Artykuł metodologiczny

Otrzymywanie i charakterystyka nanoliposomów do uwięzienia bioaktywnych hydrofilowych białek kulistych

27.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59900

⸱

31 sierpnia 2019

 ,  , 
1Chemistry Institute, Federal University of Rio de Janeiro

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie opisuje klasyczną hydratację przy użyciu metody cienkiego filmu lipidowego do przygotowania nanoliposomów, a następnie charakterystyki nanocząstek. Hydrofilowe i globularne białko o masie 47 kDa, taryna, jest z powodzeniem kapsułkowane jako strategia poprawiająca stabilność, unikająca szybkiego klirensu i promująca kontrolowane uwalnianie. Metoda może być dostosowana do enkapsulacji cząsteczek hydrofobowych.

Streszczenie

Nanokapsułki liposomowe były stosowane do wielu celów w przemyśle farmaceutycznym, kosmetycznym i spożywczym. Atrybuty liposomów obejmują ich biokompatybilność, biodegradowalność, nieimmunogenność, nietoksyczność oraz zdolność do zatrzymywania zarówno związków hydrofilowych, jak i hydrofobowych. Klasyczne uwodnienie cienkich warstw lipidowych w rozpuszczalniku organicznym jest tutaj stosowane jako technika kapsułkowania taryny, lektyny roślinnej, w nanoliposomach. Szczegółowo opisano wielkość nanoliposomów, stabilność, skuteczność uwięzienia i charakterystykę morfologiczną. Nanoliposomy przygotowuje się przy użyciu 1,2-dioleoilo-sn-glicerolu-3-fosfoetanoloaminy (DOPE), 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy-N-[amino(glikolu polietylenowego)-2000] (soli amonowej; DSPE-MPEG 2000) i cholesterylhemibursztynian (CHEMS) jako główne składniki. Lipidy są najpierw rozpuszczane w chloroformie w celu uzyskania cienkiego filmu lipidowego, który jest następnie ponownie hydratelizowany w roztworze siarczanu amonu zawierającym białko, które ma być uwięzione i inkubowane przez noc. Następnie stosuje się techniki sonikacji i ekstruzji w celu wygenerowania nanorozmiarów pęcherzyków jednowarstwowych. Wielkość i wskaźnik polidyspersyjności nanopęcherzyków określa się za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, natomiast morfologię nanopęcherzyków ocenia się za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Skuteczność uwięzienia zależy od stosunku ilości niekapsułkowanego białka do pierwotnej ilości początkowo załadowanego białka. Uzyskuje się liposomy jednorodne o średniej wielkości 155 nm i wartości wskaźnika polidyspersyjności 0,168. Osiągana jest wysoka skuteczność uwięzienia wynosząca 83%.

Wprowadzenie

Liczba badań nad skutecznymi systemami dostarczania leków wzrosła w ostatnich latach. Jednak ograniczenia, takie jak szybki klirens, słaba biodystrybucja i rozpuszczalność przy fizjologicznym pH oraz niewystarczający wychwyt komórkowy, nadal muszą zostać przezwyciężone. Zastosowanie nanosystemów pojawiło się wraz z niedawnym postępem w terapii raka, stosowanej w celu zwiększenia wewnątrzkomórkowego stężenia leków wewnątrz komórek rakowych przy jednoczesnym zminimalizowaniu toksyczności w zdrowych komórkach. Co więcej, nanocząstki uzyskane z innego zakresu materiałów (tj. polimerów, dendrymerów, liposomów, wirusów, nanorurek węglowych i metali, takich jak tlenek żelaza i złoto) są obecnie stosowane w celu wzmocnienia działania przeciwnowotworowego i zmniejszenia toksyczności ogólnoustrojowej1. W szczególności nanokapsułki liposomowe znalazły zastosowanie w wielu celach w przemyśle farmaceutycznym, kosmetycznym i spożywczym. W ostatnich latach różne produkty nutraceutyczne, takie jak witaminy, enzymy i ekstrakty ziołowe, zostały opracowane przy użyciu technologii liposomów2.

Liposomy to kuliste pęcherzyki składające się z jednej lub więcej koncentrycznych dwuwarstw lipidowych, spontanicznie powstałych w wyniku rozproszenia fosfolipidów w środowisku wodnym3,4. Polarne głowy fosfolipidów znajdują się na zewnętrznej i wewnętrznej powierzchni błon, w kontakcie ze środowiskiem wodnym. W przeciwieństwie do tego, łańcuchy kwasów tłuszczowych tworzą hydrofobowy rdzeń membran i są chronione przed wodą5. Niektóre cechy liposomów, które czynią je atrakcyjnymi systemami dostarczania leków, obejmują ich biokompatybilność, biodegradowalność, nieimmunogenność, nietoksyczność i zdolność do uwięzienia zarówno związków hydrofilowych, jak i hydrofobowych6.

Liposomy mogą być przygotowywane za pomocą różnych etapów procesów, takich jak mieszanie, sonikacja, ekstruzja, liofilizacja, zamrażanie i rozmrażanie. Klasyczne metody obejmują odparowywanie w odwrotnej fazie, wstrzykiwanie rozpuszczalnika i dializę detergentów. Najczęściej stosowaną metodą jest uwodnienie cienkiego filmu lipidowego, znane również jako metoda Banghama, która służy do uzyskiwania pęcherzykowo-lipidowych form7,8,9,10,11. Lameloliczność (liczba dwuwarstw fosfolipidowych) i wielkość cząstek są klasycznymi parametrami stosowanymi do scharakteryzowania liposomów jako: 1) pęcherzyki jednowarstwowe (ULV), utworzone przez unikalną dwuwarstwę fosfolipidową i różniące się wielkością w następujący sposób: i) małe pęcherzyki jednowarstwowe (SUV, ~0,02-0,20 μm), ii) duże pęcherzyki jednowarstwowe (LUVs, ~0,2-1,0 μm), oraz iii) gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUVs, >1 μm); lub 2) pęcherzyki wieloblaszkowe (MLV, >0,1 μm)3,12. Rozmiar pęcherzyków jest ważnym parametrem przy rozważaniu zastosowania terapeutycznego, takiego jak leczenie raka, w którym rozmiary <200 nm są idealne, aby umożliwić nanopęcherzykom przekroczenie bariery śródbłonka i dotarcie do tkanek nowotworowych4.

