Artykuł metodologiczny

Przygotowanie i wykorzystanie świeżo wyizolowanych ludzkich komórek mięśni gładkich wypieracza do charakterystyki 9-fenantrolowych prądów kationowych

9.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59884

⸱

31 stycznia 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Urology, Medical University of South Carolina, 3Department of Urology, College of Medicine, University of Tennessee Health Science Center, 4Department of Pharmacology, College of Medicine, University of Tennessee Health Science Center

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metodę przygotowania pojedynczych, świeżo wyizolowanych komórek mięśni gładkich wypieracza z próbek ludzkiego pęcherza moczowego, stosując dwuetapową procedurę enzymatyczną. Uzyskane żywotne komórki DSM można badać za pomocą różnych technik jednokomórkowych, w tym opisanej elektrofizjologii amfoterycyny-B patch-clamp, w celu ujawnienia właściwości fizjologicznych i farmakologicznych.

Streszczenie

Komórki mięśni gładkich (DSM) znajdujące się w ścianie pęcherza moczowego ostatecznie ułatwiają magazynowanie moczu i oddawanie moczu. Przygotowanie zdolnych do życia, świeżych i wyizolowanych komórek DSM stanowi ważne wyzwanie techniczne, którego osiągnięcie zapewnia optymalne komórki do późniejszych badań funkcjonalnych i molekularnych. Metoda opracowana i opracowana w niniejszym dokumencie, z powodzeniem stosowana przez naszą grupę od ponad dekady, opisuje sekcję próbek ludzkiego pęcherza moczowego uzyskanych z operacji otwartego pęcherza, a następnie enzymatyczną dwuetapową obróbkę kawałków DSM i mechaniczne rozcieranie w celu uzyskania świeżo wyizolowanych komórek DSM. Pierwszym krokiem jest rozwarstwienie w celu oddzielenia warstwy DSM (znanej również jako muscularis propria) od błony śluzowej (nabłonka dróg moczowych, blaszka właściwa i błona śluzowa mięśni) oraz przylegających tkanek łącznych, naczyniowych i tłuszczowych. DSM jest następnie cięty na kawałki (2-3 mm x 4-6 mm) w nominalnym roztworze do rozwarstwiania/trawienia (DS) zawierającym Ca2+. Fragmenty DSM są następnie przenoszone i sekwencyjnie traktowane oddzielnie DS zawierającym papainę i kolagenazę w temperaturze ~37 °C przez 30-45 minut na krok. Po przemyciu DS zawierającym bezenzymatyczną surowicę bydlęcą i roztarciu za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety, kawałki uwalniają pojedyncze komórki DSM. Świeżo wyizolowane komórki DSM idealnie nadają się do elektrofizjologicznych i farmakologicznych charakterystyk kanałów jonowych. W szczególności pokazujemy, że bloker kanałów TRPM4 9-fenantrol zmniejsza krokowe prądy kationowe wywołane napięciem zarejestrowane za pomocą perforowanego podejścia patch-clamp amfoterycyny-B. Komórki DSM można również badać za pomocą innych technik, takich jak RT-PCR z pojedynczą komórką, analiza mikromacierzy, immunocytochemia, test ligacji zbliżeniowej in situ i obrazowanie Ca2 +. Główną zaletą wykorzystania pojedynczych komórek DSM jest to, że poczynione obserwacje odnoszą się bezpośrednio do ujawnionych cech pojedynczych komórek. Badania świeżo wyizolowanych ludzkich komórek DSM dostarczyły ważnych informacji charakteryzujących właściwości różnych kanałów jonowych, w tym przepuszczalnych dla kationów w pęcherzu moczowym, i będą kontynuowane jako złoty standard w wyjaśnianiu właściwości komórkowych DSM i mechanizmów regulacyjnych.

Wprowadzenie

Komórki mięśni gładkich wypieracza (DSM) stanowią najliczniejszy typ komórek w pęcherzu moczowym i ostatecznie kontrolują magazynowanie moczu i oddawanie moczu odpowiednio poprzez rozluźnienie i skurcz. Komórki DSM tworzą wiązki mięśni gładkich, które przeplatają się z sąsiednią tkanką łączną, procesami nerwowymi, komórkami śródmiąższowymi i innymi typami komórek1. Obecna wiedza na temat roli komórek DSM w funkcjonowaniu pęcherza moczowego została osiągnięta dzięki wielopoziomowemu zintegrowanemu podejściu. Każda metoda eksperymentalna - niezależnie od tego, czy opiera się na izolowanych pojedynczych komórkach in vitro, paskach tkanek zawierających wiązki mięśni gładkich in vitro/ex vivo, czy też na oznaczeniach in vivo (takich jak cytometria i ocena funkcji mikcji) - dostarcza ważnych i szczegółowych informacji na temat fizjologicznych i farmakologicznych właściwości DSM (zobacz recenzje1,2,3,4,5,6 po szczegóły). Jednak interpretacja wyników uzyskanych z izolowanych pojedynczych komórek pozwala na specyficzne przypisanie wniosków do samego typu pojedynczej komórki. Uświadomienie sobie tego faktu było siłą napędową do opracowania niezawodnej i powtarzalnej metody uzyskiwania świeżo wyizolowanych komórek DSM z próbek pęcherza moczowego o całej grubości. W przeciwieństwie do wielu innych typów komórek, komórki mięśni gładkich nie mogą być wiarygodnie hodowane ze względu na utratę ich natywnego fenotypu, w tym specyficzne zmiany w ich właściwościach elektrofizjologicznych i kurczliwych7,8. Fakt ten dodatkowo wzmacnia znaczenie badań przeprowadzonych na fizjologicznie aktywnych, świeżo wyizolowanych komórkach DSM.

Pod koniec lat 80-tych i na początku lat 90-tych, grupa Isenberga (Niemcy) opublikowała serię badań elektrofizjologicznych na świeżo wyizolowanych komórkach DSM uzyskanych z pęcherzy moczowych świnki morskiej9,10,11,12,13 (Tabela 1). Metoda ta uwypukliła dwie ważne obserwacje, które pomogły w uzyskaniu ważnych komórek i posłużyły jako wstępna wskazówka do naśladowania dla innych. Polegały one na 1) wstępnym traktowaniu wyizolowanych fragmentów DSM roztworem/pożywką wolną od Ca2+ przed obróbką enzymatyczną oraz 2) trawieniu tkanek roztworem zawierającym kolagenazę. Te dwa krytyczne etapy zostały włączone do wszystkich kolejnych wariantów procedur dysocjacji komórek DSM (Tabela 1). Obecnie nasza grupa stosuje dwuetapowe sekwencyjne podejście do dysocjacji papainy i kolagenazy. Kawałki DSM są najpierw traktowane roztworem enzymatycznym zawierającym papainę, a następnie kolagenazą typu II rozpuszczoną w tym samym roztworze (DS, roztwór do rozwarstwiania/trawienia). W wyniku tego podejścia uzyskuje się pojedyncze komórki DSM różnych gatunków, w tym świnki morskiej, świni, szczura, myszy i, co ważne, człowieka (Tabela 1).

Pojedyncze komórki DSM stanowią źródło dla wielu eksperymentów z zakresu biologii molekularnej i fizjologii. Do tej pory ekspresje białek i mRNA badane za pomocą immunocytochemii lub oznaczeń RT-PCR/QRT-PCR wykazały wysoki poziom wykrywalności dla różnych kanałów jonowych, w tym aktywowanych napięciem o dużej przewodności i Ca2+ (BK), o małej przewodności Ca2+ aktywowanych K + typu 3 (SK3), bramkowanych napięciem K+ (Kv), Ca 2+ bramkowanych napięciem typu L i kanałów melamatatyny typu 4 o potencjale przejściowym (TRPM4), a także wymiennik Na/Ca2+14,15,16,17,18,19,20,21,22. Uważa się, że wszystkie kontrolują pobudliwość DSM, wewnątrzkomórkowy poziom Ca2 + i kurczliwość. Podejścia elektrofizjologiczne typu patch-clamp, przeprowadzone bezpośrednio na komórkach DSM świnki morskiej, myszy, szczura lub człowieka, dostarczyły bezpośredniego wykazania właściwości biofizycznych i farmakologicznych kanałów Cav, Kv (Kv2.x. Kv7), SK, BK i TRPM4 typu SK, BK i TRPM417,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Podejścia obejmowały konwencjonalny cęgi napięciowe całego ogniwa, perforowane cęgi napięciowe i nagrania jednokanałowe (konfiguracje z dołączoną komórką, na lewą stronę i na zewnątrz). Dodatkowo, rejestracja potencjału błonowego DSM za pomocą cęgów prądowych dostarczyła dowodów na to, że środki farmakologiczne angażujące cel zmieniają pobudliwość komórek. Na przykład inhibitor TRPM4 9-fenantrol indukował hiperpolaryzację w komórkach DSM uzyskanych z pęcherzy moczowych ludzi, świnek morskich i szczurów19,20,22,31. Wśród różnych metod elektrofizjologicznych, perforowane zapisy patch-clamp amfoterycyny-B (oraz nystatyny, gramicydyny i β-escyny) zapewniają kluczową zaletę, zachowując wewnętrzne wewnątrzkomórkowe cząsteczki i szlaki sygnałowe. Tylko kationy o niskiej masie cząsteczkowej i w mniejszym stopniu Cl- - ale nie białka lub cząsteczki sygnałowe, w tym Ca2+ - są przepuszczalne przez pory błony plazmatycznej utworzone przez amfoterycynę-B lub nystatynę32. Pomyślny wynik eksperymentów z perforowanym zaciskiem krosowym zależy od kilku ogólnych zmiennych unikalnych dla tej techniki. Tutaj opisujemy szczegóły procedury z wykorzystaniem amfoterycyny-B, którą nasza grupa z powodzeniem stosowała przez lata15,22,33,34,35,36,37,38,39.

Prawdopodobnie nieselektywne kanały kationowe pozostają jednym z najmniej zrozumiałych typów kanałów w komórkach DSM. Pierwsze doniesienia o nieselektywnym kanale podobnym do kationów pochodzą z 1993 roku. Artykuł Wellnera i Isenberga11 opisywał pojedynczy kanał aktywowany rozciąganiem 33 pS, wykazujący następującą kolejność przepuszczalności jonów: K+>Na+>Cs+>>>Ba2+>Ca2+ oraz hamowanie aktywności kanału przez Gd3+, ogólny inhibitor nieselektywnych kanałów kationowych. Prawie dekadę później Thorneloe i Nelson40 opisali przepuszczalne prądy kationowe Na+ w mysich komórkach DSM, hamowane przez Gd3+, używając zapisów z całych komórek. Ponieważ tożsamość molekularna nieselektywnych kanałów kationowych i ich charakterystyka biofizyczna pozostają do ustalenia, uzasadnione są przyszłe badania w tym obszarze badawczym. Opisany w niniejszym dokumencie protokół rejestracji nieselektywnych prądów kanałów kationowych - przy użyciu zewnątrzkomórkowych i pipetowych roztworów wewnątrzkomórkowych zawierających Cs+, TEA+ i nifedypinę (Tabela 2), które fizjologicznie i farmakologicznie łagodzą prądy Kv i Cav - był i będzie nadal przydatny w badaniach elektrofizjologicznych nieselektywnych kanałów kationowych. Wykorzystaliśmy ten konkretny protokół do określenia stopnia hamowania prądów kationowych całych komórek przez bloker kanału TRPM4 9-fenantrol w komórkach DSM świnki morskiej, szczura i człowieka19,20,22.

