Artykuł metodologiczny

Indukowane różnicowanie komórek podobnych do komórek M w monowarstwach jelita krętego pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

DOI:

10.3791/59894

⸱

26 lipca 2019

 ,  ,  , 
1Program in Immunology, Sackler School of Graduate Biomedical Sciences, 2Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 3Department of Molecular Biology and Microbiology, Tufts University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak indukować różnicowanie komórek M w monowarstwach jelita krętego pochodzących z ludzkich komórek macierzystych oraz metody oceny ich rozwoju.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M (mikrofałdowe) komórki jelita służą do transportu antygenu ze światła wierzchołkowego do leżących poniżej plam Peyera i blaszki właściwej, gdzie znajdują się komórki odpornościowe, a tym samym przyczyniają się do odporności błony śluzowej w jelicie. Brakuje pełnego zrozumienia, w jaki sposób limfocyty M różnicują się w jelicie, a także mechanizmów molekularnych wychwytu antygenu przez komórki M. Dzieje się tak, ponieważ limfocyty M są rzadką populacją komórek w jelicie, a modele in vitro komórek M nie są solidne. Odkrycie samoodnawiającego się systemu hodowli komórek macierzystych w jelicie, zwanych enteroidami, stworzyło nowe możliwości hodowli komórek M. Enteroidy mają przewagę nad standardowymi hodowanymi liniami komórkowymi, ponieważ można je różnicować w kilka głównych typów komórek znajdujących się w jelicie, w tym komórki kubkowe, komórki Panetha, komórki enteroendokrynne i enterocyty. Cytokina RANKL jest niezbędna w rozwoju komórek M, a dodanie RANKL i TNF-α do pożywek hodowlanych sprzyja różnicowaniu się podzbioru komórek z enteroidów jelita krętego w komórki M. Poniższy protokół opisuje metodę różnicowania komórek M w monowarstwowym systemie jelita z nabłonkiem transwell spolaryzowanym przy użyciu ludzkich enteroidów jelita krętego. Metodę tę można zastosować do badania rozwoju i funkcji komórek M.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M (mikrofałdy) komórki to wyspecjalizowane komórki nabłonka jelitowego znajdujące się głównie w nabłonku związanym z pęcherzykami (FAE) jelita pokrywającego małe obszary limfoidalne zwane łatami Peyera1. Komórki M mają krótkie, nieregularne mikrokosmki wierzchołkowe i są głęboko wgłębione po stronie podstawno-bocznej, co pozwala komórkom odpornościowym przebywać blisko ciała komórki2. Ta unikalna morfologia umożliwia komórkom M pobieranie próbek antygenu ze światła wierzchołkowego jelita i dostarczanie go bezpośrednio do leżących poniżej komórek odpornościowych2. W ten sposób limfocyty M są ważne dla nadzoru immunologicznego w jelicie, ale mogą być również wykorzystywane przez patogeny do wnikania do blaszki właściwej 1,2,3,4,5,6,7.

Badania nad komórkami M zostały utrudnione przez kilka czynników. Po pierwsze, komórki M znajdują się z niską częstotliwością w jelicie myszy i człowieka8. W hodowanych systemach komórkowych komórki podobne do komórek M zostały indukowane do różnicowania się poprzez kokulturę spolaryzowanej linii komórkowej gruczolakoraka, Caco-2, z limfocytami B z mysich łat Peyera lub linią komórkową chłoniaka z komórek B, Raji B9,10. Powoduje to powstanie podzbioru komórek Caco-2, które wyrażają markery komórek M: antygen Sialyl Lewis, A i UEA-1 w spolaryzowanym nabłonku9,10. (Markery te są również wyrażane na komórkach kubkowych w tkankach jelitowych, więc obecnie rzadziej są używane jako ostateczne markery komórek M11,12.) Ten system komórek Caco-2-M został wykorzystany do badania wychwytu cząstek i translokacji bakterii13,14. Jednak komórki Caco-2 są ustaloną linią komórkową z gruczolakoraka jelita grubego z czynnikiem zakłócającym polegającym na tym, że różne źródła komórek Caco-2 wykazują różne fenotypy wśród labs15. Co więcej, mogą nie w pełni podsumować poziomy transkrypcji prawdziwych komórek M, ponieważ brakuje im ekspresji obecnie znanych markerów komórek M GP2 i SpiB16. W związku z tym potrzebne są dodatkowe i bardziej fizjologicznie istotne modele hodowli, aby móc badać rozwój i funkcje komórek M.

W ciągu ostatnich dziesięciu lat, dziedzina modelowych systemów jelita wywodzących się z enteroidów szybko się rozwijała od początkowego odkrycia, że jelitowe komórki macierzyste pochodzące z ludzkiej biopsji jelita mogą się samoistnie rozmnażać i odnawiać w hodowli17,18. Co ważne, usunięcie czynników promujących komórki macierzyste z pożywki wzrostowej pozwala tym hodowlom komórek macierzystych różnicować się w wiele typów komórek występujących w jelicie18. Co więcej, ostatnie prace sugerują znaczenie sygnalizacji RANKL-RANK w rozwoju komórek M w jelicie19,20. Receptor RANK należy do rodziny receptorów TNF, która ulega ekspresji na nabłonkowych komórkach prekursorowych w jelicie19, podczas gdy RANKL (ligand receptora RANK) jest uwalniany przez komórki zrębu łat Peyera20. Ponieważ typy komórek nabłonkowych obecne w enteroidach jelita krętego nie wytwarzają RANKL, różnicowanie komórek M w kulturach enteroidów jelita krętego można indukować przez dodanie RANKL do pożywki hodowlanej21,22. Włączenie TNFα do pożywek hodowlanych wspomaga rozwój komórek M w enteroidach jelita krętego23. W tym miejscu opisano metody indukowania różnicowania komórek M w monowarstwach jelitowych pochodzących z ludzkich enteroidów jelita krętego. Nasze metody są częściowo oparte na modyfikacjach następujących protokołów21,22,23.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Tufts University, IBC i IRB.

1. Indukowanie różnicowania komórek M w monowarstwach pochodzących z jelita krętego

ludzkiego

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje enteroidy jelita krętego pochodzące z biopsji tkanek ludzkich. Zapoznaj się z opublikowanymi protokołami, aby uzyskać informacje o metodach wzrostu i przejścia tych komórek18,24. Poniższe metody tworzenia monowarstw zostały zaadaptowane z Zou et al.24. Metody indukowania komórek M w hodowlach pochodzących z jelita krętego zostały zaadaptowane z poprzednich raportów21,22,23. Wszystkie prace wykonywane są w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych, a inkubacje odbywają się w kapturze lub inkubatorze do hodowli tkankowych, jak wskazano. Zobacz tabelę materiałów potrzebnych do przygotowania monowarstw jelita krętego i różnych pożywek.

