Artykuł metodologiczny

Wykrywanie fuzji genów onkogennych za pomocą zakotwiczonej reakcji łańcuchowej polimerazy multipleksowej, a następnie sekwencjonowania nowej generacji

DOI:

10.3791/59895

⸱

5 lipca 2019

 ,  , 
1Department of Pathology, University of Colorado - Anschutz Medical Campus

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł szczegółowo opisuje użycie zestawu do przygotowania biblioteki opartej na reakcji łańcuchowej polimerazy zakotwiczonej, a następnie sekwencjonowania nowej generacji, do oceny fuzji genów onkogennych w klinicznych próbkach guzów litych. Opisano zarówno etapy mokrej ławki, jak i analizy danych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fuzje genów często przyczyniają się do onkogennego fenotypu wielu różnych typów raka. Ponadto obecność pewnych fuzji w próbkach pobranych od pacjentów z rakiem często bezpośrednio wpływa na diagnozę, rokowanie i/lub wybór terapii. W rezultacie, dokładne wykrywanie fuzji genów stało się kluczowym elementem postępowania klinicznego w przypadku wielu typów chorób. Do niedawna kliniczne wykrywanie fuzji genów odbywało się głównie za pomocą testów jednogenowych. Jednak stale rosnąca lista fuzji genów o znaczeniu klinicznym stworzyła potrzebę oceny statusu fuzji wielu genów jednocześnie. Testy oparte na sekwencjonowaniu nowej generacji (NGS) zaspokoiły to zapotrzebowanie dzięki możliwości sekwencjonowania kwasów nukleinowych w sposób masowo równoległy. Wiele podejść opartych na NGS, które wykorzystują różne strategie wzbogacania docelowych genów, jest obecnie dostępnych do stosowania w klinicznej diagnostyce molekularnej, a każde z nich ma swoje mocne i słabe strony. W artykule opisano zastosowanie zakotwiczonego wzbogacania celu opartego na multipleksie PCR (AMP) i przygotowania biblioteki, a następnie NGS do oceny fuzji genów w klinicznych próbkach guzów litych. AMP jest wyjątkowy wśród podejść do wzbogacania opartych na amplikonach, ponieważ identyfikuje fuzje genów niezależnie od tożsamości partnera fuzji. Szczegółowo opisano tutaj zarówno etapy mokrej ławki, jak i analizy danych, które zapewniają dokładne wykrywanie fuzji genów w próbkach klinicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fuzja dwóch lub więcej genów w jedną jednostkę transkrypcyjną może nastąpić w wyniku dużych zmian chromosomowych, w tym delecji, duplikacji, insercji, inwersji i translokacji. Poprzez zmienioną kontrolę transkrypcji i/lub zmienione właściwości funkcjonalne produktu wyrażonego genu, te geny fuzyjne mogą nadawać właściwości onkogenne komórkom nowotworowym1. W wielu przypadkach wiadomo, że geny fuzyjne działają jako główne czynniki onkogenne poprzez bezpośrednią aktywację szlaków proliferacji komórkowej i przeżycia.

Kliniczne znaczenie fuzji genów dla pacjentów z rakiem po raz pierwszy stało się oczywiste wraz z odkryciem chromosomu Philadelphia i odpowiadającego mu genu fuzji BCR-ABL1 w przewlekłej białaczce szpikowej (CML)2. Małocząsteczkowy inhibitor imatynibu mesylan został opracowany specjalnie do tego genu fuzyjnego i wykazał niezwykłą skuteczność u pacjentów z CML BCR-ABL1-dodatnim3. Terapeutyczne ukierunkowanie na fuzje genów onkogennych odniosło również sukces w guzach litych, a hamowanie genów fuzji ALK i ROS1 w niedrobnokomórkowym raku płuca służy jako główne przykłady4,5. Niedawno inhibitor NTRK larotrektynib został zatwierdzony przez FDA do leczenia guzów litych NTRK1/2/3 z dodatnim wynikiem fuzji, niezależnie od miejsca choroby6. Poza doborem terapii, wykrywanie fuzji genów odgrywa również rolę w diagnozowaniu i prognozowaniu choroby. Jest to szczególnie powszechne w różnych podtypach mięsaków i nowotworów hematologicznych, które są diagnostycznie definiowane na podstawie obecności określonych zrostów i/lub dla których obecność zrostu bezpośrednio wpływa na rokowanie7,8,9,10,11. To tylko kilka przykładów klinicznego zastosowania wykrywania fuzji genów u pacjentów z nowotworami.

Ze względu na kluczową rolę w podejmowaniu decyzji klinicznych, dokładne wykrywanie fuzji genów z próbek klinicznych ma kluczowe znaczenie. W laboratoriach klinicznych zastosowano liczne techniki analizy fuzji lub rearanżacji chromosomów, w tym: techniki cytogenetyczne, reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR), fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH), immunohistochemię (IHC) i analizę nierównowagi ekspresji 5'/3' (między innymi)12,13,14,15. Obecnie szybko rozszerzająca się lista możliwych do działania fuzji genów w nowotworach spowodowała potrzebę oceny statusu fuzji wielu genów jednocześnie. W związku z tym niektóre tradycyjne techniki, które mogą badać tylko jeden lub kilka genów na raz, stają się nieefektywnymi podejściami, zwłaszcza biorąc pod uwagę, że kliniczne próbki guza są często bardzo ograniczone i nie można ich podzielić na kilka testów. Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) jest jednak platformą analityczną, która dobrze nadaje się do testowania wielu genów, a testy oparte na NGS stały się powszechne w klinicznych laboratoriach diagnostyki molekularnej.