Podsumowując, opisana tutaj metoda uzyskiwania świeżo wyizolowanych pojedynczych komórek DSM z ludzkiego pęcherza moczowego dostarcza żywotnych komórek wysoce przydatnych do badań elektrofizjologicznych przy użyciu różnych konfiguracji techniki patch-clamp, obrazowania Ca2+, immunocytochemii, proksymalnych testów procesowych in situ i pojedynczej komórki RT-PCR/qRT-PCR, a także zaawansowanych technik biologii molekularnej, w tym analizy mikromacierzy, sekwencja RNA i sekwencja CHIP. Zastosowanie metody perforowanego patch-clampu amfoterycyny-B zachowuje natywne środowisko komórkowe w przeciwieństwie do innych konfiguracji. Przeprowadzone przy użyciu określonych tutaj warunków, zaprojektowanych w celu zanegowania wkładu prądów K + i Ca2 + w ogniwach DSM, prądy indukowane napięciem wykazują właściwości nieselektywnych prądów kationowych odpowiednich do charakterystyki biofizycznej i farmakologicznej.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitety Komisji Rewizyjnej Uniwersytetu Tennessee (Memphis, TN, IRB# 17-05714-XP) oraz Uniwersytetu Medycznego Południowej Karoliny (Charleston, SC, IRB# 00045232). Zatwierdzone procedury pozwalają na pobranie próbek pęcherza moczowego o pełnej grubości (>1 cm na >1 cm) - zawierających wszystkie warstwy, w tym błonę śluzową, mięśnie gładkie wypieracza i błonę surowiczą, a także przyczepione naczynia krwionośne i tkankę tłuszczową) - od pacjentów-dawców poddawanych chirurgicznej częściowej ekstrakcji pęcherza moczowego. Dawcami są osoby dorosłe (badany do tej pory przedział wiekowy: od 25 do 87 lat), mężczyźni lub kobiety, z objawami pęcherza nadreaktywnego lub bez (zgodnie z klasyfikacją według Amerykańskiego Towarzystwa Urologicznego I-PSS score41). Zabiegi chirurgiczne obejmują różne schorzenia, w tym radykalną cystektomię z powodu raka urotelialnego i gruczolakoraka. W takich przypadkach pobrana próbka pęcherza moczowego jest oddalona od miejsca guza.

1. Sekcja tkanek DSM i przygotowanie wolnych od błony śluzowej fragmentów DSM

  1. Zbadaj próbkę pęcherza moczowego o całej grubości, która dotarła do laboratorium z sali operacyjnej w szczelnie zamkniętym pojemniku wypełnionym zimnym roztworem do rozwarstwiania/trawienia (Rysunek 1 i Tabela 2 dla składu DS).
    UWAGA: Próbka jest zwykle przechowywana w zimnym DS od kilku godzin do nocy przed przybyciem do laboratorium. W przypadku dłuższego przechowywania, DS (Tabela 2) jest uzupełniany o 1 mM CaCl2.
  2. Usuń i spłucz ludzką próbkę DSM o całej grubości (zawierającą wszystkie warstwy, w tym błonę śluzową, DSM i błonę surowiczą) lodowatym DS, aby wypłukać przyczepione zanieczyszczenia i krew.
  3. Przypnij próbkę pęcherza moczowego, błonę śluzową skierowaną do góry i surowiczą w dół, na pokrytym silikonem enancjomerze (Tabela materiałów) okrągłym naczyniu o średnicy 150 mm wypełnionym lodowatym DS (Rysunek 1B).
  4. Usuń sąsiednią tkankę tłuszczową, naczynia krwionośne, nabłonek (nabłonek dróg moczowych) i błonę śluzową mięśni z próbki przez ostre wypreparowanie za pomocą mikronożyczek i kleszczy.
  5. Wytnij kilka wolnych od błony śluzowej kawałków DSM (~2-3 mm długości i 4-6 mm szerokości) (Rysunek 1C).

2. Enzymatyczna dysocjacja fragmentów DSM, w wyniku której powstają świeżo wyizolowane pojedyncze komórki DSM

  1. Umieścić od 3 do 6 kawałków DSM w probówce zawierającej od 1 do 2 ml wstępnie podgrzanego (~37 °C) DS zawierającego papainę i ditiotreitol (DS-P, Tabela 2) i inkubować kawałki DSM w DS-P przez 30-45 minut w temperaturze ~37 °C, delikatnie potrząsając probówką od czasu do czasu (raz na 10-15 minut).
    UWAGA: Aby optymalnie kontrolować temperaturę do obróbki enzymatycznej, probówki z kawałkami tkanek i roztworami enzymów umieszcza się w szklanej komorze na chusteczki wypełnionej wodą podłączoną do krążącej podgrzewanej łaźni wodnej (Rysunek 1D) lub w bardzo precyzyjnej łaźni wodnej z kontrolowaną temperaturą (Rysunek 1E).
  2. Wyjmij DS-P z tuby, krótko umyj kawałki DSM lodowatym DS, wyrzuć zimny DS z tubki, pozostawiając kawałki DSM na dnie tubki.
  3. Dodać 1 do 2 ml kolagenazy typu II (DS-C, tabela 2) zawierającej DS do probówki z kawałkami DSM, delikatnie wymieszać; i inkubować przez 25-40 minut w temperaturze ~37 °C, delikatnie potrząsając probówką od czasu do czasu (co 10-15 minut).
  4. Wyrzuć DS-C i umyj kawałki DSM poddane działaniu enzymów 5-10 razy lodowatym DS.
  5. Po ostatnim płukaniu pozostawić roztwór DS w probówce; delikatnie rozetrzeć kilkakrotnie wypolerowaną pipetą Pasteura, aby uwolnić pojedyncze komórki DSM.
  6. Umieść kilka kropli roztworu DS zawierającego rozproszone komórki DSM w komorze ze szklanym dnem lub szkiełku nakrywkowym i sprawdź wzrokowo jakość pod mikroskopem (przy użyciu obiektywu 20x lub 40x) po co najmniej 5 minutach od aplikacji, aby komórki przylegały do dna.
  7. Świeżo wyizolowane komórki DSM należy natychmiast wykorzystać do eksperymentów elektrofizjologicznych lub przechowywać komórki w probówce zawierającej DS w temperaturze ~4 °C na lodzie lub w lodówce do czasu użycia (zwykle do 8 godzin przygotowania).
    UWAGA: W tym samym preparacie jakość komórek waha się od wysoce żywotnych do nadmiernie strawionych, martwych komórek DSM (Rysunek 2). Gdy sekwencyjna metoda papainy-kolagenazy daje bardzo dużą liczbę niezdolnych do życia komórek, preparat jest odrzucany i przeprowadza się nowe trawienie kawałków DSM, ale ze skróconymi odstępami między inkubacjami. Jeśli w wyniku zabiegu powstaje zbyt mało komórek DSM, to w celu późniejszego trawienia fragmentów DSM wydłuża się odstępy między inkubacjami. Dodatnia immunoreaktywność na aktynę α mięśni gładkich potwierdza tożsamość komórek DSM (Ryc. 3).

3. Rejestrowanie prądów kationowych indukowanych napięciem z ogniw DSM przy użyciu techniki perforowanego zacisku napięciowego całego ogniwa amfoterycyny-B

