Artykuł metodologiczny

Test tworzenia presynaps przy użyciu kulek organizatora presynapsy i hodowli "kuli neuronalnej"

DOI:

10.3791/59893

⸱

2 sierpnia 2019

 ,  , 
1Functional Structure Biology Laboratory, Department of Medical Life Science, Yokohama City University Graduate School of Medical Life Science

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tworzenie presynaps to dynamiczny proces, w tym akumulacja białek synaptycznych w odpowiedniej kolejności. W tej metodzie tworzenie presynaps jest wywoływane przez koraliki sprzężone z białkiem organizatora presynapsy na arkuszach aksonalnych hodowli "kuli neuronalnej", dzięki czemu akumulacja białek synaptycznych jest łatwa do analizy podczas tworzenia presynapsy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas rozwoju neuronów, tworzenie synaps jest ważnym krokiem do ustanowienia obwodów neuronowych. Aby utworzyć synapsy, białka synaptyczne muszą być dostarczane w odpowiedniej kolejności poprzez transport z ciał komórkowych i/lub lokalną translację w niedojrzałych synapsach. Jednak nie do końca wiadomo, w jaki sposób białka synaptyczne gromadzą się w synapsach we właściwej kolejności. W tym miejscu przedstawiamy nowatorską metodę analizy powstawania presynaps poprzez wykorzystanie połączenia hodowli kulek neuronalnych z kulkami w celu indukowania tworzenia presynaps. Kule neuronalne, czyli agregaty komórek neuronalnych, zapewniają arkusze aksonalne z dala od ciał komórkowych i dendrytów, dzięki czemu można wykryć słabe sygnały fluorescencyjne presynaps, unikając przytłaczających sygnałów ciał komórkowych. Jako kulki do wyzwalania tworzenia presynaps używamy koralików sprzężonych z bogatym w leucynę powtarzającym się neuronem transbłonowym 2 (LRRTM2), pobudzającym organizatorem presynaptycznym. Za pomocą tej metody wykazaliśmy, że pęcherzykowy transporter glutaminianu 1 (vGlut1), białko pęcherzyków synaptycznych, gromadzi się w presynapsach szybciej niż Munc18-1, białko strefy aktywnej. Munc18-1 gromadził się w presynapsie w sposób zależny od translacji, nawet po usunięciu ciał komórkowych. Odkrycie to wskazuje na akumulację Munc18-1 poprzez lokalną translację w aksonach, a nie transport z ciał komórkowych. Podsumowując, metoda ta jest odpowiednia do analizy akumulacji białek synaptycznych w presynapsach i źródle białek synaptycznych. Ponieważ hodowla kulek neuronalnych jest prosta i nie jest konieczne stosowanie specjalnej aparatury, metoda ta może mieć zastosowanie do innych platform eksperymentalnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tworzenie synaps jest jednym z kluczowych etapów podczas rozwoju obwodów neuronowych1,2,3. Tworzenie synaps, które są wyspecjalizowanymi przedziałami złożonymi z pre- i postsynaps, jest złożonym i wieloetapowym procesem obejmującym odpowiednie rozpoznawanie aksonów i dendrytów, tworzenie strefy aktywnej i gęstości postsynaptycznej oraz prawidłowe ustawienie kanałów jonowych i receptorów neuroprzekaźników1,2. W każdym procesie wiele rodzajów białek synaptycznych gromadzi się w tych wyspecjalizowanych przedziałach we właściwym czasie, transportując białka synaptyczne z ciał komórkowych i / lub poprzez lokalną translację w przedziałach. Uważa się, że te białka synaptyczne są ułożone w zorganizowany sposób, tworząc funkcjonalne synapsy. Dysfunkcja niektórych białek synaptycznych polegająca na tworzeniu synaps prowadzi do chorób neurologicznych4,5. Nie jest jednak jasne, w jaki sposób białka synaptyczne gromadzą się we właściwym czasie.

