratoire de Biochimie et Biologie Moléculaire, Groupe Hospitalier Sud, Hospices Civils de Lyon, 2Circulating Cancer (CIRCAN) Program, Hospices Civils de Lyon Cancer Institute, 3University of Lyon, Claude Bernard University, Cancer Research Center of Lyon, 4Biolidics Limited, 5Institut de Pathologie Multisites des HCL-Site Sud, Hospices Civils de Lyon, 6Acute Respiratory Disease and Thoracic Oncology Department, Lyon Sud Hospital, Hospices Civils de Lyon Cancer Institute, 7EMR-3738 Therapeutic Targeting in Oncology, Lyon Sud Medical Faculty, Lyon 1 University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Charakterystyka krążących komórek nowotworowych (CTC) jest popularnym tematem w badaniach translacyjnych. Protokół ten opisuje półautomatyczny test immunofluorescencyjny (IF) do charakterystyki PD-L1 i liczenia CTC w próbkach pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krążące komórki nowotworowe (CTC) pochodzące z guza pierwotnego są wydalane do krwiobiegu lub układu limfatycznego. Te rzadkie komórki (1-10 komórek na ml krwi) uzasadniają złe rokowanie i są skorelowane z krótszym całkowitym przeżyciem w kilku nowotworach (np. piersi, prostaty i jelita grubego). Obecnie system wychwytywania CTC oparty na kulkach magnetycznych z powłoką anty-EpCAM jest złotym standardem testu zatwierdzonym przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) do liczenia CTC w krwiobiegu. Test ten opiera się na wykorzystaniu kulek magnetycznych pokrytych markerami anty-EpCAM, które są specyficznie ukierunkowane na komórki raka nabłonka. Wiele badań wykazało, że EpCAM nie jest optymalnym markerem do wykrywania CTC. Rzeczywiście, CTC są niejednorodną subpopulacją komórek nowotworowych i są zdolne do przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego (EMT) związanego z proliferacją i inwazją przerzutów. Te CTC są w stanie zmniejszyć ekspresję markera nabłonka powierzchni komórki EpCAM, jednocześnie zwiększając markery mezenchymalne, takie jak wimentyna. Aby rozwiązać tę przeszkodę techniczną, opracowano inne metody izolacji oparte na właściwościach fizycznych CTC. Technologie mikroprzepływowe umożliwiają bezznacznikowe podejście do wzbogacania CTC z próbek krwi pełnej. Spiralna technologia mikroprzepływowa wykorzystuje siły bezwładności i oporu Deana z ciągłym przepływem w zakrzywionych kanałach generowanych w spiralnym chipie mikroprzepływowym. Komórki są rozdzielane na podstawie różnic w wielkości i plastyczności między normalnymi komórkami krwi a komórkami nowotworowymi. Protokół ten szczegółowo opisuje różne etapy charakterystyki programowanego ligandu śmierci 1 (PD-L1) CTC, łącząc spiralne urządzenie mikroprzepływowe z konfigurowalnym zestawem markerów immunofluorescencyjnych (IF).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytotoksyczne limfocyty T (CTL) specyficzne dla antygenu nowotworowego odgrywają kluczową rolę w odpowiedzi na nowotwory w procesie znanym jako "nadzór immunologiczny" nad rakiem. Ich funkcje przeciwnowotworowe są wzmacniane przez przeciwciała blokujące immunologiczne punkty kontrolne, takie jak inhibitory CTLA-4 i inhibitory PD-1/PD-L1. W przypadku niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) terapie anty-PD-1/PD-L1 powodują odsetek odpowiedzi w zakresie od 0%-17% u pacjentów z guzami PD-L1-ujemnymi i 36%-100% u pacjentów z ekspresją PD-L1. Silna odpowiedź na blokadę PD-1/PD-L1 obserwowana w czerniaku i niedrobnokomórkowym raku płuca jest potwierdzona dowodami na poprawę ogólnego wskaźnika odpowiedzi (RR), trwałe korzyści kliniczne i przeżycie wolne od progresji choroby (PFS). Obecnie leczenie anty-PD1 jest standardem leczenia w leczeniu NDRP drugiego rzutu niwolumabem niezależnie od ekspresji PD-L1 oraz pembrolizumabem u pacjentów z ekspresją PD-L1 ≥1%. W leczeniu pierwszego rzutu standardem leczenia jest sam pembrolizumab u pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca wykazującym ekspresję PD-L1 ≥50% i może być potencjalnie wzmocniony chemioterapią (platyna i lek dubletowy w zależności od podtypu histologicznego)1,2.