  1. Odpipetować 0,25-1 ml zawiesiny komórek do szklanej dolnej komory umieszczonej na stoliku mikroskopu odwróconego i pozwolić komórkom przylgnąć do szklanego dna.
  2. Po inkubacji przez co najmniej 45 minut, usunąć DS z kąpieli i zastąpić roztworem E (Tabela 2) przez superfuzję, gdzie przepływ roztworu wspomagany grawitacyjnie przez rurki wlotowe, spowalniając zastępuje DS nowym roztworem, podczas gdy rurka wylotowa podłączona do próżniowego zbiornika na odpady usuwa roztwór komory i zapobiega przepełnieniu. Należy zauważyć, że roztwór E zawiera jony tetraetyloamonu (TEA+) i cezu (Cs+), które hamują prądy K+.
  3. Przygotować roboczy roztwór podstawowy amfoterycyny-B w dimetylosulfotlenku (DMSO) (1 mg na 10 μl DMSO). Aby całkowicie rozpuścić amfoterycynę w proszku, należy przeprowadzić sonikację (co najmniej 15 min) i dobrze zmieszać roztwór.
    UWAGA: Ten krok zajmuje zwykle mniej niż 10 minut. Dobrze sprawdza się rozpuszczenie 3-4 mg amfoterycyny-B w 30-40 μl DSMO w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Większe ilości amfoterycyny-B wymagają większej ilości rozpuszczalnika DSMO, co zwykle skutkuje dłuższym okresem mieszania i niepełnym rozpuszczeniem cząstek stałych amfoterycyny-B obecnych w probówce.
  4. Rozpuścić roztwór podstawowy amfoterycyny-B w roztworze pipety (roztwór P, tabela 2) do uzyskania końcowego stężenia 200-500 μg/ml. Ten etap wymaga rozległej sonikacji i wirowania przy wysokim ustawieniu prędkości (8-10/10) przez ~30 do 60 minut na krok, aby zapewnić optymalne mieszanie i zapobiec tworzeniu się osadu amfoterycyny-B w roztworze pipety.
    UWAGA: Amfoterycyna-B wytrąca się z czasem i jest wrażliwa na światło. Roztwór roboczy do pipet zawierający amfoterycynę-B jest sprawdzany pod kątem rozpuszczalności, ręcznie mieszany przed napełnieniem pipety i przechowywany w ciemności.
  5. Wyciągnij kilka elektrod łatkowych, wypoleruj końcówki elektrod i (jeśli to konieczne) pokryj końcówki woskiem dentystycznym.
  6. Napełnić końcówkę elektrody z plastrem roztworem pipety (roztwór P, tabela 2) bez amfoterycyny-B, zanurzając elektrodę na krótko w roztworze.
  7. Napełnij elektrodę tym samym roztworem pipety zawierającym amfoterycynę B.
  8. Zamontuj elektrodę na uchwycie podłączonym do patch-clamp amplifier headstage.
  9. Za pomocą mikromanipulatora umieść elektrodę tuż pod powierzchnią roztworu zewnątrzkomórkowego, tak aby końcówka elektrody była po prostu zanurzona.
  10. W trybie cęgów napięcia ustaw potencjał podtrzymania na 0 mV i wyreguluj prąd na 0 pA za pomocą pokrętła przesunięcia pipety na komercyjnym wzmacniaczu (Tabela materiałów).
  11. Określ rezystancję elektrody za pomocą okna/funkcji testu membrany w komercyjnym oprogramowaniu do akwizycji (tabela materiałów). Aby aktywować, kliknij Narzędzia>Membrane Test>Play lub ikonę skrótu w oprogramowaniu. Wyznaczona rezystancja elektrody powinna mieścić się w zakresie od 2 do 5 MΩ,
    UWAGA: Funkcja testu membrany dostępna w komercyjnym oprogramowaniu do akwizycji lub opcja testu uszczelnienia we wzmacniaczu może być używana do monitorowania rezystancji elektrody poprzez wielokrotne stosowanie kroków napięcia.
  12. Kontynuuj monitorowanie rezystancji elektrody, przesuwając elektrodę w kierunku wybranej komórki DSM za pomocą mikromanipulatora (Rysunek 4A).
    UWAGA: Aby można ją było uznać za żywotną komórkę DSM, musi ona wykazywać wydłużoną morfologię w kształcie wrzeciona, dobrze zdefiniowaną aureolę wokół komórki, ostre krawędzie i półkurczliwy (serpentynowy) wygląd.
  13. Podczas dotykania elektrodą powierzchni ogniwa - co wskazuje na szybki wzrost rezystancji elektrody mierzonej za pomocą funkcji testu membranowego - utwórz giga-uszczelnienie, przykładając delikatne szybkie podciśnienie do uchwytu elektrody za pomocą rurki. Powoduje to wytwarzanie podciśnienia na końcu elektrody, które wciąga błonę komórkową do elektrody, pomagając w tworzeniu giga-seal lub bardzo ścisłego kontaktu między elektrodą a błoną plazmatyczną (Rysunek 4B).
  14. Po uformowaniu się giga-seal skompensuj pojemność pipety, regulując szybkie i wolne pokrętła na komercyjnym wzmacniaczu i monitoruj stabilność giga-seal (prąd wycieku) za pomocą funkcji Membrane Test.
  15. Odczekaj czas, zwykle 30-60 minut, aby amfoterycyna-B dyfundowała w dół pipety i została wprowadzona do błony plazmatycznej, tworząc pory głównie selektywne dla kationów jednowartościowych. Na tym etapie kontynuuj monitorowanie giga-seal za pomocą funkcji Membrane Test. Wraz ze wzrostem perforacji komórek rośnie również amplituda stanów przejściowych pojemności (porównaj Rysunek 4B i Rysunek 4C przedstawiający odpowiednio brak i efektywną perforację komórki) mierzoną za pomocą funkcji testu membranowego.
  16. Gdy perforacja łaty jest optymalna (oceniana na podstawie stabilnej rezystancji szeregowej, zwykle poniżej 50 MΩ), zlikwiduj stany nieustalone pojemności, regulując pokrętła pojemności ogniwa i rezystancji szeregowej na wzmacniaczu. W tym czasie można również przeprowadzić kompensację rezystancji szeregowej (Rysunek 4D).
  17. Po zaobserwowaniu stabilnych prądów kationowych indukowanych krokowo napięciem wywołanych przez określony protokół, należy zastosować stan złożony lub fizjologiczny do przetestowania przez superfuzję i zapisać odpowiedzi dla warunków kontrolnych, testowych i wymywania (jeśli to możliwe) za pomocą komercyjnego oprogramowania do akwizycji.
    1. Rejestruj prądy za pomocą rutynowego protokołu krokowego napięcia, który polega na utrzymywaniu ogniw DSM na poziomie -64 lub -74 mV i stopniowaniu napięcia w krokach co 10 mV przez 400 lub 500 ms od -94 do +96 lub +106 mV i powrocie do potencjału podtrzymania.
      UWAGA: Wartości potencjału membrany są dostosowane do potencjału złącza cieczy wynoszącego 14 mV (przy użyciu roztworów P i E, tabela 2). Potencjał złącza cieczy uzyskuje się w komercyjnym oprogramowaniu do akwizycji (Tabela materiałów) poprzez kliknięcie (Narzędzia>Potencjały złączy) i wprowadzenie stężeń składników jonów roztworu. Protokół ramp może być również wykorzystany do uzyskania bieżących nagrań.
    2. Uruchom protokół napięcia w ciągłym interwale ~1 min podczas eksperymentu, rejestrując prądy do kontroli przed dodawaniem, warunków testowych i wymłukiwania.

4. Analiza i wizualizacja danych

  1. Otwórz nagrane pliki w komercyjnym oprogramowaniu do analizy danych (Tabela materiałów) dla kontroli, warunków testowych i wymywania, klikając Plik>Otwórz dane i wybierając interesujące Cię pliki do otwarcia.
    UWAGA: Na potrzeby analizy zazwyczaj otwierane i analizowane są trzy pliki (każdy zawierający pojedynczy zestaw śladów pojedynczego przebiegu protokołu) dla każdego warunku. Odpowiedzi są następnie uśredniane w celu uzyskania średniej odpowiedzi dla każdego warunku. Oprogramowanie używane do akwizycji danych zawiera opcję automatycznego zbierania określonych przez użytkownika wielu przebiegów testowych i uśredniania ich dla pojedynczego pliku wyjściowego, który może być użyty jako alternatywa.
  2. Uzyskaj średnią odpowiedź w ciągu ostatnich 200 ms dla ścieżki prądu mierzonej dla każdego napięcia; wybrany przedział czasu trwania odzwierciedla poziom aktywacji prądu krokowego w stanie ustalonym. Aby to zrobić, wykonaj poniższe czynności.
    1. Wybierz interesujący Cię plik do analizy w komercyjnym oprogramowaniu analitycznym (Tabela materiałów).
      UWAGA: Oprogramowanie umieszcza ostatnio zaimportowany plik w aktywnym oknie wyświetlania. Otwarty plik wyświetla serię nakładających się na siebie ścieżek uzyskanych za pomocą protokołu krokowego napięcia. Domyślnie w aktywnym oknie wyświetlane są cztery kursory (wyświetlające wartości x i y dla podświetlonego śladu).
    2. Wybierz zakres do analizy, ustawiając kursor 2 na końcu kroku napięcia 400 lub 500 ms, a kursor 1 w odstępie 200 ms wcześniej, tak aby zakres analizy wynosił 200 ms.
    3. Uzyskaj odpowiedzi dla każdego napięcia, klikając Analizuj>Szybki wykres>IV (lub ikonę skrótu IV) (w oknie zachęty przed wygenerowaniem danych potwierdź, że dla sygnału osi y (bieżącego) Region są wybrane opcje "Kursory 1..2" i "Średnia"). Kliknij przycisk OK, aby wygenerować wykres I-V i umieścić dane w arkuszu kolumn Wyniki, który można wyświetlić, uzyskując dostęp do programu Windows>Results.
    4. Analizuj dodatkowe pliki, powtarzając kroki 4.2.1 - 4.2.3. Kliknij przycisk Analizuj>Szybki wykres>IV lub skrót ikony IV, wybierz opcję Dołącz, a nie Zamień, aby dodać dodatkowe dane do arkusza wyników podczas przetwarzania śladów.
    5. Skopiuj dane do arkusza kalkulacyjnego, zaznaczając interesujące Cię kolumny i naciskając CTRL+C, aby skopiować i CTRL+V, aby wkleić. Zapisz arkusz wyników w komercyjnym oprogramowaniu analitycznym (Tabela materiałów) w formacie (*.rlt), klikając Plik>Zapisz jako.
  3. Dla każdej komórki znormalizuj odpowiedzi dla wszystkich trzech warunków na wartość kroku maksymalnego napięcia dla kontroli przed dodawaniem (zgodnie ze wzorem: Response/Response Control-Max) i narysuj odpowiedzi jako wartości prądu (lub gęstości prądu) w zależności od napięcia (Rysunek 6).
    1. W procesorze arkusza roboczego określ średnie odpowiedzi jako prądy (pA) lub gęstości prądu (pA/pF) dla sterowania, warunków testowych (w tym przykładzie 9-fenantrolu) i wymywania na każdym kroku napięcia.
    2. Podziel wartości dla każdego napięcia w każdym stanie (kontrola, 9-fenantrol i wymywanie) przez maksymalną odpowiedź kontrolną uzyskaną przy najwyższym napięciu (+96 mV w Rysunek 6) dla kontroli przed dodawaniem zgodnie ze wzorem: Znormalizowana odpowiedź dla warunku (x) = Odpowiedź (x) /Kontrola odpowiedzi-Max dla (x).
  4. W celu analizy podsumowującej ułóż dane w formacie, który można łatwo skopiować do programu graficznego (np. GraphPad Prism) w celu wizualizacji.

Wyniki

Enzymatyczna dysocjacja fragmentów DSM dostarcza zdrowych, świeżo wyizolowanych komórek DSM, rutynowo stosowanych w badaniach funkcjonalnych i molekularnych, takich jak: elektrofizjologia patch-clamp oraz immunocytochemia. Rycina 1 podsumowuje etapy dysekcji i przedstawia konfiguracje wykorzystywane do kontroli temperatury podczas etapów obróbki enzymatycznej. Rycina 2 przedstawia obrazy w jasnym polu komórek DSM uzyskanych z trzech próbek pęcherza moczowego ludzi, każda od innego pacjenta-donora. Zdrowe pojedyncze komórki DSM charakteryzują się wrzecionowatą morfologią, wyraźnymi, dobrze zdefiniowanymi krawędziami, wyraźną otoczką wokół komórki oraz półkurczliwym (w kształcie serpentyny) wyglądem pod mikroskopem (patrz komórki DSM zaznaczone białymi strzałkami na Rycynie 2). Reagują one również na czynniki stymulujące skurcz, takie jak muskarynowy agonista karbachol lub zastosowanie wysokiego stężenia K+ (60 mM). Komórki DSM wykazują pozytywną immunoreaktywność w kierunku α-aktyny mięśni gładkich, co potwierdza ich tożsamość (Rycina 3).

