Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Synteza deuterowanego wzorca do oznaczania ilościowego 2-arachidonoiloglicerolu w Caenorhabditis elegans

6.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59882

⸱

21 września 2019

 ,  ,  ,  , 
1Instituto de Química Rosario (IQUIR-CONICET), Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, 2Laboratorio de Fisiología Microbiana, Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario, 3Departamento de Química Orgánica, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario

W tym artykule

Podsumowanie

Ta praca opisuje solidną i prostą metodę wykrywania i ilościowego oznaczania endokannabinoidu 2-arachidonoiloglycerolu (2-AG) u C. elegans. Analityczny deuterowany wzorzec nas przygotowany i stosowany do oznaczania ilościowego 2-AG przez rozcieńczenie izotopowe i chromatografię cieczową - jonizację elektronową - tandemową spektrometrię mas (LC-ESI-MS / MS).

Streszczenie

Ta praca przedstawia metodę przygotowania standardu analitycznego do jakościowej i ilościowej analizy 2-arachidonoilu glicerolu (2-AG) metodą chromatografii cieczowej-elektrorozpylania Jonizacji-tandemowej spektrometrii mas (LC-ESI-MS/MS). Endokannabinoidy są konserwatywnymi mediatorami lipidowymi, które regulują wiele procesów biologicznych w różnych organizmach. Stwierdzono, że u C. elegans 2-AG pełni różne role, w tym modulację tworzenia dauer i metabolizmu cholesterolu. W niniejszym raporcie opisano metodę przezwyciężenia trudności związanych z kosztami i stabilnością deuterowanych wzorców wymaganych do oznaczania ilościowego 2-AG. Procedura syntezy wzorca jest prosta i może być wykonana w dowolnym laboratorium, bez konieczności posiadania specjalistycznej wiedzy z zakresu syntezy organicznej lub specjalnego sprzętu. Ponadto opisano modyfikację metody Folcha polegającą na ekstrakcji deuterowanego wzorca z kultury C. elegans. Na koniec opisano ilościową i analityczną metodę wykrywania 2-AG przy użyciu stabilnego izotopowo znakowanego analogu 1-AG-d5, która zapewnia wiarygodne wyniki w szybkim przebiegu chromatograficznym. Procedura ta jest przydatna do badania wielorakich ról 2-AG w C. elegans, a jednocześnie ma zastosowanie do innych badań metabolitów w różnych organizmach.

Wprowadzenie

Endokannabinoidy regulują wiele procesów biologicznych w różnych organizmach i są konserwatywnymi mediatorami lipidów1. Pierwszymi odkrytymi i najlepiej scharakteryzowanymi endokannabinoidami są anandamid (arachidonoiloetanoloamid, AEA) i 2-arachidonoiloglicerol (2-AG). Endokannabinoidy odgrywają wiele kluczowych ról, w tym te zaangażowane w układy nagrody w mózgu, a także uzależnienie od narkotyków, pamięć, nastrój i procesy metaboliczne2. AEA i 2-AG są syntetyzowane tylko wtedy, gdy są potrzebne i mają krótką żywotność, a także są degradowane przez wychwyt zwrotny i hydrolizę białek transportowych3.

Wykorzystanie modeli zwierzęcych, takich jak Caenorhabditis elegans (C. elegans) stało się ważne do badania szerokiej gamy procesów biologicznych, w tym apoptozy, sygnalizacji komórkowej, cyklu komórkowego, polaryzacji komórek, regulacji genów, metabolizmu, starzenia się i determinacji płci4,5. Dodatkowo C. elegans jest doskonałym modelem do badania fizjologicznych ról wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA). AEA zostało zidentyfikowane u C. elegans i jest zmniejszone w ramach ograniczeń dietetycznych6. Niedobór ten wydłuża życie nicieni poprzez mechanizm ograniczeń dietetycznych, który może być stłumiony przez suplementację endokannabinoidem. Niedawno odkryto, że 2-AG i AEA odgrywają fundamentalną rolę w regulacji transportu cholesterolu u C. elegans7. Co ważniejsze, ustalono, że suplementacja egzogennym 2-AG może uratować zatrzymanie dawki, które jest spowodowane upośledzonym transportem cholesterolu w mutantach C. elegans Niemann-Pick typu C1. elegans.