Jednak takie podejście do leczenia pacjentów jest dyskusyjne3, ponieważ ekspresja PD-L1 w komórkach nowotworowych za pomocą immunohistochemii (IHC) prawdopodobnie nie jest najbardziej idealnym biomarkerem towarzyszącym. Inne, takie jak obciążenie mutacjami nowotworu4 (TMB), niestabilność mikrosatelitarna (MSI) i/lub mikrobiota, są prawdopodobnie interesujące w tym kontekście, zarówno samodzielnie, jak i w połączeniu. Wiadomo, że NSCLC są nowotworami heterogennymi, zarówno przestrzennie (z jednego miejsca guza do drugiego), jak i czasowo (od rozpoznania do nawrotu). Pacjenci z niedrobnokomórkowym rakiem płuca są zwykle delikatni, a iteracyjne inwazyjne biopsje tkanek mogą stanowić problem. Rzeczywiście, wskaźnik ponownej biopsji przy pierwszej progresji waha się od 46% do 84% w zależności od serii, a udana ponowna biopsja (czyli z analizą histologiczną i pełną analizą molekularną) waha się od 33% do 75%. Oznacza to, że 25%-67% pacjentów nie może otrzymać kompleksowej analizy ponownej biopsji podczas pierwszej progresji5,6,7,8.

Pojawienie się "płynnych biopsji" wywołało znaczny entuzjazm w tym konkretnym otoczeniu, ponieważ umożliwia kluczową ponowną ocenę zmian molekularnych podczas postępu choroby poprzez badanie krążącego wolnego DNA (cfDNA) pochodzącego z krążących komórek nowotworowych (CTC). Te żywe komórki są uwalniane z guza do krwiobiegu, gdzie swobodnie krążą. Chociaż analiza CTC nie jest rutynowo stosowana, wydaje się być bardzo obiecująca w przypadku charakterystyki molekularnej i fenotypowej, rokowania i znaczenia predykcyjnego w raku płuc (poprzez analizę DNAseq, RNAseq, miRNA i białek). Rzeczywiście, CTC prawdopodobnie zawierają cechy fenotypowe aktywnej choroby, a nie początkowe markery (wykrywane w biopsjach tkanek w momencie rozpoznania). Co więcej, CTC omijają problem przestrzennej heterogeniczności tkanki nowotworowej, który może być kluczowym problemem w przypadku małych biopsji. W związku z tym ekspresja PD-L1 w CTC może potencjalnie rzucić światło na rozbieżności wynikające z jego zastosowania jako biomarkera predykcyjnego przy użyciu tkanki nowotworowej.

Niedawno, ekspresja PD-L1 została przetestowana w CTC NSCLC. Prawie wszyscy badani pacjenci9 byli PD-L1 dodatni, co komplikuje interpretację wyniku i jego zastosowanie kliniczne. Ogólnie rzecz biorąc, CTC PD-L1-dodatnie wykryto w 69,4% próbek ze średnio 4,5 komórki/mL10. Po rozpoczęciu radioterapii odsetek PD-L1-dodatnich CTC znacznie wzrósł, co wskazuje na zwiększenie ekspresji PD-L1 w odpowiedzi na promieniowanie11. W związku z tym analiza CTC PD-L1 może być stosowana do monitorowania dynamicznych zmian guza i odpowiedzi immunologicznej, która może odzwierciedlać odpowiedź na chemioterapię, radioterapię i prawdopodobne leczenie immunoterapią (IT).

Do tej pory izolacja CTC i charakterystyka PD-L1 opierają się na różnych metodach, takich jak wychwytywanie CTC oparte na kulkach magnetycznych z powłoką anty-EpCAM, test bez wzbogacania i test oparty na rozmiarze12,13 testów przechwytywania CTC. Jednak CTC wykryto tylko u 45%-65% pacjentów z przerzutowym NDRP, co ograniczyło ich zdolność do dostarczania jakichkolwiek informacji u ponad połowy pacjentów z NDRP z przerzutami. Ponadto liczba CTC była niska w większości tych badań przy użyciu podejścia opartego na rozmiarze10. Co więcej, metoda ta doprowadziła do rozbieżności, takich jak wykrycie komórek CD45(-)/DAPI(+) z "cytomorfologicznymi wzorcami złośliwości" w krwiobiegu zdrowych dawców. Obawy te podkreślają potrzebę wysoce czułej metody pobierania CTC związanej z fenotypowaniem immunologicznym atypowych komórek CD45 (-) ze zdrowej krwi pełnej przy użyciu dodatkowych biomarkerów raka (tj. TTF1, Vimentin, EpCAM i CD44) w NSCLC.