Aby zbadać, jak białka synaptyczne gromadzą się w zorganizowany sposób, konieczne jest zbadanie akumulacji białek synaptycznych w porządku chronologicznym. Niektóre raporty wykazały obrazowanie na żywo w celu obserwacji tworzenia synaps w zdysocjowanej kulturze neuronów6,7. Jednak znalezienie neuronów, które dopiero zaczynają tworzyć synapsy pod mikroskopią, jest czasochłonne. Aby skutecznie obserwować akumulację białek synaptycznych, tworzenie synaps musi rozpocząć się w momencie, gdy naukowcy chcą indukować powstawanie. Drugim wyzwaniem jest rozróżnienie akumulacji białek synaptycznych w wyniku transportu z ciał komórkowych lub lokalnej translacji w synapsach. W tym celu konieczne jest zmierzenie poziomu translacji w warunkach, które nie pozwalają na transport białek synaptycznych z ciał komórkowych.

Opracowaliśmy nowy test tworzenia presynaps, wykorzystując połączenie hodowli kulek neuronalnych z koralikami do wywołania tworzenia presynaps8. Hodowla kulek neuronalnych została opracowana w celu zbadania fenotypu aksonalnego, ze względu na tworzenie się arkuszy aksonalnych otaczających ciała komórek9,10. Użyliśmy kulek magnetycznych sprzężonych z bogatym w leucynę powtarzającym się transbłonowym neuronem 2 (LRRTM2), który jest presynaptycznym organizatorem do indukowania pobudzających presynaps (Rysunek 1A) < sup class = "xref" > 11, 12 < sup class = "xref" >13. Dzięki zastosowaniu kulek LRRTM2 tworzenie presynaps rozpoczyna się w momencie nałożenia kulek. Oznacza to, że tworzenie presynaps rozpoczyna się w tysiącach aksonów kuli neuronowej w tym samym czasie, co pozwala na efektywne badanie precyzyjnego przebiegu akumulacji białek synaptycznych w czasie. Ponadto, hodowla kulek neuronalnych jest łatwa do zablokowania transportu białek synaptycznych z somy poprzez usunięcie ciał komórkowych (Rysunek 1B)8. Potwierdziliśmy już, że aksony bez ciał komórkowych mogą przetrwać i są zdrowe co najmniej 4 godziny po usunięciu ciał komórkowych. W związku z tym protokół ten jest odpowiedni do zbadania, skąd pochodzą białka synaptyczne (ciało komórki lub akson) i jak białka synaptyczne gromadzą się w zorganizowany sposób.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty opisane w tym manuskrypcie zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi przedstawionymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Miejskiego w Yokohamie.

1. Przygotowanie kulek neuronalnych jako hodowli z wiszącej kropli (Dni in vitro (DIV) 0-3)

UWAGA: Opisane tutaj procedury przygotowania hodowli kulek neuronalnych są oparte na metodzie wcześniej opisanej przez grupę Sasaki z pewnymi modyfikacjami9,10. Przyjęliśmy również kilka procedur z metody Bankera dla kultury dysocjacji14.