Komórki DSM są idealnie dostosowane do elektrofizycznych badań właściwości kanałów jonowych metodą patch-clamp. W niniejszej pracy opisujemy metodę rejestracji typu perforated patch-clamp z użyciem amfoterycyny B, wykorzystującą odpowiednie roztwory do pipety i do środowiska zewnętrznego (Tabela 2), aby optymalnie rejestrować kanały kationowe wywoływane skokiem napięcia. W zastosowanych specyficznych warunkach blokada prądów Kv oraz Ca2+ typu L przy użyciu odpowiednio Cs+/TEA+ i nifedypiny zapewniła wyeliminowanie wpływu tych komponentów jonowych na prądy wywołane napięciem w całej komórce. Rycina 4 oraz Rycina 5 przedstawiają odpowiednio kroki eksperymentalne metody perforated patch-clamp z amfoterycyną B oraz reprezentatywne prądy całej komórki mierzone przy użyciu protokołu skoku napięcia lub rampy w trzech różnych ludzkich komórkach DSM, każda pochodząca od innego dawcy. Należy zauważyć, że rejestracje wykazują pewien stopień zmienności pod względem amplitud prądu i prostowania wypływowego. Dodatkowe eksperymenty wykazały, że 9-fenantrol, inhibitor kanału TRPM4, skutecznie i odwracalnie hamował ludzkie prądy kationowe DSM przy ujemnych i dodatnich napięciach (Rycina 6). Komponent prądu wrażliwy na 9-fenantrol wykazuje silniejsze hamowanie przy dodatnich napięciach oraz prostowanie wypływowe (Rycina 6C).

figure-results-1
Rycina 1: Podsumowanie etapów sekcji prowadzących do przygotowania fragmentów mięśni gładkich detrusora (DSM) oraz zestawu użytego do dysocjacji enzymatycznej. Przedstawiono obrazy: (A) próbki całej grubości ludzkiego pęcherza moczowego pozyskanej podczas otwartej operacji pęcherza jako nadmiarowy materiał chirurgiczny w lodowatym roztworze DS, (B) tę samą preparację po przypięciu z częściowo wypreparowaną warstwą DSM, (C) fragmenty DSM o różnych wymiarach wycięte z warstwy DSM, gotowe do trawienia enzymatycznego (mniejsze fragmenty) lub innych badań eksperymentalnych (większe fragmenty), (D, E) alternatywne zestawy użyte do trawienia enzymatycznego fragmentów DSM, składające się albo z (1) łaźni wodnej z cyrkulacją i kontrolą temperatury połączonej za pomocą przewodów z dużą szklaną komorą tkankową wypełnioną wodą, gumowego uchwytu do probówek, plastikowych probówek zawierających fragmenty DSM i roztwory enzymów przygotowane w roztworze do sekcji/trawienia (DS, albo DS-P lub DS-C, Tabela 2) oraz sondy temperatury podłączonej do wyświetlacza umożliwiającego ciągły monitoring (D), lub (2) dużej, wypełnionej wodą łaźni z kontrolą temperatury zawierającej uchwyt i probówki z fragmentami DSM oraz roztworami enzymów (E). Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy w polu jasnym świeżo wyizolowanych ludzkich komórek DSM uzyskanych przy użyciu metody sekwencyjnego trawienia papainą i kolagenazą. (A-F) Przedstawiono obrazy żywotnych, fizjologicznie aktywnych komórek DSM uznanych za odpowiednie kandydatki do prób rejestracji metodą patch-clamp z perforacją błony. (G, H) Obrazy komórek nieżywotnych lub przetrawionych; takich komórek unikano w eksperymentach patch-clamp. Białe i czarne strzałki na panelach (A-H) wskazują odpowiednio na komórki DSM uznane za żywotne i nieżywotne w kontekście prób rejestracji patch-clamp. Należy zauważyć, że czarne strzałki na panelach (A, C i G) wskazują na fragmenty komórek (elementy okrągłe) lub małe komórki pozbawione morfologii DSM, a na panelu (H) komórki wydają się blade i rozszerzone. Obrazy pochodzą z trzech różnych preparatów pęcherza moczowego (A i B: pierwszy dawca-pacjent, C i D: drugi dawca-pacjent oraz E-H: trzeci dawca-pacjent). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Ekspresja kanału przejściowego receptora potencjału melastatin typu 4 (TRPM4) oraz immunoreaktywność specyficznej dla mięśni gładkich aktyny α w pojedynczych ludzkich komórkach DSM w analizie immunocytochemicznej. (A) Przedstawiono obrazy konfokalne ukazujące immunocytochemiczną detekcję ekspresji białka kanału TRPM4 w ludzkiej komórce DSM. Barwienie czerwone (lewy dolny róg) wskazuje białka kanału TRPM4; barwienie niebieskie (DAPI) wykrywa jądra komórkowe (lewy górny róg); barwienie zielone wskazuje aktynę mięśni gładkich α (α-SMA, prawy górny róg); obraz złożony (prawy dolny róg) ilustruje nakładanie się wszystkich trzech obrazów. (B) Obrazy konfokalne ilustrujące osłabienie immunocytochemicznej detekcji ekspresji białka kanału TRPM4 w obecności specyficznego dla TRPM4 peptydu konkurującego (CP) w izolowanych ludzkich komórkach DSM. Barwienie niebieskie (DAPI) wskazuje jądra komórkowe (lewy górny róg); barwienie zielone dotyczy aktyny mięśni gładkich α (α-SMA, prawy górny róg); obraz złożony (prawy dolny róg) ilustruje nakładanie się wszystkich trzech obrazów. Wyniki zostały zweryfikowane w czterech oddzielnych eksperymentach z użyciem całej tkanki DSM lub wielu komórek DSM izolowanych od czterech pacjentów. Obrazy pochodzą z pracy Hristov et al. (2016)22 i zostały użyte za zgodą autorów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rycina 4: Schematyczny rysunek etapów tworzenia giga-uszczelnienia (giga-seal) i perforacji komórek DSM człowieka za pomocą amfoterycyny-B. Przedstawiono pozycje przestrzenne pipety zawierającej amfoterycynę-B oraz komórki DSM, a także powiązane odpowiedzi dla testów błony uzyskane w komercyjnym oprogramowaniu akwizycyjnym (Tabela materiałów) poprzez zmianę skoków napięcia (w tym przykładzie -10 lub -20 mV) w celu wyznaczenia rezystancji. Konfiguracje to: (A) przed zbliżeniem elektrody do komórki, (B) po utworzeniu giga-uszczelnienia poprzez umieszczenie pipety zawierającej amfoterycynę-B (amfoterycyna-B zaznaczona czerwonymi kropkami) na powierzchni komórki i przyłożenie podciśnienia, (C) konfiguracja na komórce (on-cell) pokazana ok. 45 min po utworzeniu giga-uszczelnienia; w tym punkcie czasowym amfoterycyna-B przemieściła się w dół pipety, a jej cząsteczki wbudowały się w błonę plazmatyczną na końcówce elektrody, tworząc pory przepuszczalne dla kationów, oraz (D) ta sama konfiguracja co w (C), ale z wyeliminowanymi przejściami pojemności przy użyciu pokręteł pojemności całokomórkowej i rezystancji szeregowej na wzmacniaczu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rycina 5: Prądy kationowe z całych komórek zarejestrowane metodą patch-clamp z perforacją amfoterycyną B w ludzkich komórkach DSM. (A) Schemat protokołu skoków napięcia ilustruje potencjał spoczynkowy -74 mV oraz skoki napięcia o czasie trwania 400 ms od -94 do +96 mV, wykonywane w przyrostach 10 mV, a następnie powrót do -74 mV. (B, C) Reprezentatywne przebiegi prądów wraz z wykresami zależności gęstości prądu od napięcia z dwóch różnych ludzkich komórek DSM, każda z innego preparatu pęcherza moczowego/pacjenta-dawcy, uzyskane za pomocą protokołu skoków napięcia opisanego w (A). (D) Przykład przebiegu prądu uzyskanego za pomocą protokołu rampowego (przedstawionego graficznie w górnym wstawce jako zmiana napięcia od -94 do +116 mV w czasie 1 s z szybkością 0,21 mV/ms, potencjał spoczynkowy wynosił -94 mV). Po prawej stronie w panelach (B-D) wykresy przedstawiają zależność gęstości prądu od napięcia dla każdej zarejestrowanej komórki DSM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-6
Rycina 6: Inhibicja prądów kationowych indukowanych skokiem napięcia w ludzkich komórkach DSM wywołana przez 9-fenantrol, bloker kanałów TRPM4. (A) Przedstawiono reprezentatywne prądy mierzone zgodnie z protokołem skoku napięcia opisanym na Ryc. 5A dla kontroli, 9-fenantrolu oraz po wypłukaniu. (B) Podsumowanie znormalizowanych odpowiedzi w zależności od napięcia dla kontroli, 9-fenantrolu i wypłukania w siedmiu komórkach DSM (pochodzących od siedmiu różnych pacjentów-dawców). (C) Prąd różnicowy dla komponentu wrażliwego na 9-fenantrol, otrzymany poprzez odjęcie wartości uzyskanych w obecności 9-fenantrolu (30 µM) od wartości kontrolnych przedstawionych w (B). Dane w (B) i (C) przedstawiono jako średnie z słupkami błędów SEM, * oznacza istotność (p<0.05, parzysty test t Studenta) dla porównania kontroli z 9-fenantrolem przy każdym napięciu. Panele (A) i (B) zostały powielone z Hristov et al. (2016)22 i użyte za zgodą autorów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

