Artykuł metodologiczny

Synteza deuterowanego wzorca do oznaczania ilościowego 2-arachidonoiloglicerolu w Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/59882

⸱

21 września 2019

 ,  ,  ,  , 
1Instituto de Química Rosario (IQUIR-CONICET), Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, 2Laboratorio de Fisiología Microbiana, Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, 3Departamento de Química Orgánica, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca opisuje solidną i prostą metodę wykrywania i ilościowego oznaczania endokannabinoidu 2-arachidonoiloglycerolu (2-AG) u C. elegans. Analityczny deuterowany wzorzec nas przygotowany i stosowany do oznaczania ilościowego 2-AG przez rozcieńczenie izotopowe i chromatografię cieczową - jonizację elektronową - tandemową spektrometrię mas (LC-ESI-MS / MS).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca przedstawia metodę przygotowania standardu analitycznego do jakościowej i ilościowej analizy 2-arachidonoilu glicerolu (2-AG) metodą chromatografii cieczowej-elektrorozpylania Jonizacji-tandemowej spektrometrii mas (LC-ESI-MS/MS). Endokannabinoidy są konserwatywnymi mediatorami lipidowymi, które regulują wiele procesów biologicznych w różnych organizmach. Stwierdzono, że u C. elegans 2-AG pełni różne role, w tym modulację tworzenia dauer i metabolizmu cholesterolu. W niniejszym raporcie opisano metodę przezwyciężenia trudności związanych z kosztami i stabilnością deuterowanych wzorców wymaganych do oznaczania ilościowego 2-AG. Procedura syntezy wzorca jest prosta i może być wykonana w dowolnym laboratorium, bez konieczności posiadania specjalistycznej wiedzy z zakresu syntezy organicznej lub specjalnego sprzętu. Ponadto opisano modyfikację metody Folcha polegającą na ekstrakcji deuterowanego wzorca z kultury C. elegans. Na koniec opisano ilościową i analityczną metodę wykrywania 2-AG przy użyciu stabilnego izotopowo znakowanego analogu 1-AG-d5, która zapewnia wiarygodne wyniki w szybkim przebiegu chromatograficznym. Procedura ta jest przydatna do badania wielorakich ról 2-AG w C. elegans, a jednocześnie ma zastosowanie do innych badań metabolitów w różnych organizmach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endokannabinoidy regulują wiele procesów biologicznych w różnych organizmach i są konserwatywnymi mediatorami lipidów1. Pierwszymi odkrytymi i najlepiej scharakteryzowanymi endokannabinoidami są anandamid (arachidonoiloetanoloamid, AEA) i 2-arachidonoiloglicerol (2-AG). Endokannabinoidy odgrywają wiele kluczowych ról, w tym te zaangażowane w układy nagrody w mózgu, a także uzależnienie od narkotyków, pamięć, nastrój i procesy metaboliczne2. AEA i 2-AG są syntetyzowane tylko wtedy, gdy są potrzebne i mają krótką żywotność, a także są degradowane przez wychwyt zwrotny i hydrolizę białek transportowych3.

Wykorzystanie modeli zwierzęcych, takich jak Caenorhabditis elegans (C. elegans) stało się ważne do badania szerokiej gamy procesów biologicznych, w tym apoptozy, sygnalizacji komórkowej, cyklu komórkowego, polaryzacji komórek, regulacji genów, metabolizmu, starzenia się i determinacji płci4,5. Dodatkowo C. elegans jest doskonałym modelem do badania fizjologicznych ról wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA). AEA zostało zidentyfikowane u C. elegans i jest zmniejszone w ramach ograniczeń dietetycznych6. Niedobór ten wydłuża życie nicieni poprzez mechanizm ograniczeń dietetycznych, który może być stłumiony przez suplementację endokannabinoidem. Niedawno odkryto, że 2-AG i AEA odgrywają fundamentalną rolę w regulacji transportu cholesterolu u C. elegans7. Co ważniejsze, ustalono, że suplementacja egzogennym 2-AG może uratować zatrzymanie dawki, które jest spowodowane upośledzonym transportem cholesterolu w mutantach C. elegans Niemann-Pick typu C1. elegans.