  1. Potwierdzenie następujących czynności przed rozpoczęciem sekcji
    1. Przygotuj wszystkie wymagane roztwory i wcześniej wysterylizuj je w autoklawie/filtracji.
    2. Przygotuj wszystkie instrumenty i materiały, które mają być użyte na każdym etapie tej hodowli neuronów korowych.
    3. Spryskaj i wytrzyj komorę laminarnego przepływu powietrza, stół separacyjny, płytkę sceniczną mikroskopu stereoskopowego, nożyczki i kleszcze 70% etanolem.
  2. Poddaj mysz eutanazji po zastosowaniu CO2 i wypreparuj jamę brzuszną w celu uzyskania zarodków E16.
  3. Ostrożnie usunąć mózgi z zarodków za pomocą cienkich końcówek kleszczy i przenieść je do 60-milimetrowych szalek do hodowli komórkowych zawierających 4 ml buforowanego roztworu soli HEPES (HBSS).
    UWAGA: Pożywka preparcyjna HBSS zawiera 10 mM HEPES (pH 7,4), 140 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,09 mM Na2HPO4, 1,1 mM KH2PO4, 5,6 mM D-glukozy i 5,64 μM czerwieni fenolowej.
  4. Usuń skórę głowy, odetnij opuszkę węchową, oddziel korę mózgową od każdej półkuli mózgowej za pomocą cienkich końcówek kleszczy pod mikroskopem stereoskopowym i przenieś do innych 60-milimetrowych szalek zawierających świeży HBSS. Użyj co najmniej 3-5 zarodków do każdej oddzielnej hodowli kulki neuronalnej.
  5. Pokrój korę na małe kawałki za pomocą sprężynowych nożyczek do mikropreparowania w kapturze do hodowli komórek z przepływem laminarnym.
  6. Przenieś zmieloną korę mózgową do probówki o pojemności 15 ml i trypsynizuj zmieloną korę w 4 ml 0,125% trypsyny w HBSS przez 4,5 minuty w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Ten czas trypsynizacji ma kluczowe znaczenie dla wydajnej hodowli neuronów, ponieważ wydłużający się czas (> 4,5 minuty) prowadzi do znacznie większej liczby martwych neuronów.
  7. Przenieść agregaty komórek do nowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml HBSS za pomocą sterylnej pipety transferowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Powtórzyć ten krok jeszcze raz.
  8. Przenieś agregaty komórkowe do nowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml pożywki neuropodstawowej zawierającej GlutaMax, suplement B27 (pożywka NGB), 0,01% DNazy I i 10% surowicy końskiej.
  9. Trypsynizowane korki należy rozcierać, wielokrotnie pipetując je w górę i w dół (3-5 razy) za pomocą pipety Pasteura z polerowanego ogniowo szkła Pasteur.
    UWAGA: Średnica pipety Pasteura z polerowanego ogniowo szkła drobnego jest bardzo ważna, zgodnie z opisem w metodzie Bankera paper14. Jeśli pipeta jest zbyt wąska, aby przejść przez korę mózgową, przygotuj pipety o 2-3 różnych rozmiarach i spróbuj użyć większej pipety.
  10. Aby przygotować kulki neuronowe, weź powyższą zawiesinę komórek i dostosuj gęstość komórek do 1 x 106 komórek/ml za pomocą pożywki NGB.
  11. Hoduj neurony korowe w postaci wiszących kropli zawierających 10 000 komórek / kroplę (1 kropla to 10 μl) wewnątrz górnych powiek 10 cm naczyń hodowlanych.
  12. Dodać 7 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do dolnej części szalek hodowlanych, a następnie przechowywać w inkubatorze przez 3 dni w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w warunkach wilgotnych, aby umożliwić tworzenie się kulek neuronowych.

2. Umieszczanie kulek neuronów na szkiełkach nakrywkowych pokrytych PLL i utrzymanie hodowli (DIV 3-11)

UWAGA: Przed pokryciem szkiełek nakrywkowych poli-L-lizyną (PLL), ważne jest umycie szkiełek nakrywkowych za pomocą detergentu. Szkiełka nakrywkowe czasami nie są tak czyste dla hodowli neuronów i jednolitego powlekania PLL. Niejednorodna powłoka PLL może powodować nierównomierne wydłużenie aksonów kulek neuronowych.