GatunkiSzczegóły proceduryBibliografia
Świnia morskaFragmenty DSM płukane $\text{Ca}^{2+}$2+pożywka wolna od (w mM: 100 NaCl, 10 KCl, 1,2 KH2PO4, 5 MgCl22, 20 glukozy, 50 tauryny, zmierzony pCa=6 (lub 1 mM), a następnie pocięto na kawałki i inkubowano zazwyczaj przez 90–120 min (4 okresy po 30 min) w medium enzymatycznym (w mM: 130 KOH, 20 tauryny, 5 pirogronianu, 5 kreatyny, 10 mM HEPES, pH dostrojone kwasem metanosulfonowym do 7,4, 1 mg/ml kolagenazy, 0,2 mg/ml pronazy E, 1 mg/ml albuminy wolnej od kwasów tłuszczowych, pCa=4,2 (63 mM) lub 3,7 (200 mM)). Pojedyncze komórki DSM przechowywano w medium Kraft-Bruhe (KB) (w mM: 85 KCl, 30 K2PO4, 5 MgSO44, 5 Na2ATP, 5 K-pirogronianu, 5 kreatyny, 20 tauryny, 5 beta-hydroksymaślanu, 1 mg/ml albuminy wolnej od kwasów tłuszczowych, skorygowane KOH do pH 7,2).
Metoda alternatywna: fragmenty DSM płukano przez 10 min w roztworze Ca2+pożywka wolna od [składnika] (w mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1,2 MgCl22, 10 glukozy, 20 tauryny, 5 HEPES, z pH dostosowanym do 7,4 za pomocą NaOH). Następnie fragmenty DSM inkubowano w tym samym Ca2+pożywka wolna od [składnika], uzupełniona o 5 mg% kolagenazy, 2 mg% pronazy oraz 100 μM CaCl22 przez 2x20 min mieszania.		Klockner & Isenberg (1985)13,34 Klockner & Isenberg (1986)35 Schneider i wsp. (1991)10 Bonev & Isenberg (1992)9 Weidelt & Isenberg (2000)36 Moore i wsp. (2004)14
Świnia morska, świnia rasy Landrace oraz człowiekfragmenty DSM wstępnie inkubowane przez 5 min w Ca2+roztwór Krebsa bez wapnia, a następnie pociąć na kawałki i poddać trawieniu enzymatycznemu w Ca2+roztwór Krebsa wolny od [składnika], zawierający 0,5–2 mg/ml kolagenazy typu I oraz 0,1–0,5 mg/ml pronazy w temperaturze 36°C przez 20–30 min przy ciągłym mieszaniu. W niektórych przypadkach trawione fragmenty dodatkowo agitowano za pomocą pipety z tępym końcem lub poprzez wirowanie aż do uzyskania komórek. Wyizolowane komórki przechowywano w zmodyfikowanym roztworze Krebsa (opisanym w Klockner & Isenberg13) i zazwyczaj były wykorzystywane w ciągu 3 h. Skład roztworu Krebsa wynosił (mM): 140 Na+, 6 K+, 2 Ca2+, 1,2 Mg2+, 152,4 Cl-, 10 glukozy, 10 HEPES, pH 7,35-7,4 za pomocą Tris. Dla Ca2+roztwór wolny od Ca2+ oraz Mg2+ zostały pominięte w roztworze Krebsa.Inoue & Brading (1990)37 Inoue & Brading (1991)38 Nakayama & Brading (1995)39,40
Człowiekfragmenty DSM umieszczone w Ca2+roztwór Tyrode'a z HEPES (w mM: 105,4 NaCl, 20,0 lub 22,3 NaHCO3, 3,6 KCl, 0,9 MgCl2, 0,4 NaH2PO4, 19,5 lub 4,9 HEPES, 5,4 lub 5,5 glukozy, 4,5 lub 5,5 pirogronianu sodu) i pocięte na fragmenty DSM. Fragmenty DSM namoczono w roztworze enzymatycznym (Ca2+ roztwór HEPES bez siRNA z dodatkiem 0,7 mg/ml kolagenazy typu I, 0,7 mg/ml papainy oraz 1 mg/ml albuminy) przez noc w temperaturze 4°CNastępnie paski podgrzewano w temperaturze 36.5°C przez 15 do 30 min, przemyto i delikatnie utrursowano w świeżym roztworze. Izolowane komórki przechowywano w Ca2+ zawierający roztwór Tyrode’a z HEPES lub wykorzystywany bezpośrednio do eksperymentów.Montgomery & Fry (1992)24 Gallegos i Fry (1994)41 Fry i wsp. (1994)42 Sui i wsp. (2001)43 Wu i wsp. (2002)44
Świnka morskaDSM pocięte na kawałki w PSS (w mM: 137 NaCl, 5,4 KCl, 2 MgCl2)2, 2 CaCl22, 0,42 KH2P04, 4,17 NaHCO33, 10 glukozy, 10 HEPES, pH 7,4 przy użyciu NaOH). Fragmenty DSM umieszczono na 10 min w następującym roztworze do trawienia (w mM: 80 Na-glutaminianu, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 11 glukozy, 2 MgCl2oraz 0,2 CaCl22) a następnie przeniesiono do fiolki zawierającej ten sam roztwór, ale z dodatkiem kolagenazy 2 w stężeniu 1 mg/ml, inhibitora trypsyny w stężeniu 1 mg/ml (czasami pomijanego) oraz beztłuszczowej albuminy bydlęcej w stężeniu 1 mg/ml, na ok. 70 min w temperaturze 35°C lub przez ok. 60 min w temperaturze 37°CPojedyncze komórki DSM uzyskano poprzez triturację za pomocą pipety Pasteura w tym samym roztworze pozbawionym wapnia i enzymów. Po trituracji, Ca2+ (1 mM) dodano, a komórki przechowywano w 4°CKomórki zawsze wykorzystywano w tym samym dniu.Bonev & Nelson (1993)53,54 Heppner i wsp. (1997)26 Petkov i wsp. (2001)47 Shieh i wsp. (2001, 2007)48,49
Świnka morska, mysz, szczur i człowiekProtokół wykorzystuje dwuetapową enzymatyczną dysocjację po precyzyjnym wycięciu fragmentu w Ca2+roztwór do trawienia pozbawiony [składnika] (w mM: 80 L-glutaminianu sodu, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 11 glukozy i 2 MgCl2)2). Najpierw fragmenty DSM poddano obróbce przez 25–45 min w 37°C z 1–2 mg/ml papainy, 1 mg/ml ditionitreitolu i 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej w roztworze do dysocjacji (w mM: 80 glutaminianu monosodowego, 55 NaCl, 6 KCl, 2 MgCl2, 10 HEPES i 10 glukozy, z pH dostosowanym do 7,3 za pomocą NaOH) a następnie fragmenty DSM przeniesiono do roztworu trawiennego zawierającego 1–5 mg/ml kolagenazy XI (Sigma) lub kolagenazy typu 2, 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, 0 lub 1 mg/ml inhibitora trypsyny i 100 μM Ca2+przez 6–30 min. Po inkubacji strawioną tkankę przemyto kilkakrotnie roztworem do trawienia bez enzymów i Ca2+ następnie delikatnie utruty w celu uzyskania pojedynczych komórek mięśni gładkich.Petkov i wsp. (2001)50 Thorneloe & Nelson (2003)51 Thorneloe & Nelson (2004)33 Petkov & Nelson (2005)27 Hristov i wsp. (2008)52 Layne i wsp. (2010)53 Hristov i in. (2011)15 Xin i in. (2012)54 Parajuli i wsp. (2012)25 Malysz i wsp. (2013)29 Parajuli i wsp. (2013)31 Lee i wsp. (2013)55 Malysz i wsp. (2014)23 Smith i wsp. (2013)19,20 Hristov i wsp. (2016)22 Lee i wsp. (2017)56 Yarotskyy i wsp. (2018)57

Tabela 1: Podsumowanie metod enzymatycznych stosowanych do izolacji pojedynczych komórek DSM z pęcherzy moczowych różnych gatunków.

Rodzaj roztworuSkład (w mM)
DS (roztwór do dyssekcji/trawienia)80 glutaminianu sodu, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl22oraz 11 glukozy, z pH dostosowanym do 7,4 (za pomocą 10 M NaOH)
DS-P (DS zawierający papainę)bufor do rozpuszczania (DS) zawierający 1–2 mg/ml papainy, 1 mg/ml ditiotreitolu i 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej
DS-C (DS zawierający kolagenazę)roztwór DS zawierający 1–2 mg/ml kolagenazy typu II, 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, 0 lub 1 mg/ml inhibitora trypsyny oraz 100-200 μM Ca2+
P (pipeta)110 CsOH, 110 kwas aspartylowy, 10 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0,05 EGTA i 30 CsCl, pH dostrojone do 7,2 za pomocą CsOH i uzupełnione o amfoterycynę B (300-500 μg/ml)
E (pozakomórkowe)10 chlorku tetraetyloamoniowego (TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl22, 10 HEPES oraz 10 glukozy, pH skorygowane do 7,3–7,4 za pomocą NaOH lub CsOH oraz 0,002–3 (2–3 mM) nifedypiny

Tabela 2: Składy roztworu do sekcji/trawienia (DS) oraz roztworów do pipety i roztworów zewnątrzkomórkowych stosowanych w eksperymentach z metodą patch-clamp z perforacją błony.

Dyskusja

Opisane tutaj procedury wyjaśniają etapy związane z przygotowaniem żywotnych, świeżo wyizolowanych komórek DSM z próbek ludzkiego pęcherza moczowego o pełnej grubości przy użyciu trawienia enzymatycznego oraz w rejestrowaniu prądów kationowych całych komórek wrażliwych na inhibitor kanału TRPM4 9-fenantrol przy użyciu metody perforowanej amfoterycyny-B. Procedura enzymatyczna opiera się na dwuetapowej sekwencyjnej ekspozycji, zwanej tutaj sekwencyjną metodą trawienia papainy i kolagenazy. Tkanki DSM są najpierw traktowane papainą i ditiotreitolem (środkiem stabilizującym enzymy) w warunkach nominalnego wolnego od Ca2+, a następnie w drugim etapie kolagenazą typu II w obecności niskiego Ca2+. Uzasadnienie przeprowadzania trawienia papainą w warunkach niskiego poziomu Ca2 + w komórkach mięśni gładkich sięga końca lat 1980-tych. Świeżo wyizolowane komórki mięśni gładkich tętnicy szyjnej przygotowane za pomocą papainy wykazywały wydłużony kształt, wykazywały żywotność (odporność na wychwyt błękitu trypanowego) i reagowały na bodźce skurczowe (wyższy poziomCa2+ i histaminy)65. Wiele lat później metodę tę zastosowano do przygotowania komórek DSM (zob. tabela 1). Wybór kolagenazy typu II, a nie innych typów, wiąże się z jej stosunkowo wysoką aktywnością proteolityczną idealnie nadającą się do tkanek mięśni gładkich, w tym DSM. Rzeczywiście, samo leczenie kolagenazą może dać pojedyncze komórki DSM, choć wymaga rozległej ekspozycji na enzymy (≥60 min)53,54. Ponieważ aktywność kolagenazy zależy odCa2+, a enzym jest nieaktywny w warunkach wolnych odCa2+, optymalne trawienie enzymatyczne fragmentów DSM wymaga obecnościCa2+66. W naszym przypadku DS-C zawiera 100-200 μM [Ca2+] (Tabela 2). Po obróbce enzymatycznej strawione kawałki DSM są delikatnie przemywane kilka razy zimnym DS bez enzymów lub Ca2+ w celu usunięcia wszelkich enzymów związanych z tkankami. Lodowaty DS pomaga zachować integralność komórek DSM i ograniczyć aktywność enzymatyczną pozostałej papainy lub kolagenazy. W ostatnim kroku rozcieranie fragmentów DSM poddanych działaniu enzymów za pomocą polerowanej ogniowo pipety Pasteura uwalnia pojedynczą komórkę DSM. Komórki DSM są albo natychmiast umieszczane w komorze rejestracyjnej w celu przeprowadzenia badań typu patch-clamp lub innych rodzajów eksperymentów, albo przechowywane na lodzie w DS do wykorzystania później tego samego dnia (zwykle w ciągu 8 godzin od przygotowania, ale komórki zachowują żywotność do 24 godzin).

Zidentyfikowaliśmy kilka ważnych kwestii, które należy wziąć pod uwagę przy pomyślnym uzyskaniu pojedynczych komórek DSM. Pierwsza z nich dotyczy jakości źródłowej próbki DSM dla ludzi. Aby optymalnie zachować integralność tkanek, próbki DSM uzyskane z operacji otwartego pęcherza moczowego są umieszczane w lodowatym DS tak szybko, jak to możliwe i przechowywane w zimnym środowisku. W szczególności, po chirurgicznym pobraniu od pacjenta, próbka pęcherza moczowego jest natychmiast umieszczana na w pełni przygotowanym stoliku bocznym na sali operacyjnej. Następuje ogólne badanie całej próbki (zwykle uzyskane podczas radykalnej lub prostej cystektomii) i jej otwarcie. Po oględzinach wyjmuje się kawałek próbki z drabiny moczowej o całej grubości z odległego obszaru próbki rażąco niezwiązanej z guzem i natychmiast umieszcza się go w kubku (50 lub 100 ml) zawierającym zimny (~ 4 °C) roztwór preparacyjny (DS) (Tabela 2), a następnie szczelnie zamyka pokrywką. Ze względu na planowany charakter pobrania tkanki, personel sali operacyjnej i personel pomocniczy wykonujący pobieranie jest powiadamiany na początku przypadku operacyjnego, aby materiały były dostępne na sali operacyjnej w momencie ekstrakcji tkanki. Te środki ostrożności wraz z rutynowym, powtarzalnym charakterem etapów przetwarzania utrzymują czas niedokrwienia tkanki w cieple - od ekstrakcji do umieszczenia w schłodzonym pojemniku z roztworem DS - do mniej niż 5 minut. Pojemnik jest następnie umieszczany w lodówce lub na lodzie w chłodziarce w celu utrzymania zimnego środowiska i transportowany (lodowaty) do laboratorium. Gdy próbka dotrze do laboratorium, rozpoczyna się etap preparacji i dysocjacji enzymatycznej. Bardzo trudno jest przewidzieć, czy dana próbka DSM da wysokiej jakości komórki DSM po dysocjacji enzymatycznej, dlatego przystępujemy do etapów dysocjacji enzymatycznej. W wielu przypadkach, równolegle z eksperymentami elektrofizjologicznymi, nasza grupa prowadzi zapisy naprężeń izometrycznych na paskach DSM przygotowanych z tych samych próbek DSM. Odkryliśmy, że zazwyczaj możemy uzyskać wysokiej jakości komórki DSM z preparatów, które z powodzeniem dostarczają również żywotnych pasków do izometrycznych badań skurczu (nasza niepublikowana obserwacja).