Obecnie używane testy NGS do wykrywania fuzji/rearanżacji różnią się pod względem użytego materiału wejściowego, chemii użytej do przygotowania biblioteki i wzbogacenia celu, oraz liczby genów pytanych w teście. Testy NGS mogą być oparte na RNA lub DNA (lub obu) wyekstrahowanym z próbki. Chociaż analiza oparta na RNA jest utrudniona przez tendencję próbek klinicznych do zawierania wysoce zdegradowanego RNA, omija ona potrzebę sekwencjonowania dużych i często powtarzających się intronów, które są celem testów fuzji opartych na DNA, ale okazały się trudne do analizy danych NGS16. Strategie wzbogacania celów w testach NGS opartych na RNA można w dużej mierze podzielić na podejścia hybrydowe lub oparte na amplikonie. Chociaż obie strategie zostały z powodzeniem wykorzystane do wykrywania fuzji, każda z nich ma przewagę nad drugą17,18. Testy wychwytywania hybrydowego zazwyczaj skutkują bardziej złożonymi bibliotekami i zmniejszonym zanikiem alleli, podczas gdy testy oparte na amplikonach zazwyczaj wymagają niższego wkładu i skutkują mniejszą liczbą sekwencjonowania poza celem19. Jednak być może głównym ograniczeniem tradycyjnego wzbogacania opartego na amplikonach jest potrzeba stosowania starterów do wszystkich znanych partnerów fuzji. Jest to problematyczne, ponieważ wiadomo, że wiele klinicznie ważnych genów łączy się z dziesiątkami różnych partnerów, a nawet gdyby projekt startera pozwolił na wykrycie wszystkich znanych partnerów, nowe zdarzenia fuzji pozostałyby niewykryte. Niedawno opisana technika określana jako zakotwiczony multipleksowy PCR (lub w skrócie AMP) rozwiązuje ten problem: 20. W AMP "półfunkcjonalny" adapter NGS jest ligowany do fragmentów cDNA, które pochodzą z wejściowego RNA. Wzbogacenie celu uzyskuje się poprzez amplifikację między starterami specyficznymi dla genu a starterem do adaptera. W rezultacie, wszystkie fuzje z genami będącymi przedmiotem zainteresowania, nawet jeśli zaangażowany jest nowy partner do fuzji, powinny zostać wykryte (patrz Rysunek 1). W tym artykule opisano zastosowanie zestawu ArcherDx FusionPlex do guzów litych, testu opartego na NGS, który wykorzystuje AMP do wzbogacania celu i przygotowania biblioteki, do wykrywania onkogennych fuzji genów w próbkach guzów litych (patrz Tabela uzupełniająca 1, aby uzyskać pełną listę genów). Protokół mokrej ławki i etapy analizy danych zostały rygorystycznie zweryfikowane w laboratorium posiadającym certyfikat Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie i sekwencjonowanie bibliotek