  1. Namocz szkiełka nakrywkowe w rozcieńczonym w 1/20 neutralnym detergencie bez fosforu w ceramicznych stojakach na 1-3 noce.
  2. Umyj szkiełka nakrywkowe 8 razy w ultraczystej wodzie, a następnie sterylizuj w piekarniku w temperaturze 200 °C przez 12 godzin
    UWAGA: Wszystkie kroki od tego miejsca należy wykonać w okapie do hodowli komórek z laminarnym przepływem powietrza.
  3. Upieczone szkiełka nakrywkowe przełożyć do naczyń o średnicy 100 mm. Po uszczelnieniu naczynia za pomocą parafilmu między pokrywką a dolnym naczyniem, upieczone szkiełka nakrywkowe można przechowywać do długotrwałego przechowywania.
  4. (Opcjonalnie) Nałóż kropki parafinowe na szkiełka nakrywkowe. Kropki tworzą przestrzeń, aby zapobiec odklejaniu się kulek neuronalnych od szkiełek nakrywkowych podczas barwienia immunologicznego poprzez bezpośredni kontakt kulek neuronów z plastikowymi naczyniami. Rozpuść parafinę w odpowiedniej butelce w gorącej łaźni wodnej o temperaturze około 90 °C. Zanurz pipetę Pasteura w parafinie, a następnie szybko dotknij jej, aby uzyskać trzy plamy w pobliżu krawędzi szkiełka nakrywkowego.
  5. Pokryć PLL (MW > 300 000) na szkiełkach nakrywkowych z perełkami parafinowymi w 60-milimetrowych szalkach przy użyciu roztworu PLL (15 μg/ml w buforze boranowym) i przechowywać je przez co najmniej 1 godzinę w inkubatorze CO2 .
  6. Po 4-krotnym przemyciu PBS przenieść szkiełka nakrywkowe pokryte PLL na płytkę 4-dołkową zawierającą 350 μl pożywki NGB w każdym dołku i chlorowodorek cytozyny β-D-arabinofuranozydu (AraC, 3 μM) do pożywki w celu zabicia dzielących się komórek.
  7. Tę 4-dołkową płytkę zawierającą szkiełka nakrywkowe pokryte PLL należy przechowywać w inkubatorze CO2 przez co najmniej 20 minut, aby upewnić się, że temperatura podłoża osiągnie 37 °C przed przeniesieniem kulek neuronowych.
  8. W DIV 3, gdy "kulki neuronowe" są bardzo dobrze uformowane, przenieś je na szkiełka nakrywkowe pokryte PLL wewnątrz 4-dołkowej płytki (5 kulek neuronów / studzienkę) przechowywanej w inkubatorze CO2
    9. .
  9. Po 48 godzinach zastąp pożywkę do hodowli kulek neuronów świeżą pożywką NGB wolną od AraC. Bezpośrednio przed tą procedurą należy użyć płyty grzejnej w okapie do hodowli komórek z laminarnym przepływem powietrza, którego temperatura jest utrzymywana na poziomie 37 °C.
    UWAGA: Konieczna jest jak najszybsza zmiana pożywki na płycie grzejnej, aby skrócić czas, w którym kultury znajdują się na zewnątrz inkubatora CO2 .
  10. Utrzymuj tę hodowlę kulek neuronalnych w inkubatorze CO2 do DIV 11.
    UWAGA: W DIV 11-12 do eksperymentów używa się kulek neuronalnych rozciągających neuryty do 1-2 mm.

3. Stosowanie kulek LRRTM2 na hodowli kulek neuronów z ciałami komórkowymi lub bez nich (DIV 11-12)

UWAGA: Przed zastosowaniem koralików LRRTM2 na hodowli kulek neuronów, zaleca się usunięcie ciał komórkowych. Dlatego najpierw przygotuj kulki LRRTM2, następnie usuń ciała komórek, a następnie jak najwcześniej nałóż kulki LRRTM2 na hodowlę. Biotynylowany LRRTM2 jest dostarczany przez grupę Nogi (Uniwersytet Miejski w Jokohamie) jako pożywka kondycjonowana. Używają wektora ekspresji, w tym sekwencji akceptora biotyny i ligazy biotyny z E. coli (BirA)15,16, aby dołączyć biotynę do LRRTM2, a wektor ekspresji jest transfekowany do komórek Expi293F zawartych w systemie ekspresji Expi293. Informacje o wektorach są dostępne na rysunku uzupełniającym 1. Biotynylowane kulki streptawidyny sprzężone z LRRTM2 znacznie zmniejszyły tło barwienia immunologicznego w porównaniu z LRRTM2-Fc – sprzężonymi kulkami białka A, które są używane w prototypowym systemie LRRTM2 8.