Drugi czynnik odnosi się do różnych zmienności partii enzymów. Zaobserwowaliśmy, że zarówno w przypadku papainy, jak i kolagenazy typu II, za każdym razem, gdy nowa partia enzymu dociera od dostawcy, aktywność enzymu w DS do trawienia tkanek może się różnić. W związku z tym rutynowo optymalizujemy stężenie enzymów i odstępy między inkubacjami dla każdej nowej partii. Aby zminimalizować wpływ zmienności partii, zamawiamy większe ilości tej samej partii i wytwarzamy dużą partię roztworów podstawowych w 2 ml porcji enzymów i przechowujemy je w temperaturze ~-20 °C do momentu użycia. Z czasem jednak zamrożone wywary (przechowywane do 2 tygodni) mogą stracić swoją aktywność enzymatyczną. Trzecia zmienna odnosi się do temperatury zabiegów trawienia enzymatycznego. Aktywność enzymatyczna zarówno papainy, jak i kolagenazy wykazuje zależność od temperatury. Papaina i kolagenaza typu II wykazują aktywność w zakresach temperatur obejmujących normalną fizjologię ciała67,68. Dlatego dążymy do utrzymania stabilności zabiegów enzymatycznych w temperaturze ~37 °C, unikając wyższych temperatur, aby zachować integralność komórek DSM. Czwarta kwestia dotyczy zmienności jakości komórek DSM obecnych w każdym preparacie, od wysoce żywotnych (wykazujących doskonałe klasyczne cechy mięśni gładkich) do niezdrowych, nadmiernie trawionych komórek. Wydłużony okres inkubacji enzymów jest jednym z głównych powodów uzyskania dużej liczby uszkodzonych komórek. Nadmierne leczenie enzymatyczne upośledza również struktury białkowe kanałów jonowych, receptorów i transporterów, wpływając niekorzystnie na ich funkcjonalność. Interpretacja wyników uzyskanych z enzymatycznie, świeżo wyizolowanych komórek powinna mieć to na uwadze. Optymalizacja warunków trawienia enzymatycznego ma na celu zwiększenie odsetka wysoce żywotnych komórek. Podejścia eksperymentalne opierające się na większej liczbie żywotnych komórek, takie jak analizy mikromacierzy, wymagają bardziej niezawodnych optymalizacji niż te z powodzeniem przeprowadzone na mniejszej liczbie komórek, takie jak elektrofizjologia jednokomórkowa typu patch-clamp lub obrazowanieCa2+. Uwzględnienie wyżej wymienionych czynników ukierunkowało nasze wysiłki badawcze w ciągu ostatniej dekady w celu uzyskania wysokiej jakości pojedynczych ogniw DSM.

Technika perforowanego zacisku krosowego jest podstawowym podejściem elektrofizjologicznym od ponad ćwierć wieku. Kilka publikacji zawiera szczegółowe informacje na temat rozważań technicznych 69,70,71,72,73. Perforację komórek można uzyskać za pomocą amfoterycyny-B, nystatyny, gramicydyny lub β-escyny (patrz odniesienie32 w celu zapoznania się z każdym z nich). Główną zaletą perforowanych zapisów patch-clamp w porównaniu z innymi podejściami elektrofizjologicznymi jest to, że natywne środowisko wewnątrzkomórkowe - w tym wewnątrzkomórkowe Ca2+ i cząsteczki sygnałowe (np. cAMP, PKA, fosforany i fosfodiesterazy) - jest zachowane. Technika ta idealnie nadaje się zatem do badania prądów kanałów jonowych w całej komórce i ich mechanizmów regulacyjnych w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Kluczowym zastrzeżeniem jest to, że skład komórek wewnątrzkomórkowych nie może być precyzyjnie kontrolowany, w przeciwieństwie do innych metod elektrofizjologicznych, takich jak konwencjonalne zapisy całych komórek i jednokanałowych nagrań z wyciętymi łatami (wewnątrz i na zewnątrz). Z naszego doświadczenia wynika, że trzy czynniki rutynowo przyczyniają się do pomyślnych wyników eksperymentów z perforowanymi amfoterycyną B. Pierwszą z nich jest jakość komórki DSM wybranej do próby nagrania. Gdy ogniwa DSM są wysoce żywotne, wykazując półkurczliwy (serpentynowy), błyszczący wygląd o wysokim kontraście z dobrze zdefiniowaną aureolą wokół powierzchni komórki i ściśle przylegają do szklanego dna komory zapisu, wówczas tworzenie giga-uszczelnień i perforacja komórek zachodzą stosunkowo łatwo. Drugi i trzeci czynnik sukcesu, odpowiednio, odnoszą się do jakości źródła i rozpuszczalności amfoterycyny-B (w dimetylosulfotlenku / DMSO i wewnątrzkomórkowym roztworze pipety). Zaobserwowaliśmy rozbieżności pomiędzy różnymi dostawcami pod względem zmienności źródła i partii. Każdego dnia przygotowujemy świeży roztwór podstawowy amfoterycyny-B z proszku, a następnie rozcieńczamy go w wewnątrzkomórkowym roztworze pipety. Etapy te wymagają rozległej sonikacji i wirowania. W przypadku świeżo przygotowanego roztworu pipet zawierających amfoterycynę B można zwykle uzyskać w ciągu 30 minut pomyślną perforację komórek (<50 MΩ) po utworzeniu giga-seal. Stężenie amfoterycyny-B w roztworze pipety również wymaga optymalizacji w zależności od partii amfoterycyny-B i źródła. W naszych warunkach eksperymentalnych końcowe stężenia amfoterycyny-B w pipecie wahają się od 200 do 500 μg/ml. Ponieważ amfoterycyna-B wykazuje wrażliwość na światło, jej roztwory należy przechowywać w ciemności. Korzystając z techniki perforowanego patch-clamp amfoterycyny-B, nasza grupa zarejestrowała indukowane napięciem prądy K+, Ca2+ i nieselektywne prądy kationowe z komórek DSM ludzi, świnek morskich, myszy i / lub szczurów 17,21,22,23,29,30,31,35,60. W tym miejscu opisujemy warunki rejestrowania nieselektywnych prądów kationowych w ludzkich komórkach DSM. 9-fenantrol, bloker kanałów TRPM4, tłumił prądy indukowane napięciem, wspierając rolę tych kanałów w kontroli pobudliwości DSM. Należy pamiętać, że zwykle wymaga to co najmniej 45 minut po uzyskaniu giga-seal i zainicjowaniu perforacji, aby zarejestrować optymalne, stabilne, nieselektywne prądy kationowe indukowane krokowo napięciem. Rampy napięciowe mogą być również stosowane jako alternatywa dla protokołów krokowych30,64. W tym przypadku preferowany był protokół krokowy napięcia z hiperspolaryzowanego potencjału membrany podtrzymującej niż protokół rampy, ponieważ pierwsze podejście minimalizuje efekt inaktywacji zależnej od napięcia i pozwala na uśrednianie prądu wywołanego w czasie kroku napięcia, w którym rampa zapewnia pojedynczy punkt danych na napięcie. Ten ostatni punkt dotyczy w szczególności ludzkich komórek DSM, ponieważ prądy wykazują zmienną aktywność podczas kroków napięcia (rysunek 5 i rysunek 6). Technika perforowanego patch-clamp amfoterycyny-B miała zasadnicze znaczenie w identyfikacji właściwości komórek DSM i innych typów komórek i będzie nadal pomagać w dostarczaniu nowych odkryć w przyszłości. Co więcej, świeżo wyizolowane pojedyncze ogniwa DSM mogą być z powodzeniem wykorzystywane do pomiaru prądów K+, Cl- i Ca2+ dla całych komórek w konwencjonalnym trybie techniki patch-clamp, rejestracji potencjału membranowego za pomocą cęgów prądowych oraz nagrań jednokanałowych, czego przykładem są nasze wcześniejsze raporty 23,29,35,64.