  1. Hoduj enteroidy jelita krętego przez 4-10 dni w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) (patrz Tabela Materiałów) (Rysunek 1), w zależności od ich wewnętrznego tempa wzrostu, przed wysiewem na transwell.
  2. Powlekanie membran transwell
    1. Umieść żądaną liczbę transwelli w 24-dołkowej płytce, tworząc system dwukomorowy.
    2. Rozcieńczyć ECM 25-krotnie w zimnym sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) i dodać 100 μl rozcieńczonego na zimno roztworu do każdej górnej komory na membranie.
      nuta: ECM i rozcieńczony roztwór ECM muszą być przechowywane na lodzie do momentu bezpośrednio przed dodaniem.
    3. Przykryć 24-dołkową płytkę pokrywką i umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na 2 godziny, aby umożliwić zestalenie ECM na membranie.
    4. Po 2 godzinach wyjąć płytkę z inkubatora i umieścić ją w kapturze do hodowli tkankowej. Za pomocą sterylnej pęsety odwróć każdą transwell, aby delikatnie usunąć pozostały roztwór. Pozostaw membrany do wyschnięcia na powietrzu w kapturze z otwartą pokrywą podczas zbierania komórek (kroki 1.3.1-1.3.11).
  3. Dysocjacja jelita krętego na pojedyncze komórki
    1. Wyjąć płytkę z enteroidami jelita krętego z inkubatora i delikatnie usunąć pożywkę hodowlaną z każdej studzienki przez aspirację próżniową lub za pomocą pipety.
      nuta: Jedna studzienka enteroidów jelita krętego zawierająca około 100 zdrowych torbieli wystarcza do zasiania 1,5-2 dołków.
    2. Dodać 500 μl lodowatego 0,5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do każdej studzienki zawierającej enteroidy jelita krętego zawieszone w ECM, aby rozbić ECM. Energicznie pipetować w górę i w dół za pomocą pipetora P1000 ustawionego na 500 μl, aby rozbić ECM, uwalniając w ten sposób enteroidy jelita krętego do roztworu. W celu lepszego rozpuszczenia ECM, po pipetowaniu należy energicznie wstrząsać płytką w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
    3. Zebrać roztwór z każdej studzienki do stożkowych probówek o pojemności 15 ml.
      nuta: Zbierz do 10 dołków na stożkową probówkę o pojemności 15 ml, aby uzyskać optymalne pobieranie pojedynczych komórek.
    4. Osad powinien być widoczny, ale można go łatwo usunąć, w wirówce o sile 140 x g i temperaturze 4 °C. Osad powinien być widoczny, ale można go łatwo usunąć, dlatego powoli usuwaj supernatant przez aspirację próżniową lub za pomocą pipety.
      nuta: W przypadku obaw o utratę osadu i komórek, należy użyć pipety i zachować supernatant w osobnej probówce.
    5. Aby strawić ścisłe połączenia połączeniowe i rozbić enteroidy jelita krętego na pojedyncze komórki, ponownie zawieś osad w 500 μl trypsyny o temperaturze pokojowej na każde 5 dołków zebranych w kroku 1.3.3. Używając P1000, pipetuj w górę i w dół, aby rozdrobnić grudki i inkubować probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 5 minut lub krócej.
      nuta: Potrzebna jest optymalizacja, aby określić odpowiednią ilość czasu wymaganego do inkubacji probówek, tak aby komórki zostały rozbite, ale nie nadmiernie trypsynizowane do punktu, w którym umrą. Użyj błękitu trypanowego w kroku 1.3.9, aby upewnić się, że komórki są zdolne do życia po leczeniu trypsyną.
    6. Dodaj 1 ml Advanced DMEM/F12 z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) na 500 μl trypsyny, aby dezaktywować trypsynę.
    7. Pipetować w górę i w dół za pomocą P1000 ustawionego na 500 μl co najmniej 50 razy w kierunku boku stożkowej probówki, aby dalej rozdrobnić pozostałe grudki na pojedyncze komórki.
    8. Umieść sitko o pojemności 40 μm na stożkowym o pojemności 50 ml i dodaj 1 ml Advanced DMEM/F12 z 10% FBS, aby zwilżyć sitko do komórek. Odpipetować zawiesinę jednokomórkową ze stożka o pojemności 15 ml na sitko. Umyj sitko 1 ml Advanced DMEM/F12 z 10% FBS.
    9. Przenieś komórki, które przeszły przez sitko do komórek, z probówki stożkowej o pojemności 50 ml do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Podczas etapu wirowania 1.3.10 osad komórkowy będzie łatwiej widoczny w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Użyj błękitu trypanowego, aby sprawdzić, czy komórki są nadal żywe. Zazwyczaj obserwuje się >95% żywotności.
    10. Podczas liczenia komórek należy odwirować komórki w nowej probówce o pojemności 15 ml przy 400 x g i temperaturze pokojowej przez 5 minut. Osad komórek powinien być widoczny. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety, ponownie oszczędzając supernatant na wypadek przemieszczenia się osadu.
    11. Przygotuj zmodyfikowane kompletne podłoże wzrostowe25 (pożywka MCMGF+) uzupełnione 10 μM Y-27632. Zawiesić granulowane komórki w 2,5 x 105 komórek/200 μl w MCMGF+. Zobacz uwagi w dyskusji na temat optymalizacji liczby wysiewu komórek.
      nuta: Pożywka MCMGF+ to Advanced DMEM / F12 z 75% pożywką kondycjonowaną L-Wnt3a, 10% pożywką kondycjonowaną R-spondyną, 5% pożywką kondycjonowaną Noggin, 1x suplementem B27, 1x suplementem N2, 1 mM N-acetylocysteiną, 50 ng / ml rekombinowanym mysim EGF, 500 nM A-8301, 10 nM [Leu15]-Gastrin I, 10 mM HEPES, 2 mM GlutaMAX i 1x penicylina/Streptomycyna (opcjonalnie).
    12. Upewnij się, że membrany pokryte ECM przygotowane w kroku 1.2 całkowicie wyschły, zgodnie z oceną wzrokową. Umyj górną komorę 200 μl MCMGF+. Dodać 200 μl roztworu komórkowego do każdej górnej komory.
    13. Dodaj 700 μl MCMGF+ z 10 μM Y-27632 do każdej dolnej komory. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    14. Po 1 dniu wzrostu usuń pożywkę z górnej komory i zastąp ją 200 μl świeżego MCMGF+, aby zapobiec wzrostowi wielu warstw komórek.
  4. Wymiana nośnika
    1. Gdy monowarstwy zlewają się w ~ 80%, zwykle między 1-3 dniami po wysiewie, zastąp podłoża podstawno-boczne pożywkami różnicującymi (DM) dla studzienek kontrolnych (patrz krok 1.4.2, aby uzyskać więcej informacji) lub pożywką z komórek M dla studzienek indukcyjnych komórek M (patrz krok 1.4.3, aby uzyskać więcej szczegółów). Wymień nośnik w górnej komorze na DM dla obu warunków.
      nuta: DM to Advanced DMEM / F12 z 5% pożywką kondycjonowaną przez Noggin, 1x suplementem B27, 1x suplementem N2, 1 mM N-acetylocysteiną, 50 ng / ml rekombinowanym mysim EGF, 500 nM A-8301, 10 nM [Leu15]-Gastrin I, 10 mM buforem HEPES, 2 mM GlutaMAX i 1x penicyliną / Streptomycyną (opcjonalnie). Pożywka komórkowa M to DM uzupełniona 200 ng / ml RANKL i 50 ng / ml TNFα.
    2. W przypadku studzienek kontrolnych, które nie powinny zawierać komórek M, dodaj 200 μl s.m. do górnej komory i 700 μl s.m. do dolnej komory.
    3. Aby indukować komórki M, dodaj 200 μl DM do górnej komory i 700 μl pożywki komórek M do dolnej komory.
    4. Wymieniaj nośnik co 2 dni. W przypadku studni kontrolnych wymień DM w górnej i dolnej komorze. W przypadku studzienek z komórkami M należy wymienić DM w górnej komorze i pożywkę z ogniwami M w dolnej komorze.
      nuta: Do 7 dnia po wysiewie komórek komórki M są w pełni indukowane w monowarstwach.