  1. Przygotowanie biotynylowanych kulek LRRTM2
    1. Aby usunąć nadmiar biotyny z kondycjonowanej pożywki komórek Expi293F eksprymujących biotynylowany LRRTM2, nałóż 1,7 ml kondycjonowanej pożywki zmieszanej z 0,8 ml PBS (łącznie 2,5 ml) do kolumny filtracyjnej żelu PD-10. Kolumnę PD-10 wstępnie równoważy się z 25 ml ultraczystej wody i 25 ml PBS.
    2. Eluować za pomocą 3,5 ml PBS i zebrać przepływ w postaci LRRTM2 stock.
      UWAGA: Ten bulion LRRTM2 może być dozowany do podwielokrotności i przechowywany w temperaturze -80 °C przez długi czas. Poziomy ekspresji biotynylowanego LRRTM2 czasami różnią się w zależności od partii. W związku z tym należy określić odpowiednią objętość LRRTM2 do sprzężenia z kulkami, aby utworzyć wystarczającą ilość presynaps na kulkach neuronów, gdy nowa partia LRRTM2 jest używana po raz pierwszy.
    3. Pobrać 20 μl z zawiesiny cząstek magnetycznych pokrytych streptawidyną (średnica: 4-5 μm) do probówki mikrowirówkowej. Unieruchomić kulki do ręcznie wykonanego aparatu przymocowanego za pomocą neodymowych magnesów trwałych i przemyć trzykrotnie 100 μl PBS-MCBC w probówkach mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: PBS-MCBC zawiera PBS, w tym 5 mM MgCl2, 3 mM CaCl2, 0,1% BSA i 0,1% Complete EDTA.
    4. Po całkowitym usunięciu PBS-MCBC z kulek, dodaj z góry określoną objętość bulionu LRRTM2 (zwykle 500-1,000 μL, patrz uwaga 3.1.2) do umytych kulek. Inkubować mieszaninę za pomocą rotatora w temperaturze 4 °C przez 1-2 godziny.
    5. Umyj kulki dwukrotnie 100 μl PBS-MCBC, a następnie 100 μl pożywki NGB.
    6. Ponownie zawiesić kulki LRRTM2 w 50 μl pożywki NGB w celu zastosowania do hodowli kulek neuronowych.
    7. Stosować te same procedury do przygotowania kulek kontrolnych (kontrola ujemna) w innej probówce do mikrowirówki, z wyjątkiem dodania biotynylowanych białek LRRTM2.
  2. Usuwanie ciał komórkowych z kulek neuronalnych w DIV 11-12 i nakładanie kulek LRRTM2
    1. Oznacz studzienki płytki 4-dołkowej jako "Ciało komórki (+)" i "Ciało komórki (-)".
    2. Odetnij koniec żółtej końcówki pod kątem 45° za pomocą żyletki uprzednio spryskanej 70% etanolem pod mikroskopem stereoskopowym (Rysunek 1B).
    3. Umieść żółty koniec końcówki na obszarze ciała komórki kuli neuronu i usuń ciała komórkowe przez odsysanie (Rysunek 1B).
    4. Aby zidentyfikować każdy określony warunek eksperymentu, ponownie oznacz studzienki jako "Koraliki LRRTM2" i "Koraliki kontrolne".
    5. Zastosuj LRRTM2 i kulki kontrolne na kulturze kulki neuronalnej i zanurz na dnie płytek na 1 minutę za pomocą magnesów ferrytowych, aby rozpocząć tworzenie presynaps. Ta procedura zapewnia przyziemienie wszystkich koralików w tym samym czasie. Szczególnie byłby skuteczny w przypadku inkubacji krótkotrwałej (np. 30 min i 1 godzina) z kulkami LRRTM2 synchronicznie.
    6. Aby przeprowadzić eksperymenty z biegiem czasu, oznacz każdy z nich osobno jako 0 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h i 18 h i nałóż koraliki LRRTM2 we wskazanych odstępach czasu.
    7. Po dodaniu kulek LRRTM2 inkubuj kulturę kulek neuronowych z kulkami przez określony czas (od 0 min do 18 godzin), aby utworzyć presynapsy.

4. Barwienie immunologiczne i mikroskopia

UWAGA: Utrwalaj komórki przez 4 godziny poprzez inkubację z koralikami LRRTM2 w warunkach eksperymentalnych z ciałami komórkowymi i bez nich, ponieważ aksony mają tendencję do stopniowego obumierania przy braku ciał komórkowych po 4 godzinach. W przypadku kursu czasu z koralikami LRRTM2, zamocuj ogniwa we wskazanym określonym czasie.

