Otrzymywanie i charakterystyka nanoliposomów do uwięzienia bioaktywnych hydrofilowych białek kulistych

Podsumowanie

To badanie opisuje klasyczną hydratację przy użyciu metody cienkiego filmu lipidowego do przygotowania nanoliposomów, a następnie charakterystyki nanocząstek. Hydrofilowe i globularne białko o masie 47 kDa, taryna, jest z powodzeniem kapsułkowane jako strategia poprawiająca stabilność, unikająca szybkiego klirensu i promująca kontrolowane uwalnianie. Metoda może być dostosowana do enkapsulacji cząsteczek hydrofobowych.

Streszczenie

Nanokapsułki liposomowe były stosowane do wielu celów w przemyśle farmaceutycznym, kosmetycznym i spożywczym. Atrybuty liposomów obejmują ich biokompatybilność, biodegradowalność, nieimmunogenność, nietoksyczność oraz zdolność do zatrzymywania zarówno związków hydrofilowych, jak i hydrofobowych. Klasyczne uwodnienie cienkich warstw lipidowych w rozpuszczalniku organicznym jest tutaj stosowane jako technika kapsułkowania taryny, lektyny roślinnej, w nanoliposomach. Szczegółowo opisano wielkość nanoliposomów, stabilność, skuteczność uwięzienia i charakterystykę morfologiczną. Nanoliposomy przygotowuje się przy użyciu 1,2-dioleoilo-sn-glicerolu-3-fosfoetanoloaminy (DOPE), 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy-N-[amino(glikolu polietylenowego)-2000] (soli amonowej; DSPE-MPEG 2000) i cholesterylhemibursztynian (CHEMS) jako główne składniki. Lipidy są najpierw rozpuszczane w chloroformie w celu uzyskania cienkiego filmu lipidowego, który jest następnie ponownie hydratelizowany w roztworze siarczanu amonu zawierającym białko, które ma być uwięzione i inkubowane przez noc. Następnie stosuje się techniki sonikacji i ekstruzji w celu wygenerowania nanorozmiarów pęcherzyków jednowarstwowych. Wielkość i wskaźnik polidyspersyjności nanopęcherzyków określa się za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, natomiast morfologię nanopęcherzyków ocenia się za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Skuteczność uwięzienia zależy od stosunku ilości niekapsułkowanego białka do pierwotnej ilości początkowo załadowanego białka. Uzyskuje się liposomy jednorodne o średniej wielkości 155 nm i wartości wskaźnika polidyspersyjności 0,168. Osiągana jest wysoka skuteczność uwięzienia wynosząca 83%.

Wprowadzenie

Liczba badań nad skutecznymi systemami dostarczania leków wzrosła w ostatnich latach. Jednak ograniczenia, takie jak szybki klirens, słaba biodystrybucja i rozpuszczalność przy fizjologicznym pH oraz niewystarczający wychwyt komórkowy, nadal muszą zostać przezwyciężone. Zastosowanie nanosystemów pojawiło się wraz z niedawnym postępem w terapii raka, stosowanej w celu zwiększenia wewnątrzkomórkowego stężenia leków wewnątrz komórek rakowych przy jednoczesnym zminimalizowaniu toksyczności w zdrowych komórkach. Co więcej, nanocząstki uzyskane z innego zakresu materiałów (tj. polimerów, dendrymerów, liposomów, wirusów, nanorurek węglowych i metali, takich jak tlenek żelaza i złoto) są obecnie stosowane w celu wzmocnienia działania przeciwnowotworowego i zmniejszenia toksyczności ogólnoustrojowej¹. W szczególności nanokapsułki liposomowe znalazły zastosowanie w wielu celach w przemyśle farmaceutycznym, kosmetycznym i spożywczym. W ostatnich latach różne produkty nutraceutyczne, takie jak witaminy, enzymy i ekstrakty ziołowe, zostały opracowane przy użyciu technologii liposomów².

Liposomy to kuliste pęcherzyki składające się z jednej lub więcej koncentrycznych dwuwarstw lipidowych, spontanicznie powstałych w wyniku rozproszenia fosfolipidów w środowisku wodnym^3,4. Polarne głowy fosfolipidów znajdują się na zewnętrznej i wewnętrznej powierzchni błon, w kontakcie ze środowiskiem wodnym. W przeciwieństwie do tego, łańcuchy kwasów tłuszczowych tworzą hydrofobowy rdzeń membran i są chronione przed wodą⁵. Niektóre cechy liposomów, które czynią je atrakcyjnymi systemami dostarczania leków, obejmują ich biokompatybilność, biodegradowalność, nieimmunogenność, nietoksyczność i zdolność do uwięzienia zarówno związków hydrofilowych, jak i hydrofobowych⁶.