Aby lepiej zrozumieć związek 2-AG z transportem cholesterolu i innymi procesami biologicznymi u nicieni (np. sygnalizacją monoaminergiczną, nocycepcją i lokomocją), kluczowe jest zbadanie tego endogennego metabolitu i jego wpływu w pewnych warunkach środowiskowych i żywieniowych8,9,10,11,12,13. Dlatego konieczne jest zaprojektowanie i zoptymalizowanie metody wykrywania i ilościowego oznaczania endogennego 2-AG w C. elegans, która jest łatwa w użyciu dla naukowców z różnych dziedzin, zwłaszcza tych, którzy badają zachowanie nicieni w odniesieniu do tego endokannabinoidu.

W 2008 roku Lethonenowi i współpracownikom udało się zidentyfikować 2-AG i AEA u C. elegans za pomocą metod analitycznych LC-MS14. W 2011 roku udało im się rozszerzyć tę technikę na inne endokannabinoidy15. Nowsze prace wykazały inne metody analityczne, które odniosły sukces w wykrywaniu i ilościowym określaniu endokannabinoidów w C. elegans, w tym spektrometria mas i GC-MS16,17,18, a także zgłoszono, że podobne metody analityczne można rozszerzyć na inne modele19.

Poprzednio opisywane metody analityczne używane do ilościowego oznaczania 2-AG w próbkach biologicznych zazwyczaj obejmują użycie deuterowanych wzorców, które są komercyjnie nabyte i wymagają dostępności do zakupu20,21. Wiele wzorców analitycznych do oznaczania ilościowego endokannabinoidów LC-MS/MS jest dostępnych na rynku u różnych dostawców. Niemniej jednak są drogie, są wrażliwe i z czasem ulegają utlenieniu ze względu na obecność wielu wiązań podwójnych. Najpopularniejsze wersje tych wzorców są oparte na okta-deuterowanym kwasie arachidonowym i nadają się do oznaczania ilościowego przez rozcieńczenie izotopowe LC-MS/MS14,22. Ponadto większość tych wzorców jest podstawiana w pozycji 2 glicerolu, co czyni je niestabilnymi w większości warunków, ponieważ są podatne na migrację acylową19,23.

Aby przezwyciężyć trudności związane z kosztami i stabilnością tych deuterowanych standardów, przedstawiono wygodną i prostą metodę przygotowania wzorca analitycznego opartego na glicerolu-d5. Sekwencja przygotowania wzorca penta-deuterowanego wymaga trzyetapowej procedury, w wyniku której powstaje wzorzec 1-AG-d5, który jest stabilny i nie ulega migracji acylowej (główny problem przy dążeniu do syntezy 2-monoacylogliceroli).

Głównym celem tutaj jest pokazanie prostej i powtarzalnej metody badania 2-AG u C. elegans, w tym syntezy analitycznego wzorca deuterowanego, przygotowania i ekstrakcji próbek nicieni oraz analizy za pomocą LC-MS/MS (rysunek 1). Ta syntetyczna procedura jest możliwa do osiągnięcia bez zaawansowanej wiedzy na temat syntezy organicznej lub specjalnego sprzętu, dzięki czemu jest odpowiednia dla naukowców z różnych dziedzin, którzy badają zachowanie C. elegans pod wpływem endokannabinoidów. Metodę można również rozszerzyć na inne modele badawcze, dzięki czemu jest przydatna dla różnych celów. Wzorzec, przygotowany zgodnie z opisem tutaj, został zastosowany do pomyślnego opracowania szybkiej i niezawodnej metody chromatograficznej, która pozwala na skuteczne wykrywanie i oznaczanie ilościowe 2-AG w powtarzalny sposób.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie 1-AG-d5

UWAGA: Aby uzyskać 1-AG-d5 jako deuterowany wzorzec wewnętrzny do testów ilościowych, postępuj zgodnie z protokołem opisanym poniżej.