W związku z tym oceniliśmy spiralne urządzenie mikroprzepływowe, które wykorzystuje siły inercyjne i siły oporu Deana do rozdzielania komórek na podstawie wielkości i plastyczności za pomocą mikroprzepływowego chipa. Powstawanie przepływów wirowych Deana obecnych w chipie mikroprzepływowym powoduje powstawanie większych CTC zlokalizowanych wzdłuż wewnętrznej ściany i mniejszych komórek odpornościowych wzdłuż zewnętrznej ściany chipa. Proces wzbogacania kończy się zasysaniem większych komórek do wylotu zbiorczego jako wzbogaconej frakcji CTC. Metoda ta jest szczególnie czuła i specyficzna (wykrywanie około 1 CTC/ml krwi pełnej)14 i może być powiązana z niestandardowymi analizami immunofluorescencji (IF). Narzędzia te umożliwią ustalenie pozytywnego progu dla interpretacji klinicznej. W ten sposób opisano przebieg pracy, który umożliwia biologom izolowanie i immunofenotypowanie CTC z wysokim wskaźnikiem odzysku i swoistości. Protokół opisuje optymalne wykorzystanie spiralnego urządzenia mikroprzepływowego do zbierania CTC, zoptymalizowane testy IF, które można dostosować do typu nowotworu, oraz wykorzystanie bezpłatnego oprogramowania typu open source do pomiaru i analizy obrazów komórek w celu przeprowadzenia półautomatycznej numeracji komórek zgodnie z barwieniem fluorescencyjnym. Ponadto multipleksowanie mikroskopowe można przeprowadzić w zależności od liczby dostępnych filtrów/markerów fluorescencyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki zostały prospektywnie pobrane w ramach kohorty CIRCAN ("CIRculating CANcer") z siedzibą w Szpitalu Uniwersyteckim w Lyonie po uzyskaniu pisemnej zgody pacjenta. Badanie to zostało włączone do kohorty CIRCAN_ALL. Badany CIRCAN_ALL został uznany za nieinterwencyjny przez CPP South-East IV z dnia 04.11.2015 r. pod numerem referencyjnym L15-188. W dniu 20.09.2016 r. zmieniona wersja została uznana za nieinterwencyjną pod numerem referencyjnym L16-160. Badanie CIRCAN_ALL zostało zgłoszone do korespondenta ds. IT i wolności Hospices Civils de Lyon w dniu 01.12.2015 r. pod numerem referencyjnym 15-131. Pobranie krwi wykonano, gdy lekarze zaobserwowali najwcześniejsze oznaki progresji guza.

UWAGA: Użyj wszystkich odczynników i materiałów opisanych w Tabeli materiałów z odpowiednimi warunkami przechowywania do przygotowania próbki przedanalitycznej i testu immunofluorescencji. Zastępowanie odczynników i/lub modyfikowanie warunków przechowywania może skutkować nieoptymalną wydajnością testu.

1. Dekontaminacja spiralnego urządzenia mikroprzepływowego

UWAGA: Dekontaminacja spiralnego urządzenia mikroprzepływowego jest niezbędna do usunięcia całego tła immunofluorescencji powstałego w wyniku zanieczyszczenia bakteryjnego, zbadania cytomorfologii CTC i umożliwienia ich odróżnienia od normalnych komórek odpornościowych. Protokół jest zoptymalizowany dla próbek krwi pobranych w probówkach K2EDTA w ciągu 6 godzin po pobraniu krwi i wzbogacony za pomocą spiralnego urządzenia mikroprzepływowego w czystych warunkach. Stosowanie tego testu do innych rodzajów próbek (innych płynów biologicznych) może wymagać dodatkowej optymalizacji. Ten protokół dekontaminacji powinien być wykonywany raz w tygodniu.