Aby lepiej zrozumieć związek 2-AG z transportem cholesterolu i innymi procesami biologicznymi u nicieni (np. sygnalizacją monoaminergiczną, nocycepcją i lokomocją), kluczowe jest zbadanie tego endogennego metabolitu i jego wpływu w pewnych warunkach środowiskowych i żywieniowych8,9,10,11,12,13. Dlatego konieczne jest zaprojektowanie i zoptymalizowanie metody wykrywania i ilościowego oznaczania endogennego 2-AG w C. elegans, która jest łatwa w użyciu dla naukowców z różnych dziedzin, zwłaszcza tych, którzy badają zachowanie nicieni w odniesieniu do tego endokannabinoidu.

W 2008 roku Lethonenowi i współpracownikom udało się zidentyfikować 2-AG i AEA u C. elegans za pomocą metod analitycznych LC-MS14. W 2011 roku udało im się rozszerzyć tę technikę na inne endokannabinoidy15. Nowsze prace wykazały inne metody analityczne, które odniosły sukces w wykrywaniu i ilościowym określaniu endokannabinoidów w C. elegans, w tym spektrometria mas i GC-MS16,17,18, a także zgłoszono, że podobne metody analityczne można rozszerzyć na inne modele19.

Poprzednio opisywane metody analityczne używane do ilościowego oznaczania 2-AG w próbkach biologicznych zazwyczaj obejmują użycie deuterowanych wzorców, które są komercyjnie nabyte i wymagają dostępności do zakupu20,21. Wiele wzorców analitycznych do oznaczania ilościowego endokannabinoidów LC-MS/MS jest dostępnych na rynku u różnych dostawców. Niemniej jednak są drogie, są wrażliwe i z czasem ulegają utlenieniu ze względu na obecność wielu wiązań podwójnych. Najpopularniejsze wersje tych wzorców są oparte na okta-deuterowanym kwasie arachidonowym i nadają się do oznaczania ilościowego przez rozcieńczenie izotopowe LC-MS/MS14,22. Ponadto większość tych wzorców jest podstawiana w pozycji 2 glicerolu, co czyni je niestabilnymi w większości warunków, ponieważ są podatne na migrację acylową19,23.

Aby przezwyciężyć trudności związane z kosztami i stabilnością tych deuterowanych standardów, przedstawiono wygodną i prostą metodę przygotowania wzorca analitycznego opartego na glicerolu-d5. Sekwencja przygotowania wzorca penta-deuterowanego wymaga trzyetapowej procedury, w wyniku której powstaje wzorzec 1-AG-d5, który jest stabilny i nie ulega migracji acylowej (główny problem przy dążeniu do syntezy 2-monoacylogliceroli).

Głównym celem tutaj jest pokazanie prostej i powtarzalnej metody badania 2-AG u C. elegans, w tym syntezy analitycznego wzorca deuterowanego, przygotowania i ekstrakcji próbek nicieni oraz analizy za pomocą LC-MS/MS (rysunek 1). Ta syntetyczna procedura jest możliwa do osiągnięcia bez zaawansowanej wiedzy na temat syntezy organicznej lub specjalnego sprzętu, dzięki czemu jest odpowiednia dla naukowców z różnych dziedzin, którzy badają zachowanie C. elegans pod wpływem endokannabinoidów. Metodę można również rozszerzyć na inne modele badawcze, dzięki czemu jest przydatna dla różnych celów. Wzorzec, przygotowany zgodnie z opisem tutaj, został zastosowany do pomyślnego opracowania szybkiej i niezawodnej metody chromatograficznej, która pozwala na skuteczne wykrywanie i oznaczanie ilościowe 2-AG w powtarzalny sposób.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie 1-AG-d5

UWAGA: Aby uzyskać 1-AG-d5 jako deuterowany wzorzec wewnętrzny do testów ilościowych, postępuj zgodnie z protokołem opisanym poniżej.