  1. Ogólne uwagi dotyczące testu i etapy przed testem
    1. Testy zazwyczaj składają się z siedmiu próbek klinicznych i jednej kontroli pozytywnej (chociaż liczba próbek na serię przygotowania biblioteki może być dostosowana w razie potrzeby). Należy stosować kontrolę pozytywną, która zawiera co najmniej kilka fuzji genów (które są celem testu), które zostały potwierdzone przez producenta i/lub zostały potwierdzone za pomocą metodologii ortogonalnej. Kontrola bez matrycy (NTC) musi być dołączona jako dodatkowa próbka w każdym przebiegu testu, ale jest przeprowadzana tylko przez syntezę drugiej nici cDNA i kontrolę jakości przed sekwencjonowaniem (Pre-Seq QC; w celu zapewnienia braku syntezy cDNA). Użyj rozcieńczalnika do próbek (10 mM Tris HCl pH 8,0) dla NTC.
    2. Przeprowadzić ekstrakcję całkowitego kwasu nukleinowego (TNA) tkanki zatopionej w parafinie (FFPE) utrwalonej w formalinie.
    3. Określ ilościowo składnik RNA TNA za pomocą testu fluorometrycznego.
      UWAGA: Zapobiegaj degradacji RNA w próbkach, ograniczając cykle zamrażania i rozmrażania, utrzymując rozmrożony kwas nukleinowy w niskiej temperaturze (schłodzony blok, lód lub alternatywnie) i zapobiegając zanieczyszczeniu RNazą (noszenie rękawiczek, używanie sprayu odkażającego RNazę).
  2. Losowe gruntowanie
    UWAGA: Pożądanym wkładem do testu jest 200 ng RNA (w oparciu o fluorometryczną ocenę ilościową TNA). Niższe wejścia mogą być użyte, jeśli nie można osiągnąć 200 ng. Jeśli próbka nie przejdzie kontroli jakości po sekwencjonowaniu, powtórzenie z wyższymi danymi wejściowymi może skutkować akceptowalnymi wskaźnikami kontroli jakości.
    1. Rozcieńczyć TNA w 10 mM Tris HCl pH 8,0, aby osiągnąć pożądane stężenie RNA. Dla każdej próbki przenieść 20 μl rozcieńczenia do losowo zasysających probówek z paskami odczynnika (umieszczonymi we wstępnie schłodzonym bloku aluminiowym) i wymieszać, pipetując w górę iw dół 6-8 razy. Na krótko odwirować i przenieść całą objętość na 96-dołkową płytkę PCR i uszczelnić folią RT.
    2. Włóż płytkę do bloku termocyklera, przykryj podkładką kompresyjną i zamknij pokrywę. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut (podgrzewana pokrywa).
    3. Wyjmij płytkę z termocyklera i umieść na lodzie na 2 minuty.
  3. Synteza pierwszej nici cDNA
    1. Przenieś całą objętość losowego produktu gruntującego do probówek z odczynnikiem pierwszej żyły (umieszczonych we wstępnie schłodzonym bloku aluminiowym). Mieszać, pipetując w górę i w dół 6−8 razy. Krótko odwirować, przenieść całą objętość na 96-dołkową płytkę PCR i uszczelnić folią RT.
    2. Włóż płytkę do bloku termocyklera, przykryj podkładką kompresyjną i zamknij pokrywę. Uruchom program termocyklera: 25 °C 10 min, 42 °C 30 min, 80 °C 20 min, 4 °C hold (podgrzewana pokrywa).
  4. Synteza drugiej nici cDNA
    1. W nowym zestawie probówek paskowych do PCR rozcieńczyć produkt pierwszej nici w stosunku 1:10, dodając 1 μl produktu pierwszej nici do 9 μl wody wolnej od nukleaz. Odłóż rozcieńczenie na bok i użyj go w teście kontroli jakości Pre-Seq.
    2. Dodać 21 μl wody wolnej od nukleaz do pozostałego produktu z pierwszej nici. Przenieść 40 μl produktu z pierwszej nici i wody wolnej od nukleaz do probówki z odczynnikiem drugiej nici (umieszczonej we wstępnie schłodzonym bloku aluminiowym). Mieszać, pipetując w górę i w dół 6−8 razy. Zawirować, przenieść całą objętość na 96-dołkową płytkę PCR i uszczelnić folią RT.
    3. Włóż płytkę do bloku termocyklera, przykryj podkładką kompresyjną i zamknij pokrywę. Uruchom program termocyklera: 16 °C 60 min, 75 °C 20 min, 4 °C hold (podgrzewana pokrywa).
      UWAGA: Jest to dopuszczalny punkt zatrzymania. Płytka może być przechowywana w temperaturze -20 °C.
  5. Pre-Seq QC
    UWAGA: Ten test kontroli jakości (QC) jest używany przede wszystkim do weryfikacji braku syntezy cDNA z NTC. Jednak dane mogą być również przydatne w rozwiązywaniu problemów z testami. Na przykład, jeśli próbka ma dobrą wartość Pre-Seq QC, ale słabe wskaźniki testu (patrz poniżej), może to wskazywać na problem w przebiegu testu, wymagający powtórzenia.
    1. Uruchom każdą próbkę i NTC w dwóch sekwencjach. Uwzględnij również w Pre-Seq QC przebieg reakcji NTC, która jest wodą wolną od nukleaz (również przebiegającą w duplikacie). Do każdego odpowiedniego dołka na 96-dołkowej płytce optycznej dodać 5 μl mieszanki wzorcowej testu, 1 μl 10-krotnego startera VCP i 4 μl roztworu 1:10 pierwszego produktu niciowego, który został utworzony w kroku 1.4.1.
    2. Uszczelnij płytkę folią RT, odwiruj i załaduj do ilościowego przyrządu do PCR (qPCR). Uruchom program: przedwzmacniacz: 1 cykl 95 °C 20 s, amp: 35 cykli 95 °C 3 s (szybkość narastania 4,4 °C/s) − 60 °C 30 s (szybkość narastania 2,2 °C/s).
    3. Potwierdzić brak wartości progowej cyklu (Ct) zarówno dla testu NTC, jak i reakcji NTC.
      UWAGA: Jeśli w teście NTC nie zostanie zaobserwowany, nie będzie on już przenoszony w teście. Obserwacja wartości Ct w reakcji NTC wymaga powtórzenia testu Pre-Seq QC. Obserwacja Ct w teście NTC sugeruje zanieczyszczenie próbki w pewnym momencie przed badaniem, co wymaga rozpoczęcia całego testu (wszystkich próbek) od nowa. Wartość Ct Pre-Seq QC dla próbki odpowiedniej jakości powinna być niższa niż 30 (niższe wartości Ct korelują z większą ilością produktu, a tym samym wyższą jakością RNA). Wartości powyżej 30 nie są bezwzględnymi wskaźnikami niepowodzenia i próbki te powinny być kontynuowane w teście. Jednakże wszystkie dane pochodzące z takich próbek powinny być dokładnie przeanalizowane, szczególnie w przypadkach, w których nie jest wymagane fuzja.
  6. Naprawa końcówek i oczyszczanie ściegu
    1. Przenieść 40 μl produktu z drugiej nici do probówki z odczynnikiem do naprawy końcowej (umieszczonej we wstępnie schłodzonym bloku aluminiowym). Wymieszać pipetując w górę i w dół 6−8 razy, odwirować w dół i umieścić w bloku termocyklera (trzymając podgrzewaną pokrywę otwartą) i uruchomić program termocyklera: 25 °C 30 min, 4 °C wstrzymanie.