  1. Zabezpieczenie różnicowe
    1. Aby chronić tylko alkohole pierwszorzędowe, najpierw dodaj 38 mg glicerolu-d8 do probówki reakcyjnej o pojemności 10 ml za pomocą pipety Pasteura i dodaj mieszadło magnetyczne.
    2. Dodać 5 ml bezwodnego dichlorometanu (DCM) za pomocą 5 ml strzykawki Hamiltona i napełnić probówkę suchymN2 w celu uzyskania obojętnej atmosfery.
    3. Przygotować kąpiel przy użyciu płytkiej kolby Dewara wypełnionej destylowanym octanem etylu.
    4. Umieścić hermetycznie zamkniętą rurkę reakcyjną wewnątrz kąpieli i schłodzić ją, powoli dodając cieczN2 do octanu etylu, aż rozpuszczalnik zostanie zamrożony.
      UWAGA: Płyn gwałtownie wrze w temperaturze pokojowej (RT) i może spowodować poważne oparzenia w kontakcie z oczami i skórą.
    5. Dodać 54 mg bezwodnej zderydyny za pomocą strzykawki Hamiltona.
      UWAGA: Kolidyna jest lotna i ma bardzo silny i nieprzyjemny zapach.
    6. Dodać 70 mg chlorku tert-butylodimetylosililu i mieszać cały roztwór przez 3 godziny w temperaturze -78 °C na mieszadle magnetycznym.
    7. Po 3 godzinach pozostawić reakcję do ogrzania w temperaturze pokojowej i mieszać przez dodatkowe 12 godzin.
    8. Dodaj 2 ml solanki, aby ugasić reakcję.
    9. Ekstrahować roztwór 3x 2 ml destylowanego dichlorometanu za pomocą rozdzielacza, za każdym razem oszczędzając ekstrakt organiczny.
    10. Połącz trzy ekstrakty organiczne i wysusz je na siarczanie sodu.
    11. Ostrożnie odparować dichlorometan pod zmniejszonym ciśnieniem w próżniowej wyparce obrotowej, aby uniknąć rozpylania rozpuszczalnika.
    12. Oczyść surową mieszaninę za pomocą chromatografii kolumnowej, używając żelu krzemionkowego jako fazy stacjonarnej i 10% rosnącego gradientu heksanu/octanu etylu, zaczynając od 100% heksanu, a kończąc na 100% octanie etylu.
    13. Połączyć frakcje zawierające produkt i usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem w próżniowej wyparce rotacyjnej, aby otrzymać czysty 1-O,3-O-bis-(TBDMS) glicerol-d5 w postaci bezbarwnej cieczy.
  2. Estryfikacji
    1. Dodać 10 mg 1-O,3-O-bis(TBDMS)-glicerol-d5 (wcześniej zsyntetyzowanego) do 10 ml probówki reakcyjnej za pomocą pipety Pasteura i dodać mieszadło magnetyczne.
    2. Dodać 2 ml bezwodnego dichlorometanu za pomocą 5 ml strzykawki Hamiltona i napełnić probówkę suchymN2 do uzyskania obojętnej atmosfery.
    3. Schłodzić roztwór do temperatury 0 °C w łaźni lodowej.
    4. Dodać 36 mg kwasu arachidonowego za pomocą regulowanej mikropipety o dużej objętości i wymieszać.
    5. Dodać 15 mg 4-dimetyloaminopirydyny i wymieszać.
    6. Dodać 15 mg N,N'-diizopropylokarbodimidu za pomocą mikropipety o regulowanej objętości i wymieszać.
    7. Pozostawić mieszaninę w temperaturze 0 °C na 3 godziny.
    8. Po 3 godzinach pozostawić reakcję do ogrzania w temperaturze pokojowej i mieszać przez dodatkowe 12 godzin.
    9. Dodaj 2 ml wody, aby ugasić reakcję.
    10. Ekstrahować roztwór organiczny 3x 2 ml destylowanego dichlorometanu (DCM) za pomocą rozdzielacza.
    11. Umieść trzy ekstrakty organiczne w tej samej probówce i wysusz je na siarczanie sodu.
    12. Ostrożnie odparować dichlorometan pod zmniejszonym ciśnieniem w próżniowej wyparce obrotowej, aby uniknąć rozpylania rozpuszczalnika.
    13. Oczyść surową mieszaninę za pomocą chromatografii kolumnowej, używając żelu krzemionkowego jako fazy stacjonarnej i 10% rosnącego gradientu heksanu/octanu etylu, zaczynając od 100% heksanu, a kończąc na 50% heksanie/50% octanie etylu.
    14. Połączyć frakcje zawierające produkt i usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem w próżniowej wyparce obrotowej, aby otrzymać czysty 1-O, 3-O-bis(TBDMS)-2-AG-d5 w postaci żółtawej cieczy.
  3. Dezochrona
    1. Dodać 15 mg 1-O,3-O-bis(TBDMS)-2-AG-d5 (wcześniej zsyntetyzowanego) do 10 ml probówki reakcyjnej za pomocą pipety Pasteura i dodać mieszadło magnetyczne.
    2. Dodać 2 ml bezwodnego THF za pomocą strzykawki Hamiltona o pojemności 5 ml i napełnić probówkę suchymN2, aby uzyskać obojętną atmosferę.
    3. Schłodzić roztwór do temperatury 0 °C w łaźni lodowej.
    4. Dodać kroplami 150 μl 1 M roztworu fluorku tetrabutyloamonu w THF za pomocą strzykawki Hamiltona.
    5. Pozwól reakcji ogrzać się do RT i mieszaj przez 1 godzinę.
    6. Po 1 godzinie dodaj 2 ml wody, aby wygasić reakcję.
    7. Ekstrahować roztwór 3x 2 ml destylowanego dichlorometanu za pomocą rozdzielacza.
    8. Połącz trzy ekstrakty organiczne i wysusz je na siarczanie sodu.
    9. Odparować dichlorometan pod zmniejszonym ciśnieniem w próżniowej wyparce obrotowej, aby otrzymać czysty 1-AG-d5 w postaci żółtawej cieczy.
  4. Monitoruj wszystkie reakcje za pomocą chromatografii cienkowarstwowej przeprowadzonej na wstępnie powlekanych blachach aluminiowych z żelem krzemionkowym 60 F254. Wizualizacja pasm pod lampą UV 254 nm po zabarwieniu etanolowym roztworem aldehydu 4-aniżowego.