  1. Przygotowanie odczynników
    1. Przygotowanie buforu rozcieńczalnika
      1. Wysterylizuj 20 ml odczynnika z dodatkiem rozcieńczalnika za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm i dodaj bezpośrednio do 1 litra 1x buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS) ultraczystej klasy (tabela materiałów).
    2. Sterylizacja odczynników i słomy wejściowej
      1. Wysterylizować bufor do lizy RBC i bufor do ponownego zawieszania (RSB; Tabela materiałów) za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm i umieścić w nowej stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml dla każdego roztworu.
      2. Wysterylizować słomę wejściową przez inkubację w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę w uniwersalnym odczynniku czyszczącym (tabela materiałów). Przenieść słomkę do środka czyszczącego na bazie wybielacza (tabela materiałów) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
      3. Przepłukać słomkę wejściową dwukrotnie sterylnym PBS przez 1 godzinę każdy, a wysterylizowaną słomkę wejściową przechowywać w chirurgicznie sterylnej torbie (Tabela materiałów).
  2. Dekontaminacja spiralnego urządzenia mikroprzepływowego
    1. Dezynfekcja za pomocą uniwersalnego odczynnika czyszczącego
      1. Odłączyć nakrętkę butelki z rozcieńczalnikiem od portu rozcieńczalnika spiralnego urządzenia mikroprzepływowego, odkręcając brązową. Pod komorą bezpieczeństwa mikrobiologicznego przenieś do 250 ml uniwersalnego odczynnika czyszczącego (tabela materiałów) do nowej pustej butelki.
      2. Przykręć nakrętkę butelki z rozcieńczalnikiem i słomkę do butelki z 250 ml uniwersalnego odczynnika czyszczącego pod szafką bezpieczeństwa mikrobiologicznego. Przymocuj tę butelkę do portu rozcieńczalnika spiralnego urządzenia mikroprzepływowego, przykręcając brązową.
      3. Przenieś do 100 ml wybielacza (1% stężenie końcowe; Tabela materiałów) do pojemnika na odpady dostarczonego w zestawie do uruchamiania (Rysunek 1A).
      4. Załaduj nową sterylną słomkę wejściową na spiralne urządzenie mikroprzepływowe (tabela materiałów) w porcie wejściowym. Załaduj nową probówkę wirówkową o pojemności 50 ml do portu wejściowego. Załaduj nową probówkę wirówkową o pojemności 50 ml do portu wyjściowego.
      5. Kontynuuj zalewanie spiralnego urządzenia mikroprzepływowego, klikając przycisk Zalej na spiralnym urządzeniu mikroprzepływowym (3 min). Wyjmij rurkę wejściową po zakończeniu zalewania.
      6. Przenieść do 15 ml uniwersalnego odczynnika czyszczącego do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml z pipetą serologiczną pod komorą bezpieczeństwa mikrobiologicznego i przymocować probówkę do portu wejściowego spiralnego urządzenia mikroprzepływowego.
      7. Przed rozpoczęciem biegu sprawdź, czy roztwór jest wolny od nadmiernych pęcherzyków. Jeśli obecne są pęcherzyki, usuń je przez powolne zasysanie pipetą.
      8. Załaduj chip mikroprzepływowy do odkażania spiralnego urządzenia mikroprzepływowego. Uruchom program 3 na spiralnym urządzeniu mikroprzepływowym, klikając Uruchom i wybierając Program 3 (31 min).
        UWAGA: Program 3 spiralnego urządzenia mikroprzepływowego umożliwia szybkie wzbogacenie CTC w ciągu 31 minut.
      9. Kontynuuj etap czyszczenia spiralnego urządzenia mikroprzepływowego, używając pozostałej objętości uniwersalnego odczynnika czyszczącego w rurce wejściowej.
      10. Wyrzuć rurkę wejściową po zakończeniu etapu czyszczenia, pozostawiając słomkę wejściową.
    2. Dekontaminacja za pomocą środka czyszczącego na bazie wybielacza
      1. Odłącz uniwersalną nakrętkę butelki z odczynnikiem czyszczącym od portu rozcieńczalnika spiralnego urządzenia mikroprzepływowego, odkręcając brązową. Pod komorą bezpieczeństwa mikrobiologicznego przenieś do 250 ml środka czyszczącego na bazie wybielacza (tabela materiałów) w nowej pustej butelce (Rysunek 1A).
      2. Przykręć uniwersalną nakrętkę butelki z odczynnikiem czyszczącym i słomkę do butelki zawierającej środek czyszczący na bazie wybielacza pod szafką bezpieczeństwa mikrobiologicznego. Przymocuj tę butelkę do portu rozcieńczalnika spiralnego urządzenia mikroprzepływowego, przykręcając brązową.
      3. Przenieść do 15 ml środka czyszczącego na bazie wybielacza do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą pipety serologicznej pod komorą bezpieczeństwa mikrobiologicznego. Załaduj pozycję wejściową probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Załaduj pustą rurkę w pozycji wyjściowej.
      4. Przed przetworzeniem serii należy sprawdzić, czy w próbce nie ma nadmiernej ilości pęcherzyków, a jeśli takie są obecne, usunąć pęcherzyki, powoli zasysając je pipetą.
      5. Uruchom program 3, klikając Uruchom i wybierając program 3 (31 min). Po zakończeniu pracy przejdź bezpośrednio do etapu czyszczenia, używając pozostałej objętości środka czyszczącego na bazie wybielacza w rurce wejściowej.
      6. Odrzuć lampy wejściowe i wyjściowe.
    3. Przepłukać spiralne urządzenie mikroprzepływowe.
      1. Odłączyć nakrętkę butelki ze środkiem czyszczącym na bazie wybielacza od portu rozcieńczalnika spiralnego urządzenia mikroprzepływowego, odkręcając brązową. Pod komorą bezpieczeństwa mikrobiologicznego przenieść słomkę z butelki zawierającej środek czyszczący na bazie wybielacza do nowej butelki zawierającej bufor rozcieńczalnika. Przykręć butelkę do spiralnego urządzenia mikroprzepływowego.
      2. Przenieść do 15 ml wysterylizowanej wody (tabela materiałów) do nowej probówki wejściowej do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą pipety serologicznej pod komorą bezpieczeństwa mikrobiologicznego. Załaduj pozycję wejściową probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Załaduj pustą rurkę w pozycji wyjściowej.
      3. Przed przetworzeniem serii należy sprawdzić, czy w próbce nie ma nadmiernej ilości pęcherzyków, a jeśli takie są obecne, usunąć pęcherzyki, powoli zasysając je pipetą.
      4. Uruchom program 3, klikając Uruchom i wybierając program 3 (31 min). Po zakończeniu pracy przejdź bezpośrednio do etapu czyszczenia, wykorzystując pozostałą objętość wysterylizowanej wody w probówce wejściowej.
      5. Odrzuć lampy wejściowe i wyjściowe.

2. Konserwacja urządzenia spiralnego mikroprzepływowego w stanie wolnym od bakterii

UWAGA: Rutynowa konserwacja powinna być wykonana pod koniec dnia podczas ostatniego kroku czyszczenia.

  1. Przenieś do 7 ml środka czyszczącego na bazie wybielacza do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą pipety serologicznej pod komorą bezpieczeństwa mikrobiologicznego. Wkręć rurkę czyszczącą na bazie wybielacza w porcie wejściowym spiralnego urządzenia mikroprzepływowego.
  2. Przed przetworzeniem czystego przebiegu należy sprawdzić, czy próbka wejściowa jest wolna od nadmiernych pęcherzyków powietrza, a jeśli takie są obecne, usunąć pęcherzyki, powoli zasysając je pipetą.
  3. Uruchom czyszczenie spiralnego urządzenia mikroprzepływowego.