2. Weryfikacja różnicowania komórek M za pomocą qRT-PCR

UWAGA: Wykonaj następujące czynności na sterylnym stole bez RNAse. Zobacz Tabelę materiałów, aby uzyskać listę preferowanych materiałów do qRT-PCR.

  1. Wyjmij pożywkę z górnej i dolnej komory i umyj górną komorę 2x delikatnie 300 μl PBS o temperaturze pokojowej.
  2. Dodać 300 μl Trizolu do każdej górnej komory. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
    UWAGA: Podczas stosowania Trizolu należy nosić rękawice i okulary ochronne, aby uniknąć kontaktu ze skórą, jak wskazano w instrukcjach producenta.
  3. W międzyczasie oznacz probówki do mikrowirówek dla każdej studzienki i dodaj 700 μl Trizolu do każdej probówki.
  4. Zebrać homogenat komórkowy, pipetując delikatnie w górę i w dół 3x za pomocą P1000 i przenieść zawartość do odpowiedniej probówki do mikrowirówki. Wiruj przez 5 sekund, aby wymieszać.
  5. Próbki należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 3 minuty. Następnie przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do jednego miesiąca.
  6. Postępuj zgodnie ze standardową metodologią qRT-PCR do izolacji RNA, leczenia DNazą, odwrotnej transkrypcji i reakcji qRT-PCR. Zapoznaj się z listą podkładów w Tabeli materiałów.

3. Weryfikacja różnicowania komórek M za pomocą immunofluorescencji

UWAGA: Zawsze utrzymuj dolną komorę płyty wypełnioną PBS, aby membrany pozostały mokre. Ta procedura jest wykonywana na stole. Zobacz Tabelę materiałów, aby uzyskać listę preferowanych materiałów do immunofluorescencji.

  1. Wyjmij pożywkę z górnej komory i umyj delikatnie 2x 300 μl PBS o temperaturze pokojowej. Do górnej komory dodać 100 μl 4% PFA w PBS o temperaturze pokojowej. Przykryj talerz folią i odstaw na 25 minut w temperaturze pokojowej. Usuń 4% PFA.
    UWAGA: 4% PFA należy odpowiednio zutylizować jako niebezpieczne odpady chemiczne.
  2. Umyj górną komorę 3x 300 μL PBS o temperaturze pokojowej. W tym momencie próbki mogą pozostawać w temperaturze 4 °C przez okres do miesiąca przed barwieniem. Po zabarwieniu próbki powinny zostać zwizualizowane w ciągu tygodnia, aby uzyskać obrazy o najlepszej jakości.
  3. Inkubować monowarstwy ze 100 μl 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) rozpuszczonej w PBS przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej, aby zablokować monowarstwy.
  4. Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego GP2 w 1% BSA w PBS w rozcieńczeniu 1:100. Dodać 100 μl na studzienkę. Bejcować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Usuń roztwór.
    nuta: Nie należy przenikać monowarstw przed wystąpieniem pierwotnego barwienia dla GP2, ponieważ optymalne pierwotne barwienie powierzchni GP2 komórek M uzyskuje się bez przepuszczalności.
  5. Umyj górną komorę 3x razy 300 μl PBS o temperaturze pokojowej.
  6. Przygotować wtórny roztwór barwienia fluorescencyjnie znakowanej koziej anty-mysiej IgG w stosunku 1:200, falloidyny w stosunku 1:100 i DAPI w 1% BSA + 0,1% trytonu w PBS. Dodać 100 μl na studzienkę. Bejcować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    nuta: Tryton dodaje się do wtórnego roztworu barwienia, aby przeniknąć komórki na tym etapie w celu prawidłowego barwienia falloidyną.
  7. Przemyć 3x 300 μL PBS.
  8. Umieść kroplę 5 μl roztworu montażowego (tabela materiałów) na szkiełku podstawowym (Tabela materiałów). Wyjmij studzienkę z płytki 24-dołkowej i odwróć. Ostrożnie odetnij membranę ze studni za pomocą skalpela. Umieść membranę komórkami skierowanymi do góry na kropli roztworu montażowego na szkiełku podstawowym. Dodać 10 μl roztworu montażowego na górną i środkową część membrany i umieścić szkiełko nakrywkowe na górze, aby uszczelnić membranę między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym.
  9. Szkiełka należy suszyć w temperaturze pokojowej w ciemności przez 24 godziny. Wybarwione szkiełka należy uwidocznić pod mikroskopem konfokalnym w ciągu 1 tygodnia po barwieniu.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enteroidy jelita krętego hodowane w ECM są analizowane wizualnie i za pomocą qRT-PCR pod kątem ich względnego stanu zdrowia i stanów różnicowania jako środek kontroli jakości dla kultur enteroidów jelita krętego i do stosowania w monowarstwach. Niezróżnicowane enteroidy jelita krętego wyhodowane w ECM wydają się przezroczyste i torbielowate pod względem morfologii, co wskazuje na obecność wielu komórek macierzystych (Ryc. 1A). Z biegiem czasu niezróżnicowane enteroidy jelita krętego hodowane w pożywkach wzrostowych mogą przybrać fenotyp pośredni, w którym niektóre będą wyglądać na torbielowate, a niektóre na nieprzezroczyste (Figura 1B). Często nasze niezróżnicowane próbki przypominają te pokazane na Rysunek 1B, a nie Rysunek 1A. Te pośrednie kultury zawierają bardziej terminalnie zróżnicowane enterocyty, mierzone ekspresją markera enterocytów, izomaltazy sacharazy (SI), a przypuszczalnie wytłoczone martwe enterocyty w świetle przyczyniają się do ich gęstego wyglądu. Enteroidy jelita krętego mogą być stosowane w tym stanie pośrednim do rozwoju jednowarstwowego, ale należy pamiętać, że ilość jelitowych komórek macierzystych obecnych w hodowlach może być niska, a niektóre zróżnicowane typy komórek mogą być obecne (na przykład patrz poziomy qRT-PCR w niezróżnicowanych próbkach hodowanych w ECM przypominające Rysunek 1B w Rysunek 2). Dla porównania, enteroidy jelita krętego hodowane z pożywką różnicującą w ECM przez 5+ dni będą wyglądały na jednolicie ciemne i zrazikowe, a kultury o tej morfologii nie są dobrymi kandydatami do wysiewu monowarstw (Rysunek 1C).