W tym miejscu, procedura enkapsulacji następująca po klasycznym uwodnieniu techniką cienkiego filmu lipidowego7 została opisana przy użyciu taryny, lektyny roślinnej charakteryzowanej jako hydrofilowe białko globularne13,14,15. Pęcherzyki o rozmiarach nano są wytwarzane przez włączenie etapów sonikacji i ekstruzji do głównej techniki, co skutkuje stabilnymi liposomalnymi nanopęcherzykami o wysokiej skuteczności uwięzienia16.

Protokół

1. Przygotowanie liposomalnych nanokapsułek tarin16

UWAGA: Wszystkie preparaty należy przygotować w trzech powtórzeniach, aby uzyskać większą objętość (7 mL) i umożliwić wirowanie próbki w ultrawirówce (szczegóły poniżej).

  1. Odważ składniki liposomów za pomocą wagi analitycznej, zgodnie z Tabelą 1.
  2. Rozpuść składniki lipidowe w chloroformie, używając kolby miarowej o pojemności 250 mL, która mieści się w rotacyjnym odparowywaczu, aby uniknąć utraty materiału.
  3. Mieszaj mieszaninę przy 150 rpm przez 15 min.
  4. Usuń chloroform za pomocą rotacyjnego odparowywacza w następujących warunkach:
    1. Ustaw szyjkę kolby miarowej w pozycji standardowej (25°) dla optymalnej wydajności, w kontakcie z wodą z łaźni grzewczej.
      UWAGA: Ramię urządzenia powinno być nachylone pod kątem 25°, aby utrzymać kontakt między kolbą miarową a łaźnią wodną, nie wpływając przy tym na wydajność odparowywania i nie uszkadzając próbki. Pozycja standardowa może różnić się w zależności od marki urządzenia.
    2. Ustaw temperaturę skraplacza na minimum 3 °C.
    3. Ustaw temperaturę łaźni grzewczej na 40 ± 1 °C.
    4. Ustaw prędkość obrotową na 120 rpm.
    5. Ustaw próżnię na 207 mbar i temperaturę wrzenia na 20 °C.
    6. Po około 25 min wyjmij kolbę i w odpowiedni sposób zutylizuj odparowany rozpuszczalnik pozostały w skraplaczu.
      UWAGA: Na tym etapie tworzy się cienka, nieprzezroczysta błona składająca się ze składników liposomów, którą można łatwo zaobserwować. Odparowany rozpuszczalnik pozostały w skraplaczu musi być przechowywany w odpowiednich pojemnikach na odpady (chlorowane), aby mógł zostać odebrany przez wyspecjalizowaną firmę w celu właściutylizacji.
  5. Hydratuj błonę lipidową, aby uzyskać stężenie lipidów 0,01 M w 0,3 M roztworze siarczanu amonu (pH = 7,4) zawierającym tarin w stężeniu 1 mg/mL do końcowej objętości 10 mL.
    1. Mieszaj mieszaninę przez 40 min i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Ten etap może być traktowany jako punkt zatrzymania. Inkubacja przez noc nie jest obowiązkowa.
  6. Po inkubacji poddaj zawiesinę sonikacji przez 1 min w temperaturze 25 °C (temperatura pokojowa; RT), aby zmniejszyć rozmiar pęcherzyków i uniknąć agregacji.
    UWAGA: Redukcja rozmiaru była przeprowadzana w sonikatorze ultradźwiękowym w następujących warunkach: 130 W i 40 kHz.
  7. Wykonaj ekstruzję 12-cyklową przez membranę z porami poliwęglanowymi o rozmiarze 0,2 µm.
    UWAGA: Przed rozpoczęciem procesu ekstruzji sprawdź zestaw mini-ekstrudera za pomocą wody, aby uniknąć wycieku próbki. Odpowiednia jest również membrana o porach 0,1 µm. W takim przypadku należy podgrzać uchwyt mini-ekstrudera powyżej temperatury przejścia lipidów, aby ułatwić ekstruzję, zachowując jednocześnie charakterystykę fizykochemiczną zarówno lipidów, jak i białek.
    1. Złóż elementy mini-ekstrudera zgodnie z instrukcją producenta.
    2. Umieść membranę poliwęglanową pomiędzy dwoma nawilżonymi podkładkami filtrującymi i włóż ją do uchwytu.
    3. Włóż do urządzenia pustą strzykawkę 1 mL, napełnij drugą strzykawkę do pełnej objętości zawiesiną liposomalną i włóż ją po przeciwnej stronie.