3. Wstępne wzbogacenie CTC z próbek krwi pacjenta

  1. Zebrać 7,5 ml krwi do probówki K2EDTA i delikatnie mieszać, aby uniknąć sedymentacji i krzepnięcia komórek. Przetwarzanie w ciągu 6 h.
    nuta: Jeżeli krew zostanie zebrana w probówce do pobierania krwi bez komórek DNA zawierającej środek konserwujący, należy ją przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia. Upewnij się, że próbka krwi, bufor do lizy RBC i bufor RBS mają temperaturę RT przed przystąpieniem do etapu wzbogacania.
  2. Przenieść do 7,5 ml krwi pełnej do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą pipety serologicznej umieszczonej pod komorą bezpieczeństwa mikrobiologicznego.
  3. Wirować przy 1 600 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Zebrać frakcję osocza za pomocą pipety, nie naruszając kożuchowej sierści. Zastąp frakcję osocza, dodając bezpośrednio równoważną objętość PBS do 7,5 ml.
  4. Delikatnie dodać bufor do lizy RBC (tabela materiałów) do próbki krwi do końcowej objętości 30 ml (dla probówki K2EDTA) lub 37,5 ml (dla probówki do pobierania krwi bez komórek). Delikatnie odwrócić probówkę do pobierania krwi 10x i inkubować przez 10 minut w temperaturze RT.
    nuta: Próbka krwi zmienia kolor na ciemnoczerwony podczas lizy RBC. Jeśli po 10 minutach nie zaobserwuje się żadnej zmiany (z ciemnoczerwonej i nieprzezroczystej), delikatnie odwróć probówkę 3x i odstaw na kolejne maksymalnie 5 minut. Nie pozostawiaj próbki w buforze do lizy RBC na dłużej niż 15 minut, ponieważ może to pogorszyć jakość próbki i wydajność testu.
  5. Odwirować zlizowaną próbkę krwi o sile 500 x g przez 10 minut w czasie suchej masy, przy włączonych hamulcach wirówki (lub przy najwyższej prędkości zwalniania). Za pomocą pipety Pasteura lub pipety serologicznej delikatnie usunąć supernatant, aż objętość osiągnie oznaczenie 4-5 ml. Następnie użyj przefiltrowanych końcówek mikropipet, aby usunąć pozostały supernatant.
  6. Za pomocą mikropipety P1000 z końcówką z filtrem dodaj 1,0 ml RSB do ścianki probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków do mieszanki, należy ponownie zawiesić osad komórkowy, delikatnie pipetując w górę i w dół, aż próbka stanie się jednorodna.
  7. Dodać dodatkowe 3 ml RSB do ścianki probówki wejściowej z probówką wirówkową o pojemności 50 ml (całkowita objętość 4 ml). Unikaj wprowadzania bąbelków do mieszanki. Delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową, delikatnie pipetując w górę i w dół.
    nuta: W mało prawdopodobnym przypadku, gdy zwykłe pipetowanie nie jest w stanie rozbić grudek komórek (definiowanych jako widoczność lub zablokowanie końcówki pipety), należy przefiltrować próbkę przez sitko o wielkości 40 μm, aby usunąć wszelkie grudki. Dodać 150 μl RSB do próbki, aby uzupełnić utratę objętości w wyniku filtrowania. Należy pamiętać, że tę metodę należy stosować oszczędnie i tylko wtedy, gdy obserwuje się duże grudki.
  8. Przed przystąpieniem do etapu wzbogacania należy sprawdzić, czy w próbce nie ma nadmiernej ilości pęcherzyków powietrza, a jeśli takie są obecne, należy usunąć pęcherzyki i uważać, aby nie wyrzucić żadnej próbki. Jeśli obecne są drobne pęcherzyki, ich usuwanie nie jest wymagane.
  9. Zbadać próbkę na spiralnym urządzeniu mikroprzepływowym.

4. Wzbogacanie CTC z pełnej krwi pacjenta za pomocą spiralnego urządzenia mikroprzepływowego

  1. Załaduj nowy spiralny układ mikroprzepływowy. Załaduj dwie puste probówki wirówkowe o pojemności 50 ml do portów wejściowych i wyjściowych.
  2. Uruchom prime, klikając Prime na spiralnym urządzeniu mikroprzepływowym (3 min). Wyjmij rurki wejściowe i wyjściowe i załaduj próbkę do przetworzenia do portu wejściowego.
  3. Załaduj przezroczystą stożkową rurkę o pojemności 15 ml do portu wyjściowego, aby zebrać wzbogacone CTC. Uruchom program 3, klikając Uruchom i wybierając Program 3 (31 min).
  4. Rozładować probówkę wyjściową i odwirować przy 500 x g przez 10 minut (przyspieszenie: 9; opóźnienie: 5). Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml usunąć supernatant, zatrzymując się na znaku 2 ml na stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Za pomocą mikropipety usunąć supernatant, zatrzymując się na oznaczeniu 100 μl na stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Wzbogaconą próbkę należy przetworzyć bezpośrednio do barwienia immunofluorescencyjnego.

5. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Wyliczyć na szkiełku z komorą z siatką typu hemocytometr liczbę komórek na ml. Wzbogaconą próbkę rozcieńczyć 0,2% roztworem zapobiegającym wiązaniu (tabela materiałów) do stężenia osiągającego 100 000 komórek/100 μl na cytospinę.
  2. Zwilżyć kontur komory próbki bawełną (tabela materiałów) z 50 μl 0,2% roztworu zapobiegającego wiązaniu. Umieścić szkiełko ze szkła polilizynowego w komorze na próbkę i zamknąć.
  3. Pokryj końcówkę 0,2% roztworem zapobiegającym wiązaniu, pipetując w górę i w dół 3 razy. Ponownie zawiesić wzbogaconą próbkę i przenieść roztwór komórkowy do komory na próbkę. Wirówka z dedykowaną wirówką (tabela materiałów) przy 400 obr./min przez 4 min (niskie przyspieszenie).
  4. Umieść izolator krzemowy wokół obszaru osadzania. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia pod komorą bezpieczeństwa mikrobiologicznego na 2 minuty.
  5. Przygotować roztwór utrwalający, rozcieńczając 1 ml 16% paraformaldehydu (PFA) 3 ml sterylnego PBS. Dodać 100 μl roztworu utrwalającego (4% PFA) na próbkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Usunąć roztwór utrwalający i wykonać trzy przemycia 200 μl PBS i inkubować w temperaturze pokojowej każde przez 2 minuty
    ostrożność: Używaj PFA pod komorą bezpieczeństwa chemicznego, aby zapobiec wdychaniu.
  6. Przygotować roztwór nasycający, rozcieńczając płodową surowicę bydlęcą (FBS) w 5%, odczynnik blokujący receptor Fc (FcR) w 5% i albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w stężeniu 1% w sterylnym PBS (tabela materiałów). Dodać 100 μl roztworu nasyconego na próbkę i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór nasycony.
  7. Dodać 100 μl roztworu przeciwciała na próbkę (przeciwciało CD45 1/20; Przeciwciało PanCK 1/500; przeciwciało PD-L1 1/200; Qsp roztwór nasycający 100 μL) (Tabela materiałów). Umieścić szkiełko ze szkła polilizynowego na szalce Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm. Zwilżyć chłonny papier 2 ml sterylnej wody i zamknąć szalkę Petriego pokrywką. Umieścić w temperaturze 4 °C na noc i chronić przed światłem.
  8. Usunąć mieszaninę przeciwciał i wykonać 3 przemycia z 200 μl PBS, inkubując każde przemycie przez 2 minuty. Pozostaw próbkę do wyschnięcia na 5 minut i chroń ją przed światłem. Umieścić 10 μl roztworu montażowego (tabela materiałów) w miejscu osadzania i przykryć szkiełkiem nakrywkowym mikroskopu, nie tworząc pęcherzyka. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci.

6. Akwizycja obrazów immunofluorescencyjnych za pomocą prostego mikroskopu fluorescencyjnego i powiązanego oprogramowania

  1. Użyj prostego mikroskopu fluorescencyjnego z platformą zmotoryzowaną X/Y. Użyj obiektywu 20x, aby wykonać 8-bitowe obrazy RGB tiff w czterech kanałach odpowiadających barwnikowi DNA (4',6-diamidino-2-fenylindol [DAPI]), barwnikowi PanCK (izotiocyjanian fluoresceiny [FITC]), barwnikowi PD-L1 (CY3) i barwnikowi CD45 (CY5). Włącz lampę rtęciową 15 minut przed użyciem i dostosuj mikroskop i powiązane oprogramowanie do półautomatycznego fotografowania.
  2. Umieść szkiełko na platformie.
  3. W menu akwizycji zdefiniuj cztery kanały i ustaw czas ekspozycji (DAPI: 15 ms, FITC [PanCK]: 500 ms; CY3 [PD-L1]: 800 ms; CY5 [CD45]: 1,000 ms). Zdefiniuj kafelki do skanowania. Kliknij Kafelki. W obszarze Eksperyment zaawansowany zdefiniuj obszar do skanowania.
  4. Dostosuj ostrość na ekranie. Kliknij Rozpocznij eksperyment.
  5. Wyeksportuj pliki TIF każdego kanału i nazwij plik obrazu tymi informacjami: Sample_NumberofTilesRegion_dye_NumberOfSubtiles.tif (np. Sample1_TR1_c1m01). Nazwij barwnik w następujący sposób: kanał DAPI to c1, kanał FITC to c2, kanał CY3 to c3, a kanał CY5 to c4.