Ekspresja genów komórek macierzystych i genów różnicowania komórek jelitowych może być analizowana za pomocą qRT-PCR jako kolejny sposób oceny stanu zdrowia enteroidów jelita krętego hodowanych w ECM i ich zdolności różnicowania po wysianiu jako monowarstwy na transwellach. Ekspresję genu komórek macierzystych, LGR5, genu enterocytów, SI, genu komórki kubkowej, MUC2 i genu komórek Panetha, LYZ, porównuje się między niezróżnicowanymi kulturami enteroidów jelita krętego hodowanymi w ECM i zróżnicowanymi monowarstwami enteroidu jelita krętego w obecności lub bez RANKL/TNFα (Ryc. 2). Chociaż wartości mogą się różnić w zależności od eksperymentu, ekspresja LGR5 powinna się zmniejszyć po różnicowaniu monowarstw18,26. Ekspresja LGR5 zwykle nie jest wykrywana w zróżnicowanych monowarstwach jelita krętego bez RANKL i TNFα do 7 dnia. I odwrotnie, ekspresja markerów różnicowania określonych typów komórek, takich jak SI i MUC2, wzrasta po różnicowaniu18. Ekspresja LYZ na ogół zmniejsza się po zróżnicowaniu w naszych kulturach. Jeśli hodowle jelita krętego używane do wytwarzania monowarstw wyglądają bardziej jak Rysunek 1B niż Rysunek 1A, wzrost markerów różnicowania jelit może być niewielki po różnicowaniu, ponieważ te początkowe kultury są niejednorodne w typach komórek jelitowych i mają wyższy podstawowy poziom SI i MUC2. Jednak różnicowanie w monowarstwach nadal występuje, co oceniano na podstawie utraty ekspresji LGR5 i mikroskopii (patrz poniżej). Co więcej, dodanie RANKL i TNFα do pożywki różnicującej zmniejsza utratę ekspresji LGR5 (Rysunek 2). Równolegle ekspresja SI i MUC2 jest nieco niższa niż w stanie zróżnicowanym bez RANKL i TNFα, chociaż ich poziomy wzrastają powyżej stanu niezróżnicowanego.

M różnicowanie komórek w monowarstwach jest determinowane zarówno przez qRT-PCR, jak i immunofluorescencję przy użyciu dwóch markerów specyficznych dla komórek M, w tym glikoproteiny powierzchniowej komórki 2 (GP2) i czynnika transkrypcyjnego SpiB21. Ekspresja GP2 i SPIB jest regulowana w górę w monowarstwach pochodzących z jelita krętego pochodzących z enteroidu jelita krętego w obecności RANKL i TNFα i nie jest wykrywana w próbkach nietraktowanych RANKL i TNFα (Figura 3). Ekspresja tych markerów może być również znormalizowana do fragmentu tkanki jelita cienkiego22, jeśli jest dostępna. Pozwala to na porównanie zmiany fałdowania tych markerów komórek M z tkanką, która ma komórki M, a nie na kontrolowanie monowarstw, które nie mają ekspresji tych markerów i umożliwia standaryzację między eksperymentami w jednym laboratorium. Limfocyty M są również wykrywane przez powierzchniową ekspresję GP2 przez immunofluorescencję (Figura 4). Zazwyczaj w zlewającej się monowarstwie obserwuje się od 1 do 5 komórek M w danym polu mikroskopu przy 40-krotnym powiększeniu w dniach od 6 do 8 po wysiewie w próbkach traktowanych RANKL i TNFα (Rysunek 4A-D). W próbkach niepoddanych działaniu substancji nie zaobserwowano ekspresji GP2 ( Rysunek 4E). Ortogonalny widok płaszczyzny XZ nałożonej sondą falloidynową pokazuje struktury aktyny otaczające każdą komórkę i ekspresję GP2 na wierzchołkowej powierzchni komórek M (Rysunek 4F-G). Model ten podsumowuje niską częstotliwość komórek M występujących w jelicie ludzkim1,2,8. Aby oczyścić i wyizolować komórki M do dalszych badań, komórki M można wybarwić przy użyciu ekspresji powierzchniowej GP2 i posortować za pomocą FACS dla komórek GP2 +.

M komórki wiążą się ze światłem jelita i transportują antygen do komórek odpornościowych znajdujących się pod nabłonkiem2. Wydzielnicza IgA wytwarzana w jelicie wiąże się z bakteriami i może wiązać się z wierzchołkową powierzchnią komórek M, aby ułatwić transport drobnoustrojów27,28. Aby określić, czy komórki M rozwinięte w tym modelu są w stanie wiązać się z IgA, do górnej komory dodaje się ludzką surowicę IgA, pozostawia do wiązania przez 1 godzinę, a następnie monowarstwy przygotowuje się do analizy immunofluorescencyjnej. Obecność IgA na komórkach M jest wizualizowana za pomocą sprzężonego z fluorem przeciwciała drugorzędowego, które rozpoznaje ciężki łańcuch IgA w surowicy ludzkiej. Komórki M traktowane IgA przez 1 godzinę mają IgA związane z powierzchnią wierzchołkową (Figura 5A), podczas gdy komórki M w studzienkach kontrolnych, które były traktowane tylko drugorzędowym przeciwciałem przeciwko IgA, nie mają wykrywalnego sygnału (Figura 5B). Ponadto IgA specyficznie wiąże się z wierzchołkową powierzchnią komórek M i nie jest związana z żadnymi komórkami pozbawionymi barwienia powierzchni GP2. Ponadto komórki M mają charakterystycznie krótszą gęstą aktynę na swojej powierzchni wierzchołkowej2. Aby przeanalizować morfologię komórek M w tym modelu, monowarstwy pochodzące z jelita krętego są hodowane przez 7 dni i zbierane w celu analizy immunofluorescencyjnej F-aktyny przy użyciu falloidyny. Pomiary intensywności pikseli aktyny są obliczane dla komórek M i komórek innych niż M, które są bezpośrednio przylegające do każdej komórki M, za pomocą oprogramowania ImageJ (Rysunek 6A). Intensywność aktyny jest zmniejszona na komórkach M GP2 + w tym modelu, a reprezentatywny obraz jest pokazany w Rysunek 6B. Ogólnie rzecz biorąc, komórki M rozwinięte w tym jednowarstwowym modelu pochodzącym z jelita krętego mają charakterystyczną ekspresję genów, morfologię i niektóre funkcje komórek M ludzkich komórek M jelita, takie jak wiązanie z IgA.