  1. Utrwalanie i barwienie neuronów w hodowli kulek neuronów po utworzeniu presynapsy za pomocą kulek LRRTM2
    1. Usuń pożywkę NGB i utrwal kulki neuronowe 4% PFA w PBS (250 μL/studzienkę) przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyj 500 μl PBS 4 razy co 5 minut.
    2. Przemywać utrwalone komórki TBS (sól fizjologiczna buforowana tris: 50 mM Tris-HCl (pH 7,3) i 150 mM NaCl) przez ponad 5 minut.
    3. Przepuszczalność komórek/aksonów hodowli kulek neuronalnych za pomocą TBS zawierającego 0,3% Triton X-100 przez 5 minut.
    4. Utrzymuj komórki przez 1 godzinę w celu zablokowania za pomocą buforu blokującego (0,1% Triton X-100 i 5% NGS (normalna surowica kozia) w TBS).
    5. Inkubować komórki z pierwszorzędowymi przeciwciałami: anty-króliczym vGlut1 (pęcherzykowy transporter glutaminianu 1 (1:4000)) i anty-mysim-Munc18-1 (1:300) rozcieńczonymi rozcieńczalnikiem przeciwciał przez noc w temperaturze 4 °C.
    6. Umyj szkiełka nakrywkowe 4 razy buforem immunofluorescencyjnym (IF) (0,1% Triton X-100 i 2% BSA w TBS) i inkubuj przez 30 minut z 2nd sprzężonymi z fluoroforem (barwnik Alexa); anty-mysimi IgG-Alexa 555 (1:500), anty-króliczymi IgG-Alexa 488 (1:1000).
    7. Wybarwić jądra ciał komórkowych neuronów przez 5 minut 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI, 1 μg/ml) w PBS.
    8. Umyć szkiełka nakrywkowe trzykrotnie PBS, a następnie zamontować na szkiełkach podstawowych za pomocą podłoża montażowego zawierającego 167 mg/ml alkoholu poli(winylowego) i 6 mg/ml galusanu N-propylu.
    9. Szkiełka podstawowe należy przechowywać w lodówce w temperaturze -20 °C do czasu badania mikroskopowego. Sygnały fluorescencyjne szkiełek podstawowych są wykrywalne przez co najmniej 1 rok, gdy szkiełka są przechowywane w temperaturze -20 °C.
  2. Wykonywanie zdjęć pod mikroskopem fluorescencyjnym
    1. Rejestruj obrazy różnicowych zakłóceń, kontrastu i IF pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym za pomocą chłodzonej kamery CCD z 60-krotnym obiektywem olejkowym. W przypadku oprogramowania do akwizycji obrazu należy użyć zainstalowanego w oprogramowaniu systemu mikroskopowego. Użyj Image J jako oprogramowania do analizy obrazu.
    2. Zmierz intensywność IF w presynapsach w aksonie, korzystając z następującego wzoru; Intensywności IF obszaru zainteresowania na koralikach (ROI) – Intensywność obszaru poza koralikami/Intensywność aksonów wzdłuż 20 μm od koralików – intensywność tła. Ten współczynnik intensywności zapewnia wskaźnik akumulacji białka (Rysunek 4A). Wykonaj pomiary na oryginalnych 16-bitowych obrazach za pomocą oprogramowania Image J.
    3. Aby określić ilościowo poziom akumulacji określonego białka w presynapsie indukowanej kulkami LRRTM2, zawsze wybieraj obszar z dala od 2 lub więcej pól widzenia poza ciałem komórki za pomocą mikroskopu (60X).
      UWAGA: Wybór obszaru w kuli neuronowej do obrazowania ma kluczowe znaczenie, ponieważ gęste aksony znajdują się w pobliżu ciała komórki, a na obrzeżach kuli neuronowej może znajdować się pojedynczy akson.
    4. Aby uzyskać dokładny pomiar, wybierz 5 różnych pól aksonalnych (podobna odległość od ciał komórek) / szkiełko nakrywkowe.
    5. Utrzymuj identyczne warunki obrazowania w różnych dniach i między eksperymentami