    2. Usunąć kulki oczyszczające z 4 °C i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej. Uzupełnij tyle 70% etanolu, aby wystarczyło na całe przygotowanie biblioteki. Przed użyciem dobrze odwirować kulki i odpipetować 100 μl do odpowiedniej liczby dołków płytki dolnej w kształcie litery U.
      UWAGA: Na każde 8 próbek, które są badane, potrzebne będzie 20 ml 70% etanolu.
    3. Dodaj całą objętość produktu do naprawy końcowej do kulek. Pipetować w górę i w dół 6-8 razy, aby wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie 5-minutową inkubację na magnesie.
    4. Usunąć i wyrzucić supernatant i przeprowadzić dwa płukania 200 μl 70% etanolu z inkubacją 30-sekundową. Po ostatnim umyciu usuń całe 70% etanolu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 5 minut.
    5. Wyjmij z magnesu i ponownie zawieś kulki w 22 μl 10 mM Tris HCl pH 8,0. Inkubuj magnes przez 3 minuty, a następnie 2-minutową inkubację na magnesie. Przejdź natychmiast do kroku 1 podwiązania.
  7. Podwiązanie etap 1 i oczyszczanie ściegu
    1. Przenieść 20 μl z płytki oczyszczającej kulki do naprawy końcówki (uważając, aby nie naruszyć granulatu kulki) do probówek paskowych do ligacji etapu 1 (umieszczonych we wstępnie schłodzonym bloku aluminiowym). Wymieszać, pipetując w górę i w dół 6-8 razy, odwirować i przenieść całą objętość do 96-dołkowej płytki PCR.
    2. Włóż płytkę do bloku termocyklera, przykryj podkładką kompresyjną i zamknij pokrywę. Uruchom program termocyklera: 37 °C 15 min, 4 °C hold (podgrzewana pokrywa).
    3. Usunąć kulki oczyszczające z 4 °C i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej. Przed użyciem dobrze wymieszać kulki i odpipetować 50 μl do odpowiedniej liczby dołków na dolnej płycie w kształcie litery U.
    4. Dodaj całą objętość produktu do podwiązania krok 1 do koralików. Pipetować w górę i w dół 6-8 razy, aby wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie 5-minutową inkubację na magnesie.
    5. Usunąć i wyrzucić supernatant i przeprowadzić dwa płukania 200 μl 70% etanolu z inkubacją 30-sekundową. Po ostatnim umyciu usuń całe 70% etanolu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 5 minut.
    6. Wyjmij z magnesu i ponownie zawieś kulki w 42 μl 10 mM Tris HCl pH 8,0. Inkubuj magnes przez 3 minuty, a następnie 2-minutową inkubację na magnesie. Przejdź natychmiast do kroku 2 podwiązania.
  8. Podwiązanie krok 2 i oczyszczanie kulek
    1. Wyjmij odczynniki w probówce z molekularnymi kodami kreskowymi (MBC) z magazynu w temperaturze 4 °C. Właściwa numeracja paska adaptera MBC jest niezwykle ważna, ponieważ w tym momencie dodawane są indeksy specyficzne dla próbki. Ustaw rurki poziomo z zawiasami do tyłu i użyj trwałego markera, aby oznaczyć rurki 1, 2, 3... od lewej do prawej. Bardzo ważne jest również rejestrowanie indeksów specyficznych dla próbki do celów sekwencjonowania (muszą one być wprowadzone do arkusza sekwencera).
    2. Przenieść 40 μl z płytki oczyszczającej kulki kroku 1 ligacji (uważając, aby nie naruszyć osadu kulki) do probówek z paskami adaptera MBC (umieszczonymi we wstępnie schłodzonym bloku aluminiowym). Mieszać, pipetując w górę i w dół 6−8 razy.
    3. Odkręć i przenieś całą objętość do probówek z odczynnikiem do ligacji kroku 2 (również umieszczonych we wstępnie schłodzonym bloku aluminiowym). Wymieszać, pipetując w górę i w dół 6-8 razy, odwirować w dół i umieścić w bloku termocyklera. Przy zdjętej podgrzewanej pokrywie uruchom program termocyklera: 22 °C 5 min, 4 °C hold.
      UWAGA: Jest to bezpieczny punkt zatrzymania, a próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C.
    4. Wyjąć kulki do czyszczenia ligacji z miejsca przechowywania w temperaturze 4 °C i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej. Przygotować 1 ml świeżego 5 mM NaOH.
    5. Zmieszaj kulki czyszczące ligację i dodaj 50 μl do nowego zestawu probówek z paskami do PCR. Inkubować na magnesie przez 1 minutę. Po 1-minutowej inkubacji usunąć i wyrzucić supernatant. Wyjmij probówki z paskami z magnesu i ponownie zawieś w 50 μl buforu do czyszczenia ligacji, pipetując w górę iw dół 6−8 razy.
    6. Przenieś całą objętość produktu do podwiązania krok 2 do probówek z paskami do czyszczenia ligacji. Wymieszać próbki przez wirowanie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Ponownie wymieszaj próbki przez wirowanie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez kolejne 5 minut. Po drugiej 5-minutowej inkubacji wymieszać próbki przez wirowanie, krótko odwirować i inkubować na magnesie przez 1 minutę.
    7. Usunąć i odrzucić supernatant. Dodaj 200 μl buforu do czyszczenia ligacji i wir, aby ponownie zawiesić. Wykonaj szybki obrót i umieść na magnesie na 1 minutę. Ponownie wykonaj drugie płukanie, używając bufora do czyszczenia ligacji.
    8. Po dwóch płukaniach buforem czyszczącym ligację wykonaj identyczne płukanie przy użyciu ultraczystej wody. Po przemyciu ultraczystą wodą ponownie zawiesić kulki w 20 μl 5 mM NaOH i przenieść na 96-dołkową płytkę PCR. Umieść płytkę w bloku termocyklera z podkładką kompresyjną i uruchom program termocyklera: 75 °C 10 min, 4 °C hold (podgrzewana pokrywa).
    9. Odwirować płytkę do PCR, gdy próbki ostygną do temperatury 4 °C. Umieścić płytkę na magnesie na co najmniej 3 minuty i natychmiast przejść do pierwszego PCR.
  9. Pierwszy PCR i oczyszczanie kulek
    1. Wyjmij pierwsze probówki z odczynnikiem do PCR z magazynu w temperaturze 4 °C i umieść je we wstępnie schłodzonym bloku aluminiowym. Również usunąć startery GSP1 z -20 °C i pozostawić do zrównoważenia do temperatury pokojowej.
    2. Dodaj 2 μl starterów GSP1 do każdego dołka w pierwszych probówkach z odczynnikiem do PCR. Przenieś 18 μl produktu czyszczącego ligację 2 do pierwszych probówek z odczynnikiem do PCR i wymieszaj, pipetując w górę iw dół 6−8 razy.