figure-results-1
Rycina 1: Reprezentatywna morfologia ludzkich enteroidów jelita krętego w ECM tydzień po poszczepieniu. (A) Przezroczyste i torbielowate niezróżnicowane enteroidy jelita krętego. (B) Fenotyp pośredni z niektórymi torbielowatymi enteroidami jelita krętego i niektórymi nieprzezroczystymi enteroidami zrazikowymi jelita krętego. (C) Ciemne i zrazikowe zróżnicowane enteroidy jelita krętego. Zdjęcia wykonane przez obiektyw optycznego mikroskopu świetlnego przy 4-krotnym powiększeniu za pomocą aparatu iPhone7. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Względna ekspresja komórek macierzystych i markery różnicowania ludzkich enteroidów jelita krętego hodowanych w ECM lub zróżnicowanych jako monowarstwy. Enteroidy jelita krętego hodowano przez 7 dni w ECM (niezróżnicowane) lub hodowano i różnicowano jako monowarstwy bez (zróżnicowane) lub z RANKL i TNFα (zróżnicowane + R / T). Kultury enteroidów jelita krętego lub monowarstwy zebrano w Trizol w celu ekstrakcji RNA. Ekspresja genu została określona za pomocą qRT-PCR i ulega ekspresji w stosunku do GAPDH. Dane są średnio z 3 niezależnych studzienek enteroidów jelita krętego lub monowarstw na stan. Słupki błędów wskazują SEM. ND nie jest wykrywany. Istotność statystyczną określono na wartościach przekształconych logarytmicznie przy użyciu jednoczynnikowej ANOVA z testem wielokrotnych porównań Dunnetta w porównaniu z niezróżnicowanymi. ** p < 0,01, *** p < 0,001 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Względna ekspresja markerów specyficznych dla komórek M GP2 i SPIB z monowarstw pochodzących z ludzkiego jelita krętego. Monowarstwy pochodzące z ludzkiego jelita krętego pochodzącego z jelita krętego poddane działaniu RANKL/TNFα i niepoddane działaniu RANKL / TNFα zebrano w Trizol w celu ekstrakcji RNA po 7 dniach od wysiewu. Ekspresja genu została określona za pomocą qRT-PCR i ulega ekspresji w stosunku do GAPDH. Dane to średnio 6 niezależnych monowarstw na warunek. Słupki błędów wskazują SEM. ND nie jest wykrywany. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Ryc. 4: Immunofluorescencja powierzchniowej ekspresji GP2 na komórkach M w monowarstwach pochodzących z ludzkiego jelita krętego pochodzącego z enteroidu w czasie. Monowarstwy pochodzące z ludzkiego jelita krętego poddane działaniu RANKL / TNFα i nietraktowane utrwalono w 4% PFA i wybarwiono pod kątem immunofluorescencji w różnych wskazanych dniach po wysiewie. Obrazy analizowano za pomocą oprogramowania ImageJ. DAPI = Niebieski; Glikoproteina 2 (GP2) = Czerwony. (A-D) Monowarstwy traktowane RANKL/TNFα w różnych dniach po wysiewie. (E) Niepoddane działaniu środka monowarstwowe zbierane w 7 dniu po wysiewie. (F-G) Ortogonalna płaszczyzna XZ monowarstw w dniu 7 po wysiewie pokryta sondą falloidyny dla F-aktyny. Falloidyna = Błękitny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Ryc. 5: IgA wiąże się specyficznie z wierzchołkową powierzchnią komórek M. Monowarstwy ludzkiego jelita krętego pochodzące z enteroidu jelita krętego leczone RANKL / TNFα hodowano przez 7 dni, a następnie (A) traktowano 10 μg ludzkiej surowicy IgA przez 1 godzinę lub (B) próbowano tylko PBS (bez kontroli IgA). Po 1 godzinie monowarstwy przemyto 2x w PBS, utrwalono w 4% PFA, przesiąknięto 0,1% TritonX-100 i wybarwiono pod kątem immunofluorescencji. Obrazy zostały przeanalizowane za pomocą oprogramowania ImageJ i są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów. DAPI = Niebieski; Glikoproteina 2 (GP2) = Czerwony; Przeciwciało przeciwko ludzkiej surowicy IgA = zielone; Falloidyna = Błękitny. Czarne strzałki oznaczają IgA związaną z powierzchnią wierzchołkową komórki M. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Ryc. 6: Komórki M mają zmniejszoną intensywność aktyny w porównaniu z sąsiednimi komórkami innymi niż M. Monowarstwy pochodzące z jelita krętego ludzkiego leczone RANKL / TNFα hodowano przez 7 dni, a następnie utrwalono w 4% PFA i wybarwiono pod kątem immunofluorescencji. (A) Korzystając z ImageJ, komórki GP2 + M zostały obrysowane za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego, a pomiary powierzchni i zintegrowanej gęstości wykonano w kanale falloidyny. Ta sama analiza została następnie przeprowadzona dla każdej sąsiedniej komórki innej niż M, która sąsiaduje z komórką M. Surowa zintegrowana gęstość została podzielona przez powierzchnię każdej pojedynczej komórki w celu normalizacji. Średnia zintegrowana gęstość/powierzchnia została obliczona dla każdej sąsiedniej komórki innej niż M dla każdej komórki M. Obrazy zostały przeanalizowane z 3 niezależnych eksperymentów; każda kropka jest komórką M lub średnią z sąsiednich komórek. Słupki błędów wskazują SD. Istotność statystyczna została określona na podstawie wartości przekształconych logarytmicznie za pomocą sparowanego testu t. p = 0,0001 (B) Reprezentatywny obraz płaszczyzny XZ z wykresu w A. Obrazy analizowano za pomocą oprogramowania ImageJ. DAPI = Niebieski; Glikoproteina 2 (GP2) = Czerwony; Falloidyna = Błękitny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby opracować monowarstwy, które prawidłowo różnicują się w główne typy komórek jelitowych i komórki M, należy zdawać sobie sprawę z kilku czynników. Enteroidy jelita krętego muszą być pobierane z kultur ECM, które są niezróżnicowane i mają wysoki udział komórek macierzystych Lgr5+. Wizualnie większość enteroidów jelita krętego w hodowlach ECM nie powinna być ciemna i wielopłatkowa, a ekspresja LGR5 powinna być wykrywana w tych hodowlach za pomocą analizy qRT-PCR. Kontrola jakości kondycjonowanych pożywek ma zasadnicze znaczenie dla rozmnażania niezróżnicowanych kultur w czasie i musi być zakończona dla każdej wyprodukowanej partii kondycjonowanych pożywek. Kontrolę jakości można zakończyć, testując nową partię pożywki na niektórych kulturach ECM i porównując morfologię enteroidów jelita krętego z poprzednią partią pożywki w ciągu tygodnia. Ekspresja LGR5 powinna pozostać względnie podobna w kulturach enteroidów jelita krętego hodowanych w nowej partii pożywki w porównaniu z poprzednią partią.