Liposomy mogą być przygotowywane za pomocą różnych etapów procesów, takich jak mieszanie, sonikacja, ekstruzja, liofilizacja, zamrażanie i rozmrażanie. Klasyczne metody obejmują odparowywanie w odwrotnej fazie, wstrzykiwanie rozpuszczalnika i dializę detergentów. Najczęściej stosowaną metodą jest uwodnienie cienkiego filmu lipidowego, znane również jako metoda Banghama, która służy do uzyskiwania pęcherzykowo-lipidowych form^7,8,9,10,11. Lameloliczność (liczba dwuwarstw fosfolipidowych) i wielkość cząstek są klasycznymi parametrami stosowanymi do scharakteryzowania liposomów jako: 1) pęcherzyki jednowarstwowe (ULV), utworzone przez unikalną dwuwarstwę fosfolipidową i różniące się wielkością w następujący sposób: i) małe pęcherzyki jednowarstwowe (SUV, ~0,02-0,20 μm), ii) duże pęcherzyki jednowarstwowe (LUVs, ~0,2-1,0 μm), oraz iii) gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe (GUVs, >1 μm); lub 2) pęcherzyki wieloblaszkowe (MLV, >0,1 μm)^3,12. Rozmiar pęcherzyków jest ważnym parametrem przy rozważaniu zastosowania terapeutycznego, takiego jak leczenie raka, w którym rozmiary <200 nm są idealne, aby umożliwić nanopęcherzykom przekroczenie bariery śródbłonka i dotarcie do tkanek nowotworowych⁴.

W tym miejscu, procedura enkapsulacji następująca po klasycznym uwodnieniu techniką cienkiego filmu lipidowego⁷ została opisana przy użyciu taryny, lektyny roślinnej charakteryzowanej jako hydrofilowe białko globularne^13,14,15. Pęcherzyki o rozmiarach nano są wytwarzane przez włączenie etapów sonikacji i ekstruzji do głównej techniki, co skutkuje stabilnymi liposomalnymi nanopęcherzykami o wysokiej skuteczności uwięzienia¹⁶.

Protokół

1. Przygotowanie nanokapsułek liposomalnych taryny¹⁶

UWAGA: Wszystkie preparaty powinny być przygotowane w trzech egzemplarzach, aby uzyskać większą objętość (7 ml) i umożliwić odwirowanie próbki w ultrawirówce (szczegóły poniżej).