    4. Wykonaj ekstruzję 12-cyklową przez membranę z porami poliwęglanowymi 0,2 µm. Powoli przetłocz próbkę z jednej strzykawki do drugiej. Zbierz ekstruhowaną zawiesinę do schłodzonej wcześniej probówki.
      UWAGA: Membranę poliwęglanową należy wymieniać tylko wtedy, gdy przenoszenie próbki z jednej strzykawki do drugiej stanie się utrudnione. W miarę postępu procesu ekstruzji zawiesina liposomalna powinna stać się klarowna w wyniku redukcji rozmiaru spowodowanej tworzeniem się SUV. Na tym etapie może dojść do utraty około 0,2 mL próbki.
  8. Oddziel liposomy za pomocą ultrawirowania.
    UWAGA: Próbki należy utrzymywać w łaźni lodowej do czasu przygotowania ultrawirowarki. Oddziel SUV od pozostałych składników i siarczanu amonu za pomocą ultrawirowania z użyciem ultrawirowarki z rotorem z koszyczkami wachlarzowymi (szczegóły poniżej).
    1. Odważ próbkę w probówce tytanowej dopasowanej do rotora i zrównoważ probówki. Sprawdź minimalną objętość wymaganą dla używanego rotora, aby uniknąć uszkodzenia probówek, i w razie potrzeby dostosuj objętość zawiesiny liposomalnej za pomocą siarczanu amonu.
      UWAGA: Koszyczek wachlarzowy, gdy znajduje się poza wirówką, powinien być zawsze oparty o stojak, aby uniknąć porysowania „pasków zebry” (tzn. czarnych i białych pasków na spodzie), które są wykorzystywane przez wirówkę do określania prędkości obrotowej.
    2. Włącz próżnię przed użyciem wirówki, aby umożliwić jej schłodzenie.
    3. Umieść probówki tytanowe w koszyczkach wachlarzowych.
      UWAGA: Podnieś probówki do pozycji, jaką przyjmują podczas pracy, aby upewnić się, że są idealnie dopasowane.
    4. Zwolnij próżnię, otwórz drzwi wirówki i włóż rotor do środka.
      UWAGA: Zwróć uwagę na oznaczenie okręgu na spodzie rotora, które musi być ustawione w kierunku przeciwnym do analogicznego oznaczenia wewnątrz wirówki.
    5. Zamknij drzwi wirówki, naciśnij przycisk Vacuum i poczekaj, aż próżnia osiągnie wartość od 200 do <20 mikronów lub od 26 Pa do <3 Pa.
    6. Ustaw parametry na wyświetlaczu ultrawirowarki na 150 000 x g (co odpowiada 29 600 rpm dla wspomnianego koszyczka wachlarzowego) przez 90 min w temperaturze 4 °C (przyspieszenie: max, zwolnienie: max).
      UWAGA: Zawsze przeliczaj prędkość na x g, jeśli konkretna wirówka jest ustawiona w rpm. Skorzystaj ze strony internetowej producenta wirówki, aby przeliczyć jednostkę zgodnie z użytym rotorem.
    7. Naciśnij Recall, sprawdź warunki i naciśnij Start, aby rozpocząć pracę.
      UWAGA: Poczekaj, aż wirówka osiągnie żądaną prędkość.
    8. Po 90 min zwolnij próżnię, naciskając przycisk Vacuum, i otwórz drzwi wirówki, gdy próżnia osiągnie wartość 200-700 mikronów (odpowiednio 26-93 Pa).
    9. Wyłącz wirówkę, wyjmij rotor i pozostaw go na blacie z koszyczkami do wyschnięcia.
    10. Próbki po ultrawirowaniu przechowuj w lodzie.
  9. Ostrożnie oddziel nadsącz od osadu, odwracając probówkę do jednorazowej probówki wirówkowej 15 mL.
    UWAGA: Nadsącz zawierający nieenkapsulowane białko przechowuj w temperaturze 4 °C. Zostanie on wykorzystany do określenia wydajności enkapsulacji. Osad ma postać przezroczystej galaretki.
  10. Resuspenduj osad zawierający enkapsulowane białko w buforze solnym HEPES (3 mL 1x HBS).
    UWAGA: Roztwór stokowy HBS 2x przygotowuje się poprzez rozpuszczenie następujących ilości reagentów w wodzie destylowanej: 140 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4, 50 mM HEPES, a następnie dostosowanie pH do 7,4 i końcowej objętości do 100 mL. Na2HPO4 można zastąpić NaHCO3 lub pominąć, aby uniknąć interferencji, jeśli planowane jest oznaczenie stężenia liposomów. Roztwór stokowy HBS 2x należy rozcieńczyć wodą destylowaną do uzyskania HBS 1x przed użyciem.