Oprócz metod patch-clamp jednokomórkowych, świeżo wyizolowane komórki DSM można badać za pomocą innych podejść technicznych, w tym obrazowania Ca2 +, RT-PCR / q-RT-PCR, immunocytochemii, testu ligacji zbliżeniowej in situ i podejść genomicznych (np. mikromacierz, sekwencjonowanie RNA, CHIP-seq)15,18,30,33,34. Ponieważ metody oznaczania transkryptomu pojedynczej komórki wciąż ewoluują i stają się bardzo czułe, przewidujemy w przyszłości możliwość rutynowego i specyficznego łączenia właściwości elektrycznych lub farmakologicznych poszczególnych komórek DSM z ich profilami transkryptomu/proteomu. Zostanie to osiągnięte poprzez najpierw rejestrację z komórki DSM, a następnie ekstrakcję mRNA lub białka, a następnie analizy transkryptomiczne/proteomiczne. Chociaż takie metody zostały już przetestowane w komórkach innych niż DSM, są one obecnie technicznie trudne, brakuje im czułości, aby można je było uznać za rutynowe, i ograniczają się do skutecznego wykrywania kilku wybranych produktów genowych74. Badania łączące ekspresję profilu funkcyjno-molekularnego przeprowadzone na komórkach DSM uzyskanych z pęcherzy moczowych pochodzących od kontrolnych i chorych dawców pacjentów-dawców dostarczą informacji na temat procesów fizjologicznych niezbędnych do kierowania normalnymi funkcjami DSM, patogenezy oraz do identyfikacji skutecznych nowych podejść terapeutycznych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez NIH-R01DK106964 i P20DK123971 granty dla Georgi V. Petkova. Autorzy dziękują dr. Wiktorowi Jarockiemu i pani Sarah Maxwell za krytyczną ocenę manuskryptu. Jesteśmy również wdzięczni chirurgom urologicznym z MUSC i UTHSC: dr Thomasowi Keane'owi, Harry'emu Clarke'owi, Stephenowi Savage'owi, Rossowi Ramesowi, Sandipowi Prasadowi, Jonathanowi Picardowi, Christopherowi Ledbetterowi i Anthony'emu Pattersonowi, a także rezydentom urologii MUSC i UTHSC: dr Taylorowi Vaughanowi, Samuelowi Walkerowi Nicklesowi, Matthew Youngowi, Erin Burns, Justinowi Ellettowi, Ryanowi Leveyowi, Austinowi Youngerowi, Markowi Currinowi, Nima Baradaran, Olugbemisola McCoy, Tracy Tipton, Bryce Wyatt, Alyssa Greiman, Sarah Starosta, Aaron Bloch, Christine Callaway, Lucille Cox, Christian Dewan, Erin Heitman, Bradley Houston, Stephen Legg, Robert S. Libby, Cole Locklear, Kristen Marley, Monica O'Hanlon, Patrick Probst, Cynthia Sharadin, Elizabeth Tourville, Daniel Zapata za pomoc w pobieraniu tkanek ludzkich.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5 ml polistyrenowa probówka okrągłodennaFalcon352054Probówki do DS zawierające enzymy stosowane na etapach trawienia
9-PhenanthrolSigma-Aldrich211281Inhibitor kanału TRPM4
Amfoterycyna-BFisherBP928-250Stosowany do perforacji plastrów/komórek
Amfoterycyna-BNormy referencyjne Farmakopei Europejskiej5Używany do łatki/ perforacja komórek
Amfoterycyna-BSigma-AldrichA9528-100MGSłuży do perforacji łat/komórek
Analogowy mieszalnik wirowyVWR58816-121
Kwas asparaginowySigma-AldrichA9006Wewnątrzkomórkowy roztwór do pipet
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA7906DS
CaCl2Sigma-AldrichC1016Roztwór zewnątrzkomórkowy i DS
Szkło kapilarneSutterBF150-110-7.5Kapilara, do przygotowania elektrod ciągniętych Hydrat
wodorotlenku cezuSigma-AldrichC8518Wewnątrzkomórkowy roztwór pipetowy
Oprogramowanie Clampex ver. 10 zawiera programy do pozyskiwania danych (Clampex) i analizy (Clampfit)Axon Instruments/ Molecular DevicespCLAMP-10Oprogramowanie komercyjne i część konfiguracji zestawu do zacisków krosowych
Kolagenaza typu 2Worthington Biochemical CorporationLS004177DS-C
CsClSigma-Aldrich203025Roztwory zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe
Wosk dentystycznyMiltex Dental Wax Technologies, Inc.
Termometr cyfrowy 18058351 z sondąFisher Scientific15-077-32Umieszczony w kąpieli tkankowej w celu monitorowania temperatury
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD2650Rozpuszczalnik
DL-Ditiothreitol (DDT)Sigma-AldrichD9779Środki redukujące stosowane razem z Papainą
EGTASigma-AldrichE3889Chelatator Ca2+, stosowany w wewnątrzkomórkowym roztworze do pipet
Ściągacz do mikropipet Flaming/BrownSutterP-97Wymagany do wyciągania elektrod z bardzo cienkimi końcówkami
Pływający stojak/uchwyt na rurki piankoweVWR Scientific82017-634Służy do trzymania probówek z enzymami do kontroli temperatury
GlukozaSigmaG8270
Kwas glutaminowy (sól Na)Sigma-AldrichG1626DS
HEPESSigma-AldrichH3375Bufor pH
KClFisher ScientificBP366-1Roztwór zewnątrzkomórkowy
System akwizycji danych o niskim poziomie szumówAxon Instruments/ Urządzenia molekularneDigidata 1440ACzęść zestawu z zaciskiem krosowym
Mieszadło magnetyczneVWR01-442-684
MgCl2 (sześciowodne)Sigma-AldrichM2670Roztwory zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe
MicroForgeNarishigeMF-830Stosowany do elektrod do polerowania ogniowego
NaClSigma-AldrichS7653Roztwory zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe
NaOHSigma-AldrichS8045
NifedypinaSigma-AldrichN7634Kanał Ca2+ bramkowany napięciem typu L bloker
Mikroskop odwrócony firmy Nikon, TS100 ze stolikiem T1-SM z obiektywami 5x, 10x, 20x i 40xNikonwycofany z produkcjiCzęść zestawu Patch-clamp
Igła do strzykawek Niemetalowa igła strzykawkowa, MicroFilWPIMF-34G-5Napełnianie wewnątrzkomórkowego roztworu pipet
PapainWorthington Biochemical CorporationLS003126DS-P
Pipeta PasteuraFisherBrand13-678-20AKońcówki są odłamywane i polerowane ogniowo i używane do miareczkowania tkanek poddanych działaniu enzymatycznym w celu uwolnienia pojedynczych komórek DSM z kawałków
Wzmacniacz patch-clampAxon Instruments/ Urządzenia molekularneAxon Axopatch 200BCzęść zestawu do zacisków krosowych
Komputer PCDELLKonfiguracja niestandardowaCzęść zestawu do zacisków krosowych
pH-metrAspera InstrumentsPH700
Rurka polietylenowaIntramedic427-436Rurka do superfuzji kąpieli zewnątrzkomórkowej podłączona do komory zapisu ze szklanym dnem
Chlorek tetraetyloamonuSigma-AldrichT2265Bloker kanałów jonowych Kv i BK dodany do roztworu do kąpieli zewnątrzkomórkowej
Thermo Scientific Precyzyjna kąpiel wodna z wytrząsaniem (model 2870)Thermo ScientificWycofane ze sprzedażyŁaźnia wodna do kontroli temperatury trawienia enzymatycznego stosowana jako alternatywa dla kąpieli w komorze cyrkulacyjnej
tkanek Kąpiel tkankowa, 100 mlRadnoti1583-101Podłączone do kąpieli cyrkulacyjnej i wypełnione wodą, probówki z kawałkami DS i DSM są umieszczane w konfiguracji do kontrolowania temperatury etapów trawienia
Rurki winyloweColePalmer06405-3Wiele zastosowań, w tym do łączenia kąpieli tkankowej z kąpielą z obiegową wodą
Kąpiel cyrkulatora wody, Haake D1 LHaakeWycofanePołączone z kąpielą tkankową
Waga WagaMettler ToledoXS64
Mikroskop odwrócony ZeissAxiovert 40C z obiektywami 10x i 40xCarl-ZeissWycofaneCzęść zestawu z zaciskiem krosowym