    3. Zakręć w dół i przenieś na 96-dołkową płytkę PCR. Umieścić płytkę w bloku termocyklera z podkładką kompresyjną i uruchomić program termocyklera: 95 °C 3 min, 15 cykli 95 °C 30 s − 65 °C 5 min (100% szybkość narastania), 72 °C 3 min, 4 °C hold (podgrzewana pokrywa).
      UWAGA: Jest to bezpieczny punkt zatrzymania, a próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez noc lub w temperaturze -20 °C w przypadku długotrwałego przechowywania.
    4. Usunąć kulki oczyszczające z 4 °C i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej. Przed użyciem dobrze wymieszać kulki i odpipetować 24 μl do odpowiedniej liczby dołków na dolnej płytce w kształcie litery U.
    5. Przenieś 20 μl pierwszego produktu PCR do 24 μl kulek. Pipetować w górę iw dół 6-8 razy, aby wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie 2-minutową inkubację na magnesie.
    6. Usunąć i wyrzucić supernatant i przeprowadzić dwa płukania 200 μl 70% etanolu z inkubacją 30-sekundową. Po ostatnim umyciu usuń cały 70% etanolu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 2 minuty.
    7. Zdejmij z magnesu i ponownie zawieś kulki w 24 μl 10 mM Tris HCl pH 8,0. Inkubuj magnes przez 3 minuty, a następnie 2-minutową inkubację na magnesie. Natychmiast przejdź do drugiego PCR.
  10. Drugi PCR i oczyszczanie kulek
    1. Wyjmij probówki z drugim paskiem odczynnika do PCR z 4 °C i umieść we wstępnie schłodzonym bloku aluminiowym. Właściwa numeracja drugich probówek paskowych do PCR jest niezwykle ważna, ponieważ w tym momencie dodawane są indeksy specyficzne dla próbki. Ustaw rurki poziomo z zawiasami do tyłu i użyj trwałego markera, aby oznaczyć rurki 1, 2, 3... od lewej do prawej. Również usunąć startery GSP2 z -20 °C i pozostawić do zrównoważenia do temperatury pokojowej.
      UWAGA: Bardzo ważne jest również zapisanie indeksów specyficznych dla próbki do celów sekwencjonowania (muszą one być wprowadzone do arkusza sekwencera).
    2. Dodaj 2 μl starterów GSP2 do każdego dołka w drugiej probówce z odczynnikiem do PCR. Przenieś 18 μl pierwszego produktu oczyszczającego do PCR do drugiej probówki z odczynnikiem do PCR i wymieszaj, pipetując w górę iw dół 6-8 razy.
    3. Zakręć w dół i przenieś na 96-dołkową płytkę PCR. Umieścić płytkę w bloku termocyklera z podkładką kompresyjną i uruchomić program termocyklera: 95 °C 3 min, 18 cykli 95 °C 30 s − 65 °C 5 min (100% szybkość narastania), 72 °C 3 min, 4 °C hold (podgrzewana pokrywa).
      UWAGA: Jest to bezpieczny punkt zatrzymania, a próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez noc lub w temperaturze -20 °C w przypadku długotrwałego przechowywania.
    4. Usunąć kulki oczyszczające z 4 °C i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej. Przed użyciem dobrze wymieszać kulki i odpipetować 24 μl do odpowiedniej liczby dołków na dolnej płytce w kształcie litery U.
    5. Przenieś 20 μl drugiego produktu PCR na kulki. Pipetować w górę iw dół 6-8 razy, aby wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie 2-minutową inkubację na magnesie.
    6. Usunąć i wyrzucić supernatant i przeprowadzić dwa płukania 200 μl 70% etanolu z inkubacją 30-sekundową. Po ostatnim umyciu usuń cały 70% etanolu i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 2 minuty.
    7. Zdejmij z magnesu i ponownie zawieś kulki w 24 μl 10 mM Tris HCl pH 8,0. Inkubuj magnes przez 3 minuty, a następnie 2-minutową inkubację na magnesie. Przenieść 20 μl drugiego produktu do oczyszczania PCR na nową 96-dołkową płytkę PCR.
      UWAGA: Jest to bezpieczny punkt zatrzymania, a biblioteki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C w celu długoterminowego przechowywania lub natychmiast przejść do kwantyfikacji biblioteki.
  11. Kwantyfikacja biblioteki
    1. Wyjąć z biblioteki wzorcową mieszaninę ilościową i wzorce z miejsca przechowywania w temperaturze -20 °C i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej.
    2. Wykonać rozcieńczenie 1:5 wszystkich bibliotek (drugi produkt PCR) przy użyciu 10 mM Tris HCl pH 8,0, a następnie szeregowe rozcieńczenie 1:199, 1:199 i 20:80 przy użyciu 10 mM Tris HCl pH 8,0 0,05% polisorbatu. Ostatnie dwa rozcieńczenia odpowiednio 1:200 000 i 1:1 000 000 zostaną przeprowadzone w trzech egzemplarzach.
    3. Dodać 6 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka na 96-dołkowej płytce optycznej, a następnie 4 μl odpowiedniego rozcieńczenia lub wzorca. Zakręć płytką i załaduj ją do urządzenia qPCR. Stosować następujące warunki cyklu: 1 cykl 95 °C 5 min, 35 cykli 95 °C 30 s (szybkość narastania 4,4 °C/s) − 60 °C 45 s (szybkość narastania 2,2 °C/s).
    4. Po zakończeniu kwantyfikacji biblioteki i określeniu stężeń bibliotecznych (poprzez uśrednienie obu badanych rozcieńczeń), znormalizuj wszystkie biblioteki do 2 nM przy użyciu 10 mM Tris HCl pH 8,0. Stwórz pulę bibliotek, łącząc 10 μl każdej znormalizowanej biblioteki w jedną mikroprobówkę wirówkową o pojemności 1,5 ml.
  12. Sekwencjonowanie bibliotek
    1. Wyjmij wkład z odczynnikiem sekwensera z magazynu w temperaturze -20 °C i umieść w wodzie dejonizowanej (DI) do linii napełniania na co najmniej 1 godzinę. Wyjmij również zestaw odczynników sekwenatora z 4 °C i pozostaw do zrównoważenia do temperatury pokojowej przez co najmniej 1 godzinę. Maksymalna liczba bibliotek, które można sekwencjonować na tej platformie sekwencjonowania, wynosi 8 (z których jedna musi być kontrolą pozytywną).
    2. Przygotować pulę zdenaturowanych amplikonów (DAL), łącząc 10 μl puli bibliotecznej z 10 μl 0,2 N NaOH i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po 5-minutowej inkubacji dodać 10 μl 200 mM Tris HCl pH 7,0, a następnie 970 μl buforu hybrydyzacyjnego HT1.
    3. Wykonaj końcową rurkę ładującą, łącząc 300 μL HT1, 25 μL 20 pM PhiX i 675 μL puli DAL. Wiruj i odkręć rurę ładunkową. Dodaj całą objętość rurki ładującej do dołka próbki w kartridżu z odczynnikiem sekwencera i załaduj kartridż do sekwencera, wykonując odczyty 2 x 151 pz z odczytami indeksu 2 x 8.