2. Wydajność enkapsulacji

UWAGA: Wydajność enkapsulacji należy określić zgodnie z protokołem Petersona17, aby uniknąć interferencji lipidów podczas oznaczania ilości białka. Wszystkie próbki (standardy BSA i nadsącz z liposomów) powinny być analizowane w trzech powtórzeniach. Należy również przygotować próbkę ślepą.

  1. Przygotowanie odczynników macierzystych i roztworów roboczych17
    1. W celu przygotowania odczynników macierzystych, sporządzić roztwór miedziowo-tatronianowo-węglanowy (CTC) poprzez zmieszanie 10 mL 20% węglanu sodu, 200 µL 0,1% siarczanu miedzi oraz 200 µL 0,2% tatronianu potasu z 9,6 mL wody destylowanej. Przygotować 100 mL 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) oraz 0,8 N wodorotlenku sodu (NaOH).
    2. W celu przygotowania roztworów roboczych, sporządzić 10 mL 0,15% deoksycholanu sodu (DOC) oraz 72% kwasu trójchlorooctowego (TCA). Rozpuścić 10 mg albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 10 mL wody destylowanej w celu uzyskania roztworu standardowego o stężeniu 1 mg/mL. Przygotować odczynnik A, dodając równe części CTC, NaOH, SDS i H2O. Przygotować odczynnik B poprzez rozcieńczenie odczynnika fenolowego Folina-Ciocalteu w stosunku 1:5 wodą destylowaną.
      UWAGA: Na każdą probkę reakcyjną wymagany jest 1 mL odczynnika A oraz 0,5 mL odczynnika B. Aby określić końcowe objętości odczynników A i B, należy najpierce zdefiniować liczbę probek reakcyjnych, uwzględniając trzy różne stężenia BSA, próbę ślepą oraz próbki w trzech powtórzeniach. Odczynnik A musi zostać dobrze zhomogenizowany przed użyciem i może być przechowywany w temperaturze 25 °C (RT) przez 2 tygodnie. Odczynnik B jest również stabilny w temperaturze 25 °C (RT), jeśli jest przechowywany w brązowym szkle.
  2. Wytrącanie
    UWAGA: Ten etap jest wykonywany w probówkach do mikrocentryfugi.
    1. Rozcieńczyć supernatant liposomów wodą do końcowej objętości 1 mL, tak aby zawierał 5-100 µg białka.
      UWAGA: Probówkę ślepą należy wypełnić 1 mL wody destylowanej.
    2. Dodać 0,1 mL 0,15% DOC, zhomogenizować za pomocą wortexa i inkubować przez 10 min w RT.
    3. Dodać 0,1 mL 72% TCA, dobrze wymieszać i wirować przy 3 000 x g w RT przez 15 min.
      UWAGA: DOC-TCA sprzyja wytrącaniu białek, tworząc dwie wyraźne fazy. Białko docelowe można odzyskać poprzez wirowanie, unikając interferencji lipidów.
    4. Ostrożnie usunąć supernatant, odwracając probówkę w dół i kładąc ją na papierze chłonnym. Osad zachować do następnego etapu.
      UWAGA: Osad może być bardzo trudny do zauważenia, jednak probówkę należy odwrócić nawet jeśli osad nie jest widoczny.
  3. Spektrofotometria
    1. Zawiesić osad otrzymany w kroku 2.2.4 w 1 mL wody destylowanej. Mieszać dokładnie, aby upewnić się, że osad został rozpuszczony, a następnie przenieść próbkę do nowej probówki.
    2. Przygotować rozcieńczenia standardów albuminy (BSA) do końcowej objętości 1 mL.
      UWAGA: Standardy białek muszą mieć stężenie od 5-100 µg/mL.
    3. Dodać 1 mL odczynnika A do probówek z kroków 2.3.1 i 2.3.2 bez wyjątków, dobrze wymieszać i inkubować przez 10 min w RT.
      UWAGA: SDS może niwelować ewentualne interferencje lipidów, pomagając jednocześnie w solubilizacji białek.
    4. Dodać 0,5 mL odczynnika B do probówek z kroków 2.3.1 i 2.3.2, dobrze wymieszać i inkubować przez 30 min w RT, chroniąc przed światłem.
      UWAGA: Odczynnik fenolowy Folina-Ciocalteu jest mieszaniną fosforanu molibdenu i fosforanu wolframu, używaną do analiz kolorymetrycznych niektórych związków zawierających azot, takich jak białka. Kompleksowanie miedzi zwiększa reaktywność fenoli w stosunku do tego odczynnika, tworząc kompleks niebiesko-fioletowy w zależności od stężenia białka.
    5. Wyznaczyć absorbancję przy 750 nm za pomocą spektrofotometru.
    6. Obliczyć stężenie białka w supernatancie na podstawie krzywej standardowej w następujący sposób:
      1. Wykreślić wartość absorbancji (Abs) w funkcji stężenia BSA (mg/mL), aby uzyskać współczynnik kątowy (k), przyjmując linię trendu liniowego.
      2. Wyznaczyć stężenie białka w supernatancie (C) poprzez stosunek wartości absorbancji do współczynnika kątowego (k), a następnie pomnożyć przez objętość całkowitą zgodnie z poniższym wzorem:
        C=Abs/k×objętość supernatantu, wzór na stężenie; stosowany w analizie spektroskopowej, schemat.
  4. Wyznaczyć efektywność enkapsulacji zgodnie z następującym wzorem:
    Wzór na efektywność enkapsulacji; równanie obliczania ładunku białka w analizie badawczej.
  5. gdzie białko załadowane = 10 mg, białko nieenkapsulowane = wartość C otrzymana w kroku 2.3.6.2.
    UWAGA: W tym przypadku do przeprowadzenia procedury enkapsulacji użyto łącznie 10 mg tariny rozpuszczonej w roztworze siarczanu amonu (1 mg/mL), ponieważ stężenie to jest wystarczające do uzyskania satysfakcjonujących efektów in vitro13,16,18.

3. Wyznaczanie wielkości i stabilności

UWAGA: Rozkład wielkości i indeks polidyspersyjności (PdI) preparatów liposomalnych ocenia się za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS). PdI bliski 0,1 wskazuje na homogeniczny preparat. W celu określenia stabilności liposomy należy przechowywać w temperaturze 4 °C i regularnie sprawdzać rozkład wielkości oraz średnią wielkość cząstek.

  1. Włącz urządzenie DLS na 30 min przed użyciem, aby rozgrzać lampę laserową.
  2. Przenieś preparat liposomalny otrzymany w kroku 1.10 do jednorazowej kuwety pomiarowej.
  3. Ustaw parametry urządzenia w następujący sposób: typ dyspergentu = woda (RI = 1.33); materiał = lipidy (RI = 1.45); oraz RT.
  4. Naciśnij Start i poczekaj, aż urządzenie zakończy odczyt.
  5. Wyjmij kuwetę i wyłącz urządzenie.
    UWAGA: Przenieś próbkę z kuwety z powrotem do jednorazowej probówki wirówkowej 15 mL do dalszych analiz lub zutylizuj ją, jeśli dostępna jest wystarczająca ilość materiału do nowych pomiarów.