Podczas przygotowywania enteroidów jelita krętego do wysiewu w postaci monowarstw, ważne jest, aby energicznie pipetować roztwór komórkowy po inkubacji z trypsyną, aby rozbić enteroidy jelita krętego na pojedyncze komórki. Skupiska komórek mogą prowadzić do tworzenia się wielowarstw po wysiewie na monowarstwy. Ponadto konieczne jest empiryczne określenie liczby komórek wymaganych do utworzenia monowarstwy dla każdej uzyskanej pojedynczej linii jelita krętego. Zazwyczaj wartość ta może wynosić od 2,5 x 105 – 5,0 x 105 komórek / studzienkę, ale zależy od stopnia torbielowatych i nietorbielowatych enteroidów jelita krętego w hodowlach i różni się dla każdej pojedynczej linii jelita krętego. Z doświadczenia wynika, że enteroidy jelita krętego hodowane w ECM, które wydają się mniej torbielowate, wymagają większej gęstości wysiewu komórek, aby uzyskać monowarstwy. Zaleca się umycie górnej komory po 1 dniu wzrostu, delikatnie pipetując pożywkę w górę iw dół 2-3 razy i zastępując ją świeżą pożywką wzrostową. Proces ten usuwa komórki, które wylądowały na innych komórkach, zmniejszając prawdopodobieństwo tworzenia się wielu warstw. Przełączanie pożywki w górnej komorze z pożywki wzrostowej na pożywkę z komórek M, gdy monowarstwy są ~ 80% zlewne, co zwykle występuje w 2 dniu po wysiewie, pomaga osiągnąć dobre różnicowanie komórek M. Dodanie RANKL/TNFα do górnej komory podczas indukcji komórek M nie prowadzi do powstania większej liczby komórek M na monowarstwę i dlatego można je pominąć w pożywce górnej komory. Transwell o różnych rozmiarach porów mogą być stosowane w tym protokole bez wpływu na rozwój komórek M; Jednak gęstość wysiewu komórek musi być zoptymalizowana dla tych o większych rozmiarach porów. Kolagen IV może być zastąpiony ECM jako powłoka białkowa błony podstawnej dla transwelli lub płytek studzienkowych, które mogą być lepiej przystosowane do niektórych zastosowań.

Monowarstwy jelita krętego pochodzące z enteroidu na transwellach zapewniają dwukomorowy system, który pozwala na tworzenie zdefiniowanych powierzchni wierzchołkowych i podstawno-bocznych, tak że 4-5 różnych typów komórek jelitowych nabłonka może polaryzować się w celu ekspresji markerów powierzchniowych po każdej stronie w stosunku do tego, który znajduje się w jelicie. Po obu stronach można dodać dodatkowe czynniki, takie jak cząsteczki, czynniki zakaźne lub inne typy komórek. Do tej pory jednak istnieją pewne ograniczenia. Zgodnie z opisem, system ten jest systemem statycznym, w którym brakuje przepływu fizjologicznego, skurczów jelitowych i treści jelitowej. Ponadto architektura kosmka-krypta jest tracona przez tworzenie płaskiej monowarstwy. Systemy te nie mają obszarów łat Peyera, komórek odpornościowych i komórek zrębu. To, czy brak komórek odpornościowych i zrębowych znajdujących się blisko komórek M wpływa na wgłębienia, które nie są obserwowane w tym układzie i inne funkcje fizjologiczne, jest ważnym przyszłym obszarem badań. Protokół ten można dostosować do formatu płytki 96-dołkowej lub wielodołkowej. Procedura powlekania płytki 96-dołkowej ECM i wysiewu pojedynczymi komórkami z enteroidów jelita krętego pozostaje taka sama jak w przypadku transwelli. Należy przeprowadzić miareczkowanie gęstości wysiewu komórek wymaganej do uzyskania monowarstw, ale zwykle waha się od 1,0 x 105 – 3,0 x 105 komórek/dołek w formacie płytki 96-dołkowej. Komórki M są indukowane przez zastąpienie pożywki wzrostowej pożywką komórkową M, gdy monowarstwy zlewają się w 80%, zwykle przez 1-3 dni, w zależności od początkowej gęstości wysiewu komórek.