2. Analiza danych

  1. Sekwencjonowanie, obsługa i analiza danych
    1. Pobierz metryki sekwencjonowania z instrumentu NGS.
    2. Upewnij się, że dane sekwencjonowania mieszczą się w poniższych zakresach (specyficznych dla zestawu użytego w tym przykładzie). Gęstość klastrów (gęstość [K/mm2]): 945–1600 K; % odczytów przechodzi przez filtr (klastry PF [%]): >90%; wyniki jakości (% ≥Q30): >85%; Wyrównanie PhiX (wyrównane %): 1,5−6,0%; Poziom błędu PhiX (poziom błędu [%]): <1,0%; odczytuje filtr przechodzący (odczytuje PF [M]): >22 miliona.
      UWAGA: Sekwencjonowanie, które nie spełnia tych wskaźników, może się powtarzać.
    3. Przejrzyj % odczytów przypisanych do każdej próbki (tj. każdego indeksu specyficznego dla próby). W przypadku typowego przebiegu, w którym skok PhiX wynosił ~5% i zsekwencjonowano 8 próbek, każda próbka powinna idealnie odpowiadać za około 11,9% odczytów. Dopuszczalny zakres dla każdej próbki wynosi 5-25%. Jeśli jakiekolwiek próbki nie mieszczą się w tym zakresie, powtórz kwantyfikację i sekwencjonowanie w bibliotece.
  2. Przekazywanie surowych danych sekwencyjnych do algorytmu analitycznego
    UWAGA: Wersja 4.1.1.7 ArcherDx Analysis jest opisana tutaj. W tym przykładzie oprogramowanie analityczne jest wdrażane jako "maszyna wirtualna" uruchamiana na serwerze wewnętrznym. Jedna jednostka centralna (CPU) i 12 GB pamięci o dostępie swobodnym (RAM) są wymagane do jednoczesnej analizy każdej próbki (zwykle 8 próbek jest przetwarzanych jednocześnie, co wymaga 8 procesorów i 96 GB pamięci RAM). Przetwarzanie trwa zwykle 3-8 godzin.
    1. Należy użyć domyślnych ustawień analizy w systemie analizy, z wyjątkiem MIN_AVERAGE_UNIQUE_RNA_START_SITES_PER_GSP2_CONTROLS (wartość ta jest zmieniana z 10 na 20) i READ_DEPTH_NORMALIZATION (wartość ta jest ustawiana na 0, aby zapobiec próbkowaniu w dół).
    2. Aby rozpocząć zadanie analizy, kliknij opcję Wykonaj analizę w interfejsie użytkownika, prześlij nazwę zadania, a następnie wybierz niezbędne pliki FASTQ (upewniając się, że dla każdej próbki wybrano oba odczyty [R1 i R2]).
    3. Wybierz RNA Fusion dla typów analizy RNA, Illumina (sparowany) dla platformy i FusionPlex Solid Tumor Panel dla regionu docelowego. Następnie kliknij Prześlij analizę.
  3. Interpretacja danych testowych
    1. Otwórz interfejs użytkownika systemu analitycznego i wybierz żądane zadanie. Pobrać dodatnią próbkę kontrolną. Upewnij się, że wszystkie oczekiwane fuzje i izoformy onkogenne zostały wykryte i są wymienione w zakładce Silne dowody.
      UWAGA: Jeżeli którakolwiek ze śledzonych fuzji w kontroli dodatniej nie zostanie wykryta dla danej serii testu, może to wskazywać na problem w tej serii, który wymaga powtórzenia (od początku testu).
    2. Sprawdź statystyki odczytu dla każdej próbki klinicznej w przebiegu, klikając kartę Statystyki odczytu. Każda próbka powinna składać się z co najmniej 1 miliona fragmentów. Jeśli liczba ta jest mniejsza niż 1 milion, należy ponownie uporządkować bibliotekę z uwzględnieniem ponownej oceny ilościowej, aby upewnić się, że początkowa ocena ilościowa nie była nieprawidłowo wysoka.
      UWAGA: Próbki dobrej jakości zazwyczaj wyświetlają % wartości docelowej >85%, a pojemniki molekularne RNA powinny wynosić 20 000 > i stanowić >30% odczytów. Jednak niespełnienie tych metryk nie powoduje automatycznie niepowodzenia próbki.
    3. Sprawdź średnią unikatowych lokalizacji początkowych na wartość kontrolną GSP2.
      UWAGA: Ta wartość jest miarą złożoności sekwencjonowania od starterów do czterech genów porządkowania. Wskaźnik ten jest krytycznym wyznacznikiem jakości RNA w próbce (jeśli sekwencjonowanie genów, które mają ulec ekspresji w próbce, jest słabe, oznacza to, że pewność co do zdolności do wykrycia ekspresji fuzji genów jest niska). Wartość graniczna dla tej metryki to 20. Jeśli dowolna próbka ma wartość mniejszą niż 20, wyniki dla próbki muszą być zgłaszane jako nieinformacyjne, jeśli nie zostanie znaleziona fuzja o wysokim poziomie ufności. Stan tej metryki można również określić na stronie podsumowania przebiegu (stan będzie wyświetlany jako Fusion QC: Pass lub Fusion QC: Liczba unikalnych miejsc startowych kontroli RNA GSP2 Niski w zależności od tego, czy wartość jest większa czy mniejsza niż 20). Fuzja o wysokim poziomie ufności w próbce, która nie przeszła tego wskaźnika kontroli jakości, może być nadal zgłaszana, jeśli zostanie uznana za rzeczywistą (patrz poniżej). Ogólnie rzecz biorąc, wyższe wyniki QC przy użyciu tej metryki korelują z niższymi wynikami PreSeq Ct, zgodnie z oczekiwaniami (Rysunek 2).
  4. Interpretacja wywołania fuzji
    1. Uważnie przyjrzyj się każdej wywołanej fuzji w zakładce Mocne dowody (większość fuzji silnych dowodów wywoływanych przez system jest sztuczna). Zeskanuj również pojemnik na fuzję słabych dowodów, chociaż obecność nieartefaktowej fuzji w tym pojemniku jest niezwykle rzadkim zdarzeniem. Aby ocenić poprawność fuzji, najpierw zanotuj metryki Odczyty (#/%) i Witryny startowe.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, zaufanie do wywołanej fuzji wzrasta, im wyższe są te wskaźniki. Fuzje, które są obsługiwane przez mniej niż 5 miejsc startowych i mniej niż 10% odczytów z podkładu pomocniczego, powinny być uważane za wysoce podejrzane jako sztuczne.
    2. Zwróć uwagę na ikony wyświetlane w kolumnie Filtry.
      UWAGA: Kilka z tych ikon ostrzega użytkownika o potencjalnym źródle fałszywego połączenia. Częste wśród nich (i przede wszystkim znajdowane w słabym pojemniku z dowodami zwanych fuzji) są przypadki, w których partnerzy są znanymi paralogami lub wykazują podobieństwo do siebie w sekwencji (co wskazuje na prawdopodobne błędne przygotowanie lub błędne ustawienie). Innym częstym źródłem sztucznych wywołań fuzji występuje, gdy odczyty obsługujące fuzję zawierają wysoki poziom błędów, który wskazuje na słabe mapowanie do genomu referencyjnego, co jest powiązane z odrębną ikoną. Zdarzenia odczytu transkrypcji są identyfikowane za pomocą innej ikony. Są one powszechne i na ogół ignorowane. W interfejsie użytkownika używanych jest również kilka innych ikon, ale pełny opis wszystkich wykracza poza zakres tego artykułu. Typowe artefakty, które można ogólnie zignorować bez dalszego badania, to: ADCK4-NUMBL, SYN2-PPARG, DGKG-ETV5, ETV6-AXL, ETV1-ERG, ETV4-ETV1, FGFR3-PDGFRB, EGFR-NTRK1, RAF1-RET, ALK-TFEB, NOTCH1-RET, RELA-RET, NTRK3-ALK, BRAF-ADAMTS8 i FCGR2C-MAST.