4. Charakterystyka morfologiczna

UWAGA: Charakterystyka liposomów jest przeprowadzana zgodnie z metodą Murteya i Ramasamya19. Próbki zawierające nanoliposomy otrzymane w kroku 1.10 są przygotowywane w trzech powtórzeniach.

  1. Przymocuj szkiełka nakrywki (średnica 13 mm) do dna szalki Petriego za pomocą dwustronnej taśmy klejącej. Potnij taśmę na małe kawałki (o rozmiarze odpowiednim do przymocowania nakrywek), usuń papier zabezpieczający od spodu i przyklej taśmę do dna szalki Petriego. Za pomocą pęsety usuń papier zabezpieczający z górnej strony taśmy i przymocuj do niej szkiełka nakrywki.
    UWAGA: W kolejnych krokach należy uważać, aby nie odkleić szkiełek nakrywek, i stosować mocną taśmę.
  2. Powlecz szkiełka nakrywki poli-L-lizyną. Umieść mokre papierowe filtry wewnątrz szalki Petriego, aby utrzymać wilgotność, i inkubuj przez 1 h w RT (25 °C).
  3. Po powleczeniu opłucz szkiełka nakrywki wodą destylowaną.
  4. Nanieś na szkiełka nakrywki kroplę próbki z kroku 1.10 i pozostaw do wyschnięcia przez 1 h w RT.
  5. W celu utrwalenia próbek pokryj je 4% glutaraldehydem przygotowanym w 0,1 M buforze fosforanowym, pH = 7,2. Umieść mokre papierowe filtry wewnątrz szalki Petriego i szczelnie zamknij naczynie, aby utrzymać poziom wilgotności. Inkubuj w 4 °C przez 48 h.
  6. Opłucz szkiełka nakrywki 3x przez 5 min tym samym buforem fosforanowym.
  7. Odwodnij próbki w następujący sposób: 35% etanol 1x przez 15 min, 50% etanol 1x przez 15 min, 75% etanol 1x przez 15 min, 95% etanol 2x przez 15 min oraz etanol bezwodny 3x przez 20 min.
  8. Osusz chemicznie próbki poprzez dwukrotne zanurzenie w 1−2 mL heksametylodisilazanu (HMDS) przez 10 min.
    UWAGA: HMDS należy manipulować ostrożnie wewnątrz dygestorium. Próbki powinny schnąć przez noc wewnątrz eksykatora lub w dygestorium w RT.
  9. Zamocuj wysuszone próbki na uchwycie (stub) za pomocą przewodzącej węglowej taśmy klejącej.
  10. Napyl wówczas w próżni powierzchnię szkiełka nakrywki warstwą przewodzącą elektrycznie (grubość 20 nm) z złoto-palladu.
  11. Wykonaj obrazowanie za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) w trybie niskiej próżni i niskim napięciu (20 kV).

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia przygotowanie nanoliposomów16,20,21. Fosfolipidy: 1,2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino(glikol polietylenowy)-2000] (sól amonu; DSPE-MPEG 2000) oraz cholesteryllohemisukcynian (CHEMS), będące głównymi składnikami liposomów, rozpuszczono najpierw w chloroformie w celu uzyskania filmu lipidowego. Następnie film lipidowy rehydratowano w roztworze siarczanu amonu zawierającym białko hydrofilowe (tarinę) przeznaczone do enkapsulacji, a inkubację prowadzono przez noc. Następnie zastosowano techniki sonikacji i ekstruzji w celu wytworzenia małych pęcherzyków jednowarstwowych. Etap ultrawirowania pozwolił na oddzielenie preparatu liposomalnego od wolnych lipidów i nieenkapsulowanego białka, natomiast nadsącz wykorzystano do oznaczenia wydajności enkapsulacji.

Nanoliposomy otrzymane przy użyciu wyżej opisanej metody charakteryzowały się rozkładem wielkości w zakresie 51−396 nm i średnią wielkością 155 nm (Tabela 2). Preparat był homogeniczny, ponieważ indeks polidyspersyjności wynosił 0,168. Wysoką wydajność enkapsulacji na poziomie 83% można osiągnąć, jeśli liposomy zostaną poddane ekstruzji przez membranę o rozmiarze porów 0,2 µm (Tabela 2).

Charakterystykę morfologiczną nanoliposomów oceniono za pomocą SEM. Rysunek 2A,B przedstawia okrągłe pęcherzyki liposomalne o rozmiarach rzędu 121 nm, analizowane przy 20 kV, natomiast Rysunek 2C,D przedstawia próbki przygotowane w sposób nieprawidłowy. Nanoliposomy suszono w powietrzu bez uprzednej fiksacji ani jakiejkolwiek innej obróbki opisanej w niniejszym badaniu. W rezultacie zaobserwowano większe i uszkodzone pęcherzyki o rozmiarach rzędu 332 µm, analizowane przy 5 kV.

Schemat procesu formułowania liposomów z wykorzystaniem odparowania organicznego, rehydratacji, sonikacji i ekstruzji.
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie przygotowania nanoliposomów. DOPE, PEG i CHEMS, główne składniki liposomów, zostały najpierw rozpuszczone w chloroformie w celu uzyskania filmu lipidowego (1, 2, 3). Następnie film lipidowy poddano rehydratacji w buforze solnym zawierającym hydrofilowe białko (tarynę) do zamknięcia, a inkubację przeprowadzono przez noc (4). Następnie zastosowano techniki sonikacji i ekstruzji w celu wytworzenia SUV (5, 6). Etap ultrawirowania oddzielił preparat liposomalny od wolnych lipidów i nieinkapsulowanego białka, natomiast supernatant wykorzystano do oznaczenia wydajności enkapsulacji (7). Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Correa et al.16. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia próbek odpowiednich i nieodpowiednich; porównanie nanostruktur; obrazy SEM do analizy laboratoryjnej.
Rycina 2: Fotomikroskopia nanoliposomów metodą SEM. (A,B) Obrazy okrągłych pęcherzyków liposomalnych o rozmiarach w zakresie 121 nm, analizowane przy napięciu 20 kV. (C,D) Obrazy nieprawidłowo przygotowanych próbek. Niewłaściwie potraktowane próbki pozwoliły na zaobserwowanie większych i/lub uszkodzonych pęcherzyków, które nie wytrzymują warunków próżni i/lub napięcia 5 kV. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Correa et al.16. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Składniki liposomówMasa (g)Stężenie (mM)Objętość końcowa
DOPE0.04205.710 mL
MPEG 2000-DSPE0.10593.8
CHEMS0.00240.5