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj pokazujemy reprezentatywne wyniki akumulacji białek presynaptycznych w indukowanych przez LRRTM2 presynapsach arkuszy aksonalnych hodowli kul neuronów. Jako białka presynaptyczne przeanalizowaliśmy pobudzające białko pęcherzyków synaptycznych vGlut1 i białko strefy aktywnej Munc18-1. Zbadano również przebieg czasowy akumulacji vGlut1 i Munc18-1 w presynapsach i uzyskano wyniki wskazujące na źródło Munc18-1 w presynapsach za pomocą aksonów usuwających ciała komórkowe i inhibitora syntezy białek. Ostatnio badaliśmy r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy nowatorską metodę badania powstawania presynaps stymulowanych kulkami LRRTM2 przy użyciu hodowli kulek neuronalnych. Obecnie większość testów tworzenia presynaps obejmuje kulki pokryte poli-D-lizyną (PDL) i zdysocjowaną hodowlę/komorę mikroprzepływową 20,21,22. Jedną z zalet tej metody są koraliki LRRTM2. Podczas gdy LRRTM2 oddziałuje z neureksyną, tworząc pobudzające presynapsy specyficznie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest częściowo wspierana przez JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (C) (No. 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki). Dziękujemy dr Terukazu Nogi i Pani Makiko Neyazaki (Yokohama City University) za uprzejme dostarczenie biotynylowanego białka LRRTM2. Dziękujemy również Honami Uechi i Rie Ishii za pomoc techniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rozcieńczalnik przeciwciałDAKOS2022
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-585-151
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch711-545-152
mysi anty-Munc18-1BD Biosciences610336
Suplement B-27 (50X), surowica darmowyThermo Fisher Scientific17504044
Surowica bydlęca Alubumin (BSA)Nacalai Tesque01863-48
Wielonaczynia poddane hodowli komórkowej (naczynie 4-dołkowe)Nunc176740
Kompletna kamera CCD chłodzona
C015001Rozmiar: 15 mm, Grubość: 0,13-0,17 mm
Cytozyna β-D-arabinofuranozyd (AraC)Sigma-AldrichC1768
Dichlorowodorek 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI)Nacalai Tesque11034-56
Deoksyrybonukleaza 1 (DNaza I)Wako czyste chemikalia047-26771
Expi293 System ekspresjiThermo Fisher NaukowyA14635
Oprogramowanie do akwizycji obrazu
Oprogramowanie do analizy obrazuNIHImage Jhttps://imagej.nih.gov/ij/
Odwrócony mikroskop fluoniedawnyNikonEclipse Ti-E
Podłoże neuropodstawoweThermo Fisher Scientific#21103-049
Normalna surowica kozia (NGS)Thermo Fisher Scientific#143-06561
Galusan N-propyluNacalai Tesque29303-92
Paraformaldehyd (PFA)Nacalai Tesque26126-25

Paraplast Plus		Sigma-AldrichP3558
Bromek poli-L-lizyny (MW > 300 000)Nacalai Tesque28359-54
poli (alkohol winylowy)SigmaP8136
Paczkowane jednorazowe kolumny PD-10GE opieka zdrowotna17085101
przeciwpęcherzykowy transporter glutaminianuSystemy synaptyczne135-302
SCAT 20X-N (obojętny niefosforowy detergent)Nacalai Tesque41506-04
Cząstki magnetyczne pokryte streptawidynąSpherotech IncSVM-40-10średnica: 4-5 i mikro; m
TritonX-100Nacalai Tesque35501-15
TrypsynaNacalai Tesque18172-94
11873580001 Roche bez EDTA Andor Technology iXON3 Szkiełko nakrywkowe Matsunami surowicy końskiej Sigma-Aldrich H1270 Nikon NIS-element AR GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061 królika 1

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).
  2. Ziv, N. E., Garner, C. C. Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly. Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).
  3. Chia, P. H., Li, P., Shen, K. Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation. Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).
  4. Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
  5. Saitsu, H., et al. CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia. Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).
  6. Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. Assembly of New Individual Excitatory Synapses. Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).
  7. Bresler, T., et al. Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).
  8. Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis. Neuroscience Research. , (2018).
  9. Sasaki, Y., et al. Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local β-Actin Synthesis and Growth Cone Turning. Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).
  10. Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons. Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).
  11. Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
  12. de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
  13. Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
  14. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  15. Hirai, H., et al. Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2. EMBO reports. , (2017).
  16. Yasui, N., et al. Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).
  17. Bassell, G. J., Warren, S. T. Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function. Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).
  18. Darnell, J. C., Klann, E. The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS. Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).
  19. Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome. Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).
  20. Lucido, A. L., et al. Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts. Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).
  21. Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal Translation of β-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).
  22. Batista, A. F. R., Martínez, J. C., Hengst, U. Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals. Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kuleczki LRRTM2akumulacja vGlut1akumulacja Munc18 1aksonalny transport bia ektranslacja lokalnaobrazowanie immunofluorescencyjnebia ko p cherzyk w synaptycznychbia ko strefy aktywnej

Powiązane artykuły