    3. Wizualizuj odczyty pomocnicze dla każdej potencjalnej fuzji, klikając łącze Wizualizuj w interfejsie użytkownika, które przenosi użytkownika do internetowego widoku JBrowse stosów poszczególnych odczytów obsługujących fuzję. Upewnij się, że odczyty są na ogół wolne od niezgodności (chociaż należy spodziewać się pewnego szumu), że znaczna część (najlepiej >30 zasad) odczytów jest wyrównana z partnerem fuzyjnym oraz że sekwencje bezpośrednio przylegające do punktu przerwania między genami a miejscami wiązania starterów są wolne od insercji lub delecji. Upewnij się, że wyrównana sekwencja zawiera część 3' sekwencji wiążących starter dla starterów, które obsługują odczyty fuzji (jeśli porcje 3' nie są uwzględnione, może to wskazywać na nieprawidłowe gruntowanie).
    4. Jeśli sekwencje kodujące obu genów są zaangażowane w fuzję, upewnij się, że partner 3' pozostaje w ramce. Kliknij link Tłumaczenie w interfejsie (który poda status Prawda lub Fałsz dla każdej kombinacji sekwencji referencyjnej), a także ręcznie potwierdź, że fuzja jest w ramce, poprzez inspekcję wywołanych punktów przerwania w przeglądarce genomu. Wywoływane punkty przerwania można określić, najeżdżając kursorem myszy na czerwone kropki na schemacie fuzji.
      UWAGA: Ponieważ większość (ale nie wszystkie) genomowych punktów przerwania dla legalnych fuzji występuje w regionach intronicznych i powoduje splicing całych eksonów, fuzje, w których granice eksonów obejmują punkty przerwania dla obu partnerów, są ogólnie postrzegane z większą dozą pewności. Ponieważ jednak istnieje wiele opublikowanych przykładów środkowych egzonicznych punktów granicznych w fuzjach, nie należy ich używać jako bezwzględnych kryteriów interpretacji fuzji.
    5. Dla każdej fuzji należy ręcznie upewnić się, że sekwencje sąsiadujące z punktem przerwania nie są homologiczne z następnymi oczekiwanymi ciągłymi zasadami dla każdego partnera. Sprawdź wszystkie możliwe sąsiadujące ze sobą eksony w przeglądarce genomu.
      UWAGA: Częstym źródłem fuzji artefaktów jest niewspółosiowość lub niewłaściwe torowanie spowodowane homologią między dwoma partnerami genów, a nie zawsze jest to wywoływane przez system za pomocą ikon opisanych powyżej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazane w Rysunek 3, Rysunek 4 i Rysunek 5 to zrzuty ekranu z interfejsu użytkownika analizy pokazujące wyniki próbki gruczolakoraka płuc. W Rysunek 3, pokazane jest podsumowanie próbki (na górze), które zawiera listę wywołanych fuzji silnych dowodów, a także status QC (zakreślony na czerwono). Fuzja ADCK4-NUMBL (z której wymienione są 3 izoformy) jest natychmiast ignorowana, ponieważ jest to ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakotwiczone wzbogacanie celów w oparciu o multipleksowy PCR i przygotowanie biblioteki, a następnie sekwencjonowanie nowej generacji dobrze nadaje się do oceny fuzji genów multipleksowych w klinicznych próbkach guza. Skupiając się na danych wejściowych RNA, a nie na genomowym DNA, unika się konieczności sekwencjonowania dużych i powtarzających się intronów. Ponadto, ponieważ takie podejście wzmacnia fuzje genów niezależnie od tożsamości partnera fuzji, wykrywane są nowe fuzje. Jest to krytyczna zaleta w sferze kliniczne...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Firma D.L.A. otrzymała honoraria za konsultacje od firm Bayer Oncology, Genentech, AbbVie i Bristol Myers Squibb. K.D.D otrzymał sponsorowane podróże od ArcherDx.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Molecular Pathology Shared Resource Uniwersytetu Kolorado (National Cancer Institute Cancer Center Support Grant No. P30-CA046934) oraz przez Colorado Center for Personalized Medicine.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 mM Tris HCl pH 8,0IDT11-05-01-13Używany do rozcieńczania TNA
1M Tris pH 7,0Thermo FisherAM9850GUżywany w puli bibliotecznej
25 ml Zbiornik na odczynniki z rozdzielaczemUSA Scientific9173-2000Do stosowania z pipeterami wielokanałowymi i dużymi objętościami odczynników
96-dołkowa płytka TemPlate Semi-Skirt 0,1 ml PCR-naturalnaUSA Scientific1402-9700Płytka używana do stopni termocyklera
Agencourt AMPure XPBeads Beckman CoulterA63881Używana do oczyszczania po kilku etapach oznaczania
Agencourt Formapure KitBeckman CoulterA33343Używana do ekstrakcji TNA
Archer FusionPlex ZestawArcherDXAB0005Ten zestaw zawiera większość odczynników niezbędnych do przygotowania biblioteki do sekwencjonowania Illumina (dostępne są również zestawy do sekwencjonowania Ion Torrent)
Zimny blok, 96-dołkowyLight LabsA7079Służy do chłodzenia próbek na różnych etapach
EtanolDecon LabsDSP-MD.43Używany do mycia koralików
Biblioteka Kwantyfikacja dla standardu kontroli wewnętrznej IlluminaKapa BiosystemsKK4906Służy do ilościowego oznaczania biblioteki
Podstawki do kwantyfikacji biblioteki i mieszanka ROX Low qPCRKapa BiosystemsKK4973Służy do kwantyfikacji biblioteki
Standardy kwantyfikacji bibliotekiKapa BiosystemsKK4903Służy do kwantyfikacji biblioteki
Płyta magnetyczna, 96-dołkowa (klasa N38)AlpaquaA32782Stosowana w etapach oczyszczania kulek
Zestaw adapterów MBC BArcherDXAK0016-48Adaptery zawierające indeksy specyficzne dla próbki, umożliwiające sekwencjonowanie multipleksowe
MikrowirówkaUSA Scientific2641-0016Służy do obracania probówek PCR
MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well PlateThermo-Fisher4483485Używany do Pre-Seq QClibrary
Optyczna podkładka kompresyjna Microamp AppliedBiosystems4312639Służy do ilościowego oznaczania biblioteki
Mini wirówka do płytekLabnetMPS-1000Służy do zbierania cieczy na dnie dołków płytowych
Zestaw odczynników MiSeq v3 (600 cykli)IlluminaMS-102-3003Zawiera składniki niezbędne do przebiegu sekwencjonowania MiSeq
System MiSeqDxPrzyrządsekwencjonowania Illumina
Model 9700 TermocyklerApplied BiosystemsUżywany do kilku kroków podczas Badanie
Woda wolna od nukleazAmbion9938Używany jako ogólny rozcieńczalnik
Optyczne ABI 96-dołkowe płytki PCRThermo-Fisher4311971Używany do Pre-Seq QClibrary ilościowa
stacja robocza PCR Model 600Systemy oczyszczania powietrzaBZ10119636Etapy testu na mokrym stole wykonywane w tej "skrzynce martwego powietrza"
Proteinaza KQiagen1019499Używany w ekstrakcji TNA
QuantStudio 5Applied BiosystemsLSA28139Przyrząd qPCR używany do PreSeq i biblioteki
Zestaw do oznaczania ilościowego kubitowego RNA HS LifeTechnologiesQ32855Służy do określania stężenia RNA w próbkach TNA
RNase AwayFisher12-402-178Służy do ogólnej dekontaminacji RNazy w miejscach pracy
Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Materiał referencyjny v2SeraCare0710-0129Stosowany jako kontrola pozytywna testu
Wodorotlenek soduFisherBP359-212Stosowany na etapach oczyszczania i do sekwencjonowania
SYBR Green SupermixBio Rad172-5120Składnik testu PreSeq QC
TempAssure PCR 8-tube StripsUSA Scientific1402-2700Używany do mieszania odczynników i próbek itp.
Szablon Folia RT PCRUSA Scientific2921-7800Służy do pokrywania płytek 96-dołkowych
U-Bottom 96-dołkowa mikropłytkaLSPMP8117-RUżywana podczas oczyszczania kulek
do guzów litych do NGS