Ta metoda różnicowania komórek M z enteroidów jelita krętego in vitro zapewnia znaczną poprawę w porównaniu z metodą Caco-2. Jelita kręte są komórkami pierwotnymi, a w systemie występuje co najmniej 4-5 typów komórek nabłonkowych. Ponadto można badać linie jelita krętego pochodzące od różnych osób w celu zbadania, w jaki sposób genetyka lub stan choroby wpływają na rozwój i zachowanie komórek M. Dodatkowa manipulacja enteroidami jelita krętego podczas różnicowania komórek M pozwoli lepiej zrozumieć rozwój komórek M, w tym scharakteryzować komórki prekursorowe komórek M. Wreszcie, ponieważ mechanizmy molekularne fagocytozy i transcytozy komórek M nadal nie są w pełni poznane 3,29, model ten daje możliwość badania i wizualizacji wychwytu antygenu i cząstek przez komórki M.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez NIAID U19AI131126 dr Isberga (Tufts University School of Medicine) i dr Kaplana (Tufts University); (JM jest liderem Projektu 2), a NIAID R21AI128093 do JM. ACF był częściowo wspierany przez NIAID T32AI007077. SEB i MKE były wspierane przez NIAID U19AI116497-05. Dziękujemy członkom laboratorium Mecsas, laboratorium Ng i dr Isbergowi z Tufts University School of Medicine za przydatne dyskusje. Obrazowanie konfokalne przeprowadzono w Tufts Center for Neuroscience Research, P30 NS047243.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
[Leu15]-Gastrin ISigma-AldrichG9145MCMGF+ i DM składnik
Rozpuszczalnik: PBS
Stężenie zapasów: 10 &mikro; M
Stężenie końcowe: 10 nM
0,5 M EDTAInvitrogen15575020Do rozdrabniania ECM
Rozpuszczalnik: PBS
Stężenie fabryczne: 0,5 m
Stężenie końcowe: 0,5 mM
40 &mikro; m sitko komórkoweCorning352340Do wykluczania grudek z pojedynczych komórek
Rozpuszczalnik:
Stężenie zapasów:
Stężenie końcowe:
A-8301Sigma-AldrichSML0788-5MGMCMGF+ i składnik DM
Rozpuszczalnik: DMSO
Stężenie zapasów: 500 &mikro; M
Stężenie końcowe: 500 nM
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634-028MCMGF+ i DM Podłoże podstawowe
Rozpuszczalnik:
Stężenie materiału:
Stężenie końcowe:
Alexa Fluor 594 kozia anty-mysz IgGThermo FisherA-11005Do barwienia wtórnego
Rozpuszczalnik:
Stężenie zapasów:
Stężenie końcowe: 1:200
Alexa Fluor 647 PhalloidinInvitrogenA22287Opcjonalne wtórne barwienie do F-aktyny
Rozpuszczalnik:
Stężenie zapasów:
Stężenie końcowe: 1:100
B27 SuplementInvitrogen17504-044MCMGF+ i DM składnik
Rozpuszczalnik:
Stężenie zapasów: 50x
Stężenie końcowe: 1x
Albumina surowicy bydlęcejChem-Impex005355% do roztworu blokującego
Rozpuszczalnik: PBS
Stężenie zapasów:
Stężenie końcowe: 0,01
ChloroformFisher ScientificC298-500Do izolacji RNA
Rozpuszczalnik:
Stężenie materiału:
Końcowe stężenie:
Szkiełka nakrywkowe okrągłeThomas Scientific1157B50Do montażu membrany na szkiełku
Rozpuszczalnik:
Stężenie zapasów:
Stężenie końcowe:
DAPI (4&prime,,6-diamidino-2-fenyloindol)Thermo Fisher62247Do barwienia wtórnego
Rozpuszczalnik: PBS
Stężenie magazynowe: 100x
Końcowe stężenie: 1x
RNAz poddane działaniu DEPC wolne od H2OFisher ScientificBP561-1Do izolacji RNA
Rozpuszczalnik:
Stężenie magazynowe:
Końcowe stężenie:
Zestaw do usuwania DNAInvitrogenAM1906Do izolacji RNA
Rozpuszczalnik:
Stężenie magazynowe:
Stężenie końcowe:
Alkohol etylowy, 200 proofSigma AldrichEX0276-4Do izolacji RNA
Rozpuszczalnik:
Stężenie zapasów:
Końcowe stężenie:
Skalpele z piórVWR100499-580Do cięcia membrany z transwells
Rozpuszczalnik:
Stężenie zapasów:
Stężenie końcowe:
Surowica bydlęca płodu (FBS)Gibco26140079Do inaktywacji trypsyny
Rozpuszczalnik: Zaawansowany DMEM/F12
Stężenie zapasów: 1
Stężenie końcowe: 0,1
SzkiełkaMercedes ScientificMER 7200/90/WHDo montażu membrany na szkiełku
Rozpuszczalnik:
Stężenie zapasów:
Stężenie końcowe:
GlutaMAXInvitrogen35050-061MCMGF+ i DM składnik
Rozpuszczalnik:
Stężenie magazynowe: 200 mM
Stężenie końcowe: 2 mM
Przeciwciało GP2MBL InternationalD277-3Barwienie powierzchniowe dla komórek M
Rozpuszczalnik:
Stężenie zapasów:
Stężenie końcowe: 1:100
HEPESInvitrogen15630-080MCMGF+ i DM składnik
Rozpuszczalnik:
Stężenie magazynowe: 1 m
Stężenie końcowe: 10 mM
Surowica ludzka IgALee BioSolutions340-12-1Do analizy funkcjonalnej komórek M
Rozpuszczalnik: PBS
Stężenie podstawowe: 1 mg/ml
Stężenie końcowe: 10 &mikro; g
Media kondycjonowane L-Wnt3aLinia komórkowa z ATCCCRL-2647Zapoznaj się z kartą produktu ATCC dla L Wnt­ 3A (ATCC CRL2647) dla protokołu kondycjonowanych mediów; Składnik MCMGF+
Rozpuszczalnik:
Stężenie zapasów:
Stężenie końcowe: 75% w MCMGF+
0% w DM
Matrigel, GFR, bez fenoluCorning356231Matrix zewnątrzkomórkowy (ECM)
Rozpuszczalnik:
Stężenie zapasów:
Stężenie końcowe:
Mysz rekombinowana EGFInvitrogenPMG8043MCMGF+ i DM składnik
Rozpuszczalnik: PBS
Stężenie zapasów: 50 &mikro; g / ml
Stężenie końcowe: 50 ng / ml
Suplement N2Invitrogen17502-048MCMGF+ i DM Składnik
Rozpuszczalnik:
Stężenie magazynowe: 100x
Stężenie końcowe: 1x
N-acetylocysteinaSigma-AldrichA9165-5GMCMGF+ i DM Składnik
Rozpuszczalnik: H2O
Stężenie zapasów: 500 mM
Stężenie końcowe: 1 mM
Pożywka kondycjonowana przez NogginLinia komórkowa prezent od dr Gijsa van den Brinka (Uniwersytet w Amsterdamie)Ref 30 dla protokołu pożywek kondycjonowanych; MCMGF+ i DM Składnik
Rozpuszczalnik:
Stężenie fabryczne:
Stężenie końcowe: 5% w MCMGF+
5% w DM
Paraformaldehyd (PFA)MP Biomedicals2199983Do mocowania monowarstw
Rozpuszczalnik: PBS
Stężenie zapasów: 0,16
Stężenie końcowe: 0,04
PBS, -Mg, -CaCorningMT21040CVRozpuszczalnik dla 0,5 mM EDTA
Rozpuszczalnik:
Stężenie zapasów:
Stężenie końcowe:
penicylina / streptomycynaInvitrogen15140-122Opcjonalny składnik MCMGF+ i DM
Rozpuszczalnik:
Stężenie zapasów: 100x
Stężenie końcowe: 1x
Prolong GoldInvitrogenP36930Rozwiązanie montażowe zapobiegające blaknięciu
Rozpuszczalnik:
Stężenie zapasów:
Stężenie końcowe:
Qiagen RNeasy KitQiagen74106do izolacji RNA
Rozpuszczalnik:
Stężenie zapasów:
Końcowe stężenie:
Rekombinowany ludzki RANKLPeprotech310-01Służy do indukowania komórek M
Rozpuszczalnik: H2O
Stężenie zapasowe: 0,1 mg / ml
Stężenie końcowe: 200 ng / ml
Rekombinowany mysi TNFaPeprotech315-01ASłuży do indukowania komórek M
Rozpuszczalnik: H2O
Stężenie zapasów: 5 mg / ml
Stężenie końcowe: 50 ng / ml
pożywki kondycjonowane R-spondynąLinia komórkowa z Trevigen3710-001-01Zapoznaj się z instrukcją obsługi komórek Trevigen Cultrex Rspo1 (linia komórkowa HA-R-Spondin1 293T), aby zapoznać się z protokołem kondycjonowanych pożywek; Składnik MCMGF+
Rozpuszczalnik:
Stężenie zapasów:
Stężenie końcowe: 10% w MCMGF+
0% w DM
Drugorzędowe przeciwciało anty-ludzkie IgAJackson Immuno Research109-545-011Do barwienia wtórnego
Rozpuszczalnik:
Stężenie zapasów:
Stężenie końcowe: 1:200
Super Script IV Odwrotna transkryptazaThermo Fisher18091200Do konwersji RNA do DNA
Rozpuszczalnik:
Stężenie zapasowe:
Stężenie końcowe:
wkładki Transwell, 24 dobrze zwymiarowaneGreiner Bio-One6626410,4 i mikro; m Wielkość porów