  1. Zabezpieczenie różnicowe
    1. Aby chronić tylko alkohole pierwszorzędowe, najpierw dodaj 38 mg glicerolu-d8 do probówki reakcyjnej o pojemności 10 ml za pomocą pipety Pasteura i dodaj mieszadło magnetyczne.
    2. Dodać 5 ml bezwodnego dichlorometanu (DCM) za pomocą 5 ml strzykawki Hamiltona i napełnić probówkę suchymN2 w celu uzyskania obojętnej atmosfery.
    3. Przygotować kąpiel przy użyciu płytkiej kolby Dewara wypełnionej destylowanym octanem etylu.
    4. Umieścić hermetycznie zamkniętą rurkę reakcyjną wewnątrz kąpieli i schłodzić ją, powoli dodając cieczN2 do octanu etylu, aż rozpuszczalnik zostanie zamrożony.
      UWAGA: Płyn gwałtownie wrze w temperaturze pokojowej (RT) i może spowodować poważne oparzenia w kontakcie z oczami i skórą.
    5. Dodać 54 mg bezwodnej zderydyny za pomocą strzykawki Hamiltona.
      UWAGA: Kolidyna jest lotna i ma bardzo silny i nieprzyjemny zapach.
    6. Dodać 70 mg chlorku tert-butylodimetylosililu i mieszać cały roztwór przez 3 godziny w temperaturze -78 °C na mieszadle magnetycznym.
    7. Po 3 godzinach pozostawić reakcję do ogrzania w temperaturze pokojowej i mieszać przez dodatkowe 12 godzin.
    8. Dodaj 2 ml solanki, aby ugasić reakcję.
    9. Ekstrahować roztwór 3x 2 ml destylowanego dichlorometanu za pomocą rozdzielacza, za każdym razem oszczędzając ekstrakt organiczny.
    10. Połącz trzy ekstrakty organiczne i wysusz je na siarczanie sodu.
    11. Ostrożnie odparować dichlorometan pod zmniejszonym ciśnieniem w próżniowej wyparce obrotowej, aby uniknąć rozpylania rozpuszczalnika.
    12. Oczyść surową mieszaninę za pomocą chromatografii kolumnowej, używając żelu krzemionkowego jako fazy stacjonarnej i 10% rosnącego gradientu heksanu/octanu etylu, zaczynając od 100% heksanu, a kończąc na 100% octanie etylu.
    13. Połączyć frakcje zawierające produkt i usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem w próżniowej wyparce rotacyjnej, aby otrzymać czysty 1-O,3-O-bis-(TBDMS) glicerol-d5 w postaci bezbarwnej cieczy.
  2. Estryfikacji
    1. Dodać 10 mg 1-O,3-O-bis(TBDMS)-glicerol-d5 (wcześniej zsyntetyzowanego) do 10 ml probówki reakcyjnej za pomocą pipety Pasteura i dodać mieszadło magnetyczne.
    2. Dodać 2 ml bezwodnego dichlorometanu za pomocą 5 ml strzykawki Hamiltona i napełnić probówkę suchymN2 do uzyskania obojętnej atmosfery.
    3. Schłodzić roztwór do temperatury 0 °C w łaźni lodowej.
    4. Dodać 36 mg kwasu arachidonowego za pomocą regulowanej mikropipety o dużej objętości i wymieszać.
    5. Dodać 15 mg 4-dimetyloaminopirydyny i wymieszać.
    6. Dodać 15 mg N,N'-diizopropylokarbodimidu za pomocą mikropipety o regulowanej objętości i wymieszać.
    7. Pozostawić mieszaninę w temperaturze 0 °C na 3 godziny.
    8. Po 3 godzinach pozostawić reakcję do ogrzania w temperaturze pokojowej i mieszać przez dodatkowe 12 godzin.
    9. Dodaj 2 ml wody, aby ugasić reakcję.
    10. Ekstrahować roztwór organiczny 3x 2 ml destylowanego dichlorometanu (DCM) za pomocą rozdzielacza.
    11. Umieść trzy ekstrakty organiczne w tej samej probówce i wysusz je na siarczanie sodu.
    12. Ostrożnie odparować dichlorometan pod zmniejszonym ciśnieniem w próżniowej wyparce obrotowej, aby uniknąć rozpylania rozpuszczalnika.
    13. Oczyść surową mieszaninę za pomocą chromatografii kolumnowej, używając żelu krzemionkowego jako fazy stacjonarnej i 10% rosnącego gradientu heksanu/octanu etylu, zaczynając od 100% heksanu, a kończąc na 50% heksanie/50% octanie etylu.
    14. Połączyć frakcje zawierające produkt i usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem w próżniowej wyparce obrotowej, aby otrzymać czysty 1-O, 3-O-bis(TBDMS)-2-AG-d5 w postaci żółtawej cieczy.
  3. Dezochrona
    1. Dodać 15 mg 1-O,3-O-bis(TBDMS)-2-AG-d5 (wcześniej zsyntetyzowanego) do 10 ml probówki reakcyjnej za pomocą pipety Pasteura i dodać mieszadło magnetyczne.
    2. Dodać 2 ml bezwodnego THF za pomocą strzykawki Hamiltona o pojemności 5 ml i napełnić probówkę suchymN2, aby uzyskać obojętną atmosferę.
    3. Schłodzić roztwór do temperatury 0 °C w łaźni lodowej.
    4. Dodać kroplami 150 μl 1 M roztworu fluorku tetrabutyloamonu w THF za pomocą strzykawki Hamiltona.
    5. Pozwól reakcji ogrzać się do RT i mieszaj przez 1 godzinę.
    6. Po 1 godzinie dodaj 2 ml wody, aby wygasić reakcję.
    7. Ekstrahować roztwór 3x 2 ml destylowanego dichlorometanu za pomocą rozdzielacza.
    8. Połącz trzy ekstrakty organiczne i wysusz je na siarczanie sodu.
    9. Odparować dichlorometan pod zmniejszonym ciśnieniem w próżniowej wyparce obrotowej, aby otrzymać czysty 1-AG-d5 w postaci żółtawej cieczy.
  4. Monitoruj wszystkie reakcje za pomocą chromatografii cienkowarstwowej przeprowadzonej na wstępnie powlekanych blachach aluminiowych z żelem krzemionkowym 60 F254. Wizualizacja pasm pod lampą UV 254 nm po zabarwieniu etanolowym roztworem aldehydu 4-aniżowego.