DOPE – 1,2-dioleoylo-sn-glicerol-3-fosfoetanolamina); MPEG 2000-DSPE – 1,2-distearylo-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [amino (glikol polietylenowy)-2000] (sól amonowa); CHEMS – hemisukcynian cholesterylu.

Tabela 1: Przygotowanie liposomalnych nanokapsułek z tarinem.

Rozmiar porów membrany (µm)Rozkład wielkości (nm)Średnia wielkość (nm)Wskaźnik polidyspersyjności (PdI)Peak (nm)Wydajność enkapsulacji
0.251 - 3961550. 16894 ± 390.83

Wielkość oraz indeks polidyspersyjności oceniono za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, natomiast wydajność enkapsulacji określono zgodnie z metodą Petersona17.

Tabela 2: Rozmiar, indeks polidyspersyjności i wydajność enkapsulacji preparatu nanoliposomów.

Dyskusja

Opisany w niniejszym dokumencie protokół został przetestowany przez Correa i wsp.16 w celu enkapsulacji taryny, immunomodulującej i przeciwnowotworowej lektyny oczyszczonej z Colocasia esculenta22. Metodologia ta przyniosła pomyślne wyniki, co pozwoliło na produkcję stabilnych nanoliposomów o rozmiarach odpowiednich do zastosowań terapeutycznych. Preparat charakteryzuje się kontrolowanym uwalnianiem na różnych poziomach pH w warunkach fizjologicznych. Nasila również właściwości farmakologiczne taryny, takie jak hamowanie linii komórkowych ludzkiego glejaka U-87 MG i raka piersi MDA-MB-231 oraz stymulację komórek szpiku kostnego myszy. Preparat liposomalny nie wykazywał działania toksycznego w zdrowych komórkach myszy16.

Klasyczna metoda, po raz pierwszy opisana przez Banghama i wsp.7, pozwala na wytwarzanie dużych wielopłytkowych pęcherzyków liposomowych, niejednorodnych pod względem wielkości i kształtu. Adaptacje tej metody, jak opisano w niniejszym badaniu, są z powodzeniem stosowane poprzez włączenie dodatkowych etapów, takich jak sonikacja i wytłaczanie przez membranę poliwęglanową o grubości 0,2 μm. Pozwala to na uzyskanie bardziej jednorodnej dyspersji pod względem wielkości w zakresienanometrów 16,23,24. Dlatego, aby zapewnić pomyślne wyniki, należy ściśle przestrzegać opisanego tutaj protokołu enkapsulacji i preparatu liposomalnego.

Skład nanoliposomów został starannie dobrany, aby zapewnić utworzenie dwuwarstwowej membrany, której głównymi składnikami są DOPE, MPEG 2000-DSPE i CHEMS. Są to naturalne składniki dwuwarstwowe błony zwierzęcej, które mogą nadawać płynność architekturze nanoliposomów, zapewniając szerokie zastosowanie w dostarczaniu związków bioaktywnych u ludzi.

Pegylacja nanoliposomów jest niezbędna do zagwarantowania stabilności struktury liposomów. Brak PEG prowadzi do powiększenia rozmiaru, wysokiego wskaźnika polidyspersyjności i niskiej skuteczności uwięzienia. Optymalne wyniki można uzyskać stosując DOPE jako główny składnik liposomów. Jest to jednak kosztowny fosfolipid. Koszty finansowe produkcji nanoliposomów można osiągnąć poprzez zastąpienie DOPE innymi podobnymi lipidami, takimi jak DOPC (1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina). CHEMS to cząsteczka cholesterolu naturalnie występująca w błonach komórek zwierzęcych, której nie należy wykluczać z preparatu, ponieważ ważne jest zapewnienie płynności i plastyczności dwuwarstwy lipidowej16.

Inne aspekty protokołu enkapsulacji również mogą zostać dostosowane. Chloroform używany do rozpuszczania składników liposomalnych można łatwo zastąpić metanolem bez wpływu na średnią wielkości, jednorodność i skuteczność uwięzienia. Jednakże podczas przechowywania w temperaturze poniżej 4 °C16 może dojść do pewnego wycieku białka. Etap inkubacji przez noc z roztworem siarczanu amonu zawierającym tarynę nie jest obowiązkowy; jednak dla wygody można go wykonać bez uszkodzenia nanoliposomalnych cech biofizycznych, enkapsulacji lub utraty wydajności stabilności, jak wykazano przez Correa i wsp.16. Etap wytłaczania odbywa się w temperaturze pokojowej, co może zmniejszyć natężenie przepływu między strzykawkami, jeśli używana jest membrana o wielkości porów 0,1 μm.