2. Przygotowanie standardowych roztworów podstawowych i pomiarowych

  1. Rozpuścić 1 mg wzorca wewnętrznego 1-AG-d5 w 1 ml ACN i sonikować przez 1 minutę, aby uzyskać 1,000 ppm wzorcowego roztworu podstawowego.
  2. Aby przygotować roztwór 1000 ppb używany do oznaczania ilościowego u robaków, najpierw przygotuj roztwór o stężeniu 10 ppm: weź 10 μl roztworu podstawowego za pomocą strzykawki Hamiltona i rozcieńcz go do końcowej objętości 1 ml, dodając 990 μl ACN.
  3. Pobrać 100 μl z roztworu wytworzonego w kroku 2.2 za pomocą strzykawki Hamiltona i rozcieńczyć go do końcowej objętości 1 ml przez dodanie 900 μl ACN w celu otrzymania roztworu 1000 ppb użytego do oznaczania ilościowego.
  4. Sonikuj przez 1 minutę między każdym krokiem, aby zapewnić całkowitą rozpuszczalność. Roztwory należy przechowywać w temperaturze -78 °C w celu utrzymania stężeń i integralności wzorców. Po użyciu roztworu wzorcowego należy przepuścić trochę azotu przed zamknięciem fiolki, aby zapobiec utlenianiu.