2. Przygotowanie standardowych roztworów podstawowych i pomiarowych

  1. Rozpuścić 1 mg wzorca wewnętrznego 1-AG-d5 w 1 ml ACN i sonikować przez 1 minutę, aby uzyskać 1,000 ppm wzorcowego roztworu podstawowego.
  2. Aby przygotować roztwór 1000 ppb używany do oznaczania ilościowego u robaków, najpierw przygotuj roztwór o stężeniu 10 ppm: weź 10 μl roztworu podstawowego za pomocą strzykawki Hamiltona i rozcieńcz go do końcowej objętości 1 ml, dodając 990 μl ACN.
  3. Pobrać 100 μl z roztworu wytworzonego w kroku 2.2 za pomocą strzykawki Hamiltona i rozcieńczyć go do końcowej objętości 1 ml przez dodanie 900 μl ACN w celu otrzymania roztworu 1000 ppb użytego do oznaczania ilościowego.
  4. Sonikuj przez 1 minutę między każdym krokiem, aby zapewnić całkowitą rozpuszczalność. Roztwory należy przechowywać w temperaturze -78 °C w celu utrzymania stężeń i integralności wzorców. Po użyciu roztworu wzorcowego należy przepuścić trochę azotu przed zamknięciem fiolki, aby zapobiec utlenianiu.