Rozpuszczalnik:
Stężenie zapasów:
Końcowe zagęszczenie:
TritonX-100Sigma-AldrichT8787Nie jest wymagane podczas pierwotnego barwienia GP2
Rozpuszczalnik: 1% BSA
Stężenie magazynowe:
Stężenie końcowe: 0,001
TRIzolInvitrogen15596018Do izolacji RNA
Rozpuszczalnik:
Stężenie magazynowe:
Stężenie końcowe:
TrypLE ExpressInvitrogen12605010Trypsyna do rozbijania enteroidów na pojedyncze komórki
Rozpuszczalnik:
Stężenie zapasów:
Stężenie końcowe:
Y-27632Sigma-AldrichY-0503MCMGF+ składnik w dniu 0
Rozpuszczalnik: H2O
Stężenie zapasów: 5 mM
Stężenie końcowe: 10 &mikro; M
GAPDH podkładCATGAGAAGTATGACAACAGCCT
GAPDH podkładAGTCCTTCCACGATACCAAAGT
GP2 podkładCAATGTGCCTACCCACTGGA
GP2 starterATGGCACCCACATACAGCAC
LYZ starterCGCTACTGGTGTAATGATGG
LYZ starter odwrotnyStarter do przodu TTTGCACACAAGCTACAGCATC
MUC2 starterATGCCCTTGCGTCCATAACA
MUC2 starterAGGAGCAGTGTCCGTCAAAG
SI starterTCCAGCTACTACTCGTGTGAC
SI starterCCCTCTGTTGGGAATTGTTCTG
SPIB starterdo przoduCAGCAGCCGCTTTTAGCCAC
SPIB starterGCATATGCCGGGGGAACC
LGR5 starterTCAGTCAGCTGCTCCCGAAT
LGR5 starterCGTTTCCCGCAAGACGTAAC
podstawowe do przodu odwrotny do przodu wsteczny do przodu do przodu odwrotny do przodu do przodu odwrotny do przodu odwrotny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kraehenbuhl, J. P., Neutra, M. R. Epithelial M cells: differentiation and function. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 301-332 (2000).
  2. Neutra, M. R., Frey, A., Kraehenbuhl, J. P. Epithelial M cells: gateways for mucosal infection and immunization. Cell. 86 (3), 345-348 (1996).
  3. Nakamura, Y., Kimura, S., Hase, K. M. cell-dependent antigen uptake on follicle-associated epithelium for mucosal immune surveillance. Inflammation and Regeneration. 38, 15(2018).
  4. Clark, M. A., Hirst, B. H., Jepson, M. A. M-cell surface beta1 integrin expression and invasin-mediated targeting of Yersinia pseudotuberculosis to mouse Peyer's patch M cells. Infection and Immunity. 66 (3), 1237-1243 (1998).
  5. Jensen, V. B., Harty, J. T., Jones, B. D. Interactions of the invasive pathogens Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, and Shigella flexneri with M cells and murine Peyer's patches. Infection and Immunity. 66 (8), 3758-3766 (1998).
  6. Jones, B. D., Ghori, N., Falkow, S. Salmonella typhimurium initiates murine infection by penetrating and destroying the specialized epithelial M cells of the Peyer's patches. Journal of Experimental Medicine. 180 (1), 15-23 (1994).
  7. Marra, A., Isberg, R. R. Invasin-dependent and invasin-independent pathways for translocation of Yersinia pseudotuberculosis across the Peyer's patch intestinal epithelium. Infection and Immunity. 65 (8), 3412-3421 (1997).
  8. Ohno, H. Intestinal M cells. Journal of Biochemistry. 159 (2), 151-160 (2016).
  9. Kerneis, S., Bogdanova, A., Kraehenbuhl, J. P., Pringault, E. Conversion by Peyer's patch lymphocytes of human enterocytes into M cells that transport bacteria. Science. 277 (5328), 949-952 (1997).
  10. Gullberg, E., et al. Expression of specific markers and particle transport in a new human intestinal M-cell model. Biochemical and Biophysical Research Communications. 279 (3), 808-813 (2000).
  11. Giannasca, P. J., Giannasca, K. T., Leichtner, A. M., Neutra, M. R. Human intestinal M cells display the sialyl Lewis A antigen. Infection and Immunity. 67 (2), 946-953 (1999).
  12. Jang, M. H., et al. Intestinal villous M cells: an antigen entry site in the mucosal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6110-6115 (2004).
  13. Beloqui, A., Brayden, D. J., Artursson, P., Preat, V., des Rieux, A. A human intestinal M-cell-like model for investigating particle, antigen and microorganism translocation. Nature Protocols. 12 (7), 1387-1399 (2017).
  14. Martinez-Argudo, I., Jepson, M. A. Salmonella translocates across an in vitro M cell model independently of SPI-1 and SPI-2. Microbiology. 154 (Pt 12), 3887-3894 (2008).
  15. Lee, J. B., et al. Quantitative analysis of lab-to-lab variability in Caco-2 permeability assays. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 114, 38-42 (2017).
  16. Mabbott, N. A., Donaldson, D. S., Ohno, H., Williams, I. R., Mahajan, A. Microfold (M) cells: important immunosurveillance posts in the intestinal epithelium. Mucosal Immunology. 6 (4), 666-677 (2013).
  17. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  18. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  19. Knoop, K. A., et al. RANKL is necessary and sufficient to initiate development of antigen-sampling M cells in the intestinal epithelium. Journal of Immunology. 183 (9), 5738-5747 (2009).
  20. Taylor, R. T., et al. Lymphotoxin-independent expression of TNF-related activation-induced cytokine by stromal cells in cryptopatches, isolated lymphoid follicles, and Peyer's patches. Journal of Immunology. 178 (9), 5659-5667 (2007).
  21. de Lau, W., et al. Peyer's patch M cells derived from Lgr5(+) stem cells require SpiB and are induced by RankL in cultured "miniguts". Molecular and Cellular Biology. 32 (18), 3639-3647 (2012).
  22. Rouch, J. D., et al. Development of Functional Microfold (M) Cells from Intestinal Stem Cells in Primary Human Enteroids. PloS One. 11 (1), e0148216(2016).
  23. Wood, M. B., Rios, D., Williams, I. R. TNF-alpha augments RANKL-dependent intestinal M cell differentiation in enteroid cultures. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 311 (3), C498-C507 (2016).
  24. Zou, W. Y., et al. Human Intestinal Enteroids: New Models to Study Gastrointestinal Virus Infections. Methods in Molecular Biology. , (2017).
  25. Kozuka, K., et al. Development and Characterization of a Human and Mouse Intestinal Epithelial Cell Monolayer Platform. Stem Cell Reports. 9 (6), 1976-1990 (2017).
  26. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  27. Mantis, N. J., et al. Selective adherence of IgA to murine Peyer's patch M cells: evidence for a novel IgA receptor. Journal of Immunology. 169 (4), 1844-1851 (2002).
  28. Rios, D., et al. Antigen sampling by intestinal M cells is the principal pathway initiating mucosal IgA production to commensal enteric bacteria. Mucosal Immunology. 9 (4), 907-916 (2016).
  29. Miller, H., Zhang, J., Kuolee, R., Patel, G. B., Chen, W. Intestinal M cells: the fallible sentinels? World Journal of Gastroenterology. 13 (10), 1477-1486 (2007).
  30. Heijmans, J., et al. ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response. Cell Reports. 3 (4), 1128-1139 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

R nicowanie kom rek Mludzkie enteroidy jelita kr tegomonowarstwa nab onkowa w uk adzie TranswellRANKL TNF alfaimmunofluorescencja GP2protok izolacji kom rekmetoda powlekania ECMtrawienie trypsynfiltracja przez sitko kom rkowetest wi zania IgA

Powiązane artykuły