Bibliografia

  1. Andersson, K. E., Arner, A. Urinary bladder contraction and relaxation: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 84 (3), 935-986 (2004).
  2. Brading, A. F., Brain, K. L. Ion channel modulators and urinary tract function. Urinary Tract. Andersson, K. E., Michel, M. C. 202, Springer-Verlag. Berlin Heidelberg, Germany. Part of Handbook of Experimental Pharmacology book series 375-393 (2011).
  3. Brading, A. F. Spontaneous activity of lower urinary tract smooth muscles: correlation between ion channels and tissue function. Journal of Physiology. 570, Pt 1 13-22 (2006).
  4. Brading, A. F., Heaton, J. P., Hashitani, H. A survey of commonalities relevant to function and dysfunction in pelvic and sexual organs. International Journal of Impotence Research. 20 (1), 1-16 (2008).
  5. Petkov, G. V. Role of potassium ion channels in detrusor smooth muscle function and dysfunction. Nature Reviews Urology. 9 (1), 30-40 (2012).
  6. Andersson, K. E. Treatment-resistant detrusor overactivity--underlying pharmacology and potential mechanisms. International Journal of Clinical Practice Supplement. 151, 8-16 (2006).
  7. Sui, G. P., Wu, C., Fry, C. H. The electrophysiological properties of cultured and freshly isolated detrusor smooth muscle cells. Journal of Urology. 165 (2), 627-632 (2001).
  8. Kropp, B. P., et al. Characterization of cultured bladder smooth muscle cells: assessment of in vitro contractility. Journal of Urology. 162 (5), 1779-1784 (1999).
  9. Bonev, A., Isenberg, G. Arginine-vasopressin induces mode-2 gating in L-type Ca2+ channels (smooth muscle cells of the urinary bladder of the guinea-pig). Pflügers Archive - European Journal of Physiology. 420 (2), 219-222 (1992).
  10. Schneider, P., Hopp, H. H., Isenberg, G. Ca2+ influx through ATP-gated channels increments [Ca2+]i and inactivates ICa in myocytes from guinea-pig urinary bladder. Journal of Physiology. 440, 479-496 (1991).
  11. Wellner, M. C., Isenberg, G. Properties of stretch-activated channels in myocytes from the guinea-pig urinary bladder. Journal of Physiology. 466, 213-227 (1993).
  12. Wellner, M. C., Isenberg, G. Stretch-activated nonselective cation channels in urinary bladder myocytes: importance for pacemaker potentials and myogenic response. Experientia Supplementum. 66, 93-99 (1993).
  13. Klockner, U., Isenberg, G. Action potentials and net membrane currents of isolated smooth muscle cells (urinary bladder of the guinea-pig). Pflügers Archive - European Journal of Physiology. 405 (4), 329-339 (1985).
  14. Moore, E. D., et al. Organization of Ca2+ release units in excitable smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder. Biophysical Journal. 87 (3), 1836-1847 (2004).
  15. Hristov, K. L., Chen, M., Kellett, W. F., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Large conductance voltage- and Ca2+-activated K+ channels regulate human detrusor smooth muscle function. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 301 (4), 903-912 (2011).
  16. Afeli, S. A., Rovner, E. S., Petkov, G. V. SK but not IK channels regulate human detrusor smooth muscle spontaneous and nerve-evoked contractions. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 303 (4), 559-568 (2012).
  17. Hristov, K. L., et al. Kv2.1 and electrically silent Kv channel subunits control excitability and contractility of guinea pig detrusor smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (2), 360(2012).
  18. Afeli, S. A., Malysz, J., Petkov, G. V. Molecular expression and pharmacological evidence for a functional role of Kv7 channel subtypes in Guinea pig urinary bladder smooth muscle. PLoS One. 8 (9), 75875(2013).
  19. Smith, A. C., et al. TRPM4 channel: a new player in urinary bladder smooth muscle function in rats. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 304 (7), 918-929 (2013).
  20. Smith, A. C., et al. Novel role for the transient potential receptor melastatin 4 channel in guinea pig detrusor smooth muscle physiology. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 304 (5), 467(2013).
  21. Hristov, K. L., Smith, A. C., Parajuli, S. P., Malysz, J., Petkov, G. V. Large-conductance voltage- and Ca2+-activated K+ channel regulation by protein kinase C in guinea pig urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 306 (5), 460-470 (2014).
  22. Hristov, K. L., et al. Novel regulatory mechanism in human urinary bladder: central role of transient receptor potential melastatin 4 channels in detrusor smooth muscle function. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310 (7), 600-611 (2016).
  23. Malysz, J., Afeli, S. A., Provence, A., Petkov, G. V. Ethanol-mediated relaxation of guinea pig urinary bladder smooth muscle: involvement of BK and L-type Ca2+ channels. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 306 (1), 45-58 (2014).
  24. Montgomery, B. S., Fry, C. H. The action potential and net membrane currents in isolated human detrusor smooth muscle cells. Journal of Urology. 147 (1), 176-184 (1992).
  25. Parajuli, S. P., Soder, R. P., Hristov, K. L., Petkov, G. V. Pharmacological activation of small conductance calcium-activated potassium channels with naphtho[1,2-d]thiazol-2-ylamine decreases guinea pig detrusor smooth muscle excitability and contractility. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 340 (1), 114-123 (2012).
  26. Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Ca2+-activated K+ channels regulate action potential repolarization in urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 273 (1), Pt 1 110-117 (1997).
  27. Petkov, G. V., Nelson, M. T. Differential regulation of Ca2+-activated K+ channels by beta-adrenoceptors in guinea pig urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 288 (6), 1255-1263 (2005).
  28. Herrera, G. M., Etherton, B., Nausch, B., Nelson, M. T. Negative feedback regulation of nerve-mediated contractions by KCa channels in mouse urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative Comparative Physiology. 289 (2), 402-409 (2005).
  29. Malysz, J., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Single-channel biophysical and pharmacological characterizations of native human large-conductance calcium-activated potassium channels in freshly isolated detrusor smooth muscle cells. Pflügers Archive - European Journal of Physiology. 465 (7), 965-975 (2013).
  30. Provence, A., Angoli, D., Petkov, G. V. Kv7 channel pharmacological activation by the novel activator ML213: role for heteromeric Kv7.4/Kv7.5 channels in guinea pig detrusor smooth muscle function. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 364 (1), 131-144 (2018).
  31. Parajuli, S. P., et al. Control of urinary bladder smooth muscle excitability by the TRPM4 channel modulator 9-phenanthrol. Channels (Austin). 7 (6), 537-540 (2013).
  32. Ishibashi, H., Moorhouse, A. J., Nabekura, J. Perforated whole-cell patch-clamp technique: a user's guide. Patch Clamp Techniques: From Beginning to Advanced Protocols. Okada, Y. 4, Springer. Tokyo, Japan. 71-83 (2012).
  33. Provence, A., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Regulation of transient receptor potential melastatin 4 channel by sarcoplasmic reticulum inositol trisphosphate receptors: Role in human detrusor smooth muscle function. Channels (Austin). 11 (5), 459-466 (2017).
  34. Hristov, K. L., et al. Suppression of human detrusor smooth muscle excitability and contractility via pharmacological activation of large conductance Ca2+-activated K+ channels. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (11), 1632-1641 (2012).
  35. Xin, W., Soder, R. P., Cheng, Q., Petkov, G. V. Inhibition of phosphodiesterases relaxes detrusor smooth muscle via activation of the large conductance voltage- and Ca2+-activated K+ channel. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (9), 1361-1370 (2012).
  36. Hristov, K. L., et al. Neurogenic detrusor overactivity is associated with decreased expression and function of the large conductance voltage- and Ca2+-activated K+ channels. PLoS One. 8 (7), 68052(2013).
  37. Hristov, K. L., Parajuli, S. P., Provence, A., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Nongenomic modulation of the large conductance voltage- and Ca2+-activated K+ channels by estrogen: A novel regulatory mechanism in human detrusor smooth muscle. Physiological Reports. 5 (14), (2017).
  38. Parajuli, S. P., et al. Functional link between muscarinic receptors and large-conductance Ca2+ -activated K+ channels in freshly isolated human detrusor smooth muscle cells. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 467 (4), 665-675 (2015).
  39. Malysz, J., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Single-channel biophysical and pharmacological characterizations of native human large-conductance calcium-activated potassium channels in freshly isolated detrusor smooth muscle cells. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 465 (7), 965-975 (2013).
  40. Thorneloe, K. S., Nelson, M. T. Properties of a tonically active, sodium-permeable current in mouse urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 286 (6), 1246-1257 (2004).
  41. Barry, M. J., et al. The American Urological Association symptom index for benign prostatic hyperplasia. The Measurement Committee of the American Urological Association. Journal of Urology. 148 (5), 1549-1557 (1992).
  42. Klockner, U., Isenberg, G. Calcium currents of cesium loaded isolated smooth muscle cells (urinary bladder of the guinea pig). Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 405 (4), 340-348 (1985).
  43. Klockner, U., Isenberg, G. Tiapamil reduces the calcium inward current of isolated smooth muscle cells. Dependence on holding potential and pulse frequency. European Journal of Pharmacology. 127 (3), 165-171 (1986).
  44. Weidelt, T., Isenberg, G. Augmentation of SR Ca2+ release by rapamycin and FK506 causes K+-channel activation and membrane hyperpolarization in bladder smooth muscle. British Journal of Pharmacology. 129 (7), 1293-1300 (2000).
  45. Inoue, R., Brading, A. F. The properties of the ATP-induced depolarization and current in single cells isolated from the guinea-pig urinary bladder. British Journal of Pharmacology. 100 (3), 619-625 (1990).
  46. Inoue, R., Brading, A. F. Human, pig and guinea-pig bladder smooth muscle cells generate similar inward currents in response to purinoceptor activation. British Journal of Pharmacology. 103 (4), 1840-1841 (1991).
  47. Nakayama, S., Brading, A. F. Possible contribution of long open state to noninactivating Ca2+ current in detrusor cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 269 (1), Pt 1 48-54 (1995).
  48. Nakayama, S., Brading, A. F. Interaction of Ca2+ agonist and depolarization on Ca2+ channel current in guinea pig detrusor cells. Journal of General Physiology. 106 (6), 1211-1224 (1995).
  49. Gallegos, C. R., Fry, C. H. Alterations to the electrophysiology of isolated human detrusor smooth muscle cells in bladder disease. Journal of Urology. 151 (3), 754-758 (1994).
  50. JournalFry, C. H., Gallegos, C. R., Montgomery, B. S. The actions of extracellular H+ on the electrophysiological properties of isolated human detrusor smooth muscle cells. Journal of Physiology. 480, Pt 1 71-80 (1994).
  51. Sui, G. P., Wu, C., Fry, C. H. A description of Ca2+ channels in human detrusor smooth muscle. BJU International Journal. 92 (4), 476(2003).
  52. Wu, C., Sui, G., Fry, C. H. The role of the L-type Ca2+ channel in refilling functional intracellular Ca2+ stores in guinea-pig detrusor smooth muscle. Journal of Physiology. 538, Pt 2 357-369 (2002).
  53. Bonev, A. D., Nelson, M. T. Muscarinic inhibition of ATP-sensitive K+ channels by protein kinase C in urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 265 (6), Pt 1 1723-1728 (1993).
  54. Bonev, A. D., Nelson, M. T. ATP-sensitive potassium channels in smooth muscle cells from guinea pig urinary bladder. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 264 (5), 1190-1200 (1993).
  55. Petkov, G. V., Heppner, T. J., Bonev, A. D., Herrera, G. M., Nelson, M. T. Low levels of KATP channel activation decrease excitability and contractility of urinary bladder. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative Comparative Physiology. 280 (5), 1427-1433 (2001).
  56. Shieh, C. C., et al. Functional implication of spare ATP-sensitive K+ channels in bladder smooth muscle cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 296 (3), 669-675 (2001).
  57. Shieh, C. C., et al. Characterization of a novel ATP-sensitive K+ channel opener, A-251179, on urinary bladder relaxation and cystometric parameters. British Journal of Pharmacology. 151 (4), 467-475 (2007).
  58. Petkov, G. V., et al. Beta1-subunit of the Ca2+-activated K+ channel regulates contractile activity of mouse urinary bladder smooth muscle. Journal of Physiology. 537, Pt 2 443-452 (2001).
  59. Thorneloe, K. S., Nelson, M. T. Properties and molecular basis of the mouse urinary bladder voltage-gated K+ current. Journal of Physiology. 549, Pt 1 65-74 (2003).
  60. Hristov, K. L., et al. Stimulation of beta3-adrenoceptors relaxes rat urinary bladder smooth muscle via activation of the large-conductance Ca2+-activated K+ channels. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 295 (5), 1344-1353 (2008).
  61. Layne, J. J., Nausch, B., Olesen, S. P., Nelson, M. T. BK channel activation by NS11021 decreases excitability and contractility of urinary bladder smooth muscle. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative Comparative Physiology. 298 (2), 378-384 (2010).
  62. Lee, H., Koh, B. H., Peri, L. E., Sanders, K. M., Koh, S. D. Functional expression of SK channels in murine detrusor PDGFRalpha+ cells. Journal of Physiology. 591 (2), 503-513 (2013).
  63. Lee, H., et al. Premature contractions of the bladder are suppressed by interactions between TRPV4 and SK3 channels in murine detrusor PDGFRalpha+ cells. Scientific Reports. 7 (1), 12245(2017).
  64. Yarotskyy, V., Malysz, J., Petkov, G. V. Properties of single channel and whole-cell Cl- currents in guinea pig detrusor smooth muscle cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 316 (5), 698-710 (2019).
  65. Driska, S. P., Porter, R. Isolation of smooth muscle cells from swine carotid artery by digestion with papain. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 251 (3), Pt 1 474-481 (1986).
  66. Seltzer, J. L., Welgus, H. G., Jeffrey, J. J., Eisen, A. Z. The function of Ca2+ in the action of mammalian collagenases. Archives of Biochemistry and Biophysics. 173 (1), 355-361 (1976).
  67. Skelton, G. S. Papaya proteinases. I. Temperature-and pH-stability curves. Enzymologia. 35 (5), 270-274 (1968).
  68. Petrova, D., Derekova, A., Vlahov, S. Purification and properties of individual collagenases from Streptomyces sp. strain 3B. Folia Microbiologica (Praha). 51 (2), 93-98 (2006).
  69. Sharpe, E. J., St Clair, J. R., Proenza, C. Methods for the isolation, culture, and functional characterization of sinoatrial node myocytes from adult mice. Journal of Visualized Experiments. (116), (2016).
  70. Brueggemann, L. I., Mani, B. K., Haick, J., Byron, K. L. Exploring arterial smooth muscle Kv7 potassium channel function using patch clamp electrophysiology and pressure myography. Journal of Visualized Experiments. (67), e4263(2012).
  71. Jarriault, D., Grosmaitre, X. Perforated patch-clamp recording of mouse olfactory sensory neurons in intact neuroepithelium: functional analysis of neurons expressing an identified odorant receptor. Journal of Visualized Experiments. (101), e52652(2015).
  72. Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B. Journal of Neuroscience Methods. 37 (1), 15-26 (1991).
  73. Knutson, K., et al. Whole cell electrophysiology of primary cultured murine enterochromaffin cells. Journal of Visualized Experiments. (139), (2018).
  74. Devienne, G., Le Gac, B., Piquet, J., Cauli, B. Single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp. Journal of Visualized Experiments. (136), (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

ludzkie kom rki DSMizolacja enzymatycznaelektrofizjologia patch clampkana TRPM4inhibicja 9 fenantrolemanaliza pojedynczych kom reksekcja tkanki p cherza moczowegoperforacja amfoterycyn B
Przygotowanie i wykorzystanie świeżo wyizolowanych ludzkich komórek mięśni gładkich wypieracza do charakterystyki 9-fenantrolowych prądów kationowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.