3. Wzrost i utrzymanie C. elegans

UWAGA: Zasiej płytki agarowe pożywki dla nicieni (NGM) E. coli OP50 i rozmnóż robaki na tych płytkach.

  1. Wymieszaj 3 g NaCl z 17 g agaru.
  2. Dodać 2,5 g peptonu, a następnie dodać 975 ml H2O.
  3. Przechowywać w autoklawie przez 50 minut, a następnie schłodzić kolbę do temperatury 55 °C.
  4. Wymieszać następujące elementy: 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4, 25 ml 1 M KH2PO4 buforu (z których wszystkie zostały wcześniej autoklawowane) i 1 ml 5 mg/ml cholesterolu w etanolu.
  5. Utrzymując sterylne środowisko, dozować roztwór NGM do 60-milimetrowych płytek Petriego, wypełniając płytki do dwóch trzecich ich objętości. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C.
  6. Umieść kulturę bakterii E. coli z bulionu glicerolu o temperaturze -80 °C na płytkę agarową LB. Pozostaw na noc na talerzu w temperaturze 37 °C.
  7. Zebrać pojedynczą kolonię, aby zaszczepić 100 ml płynnego LB przez noc w temperaturze 37 °C z mieszaniem.
    UWAGA: Nie jest konieczne sprawdzanie średnicy zewnętrznej, ponieważ w tym czasie szczep ten może osiągnąć fazę stacjonarną.
  8. Wyjmij przechowywane płytki NGM, zdejmij pokrywki z okapu z przepływem laminarnym i pozostaw otwarte, aby umożliwić odparowanie nadmiaru wilgoci z płyt.
  9. Po wysuszeniu płytek użyj pipety Pasteura, aby dodać 100 μl OP50 E. coli do środka płytki bez rozprowadzania.
  10. Pozostaw trawnik OP50 E. coli do wzrostu na noc w temperaturze pokojowej lub 37 °C przez 8 godzin.
  11. Dodać żądaną liczbę zarodków robaków otrzymanych przez poddziałanie podchlorynu lub "wybielanie" (sekcja 4).
    UWAGA: Ostudzić talerze do temperatury RT przed dodaniem robaków.

4. Technika wybielania do synchronizacji kultur C elegans

  1. Nasiona i kawałki robaków na 6 cm talerze NGM.
  2. Pozostaw robaki rosnące na 2-3 dni, aby uzyskać wystarczającą liczbę jaj i ciężarnych dorosłych osobników na talerzu.
  3. Gdy będzie wystarczająca ilość jaj/dorosłych, wlej 5 ml M9 na talerz
    4. .
  4. Przenieś robaki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą szklanej pipety.
  5. Odwiruj probówkę przez 2 minuty przy 2,000 x g i rozpuść robaki.
  6. Wysysaj większość M9, unikając zakłóceń granulki robaka.
  7. Dodać 3 ml roztworu wybielającego (stosunek NaOH:NaOCl:H2O 2:1:1).
  8. Delikatnie odwróć, aby mieszać roztwór przez 5 minut lub do momentu, gdy liczba nienaruszonych dorosłych robaków zmniejszy się.
    UWAGA: Nie wybielać dłużej niż 5 minut.
  9. Wirować przez 1 minutę przy 2,000 x g i odsysać większość roztworu wybielającego bez naruszania osadu robaka.
  10. Dodaj 15 ml M9 i dobrze wymieszaj.
  11. Odwirować ponownie przy 2000 x g przez 1 min.
  12. Wysysaj większość M9 bez naruszania granulki robaka.
  13. Powtórz kroki 4.10-4.12 jeszcze raz lub dwa razy.
  14. Dodać 5 ml świeżego M9 i wymieszać.
  15. Pozwól jajom wykluć się przez noc, delikatnie kołysząc.