3. Wzrost i utrzymanie C. elegans

UWAGA: Zasiej płytki agarowe pożywki dla nicieni (NGM) E. coli OP50 i rozmnóż robaki na tych płytkach.

  1. Wymieszaj 3 g NaCl z 17 g agaru.
  2. Dodać 2,5 g peptonu, a następnie dodać 975 ml H2O.
  3. Przechowywać w autoklawie przez 50 minut, a następnie schłodzić kolbę do temperatury 55 °C.
  4. Wymieszać następujące elementy: 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4, 25 ml 1 M KH2PO4 buforu (z których wszystkie zostały wcześniej autoklawowane) i 1 ml 5 mg/ml cholesterolu w etanolu.
  5. Utrzymując sterylne środowisko, dozować roztwór NGM do 60-milimetrowych płytek Petriego, wypełniając płytki do dwóch trzecich ich objętości. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C.
  6. Umieść kulturę bakterii E. coli z bulionu glicerolu o temperaturze -80 °C na płytkę agarową LB. Pozostaw na noc na talerzu w temperaturze 37 °C.
  7. Zebrać pojedynczą kolonię, aby zaszczepić 100 ml płynnego LB przez noc w temperaturze 37 °C z mieszaniem.
    UWAGA: Nie jest konieczne sprawdzanie średnicy zewnętrznej, ponieważ w tym czasie szczep ten może osiągnąć fazę stacjonarną.
  8. Wyjmij przechowywane płytki NGM, zdejmij pokrywki z okapu z przepływem laminarnym i pozostaw otwarte, aby umożliwić odparowanie nadmiaru wilgoci z płyt.
  9. Po wysuszeniu płytek użyj pipety Pasteura, aby dodać 100 μl OP50 E. coli do środka płytki bez rozprowadzania.
  10. Pozostaw trawnik OP50 E. coli do wzrostu na noc w temperaturze pokojowej lub 37 °C przez 8 godzin.
  11. Dodać żądaną liczbę zarodków robaków otrzymanych przez poddziałanie podchlorynu lub "wybielanie" (sekcja 4).
    UWAGA: Ostudzić talerze do temperatury RT przed dodaniem robaków.

4. Technika wybielania do synchronizacji kultur C elegans

  1. Nasiona i kawałki robaków na 6 cm talerze NGM.
  2. Pozostaw robaki rosnące na 2-3 dni, aby uzyskać wystarczającą liczbę jaj i ciężarnych dorosłych osobników na talerzu.
  3. Gdy będzie wystarczająca ilość jaj/dorosłych, wlej 5 ml M9 na talerz
    4. .
  4. Przenieś robaki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą szklanej pipety.
  5. Odwiruj probówkę przez 2 minuty przy 2,000 x g i rozpuść robaki.
  6. Wysysaj większość M9, unikając zakłóceń granulki robaka.
  7. Dodać 3 ml roztworu wybielającego (stosunek NaOH:NaOCl:H2O 2:1:1).
  8. Delikatnie odwróć, aby mieszać roztwór przez 5 minut lub do momentu, gdy liczba nienaruszonych dorosłych robaków zmniejszy się.
    UWAGA: Nie wybielać dłużej niż 5 minut.
  9. Wirować przez 1 minutę przy 2,000 x g i odsysać większość roztworu wybielającego bez naruszania osadu robaka.
  10. Dodaj 15 ml M9 i dobrze wymieszaj.
  11. Odwirować ponownie przy 2000 x g przez 1 min.
  12. Wysysaj większość M9 bez naruszania granulki robaka.
  13. Powtórz kroki 4.10-4.12 jeszcze raz lub dwa razy.
  14. Dodać 5 ml świeżego M9 i wymieszać.
  15. Pozwól jajom wykluć się przez noc, delikatnie kołysząc.