Aby rozwiązać ten problem, należy rozważyć zastosowanie membrany o wielkości porów 0,2 μm lub podgrzanie uchwytu ekstrudera powyżej temperatury przemiany lipidowej. Analityk musi uważać, aby nie uszkodzić lipidów lub białek, które mogą zostać dezaktywowane i stracić aktywność biologiczną. Alternatywnie, preparat liposomalny można dializować przeciwko HBS zamiast ultrawirowania, przy użyciu membrany odcinającej zgodnie z masą cząsteczkową białka. Wybór chemicznego charakteru buforu, w którym zawieszone są nanoliposomy po ultraodwirowaniu, jest bezpośrednio związany z jego późniejszym zastosowaniem. Ponieważ perspektywy tego badania obejmują testy in vivo i in vitro, zawiesina w buforowanym roztworze soli fizjologicznej HEPES była wystarczająca, aby zapewnić brak działania cytotoksycznego i zakres pH zbliżony do warunków fizjologicznych.

Liposomy powinny być dokładnie traktowane, podobnie jak żywe komórki, aby uzyskać obrazy SEM o wyższej jakości. Procedury utrwalania i suszenia są ważne, aby zapewnić wizualizację mniejszych, nienaruszonych pęcherzyków, które utrzymują wartości wyższe niż 20 kV w warunkach próżni. Rysunek 2A,B przedstawia pęcherzyki o rozmiarach nano zgodne z procedurą ekstruzji. Wizualizacja pęcherzyków w zakresie od 51 do 396 nm jest możliwa, jeśli zostanie przeprowadzone odpowiednie przygotowanie próbki zgodnie z tą procedurą. Etapy obejmują utrwalanie, suszenie poprzez zwiększanie stężenia etanolu i odwadnianie chemiczne, aby uniknąć tworzenia się agregatów i pękniętych pęcherzyków spowodowanych przez próżnię i wiązkę elektronów. Z drugiej strony, rysunek 2C,D przedstawia pęcherzyki liposomowe wysuszone w temperaturze pokojowej i niepoddane żadnym opisanym tu zabiegom, co oznacza, że zostały przygotowane nieodpowiednio. W wyniku nieodpowiedniej procedury powstają gigantyczne pęcherzyki, nawet po wytłoczeniu przez membranę o wielkości porów 0,2 μm. W obu panelach obserwuje się również pęknięte pęcherzyki w wyniku uszkodzenia przez próżnię i wiązkę elektronów.

Pęcherzyki nanoliposomowe zostały zbadane jako system enkapsulacji i dostarczania cząsteczek hydrofobowych, w tym resweratrolu (3,5,4'-trihydroksystylbenu), bioaktywnego związku przeciwko komórkom raka jelita grubego. Procedura enkapsulacji może przezwyciężyć słabą rozpuszczalność związków lipofilowych, a także zapewnić biokompatybilność, biodegradowalność, nieimmunogenność i nietoksyczność charakterystyczne dla nanokapsułek liposomowych25. W zależności od drogi i celu podawania należy wziąć pod uwagę adaptacje protokołu, takie jak opracowanie nowych preparatów liposomów do podawania doustnego.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy są wdzięczni obiektom COPPE/UFRJ, Laboratorium Mikroskopii Elektronicznej oraz Laboratorium Charakteryzacji Materiałów Multiuser; Dr. Adalberto Vieyra, Dr. Jennifer Lowe i Rafael Lindoso, profesorowie z Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brazylia, za korzystanie z ultrawirówki; Dr. Alexandre Guedes Torres i Daniel Perrone, profesorowie z Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brazylia, do stosowania parownika obrotowego; profesorowi Rolandowi Bodmeierowi i dr. Andrijowi Daszewskiemu z Freie Universität w Berlinie, którzy pomogli w przygotowaniu zasobów, dostarczyli nowe metodologie i nadzorowali ACNTF podczas 6-miesięcznego stypendium Erasmus+ w Niemczech; dr Rossanie Thiré i Aline Fernandes, profesorowi i technikowi na Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brazylia, w celu stosowania Zetasizer Malvern; Blumie Guenther i Taissie Rodrigues, profesorowi i technikowi na Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brazylia, w celu korzystania z SEM; dr Rachel Ann Hauser Davis, badaczce z Fundação Oswaldo Cruz, za narrację. Badanie to zostało częściowo sfinansowane przez Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, Brazylia (CAPES) - Kod finansowy 001 (grant nr 1627392; 1811605); Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (grant nr E-26/202.815/2018); E-26/202.815/2018; E-26/203.039/2015 i E-26/202.860/2016); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (grant nr 406601/2018-6) oraz Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Siarczan amonuSigma-Aldrich CoA4418
Analitycal Ballance Mettler H10TwMettler Inc.417870
Spektrofotometr Beckman DU-640Beckman Coulter8043-30-1090
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-Aldrich Co5470
BUCHI Rotavapor R-300 Parownik obrotowy ze sterownikiem i pompą V-300Thermo Fischer Scientific05-001-022PM
CHEMS (cholesterol hemisbursztynian)Sigma-Aldrich CoC6512
ChloroformSigma-Aldrich Co48520-UUWAGA
Siarczan miedzi (II) (pentahydrat)Sigma-Aldrich Co209198
Szkiełka nakrywkowe (średnica 13 mm)Thermo Scientific NuncEW-01839-00
DOPE (1,2-dioleoilo-sn-glicerol-3-fosfoetanoloamina)Lipoid GMBH565600.1
Etanol AbsoluteSigma-Aldrich Co32205
Odczynnik fenolowy Folin -CiocalteuSigma-Aldrich CoF9252
Aldehyd glutarowySigma-Aldrich CoG5882
HEPESSigma-Aldrich CoH3375
Hexamethyldisilazan (HMDS)Sigma-Aldrich Co440191CAUTION
JEOL JSM-6460 LV Mikroskop elektronowy do sacnninguJEOL LTD
Mini ekstruder 7Avanti Polar Lipids610000
MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-[amino(glikol polietylenowy)-2000] (sól amonowa) LipoidGMBH588200.1
Optima L-90k UltrawirówkaBeckman CoulterPN LL-IM-12AB
Bufor fosforanowySigma-Aldrich CoP3619
Poli-L-lizynaSigma-Aldrich CoP8920
Jednozasadowy L-winian potasuSigma-Aldrich Co243531
Węglan soduSigma-Aldrich CoS7795
Chlorek soduSigma-Aldrich CoS7653
Deoksycholan sodu (DOC)Sigma-Aldrich CoD6750
Dodecylowy siarczan soduSigma-Aldrich CoL3771
Wodorotlenek soduSigma-Aldrich CoS8045
Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodnySigma-Aldrich CoRES20908-A7
TESCAN VEGA 3 Skaningowy mikroskop elektronowyTescan#657874
Kwas trichlorooctowy (TCA)Sigma-Aldrich Co91230
Zetasizer Nano ZSPMalvern Panalytical LTD
Ultradźwiękowa wanna czyszcząca model 2510Branson