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).
  2. Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247 (4944), 824-830 (1990).
  3. Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).
  4. Solomon, B. J., et al. First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).
  5. Shaw, A. T., et al. Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).
  6. Drilon, A., et al. Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children. New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).
  7. Kawai, A., et al. SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma. New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).
  8. de Alava, E., et al. EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing's sarcoma. Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).
  9. Pierron, G., et al. A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion. Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).
  10. Papaemmanuil, E., et al. Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
  11. Arber, D. A., et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute. Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).
  12. Sanders, H. R., et al. Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer. Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).
  13. Camidge, D. R., et al. Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment. Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).
  14. Mino-Kenudson, M., et al. A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry. Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).
  15. Suehara, Y., et al. Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions. Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).
  16. Davies, K. D., et al. Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples. Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).
  17. Reeser, J. W., et al. Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors. Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).
  18. Beadling, C., et al. A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).
  19. Mamanova, L., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
  20. Zheng, Z., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing. Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).
  21. Davies, K. D., et al. Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion. JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).
  22. Vendrell, J. A., et al. Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches. Scientific Reports. 7 (1), 12510(2017).
  23. Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions. American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).
  24. Skalova, A., et al. Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases. American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).
  25. Guseva, N. V., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst. Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kotwiczona PCR multipleksowakliniczny guz lityrozcie czanie RNArandomowe inicjowanie syntezysynteza drugiej nicioczyszczanie za pomoc kulek magnetycznychilo ciowe oznaczanie bibliotekikartrid z odczynnikami do sekwenatora

Powiązane artykuły