5. Przygotowanie próbki robaka

  1. Pozostawić zarodki N2 uzyskane w procesie bielenia na noc wylęgnąć się w buforze M9 (5 ml w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml) w temperaturze 20 °C.
  2. Zbierz zsynchronizowane L1, odwirowując probówkę przez 2 minuty przy 2,000 x g.
  3. Umyj robaki buforem M9 1x, a następnie określ ilościowo liczbę żywych robaków L1.
  4. Wysiew około 10 000 robaków na płytki NGM (średnica 10 cm) z 1 ml OP50 E. coli (wcześniej wysuszonych).
  5. Inkubować płytki przez 48 godzin w temperaturze 20 °C, aż robaki osiągną stadium L4.
  6. Zbierz robaki za pomocą zimnego bufora M9 w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, umyj je 1x, a następnie przenieś do probówki o pojemności 1,5 ml.
  7. Granulować robaki przez odwirowanie przy 2 000 x g przez 1 minutę, usunąć większość supernatantu, zanurzyć probówki w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

6. Ekstrakcja lipidów

  1. Rozmrozić na lodzie około 100 μl zamrożonych granulek robaków należących do N2, dodać 1,3 ml metanolu i poddać próbkę sonikacji przez 4 minuty.
  2. Dodać 2,6 ml chloroformu i 1,3 ml 0,5 M KCl/0,08 M H3PO4 do końcowego stosunku 1:2:1, 1000 ppb wzorca wewnętrznego 1-AG-d5 i butylowany hydroksytoluen jako środek przeciwutleniający w końcowym stężeniu 50 μg/ml.
  3. Wirować próbki przez 1 minutę i sonikować w ultradźwiękowej łaźni wodnej przez 15 minut na lodzie.
  4. Wirować próbki 2x przez 1 minutę i odwirowywać przez 10 minut przy 2 000 x g, aby wywołać separację faz.
  5. Zebrać dolną fazę i zebrać ją w czystej probówce, wysuszyć pod azotem i ponownie zawiesić stałą pozostałość w 100 μl ACN.

7. Analiza endokannabinoidów metodą HPLC-MS/MS

  1. Użyj chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrem masowym ESI z potrójnym kwadrupolem do wykrywania i ilościowego oznaczania 2-AG w próbkach nicieni.
  2. Dla HPLC z odwróconymi fazami należy stosować następujące proporcje: od 0,0-0,5 min H2O:ACN (40:60), 0,5-6,5 min H2O:ACN (40:60) do (25:75), 6,5-7,5 min H2O:ACN (25:75), 7,5-8,0 min H2O:ACN (25:75) do (40:60), 8,0-12,0 min H2O:ACN (40:60).
  3. Utrzymuj temperaturę kolumny na poziomie 40 °C i ustaw temperaturę tacy automatycznego podajnika próbek na 10 °C.
  4. Ustaw następujące warunki jonizacji: tryb jonów dodatnich; temperatura gazu suszącego (N2) = 300 °C; natężenie przepływu gazu suszącego = 10 l/min; ciśnienie nebulizatora = 10 UA; i napięcie nasadki = 4 kV.
  5. Do wykrywania analitu należy użyć MRM z następującymi przejściami: 379,2 m/z do 289,2 m/z dla 2-AG i 384,2 m/z do 289,2 m/z dla 1-AG-d5.