7. Analiza obrazów immunofluorescencyjnych za pomocą oprogramowania do analizy obrazu

  1. Pobierz i zainstaluj bezpłatne oprogramowanie do analizy obrazu ze strony internetowej Broad Institute. Zaakceptuj wszystkie ustawienia domyślne podczas instalacji. Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu i kliknij Plik | Potok z pliku | Analysis_4channels_CTC.cppipe.
    nuta: Potok konwertuje kolorowe obrazy RGB na skalę szarości, usuwa artefakty poprzez wygładzanie obrazów za pomocą filtra mediany, identyfikuje jądra i cytoplazmę, określa ilościowo intensywność fluorescencji każdego kanału i eksportuje je do pliku Excel.
  2. Upuść pliki na liście plików. Zaktualizuj metadane, aby pogrupować pliki według tiles.
    nuta: Wszystkie instrukcje grupowania obrazów są określone w oprogramowaniu. Pliki nazw pojawiły się w module NamesAndTypes, a pliki są pogrupowane według numeru kafelka i kanału na próbki.
  3. Kliknij opcję Wyświetl ustawienia wyjściowe i określ poprawne domyślne dane wyjściowe. Kliknij przycisk Analizuj obrazy. Otwórz plik arkusza kalkulacyjnego odpowiadający measure_intensity parametrom.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwszym warunkiem wstępnym było uzyskanie nieskażonych (wolnych od czynników zakaźnych) kolekcji CTC do hodowli tkankowej i uniknięcie generowania tła IF. Protokół dekontaminacji umożliwił oczyszczenie wszystkich rur i pomp, a także zaowocował zebraniem CTC o dobrym wskaźniku odzysku bez zanieczyszczenia bakteryjnego. Wzbogacone próbki porównano bez i z przebiegiem pracy protokołu dekontaminacji spiralnego urządzenia mikroprzepływowego. Aby zweryfikować protokół dekontaminacji, wykorzystano linię komórkową A549 w przyp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym badaniu poruszono dwie główne kwestie, pierwszą dotyczącą wydajności przepływu pracy w celu jej przeniesienia do zastosowań klinicznych, a drugą dotyczącą spadku subiektywności w analizie uzyskanych obrazów fluorescencyjnych.

Wydajny i zoptymalizowany przepływ pracy do liczenia CTC został początkowo określony przy użyciu konfigurowalnego testu IF po wzbogaceniu komórek za pomocą bezznacznikowego systemu mikroprzepływowego CTC (spiralne urządzenie mikroprzepływowe). Korzystając z t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jean-Philippe Aurel i Kathryn Weiqi Li są pracownikami firmy Biolidics, która produkuje instrumenty wykorzystane w tym artykule. Pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty badawcze od AstraZeneca (Londyn, Wielka Brytania), Biolidics (Singapur) i Ligue Contre le Cancer (Saone i Loara, Francja). Autorzy dziękują firmom AstraZeneca i Biolidics za wsparcie finansowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4',6-diamidyno-2-pH i ostry; nyindol (DAPI)OzymeBLE 422801Warunki przechowywania: +4 ° C
BD Facs Clean – 5 LBD Biosciences340345Środek czyszczący na bazie wybielacza. Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Wybielacz 1% Roztwór czyszczący 100 mlBiolidicsCBB-F016012Wybielacz. Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) 7,5%SigmaA8412Warunki przechowywania: +4 ° Przeciwciało
monoklonalne C CD45 (klon HI30) Alexa Fluor 647BioLegendBLE304020Warunki przechowywania: +4 ° C
CellProfiler SoftwareBroad InstituteOprogramowanie do analizy obrazu
WirówkaHettich4706Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Probówka wirówkowa 50 mlCorning430-829Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Probówka wirówkowa 15 mLBiolidicsCBB-F001004-25Warunki przechowywania: Temperatura
ClearCell FX-1 SystemBiolidicsCBB-F011002Spiralne urządzenie mikroprzepływowe. Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Środek czyszczący Coulter Clenz – 5 LBeckman Coulter8448222Uniwersalny odczynnik czyszczący. Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
CTChip FR1SBiolidicsCBB-FR001002Chip mikroprzepływowy. Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Cytospin 4ThermoFisherA78300003Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Odczynnik do rozcieńczania – 20 mLBiolidicsCBB-F016009Warunki przechowywania: +4 ° C
EZ CytofunnelsThermoFisherA78710003Komora na próbki z bawełny. Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Środek blokujący FcRMiltenyi Biotec130-059-901Warunki przechowywania: +4 ° C
Surowica cielęca płodu (FCS)Gibco10270-106Warunki przechowywania: +4 ° C
FluoromountSigmaF4680Rozwiązanie montażowe. Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Fungizone - 50 mgBristol-Myers-Squibb90129TB29Odczynnik przeciwgrzybiczy. Warunki przechowywania: +4 ° C
FX1 Słomka wejściowa z nakrętką z zakrętkąBiolidicsCBB-F013005Słomka. Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
KovaSlideDutscher50126Zjeżdżalnia komorowa. Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Przeciwciało monoklonalne PanCK (klon AE1/AE3) Alexa Fluor 488ThermoFisher53-9003-80Warunki przechowywania: +4 ° C
Paraformaldehyd 16%ThermoFisher11490570Roztwór utrwalający. Warunki przechowywania: +4 ° Przeciwciało
monoklonalne C PD-L1 (klon 29E2A3) - PhycoerythrinBioLegendBLE329706Warunki przechowywania: +4 ° C
Szalka PetriegoDutscher632180Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)OzymeBE17-512FWarunki przechowywania: +4 ° C
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Ultra Pure Grade 1x – 1 L1st Base LaboratoryBUF-2040-1X1LWarunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Pluronic F-68 10%Gibco24040-032Roztwór antywiążący. Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Szkiełka polilizynoweThermoFisherJ2800AMNZWarunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Probówka stożkowa z polipropylenu 50 mlFalcon352098Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Bufor do lizy RBC – 100 mLG Biosciences786-649Warunki przechowywania: +4 ° C
Bufor do lizy RBC – 250 mLG Biosciences786-650Warunki przechowywania: +4 ° C
Bufor do recytacji (RSB)BiolidicsCBB-F016003Warunki przechowywania: +4 ° Wirówka C
Shandon Cytopsin4ThermoFisherA78300003Dedykowana wirówka. Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Izolator krzemuGrace bio-Labs664270Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Sterylna woda dejonizowana – 100 mL1st Base LaboratoryCUS-4100-100mlWarunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Prosty mikroskop fluorescencyjny Axio Imager D1ZeissWarunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Chirurgiczne Sterylne TorbaSPS Laboratoires98ULT01240Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Strzykawka BD Discardit II 20 mL sterylnaBD Biosciences300296Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Filtr strzykawkowy 0,22 i mikro; m 33 mm sterylnyClearLine51732Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Zen lite 2.3 Lite OprogramowanieZeissMicroscope
pokojowa