5. Przygotowanie próbki robaka

  1. Pozostawić zarodki N2 uzyskane w procesie bielenia na noc wylęgnąć się w buforze M9 (5 ml w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml) w temperaturze 20 °C.
  2. Zbierz zsynchronizowane L1, odwirowując probówkę przez 2 minuty przy 2,000 x g.
  3. Umyj robaki buforem M9 1x, a następnie określ ilościowo liczbę żywych robaków L1.
  4. Wysiew około 10 000 robaków na płytki NGM (średnica 10 cm) z 1 ml OP50 E. coli (wcześniej wysuszonych).
  5. Inkubować płytki przez 48 godzin w temperaturze 20 °C, aż robaki osiągną stadium L4.
  6. Zbierz robaki za pomocą zimnego bufora M9 w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, umyj je 1x, a następnie przenieś do probówki o pojemności 1,5 ml.
  7. Granulować robaki przez odwirowanie przy 2 000 x g przez 1 minutę, usunąć większość supernatantu, zanurzyć probówki w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

6. Ekstrakcja lipidów

  1. Rozmrozić na lodzie około 100 μl zamrożonych granulek robaków należących do N2, dodać 1,3 ml metanolu i poddać próbkę sonikacji przez 4 minuty.
  2. Dodać 2,6 ml chloroformu i 1,3 ml 0,5 M KCl/0,08 M H3PO4 do końcowego stosunku 1:2:1, 1000 ppb wzorca wewnętrznego 1-AG-d5 i butylowany hydroksytoluen jako środek przeciwutleniający w końcowym stężeniu 50 μg/ml.
  3. Wirować próbki przez 1 minutę i sonikować w ultradźwiękowej łaźni wodnej przez 15 minut na lodzie.
  4. Wirować próbki 2x przez 1 minutę i odwirowywać przez 10 minut przy 2 000 x g, aby wywołać separację faz.
  5. Zebrać dolną fazę i zebrać ją w czystej probówce, wysuszyć pod azotem i ponownie zawiesić stałą pozostałość w 100 μl ACN.

7. Analiza endokannabinoidów metodą HPLC-MS/MS

  1. Użyj chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrem masowym ESI z potrójnym kwadrupolem do wykrywania i ilościowego oznaczania 2-AG w próbkach nicieni.
  2. Dla HPLC z odwróconymi fazami należy stosować następujące proporcje: od 0,0-0,5 min H2O:ACN (40:60), 0,5-6,5 min H2O:ACN (40:60) do (25:75), 6,5-7,5 min H2O:ACN (25:75), 7,5-8,0 min H2O:ACN (25:75) do (40:60), 8,0-12,0 min H2O:ACN (40:60).
  3. Utrzymuj temperaturę kolumny na poziomie 40 °C i ustaw temperaturę tacy automatycznego podajnika próbek na 10 °C.
  4. Ustaw następujące warunki jonizacji: tryb jonów dodatnich; temperatura gazu suszącego (N2) = 300 °C; natężenie przepływu gazu suszącego = 10 l/min; ciśnienie nebulizatora = 10 UA; i napięcie nasadki = 4 kV.
  5. Do wykrywania analitu należy użyć MRM z następującymi przejściami: 379,2 m/z do 289,2 m/z dla 2-AG i 384,2 m/z do 289,2 m/z dla 1-AG-d5.