8. Kwantyfikacja endokannabinoidów u robaków

  1. Użyć deuterowanego wzorca wewnętrznego 1-AG-d5 i obliczyć stosunek powierzchni pików analitu do wzorca wewnętrznego.
  2. Użyj następujących przejść: 384,2 m/z do 287,2 m/z dla 2-AG i 379,2 m/z do 287,2 m/z dla 1-AG-d5.
  3. Obliczyć stężenie endogennego 2-AG, porównując je ze stosunkami powierzchni pików deuterowanego wzorca, stosując wartość stężenia wzorca.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izotopowo znakowany analog został pomyślnie zsyntetyzowany z komercyjnie dostępnego d 8-glicerolu i kwasu arachidonowego przy użyciu 3-etapowej metody syntezy (Rysunek 2, Rysunek 3). Te kroki są proste i nie wymagają wyrafinowanego sprzętu, specjalnie kontrolowanych warunków ani drogich odczynników. Dzięki temu metoda ta jest solidna i może być z powodzeniem rozszerzona o syntezę monoacyloglicerydów zawierających różne kwasy tłu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endokannabinoidy to klasa lipidów, które są zaangażowane w regulację tworzenia się dauer u C. elegans7. Mówiąc dokładniej, synteza wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA) jest ważna dla transportu cholesterolu i rozwoju reprodukcyjnego robaków. Okazuje się tutaj, że 2-AG, kwas arachidonowy zawierający endokannabinoid, jest odpowiedzialny za przywrócenie larwy dauer do normalnego cyklu u robaków, które mają upośledzony metabolizm cholesterolu7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta grantem badawczym z Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., G.P. i B.H.C. są stypendystami CONICET. D.d.M. i G.R.L. są członkami Zespołu Karier Badawczych CONICET. Jesteśmy wdzięczni Gonzalo Lamberto (INMET) za analizę LC-MS/MS i pomocną dyskusję. Kręceniem i montażem filmów są Ramiro Ortega i María Soledad Casasola z Dirección de Comunicación de la Ciencia, Facultad de Ciencia Política y Relaciones Internacionales, Universidad Nacional de Rosario w Rosario w Argentynie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-dimetyloaminopirydynaSigma-Aldrich107700klasa odczynnika, 99%
przeciwutleniacz BHTSigma-AldrichW21805
Kwas arachidonowySigma-Aldrich10931
Glycerol-d8Sigma-Aldrich447498
Detektor masy Potrójny kwadrupolThermo ScientificTSQ Quantum Access Max
N,N'-diizopropylokarbimidymidSigma-AldrichD125407
Spektrometr NMRBrukerAvance II 300 MHz
kolumna HPLC z odwróconymi fazamiThermo Fisher25003-052130C18 Hypersil-GOLD (50 x 2,1 mm)
chlorek tert-butylodimetylosililuSigma-Aldrich190500klasa odczynnika, 97%
Fluorek tetrabutyloamonuSigma-Aldrich2161431,0 m w systemie THF
UHPLCThermo ScientificUltimate 3000 RSLC Dionex
szczep robaka N2 BristolCaenorhabditis Centrum Genetyki (CGC)

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M. Evolutionary origins of the endocannabinoid system. Gene. 370, 64-74 (2006).
  2. Le Foll, B., Goldberg, S. R. Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).
  3. Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms. Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).
  4. Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).
  5. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline. Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).
  6. Lucanic, M., et al. N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).
  7. Galles, C., et al. Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves. Scientific Reports. 8 (1), 6398(2018).
  8. Kurihara, J., et al. 2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves. The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).
  9. Harris, G., et al. Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans. PLoS ONE. 6 (7), e21897(2011).
  10. Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32. Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).
  11. Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors. Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).
  12. Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. Anti-edema and analgesic properties of Δ9-tetrahydrocannabinol (THC). Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).
  13. Mills, H., et al. Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).
  14. Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes. Chemistry & Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).
  15. Lehtonen, M., et al. Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).
  16. Aarnio, V., et al. Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family. Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12(2011).
  17. Annibal, A., Karalay, Ö, Latza, C., Antebi, A. A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans. Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).
  18. Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).
  19. Batugedara, H. M., et al. Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection. Infection and Immunity. 86 (11), e00441(2018).
  20. Zhang, M. Y., et al. Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).
  21. Zoerner, A. A., et al. Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction. Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).
  22. Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).
  23. Keereetaweep, J., Chapman, K. D. Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification. Neural Plasticity. , (2016).
  24. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  25. Zoerner, A. A., et al. Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

2 ArachidonoylglycerolDeuterated StandardLC ESI MS MSC elegansCholesterol TraffickingFolch MethodColumn ChromatographyIsotopic DilutionWorm Sample PreparationMass Spectrometry

Powiązane artykuły