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gandhi, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 378 (22), 2078-2092 (2018).
  2. Paz-Ares, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy for Squamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 379 (21), 2040-2051 (2018).
  3. Langer, C. J., et al. Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study. The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).
  4. Hellmann, M. D., et al. Tumor Mutational Burden and Efficacy of Nivolumab Monotherapy and in Combination with Ipilimumab in Small-Cell Lung Cancer. Cancer Cell. 33 (5), 853-861 (2018).
  5. Chouaid, C., et al. Feasibility and clinical impact of re-biopsy in advanced non small-cell lung cancer: a prospective multicenter study in a real-world setting (GFPC study 12-01). Lung cancer. 86 (2), Amsterdam, Netherlands. 170-173 (2014).
  6. Nosaki, K., et al. Re-biopsy status among non-small cell lung cancer patients in Japan: A retrospective study. Lung cancer. 101, Amsterdam, Netherlands. 1-8 (2016).
  7. Uozu, S., et al. Feasibility of tissue re-biopsy in non-small cell lung cancers resistant to previous epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor therapies. BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 175(2017).
  8. Kim, T. O., et al. Feasibility of re-biopsy and EGFR mutation analysis in patients with non-small cell lung cancer. Thoracic Cancer. 9 (7), 856-864 (2018).
  9. Nicolazzo, C., et al. Monitoring PD-L1 positive circulating tumor cells in non-small cell lung cancer patients treated with the PD-1 inhibitor Nivolumab. Scientific Reports. 6, 31726(2016).
  10. Guibert, N., et al. PD-L1 expression in circulating tumor cells of advanced non-small cell lung cancer patients treated with nivolumab. Lung cancer. 120, Amsterdam, Netherlands. 108-112 (2018).
  11. Wang, Y., et al. PD-L1 Expression in Circulating Tumor Cells Increases during Radio(chemo)therapy and Indicates Poor Prognosis in Non-small Cell Lung Cancer. Scientific Reports. 9 (1), 566(2019).
  12. Hao, S. -J., Wan, Y., Xia, Y. -Q., Zou, X., Zheng, S. -Y. Size-based separation methods of circulating tumor cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 125, 3-20 (2018).
  13. Williams, A., Balic, M., Datar, R., Cote, R. Size-based enrichment technologies for CTC detection and characterization. Recent results in cancer research. Fortschritte der Krebsforschung. Progres dans les recherches sur le cancer. 195, 87-95 (2012).
  14. Garcia, J., et al. Profiling of Circulating Tumor DNA (ctDNA) in Plasma of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients, Monitoring of EGFR p.T790M mutated allelic fraction using BEAMing Companion Assay and Evaluation in future application in mimicking Circulating Tumors Cells (mCTC). Cancer Medicine. , Forthcoming (2019).
  15. Garcia, J., et al. Evaluation of pre-analytical conditions and comparison of the performance of several digital PCR assays for the detection of major EGFR mutations in circulating DNA from non-small cell lung cancers: the CIRCAN_0 study. Oncotarget. 8 (50), 87980-87996 (2017).
  16. Lustberg, M. B., et al. Heterogeneous atypical cell populations are present in blood of metastatic breast cancer patients. Breast Cancer Research. 16 (2), 23(2014).
  17. Ilie, M., et al. "Sentinel" circulating tumor cells allow early diagnosis of lung cancer in patients with chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 9 (10), 111597(2014).
  18. Khoo, B. L., et al. Clinical validation of an ultra high-throughput spiral microfluidics for the detection and enrichment of viable circulating tumor cells. PLoS ONE. 9 (7), 99409(2014).
  19. Heymann, J. J., et al. PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens. Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).
  20. Biswas, A., et al. Clinical performance of endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration for assessing programmed death ligand-1 expression in nonsmall cell lung cancer. Diagnostic Cytopathology. 46 (5), 378-383 (2018).
  21. Buttner, R., et al. Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Circulating Tumor CellsPD L1 CharacterizationSpiral Microfluidic DeviceImmunofluorescence StainingCTC EnrichmentCytospin PreparationImage Analysis SoftwareFluorescent MicroscopyBlood Sample ProcessingEpithelial to Mesenchymal Transition

Powiązane artykuły