Bibliografia

  1. Wang, X., Wang, Y., Chen, Z. G., Shin, D. M. Advances of cancer therapy by nanotechnology. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 41 (1), 1(2009).
  2. Keller, B. C. Liposomes in nutrition. Trends in Food Science & Technology. 12 (1), 25-31 (2001).
  3. Frézard, F., Schettini, D. A., Rocha, O. G., Demicheli, C. Lipossomas: propriedades físico-químicas e farmacológicas, aplicações na quimioterapia à base de antimônio. Quimica Nova. 28 (3), 511-518 (2005).
  4. Ferreira, D. dS., Lopes, S. C. dA., Franco, M. S., Oliveira, M. C. pH-sensitive liposomes for drug delivery in cancer treatment. Therapeutic Delivery. 4 (9), 1099-1123 (2013).
  5. Papachristos, A., Pippa, N., Ioannidis, K., Sivolapenko, G., Demetzos, C. Liposomal forms of anticancer agents beyond anthracyclines: present and future perspectives. Journal of Liposome Research. 25 (2), 166-173 (2015).
  6. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 8 (1), 102(2013).
  7. Bangham, A., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), 238-252 (1965).
  8. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4194-4198 (1978).
  9. Batzri, S., Korn, E. D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 298 (4), 1015-1019 (1973).
  10. Zumbuehl, O., Weder, H. G. Liposomes of controllable size in the range of 40 to 180 nm by defined dialysis of lipid/detergent mixed micelles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 640 (1), 252-262 (1981).
  11. Szebeni, J., et al. Oxidation and denaturation of hemoglobin encapsulated in liposomes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 798 (1), 60-67 (1984).
  12. Coelho, J. F., et al. Drug delivery systems: Advanced technologies potentially applicable in personalized treatments. EPMA Journal. 1 (1), 164-209 (2010).
  13. Pereira, P. R., et al. Purification and characterization of the lectin from taro (Colocasia esculenta) and its effect on mouse splenocyte proliferation in vitro and in vivo. The Protein Journal. 33 (1), 92-99 (2014).
  14. Pereira, P. R., et al. Structural analysis and binding properties of isoforms of tarin, the GNA-related lectin from Colocasia esculenta. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1854 (1), 20-30 (2015).
  15. Pereira, P. R., et al. High-resolution crystal structures of Colocasia esculenta tarin lectin. Glycobiology. 27 (1), 50-56 (2016).
  16. Correa, A., Vericimo, M. A., Dashevskiy, A., Pereira, P. R., Paschoalin, V. M. F. Liposomal Taro Lectin Nanocapsules Control Human Glioblastoma and Mammary Adenocarcinoma Cell Proliferation. Molecules. 24 (3), 471(2019).
  17. Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
  18. Merida, L. A., et al. Tarin stimulates granulocyte growth in bone marrow cell cultures and minimizes immunosuppression by cyclo-phosphamide in mice. PLoS ONE. 13 (11), e0206240(2018).
  19. Murtey, M. D., Ramasamy, P. Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy - Life Sciences. Modern Electron Microscopy in Physical and Life Sciences. Janecek, M., Kral, R. , InTechOpen. (2016).
  20. Andrade, C. A., Correia, M. T., Coelho, L. C., Nascimento, S. C., Santos-Magalhães, N. S. Antitumor activity of Cratylia mollis lectin encapsulated into liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 278 (2), 435-445 (2004).
  21. dos Santos Ferreira, D., et al. Development of a bone-targeted pH-sensitive liposomal formulation containing doxorubicin: physicochemical characterization, cytotoxicity, and biodistribution evaluation in a mouse model of bone metastasis. International Journal of Nanomedicine. 11, 3737(2016).
  22. Pereira, P. R., Corrêa, A. C. N. T. F., Vericimo, M. A., Paschoalin, V. M. F. Tarin, a Potential Immunomodulator and COX-Inhibitor Lectin Found in Taro (Colocasia esculenta). Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 17 (4), 878-891 (2018).
  23. Olson, F., Hunt, C., Szoka, F., Vail, W., Papahadjopoulos, D. Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 557 (1), 9-23 (1979).
  24. Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. Extrusion technique to generate liposomes of defined size. Methods in Enzymology. 367, 3(2003).
  25. Soo, E., et al. Enhancing delivery and cytotoxicity of resveratrol through a dual nanoencapsulation approach. Journal of Colloid and Interface Science. 462, 368-374 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przygotowanie nanoliposom whydratacja filmu lipidowegodynamiczne rozpraszanie wiat askaningowa mikroskopia elektronowawydajno inkluzyjno ciultrawirowanieekstruzja z sonikacjsiarczan amonuenkapsulacja bia ekcharakterystyka liposom w
Otrzymywanie i charakterystyka nanoliposomów do uwięzienia bioaktywnych hydrofilowych białek kulistych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.