8. Kwantyfikacja endokannabinoidów u robaków

  1. Użyć deuterowanego wzorca wewnętrznego 1-AG-d5 i obliczyć stosunek powierzchni pików analitu do wzorca wewnętrznego.
  2. Użyj następujących przejść: 384,2 m/z do 287,2 m/z dla 2-AG i 379,2 m/z do 287,2 m/z dla 1-AG-d5.
  3. Obliczyć stężenie endogennego 2-AG, porównując je ze stosunkami powierzchni pików deuterowanego wzorca, stosując wartość stężenia wzorca.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analog znakowany izotopowo został pomyślnie zsyntetyzowany z dostępnego komercyjnie d8-glicerolu i kwasu arachidonowego przy użyciu trzystopniowej metody syntetycznej (Rysunek 2, Rysunek 3). Etapy te są proste i nie wymagają zaawansowanego sprzętu, specjalnie kontrolowanych warunków ani drogich odczynników. W związku z tym metoda ta jest odporna i może zostać z powodzeniem rozszerzona na syntezę monoacyloglicerydów zaw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Endokannabinoidy to klasa lipidów, które są zaangażowane w regulację tworzenia się dauer u C. elegans7. Mówiąc dokładniej, synteza wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA) jest ważna dla transportu cholesterolu i rozwoju reprodukcyjnego robaków. Okazuje się tutaj, że 2-AG, kwas arachidonowy zawierający endokannabinoid, jest odpowiedzialny za przywrócenie larwy dauer do normalnego cyklu u robaków, które mają upośledzony metabolizm cholesterolu7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca została wsparta grantem badawczym z Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., G.P. i B.H.C. są stypendystami CONICET. D.d.M. i G.R.L. są członkami Zespołu Karier Badawczych CONICET. Jesteśmy wdzięczni Gonzalo Lamberto (INMET) za analizę LC-MS/MS i pomocną dyskusję. Kręceniem i montażem filmów są Ramiro Ortega i María Soledad Casasola z Dirección de Comunicación de la Ciencia, Facultad de Ciencia Política y Relaciones Internacionales, Universidad Nacional de Rosario w Rosario w Argentynie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-dimetyloaminopirydynaSigma-Aldrich107700klasa odczynnika, 99%
przeciwutleniacz BHTSigma-AldrichW21805
Kwas arachidonowySigma-Aldrich10931
Glycerol-d8Sigma-Aldrich447498
Detektor masy Potrójny kwadrupolThermo ScientificTSQ Quantum Access Max
N,N'-diizopropylokarbimidymidSigma-AldrichD125407
Spektrometr NMRBrukerAvance II 300 MHz
kolumna HPLC z odwróconymi fazamiThermo Fisher25003-052130C18 Hypersil-GOLD (50 x 2,1 mm)
chlorek tert-butylodimetylosililuSigma-Aldrich190500klasa odczynnika, 97%
Fluorek tetrabutyloamonuSigma-Aldrich2161431,0 m w systemie THF
UHPLCThermo ScientificUltimate 3000 RSLC Dionex
szczep robaka N2 BristolCaenorhabditis Centrum Genetyki (CGC)

Bibliografia

  1. McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M. Evolutionary origins of the endocannabinoid system. Gene. 370, 64-74 (2006).
  2. Le Foll, B., Goldberg, S. R. Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).
  3. Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms. Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).
  4. Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).
  5. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline. Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).
  6. Lucanic, M., et al. N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).
  7. Galles, C., et al. Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves. Scientific Reports. 8 (1), 6398(2018).
  8. Kurihara, J., et al. 2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves. The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).
  9. Harris, G., et al. Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans. PLoS ONE. 6 (7), e21897(2011).
  10. Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32. Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).
  11. Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors. Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).
  12. Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. Anti-edema and analgesic properties of Δ9-tetrahydrocannabinol (THC). Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).
  13. Mills, H., et al. Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).
  14. Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes. Chemistry & Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).
  15. Lehtonen, M., et al. Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).
  16. Aarnio, V., et al. Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family. Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12(2011).
  17. Annibal, A., Karalay, Ö, Latza, C., Antebi, A. A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans. Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).
  18. Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).
  19. Batugedara, H. M., et al. Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection. Infection and Immunity. 86 (11), e00441(2018).
  20. Zhang, M. Y., et al. Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).
  21. Zoerner, A. A., et al. Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction. Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).
  22. Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).
  23. Keereetaweep, J., Chapman, K. D. Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification. Neural Plasticity. , (2016).
  24. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  25. Zoerner, A. A., et al. Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

LC ESI MS MSC eleganstransport cholesterolumetoda Folchachromatografia kolumnowarozcie czenie izotopoweprzygotowanie pr bek nicienispektrometria mas
Synteza deuterowanego wzorca do oznaczania ilościowego 2-arachidonoiloglicerolu w Caenorhabditis elegans
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.