1. Zważyć składniki liposomu za pomocą wagi analitycznej, jak pokazano w tabeli 1.
2. Rozpuść składniki lipidowe w chloroformie za pomocą kolby miarowej o pojemności 250 ml, która pasuje do wyparki obrotowej, aby uniknąć strat materiału.
3. Mieszaj mieszaninę przy 150 obr./min przez 15 min.
4. Usunąć chloroform za pomocą wyparki obrotowej w następujących warunkach:
   1. Ustawić otwór kolby miarowej w standardowej pozycji (25°), aby uzyskać optymalną wydajność, w kontakcie z wodą z łaźni grzewczej.
      UWAGA: Ramię urządzenia powinno być nachylone pod kątem 25°, aby utrzymać kontakt między kolbą miarową a łaźnią wodną, nie wpływając jednocześnie na wydajność parowania ani nie uszkadzając próbki. Standardowa pozycja może się różnić w zależności od marki sprzętu.
   2. Ustawić temperaturę skraplacza na minimum 3 °C.
   3. Ustawić temperaturę łaźni grzewczej na 40 ± 1 °C.
   4. Ustaw obroty na 120 obr./min.
   5. Ustaw podciśnienie do 207 mbar i temperaturę wrzenia do 20 °C.
   6. Po ~25 minutach wyjąć kolbę i wyrzucić odparowany rozpuszczalnik, pozostający w skraplaczu, odpowiednio.
      UWAGA: Na tym etapie tworzy się cienka i nieprzezroczysta folia składająca się ze składników liposomowych, którą można łatwo zwizualizować. Odparowany rozpuszczalnik pozostały w skraplaczu musi być przechowywany w pojemnikach do utylizacji (chlorowany), aby specjalistyczna firma mogła się z nim utylizować w celu odpowiedniego wyrzucenia.
5. Uwodnić warstwę lipidową, aby osiągnąć stężenie 0,01 M lipidów w 0,3 M roztworze siarczanu amonu (pH = 7,4) zawierającym tarynę w stężeniu 1 mg/ml do końcowej objętości 10 ml.
   1. Mieszać mieszaninę przez 40 minut i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Ten krok można uznać za punkt zatrzymania. Inkubacja przez noc nie jest obowiązkowa.
6. Po inkubacji sonikować zawiesinę przez 1 minutę w temperaturze 25 °C (temperatura pokojowa; RT) w celu zmniejszenia rozmiaru pęcherzyków i uniknięcia agregacji.
   UWAGA: Zmniejszenie rozmiaru przeprowadzono w ultradźwiękowym sonikatorze w następujących warunkach: 130 W i 40 kHz.
7. Wykonaj 12-cyklową ekstruzję przez poliwęglanową membranę porową 0,2 μm.
   UWAGA: Przed procesem wytłaczania przetestuj zespół mini-ekstrudera za pomocą wody, aby uniknąć wycieku próbki. Odpowiednia jest również membrana porowa 0,1 μm. W takim przypadku należy podgrzać wstępnie uchwyt mini-ekstrudera powyżej temperatury przemiany lipidów, aby ułatwić wytłaczanie, przy jednoczesnym zachowaniu właściwości fizykochemicznych zarówno lipidów, jak i białek.
   1. Zamontuj części mini ekstrudera, zgodnie z opisem w instrukcji producenta.
   2. Umieść membranę poliwęglanową między dwoma wstępnie zwilżonymi wspornikami filtra i umieść ją w uchwycie.
   3. Włożyć pustą strzykawkę o pojemności 1 ml do urządzenia, drugą strzykawkę napełnić zawiesiną liposomalną do całkowitej objętości i włożyć ją po przeciwnej stronie.
   4. Wykonaj 12-cyklową ekstruzję przez poliwęglanową membranę porową 0,2 μm. Powoli przepchnąć próbkę z jednej strzykawki do drugiej. Zebrać wytłaczaną zawiesinę do wstępnie schłodzonej rurki.
      UWAGA: Membranę poliwęglanową należy wymieniać tylko wtedy, gdy przenoszenie próbki z jednej strzykawki do drugiej staje się trudne. Zawiesina liposomalna powinna stać się przezroczysta podczas procesu wytłaczania w wyniku zmniejszenia rozmiaru w wyniku powstania SUV-ów. Na tym etapie można stracić około 0,2 ml próbki.
8. Oddziel liposomy przez ultrawirowanie.
   UWAGA: Próbki należy przechowywać w łaźni lodowej do czasu, aż ultrawirówka będzie gotowa do użycia. Oddzielić SUV-y od pozostałych składników i siarczanu amonu przez ultrawirowanie przy użyciu ultrawirówki z wirnikiem obrotowym (patrz szczegóły poniżej).
   1. Zważyć próbkę w tytanowej rurce, która pasuje do wirnika i zrównoważyć probówki. Sprawdź minimalną objętość wymaganą w zależności od użytego wirnika, aby uniknąć uszkodzenia rurek, i w razie potrzeby dostosuj objętość zawiesiny liposomalnej siarczanem amonu.
      UWAGA: Wiadro wahadłowe powinno być zawsze podparte na stojaku, gdy znajduje się poza wirówką, aby uniknąć zarysowania "pasków zebry" (tj. czarno-białych pasków na spodzie), które są używane przez wirówkę do określania prędkości obrotowej.
   2. Włącz odkurzacz przed użyciem wirówki, aby umożliwić jej schłodzenie.
   3. Dopasuj tytanowe rurki do wiadra huśtawki.
      UWAGA: Podnieś rurki do pozycji, którą przyjmują podczas pracy, aby upewnić się, że są idealnie dopasowane.
   4. Zwolnij podciśnienie, otwórz drzwiczki wirówki i umieść wirnik w środku.
      UWAGA: Zwróć uwagę na okrągły znak na spodzie wirnika, który musi pasować w przeciwnym kierunku niż ten sam znak koła do samej wirówki.
   5. Zamknij drzwiczki wirówki, naciśnij Próżnia i poczekaj, aż próżnia osiągnie od 200 do <20 mikronów lub od 26 Pa do <3 Pa.
   6. Dostosuj parametry na wyświetlaczu ultrawirówki do 150 000 x g (co odpowiada 29 600 obr./min dla wyżej wymienionej łyżki obrotowej) przez 90 min w temperaturze 4 °C (przyspieszenie: maks., opóźnienie: maks.).
      UWAGA: Zawsze konwertuj prędkość na x g, jeśli konkretna wirówka jest ustawiona na obroty. Skorzystaj ze strony internetowej wirówki, aby przekonwertować jednostkę zgodnie z zastosowanym wirnikiem.
   7. Naciśnij Przywołaj, sprawdź warunki i naciśnij Start, aby uruchomić.
      UWAGA: Poczekaj, aż wirówka osiągnie żądaną prędkość.
   8. Po 90 minutach zwolnij próżnię, naciskając przycisk próżni i otwórz drzwiczki wirówki, gdy próżnia osiągnie 200-700 mikronów (co odpowiada 26-93 Pa).
   9. Wyłącz wirówkę, wyjmij wirnik od wewnątrz i pozostaw go na stole z wiadrami do wyschnięcia.
   10. Ultraodwirowane próbki należy utrzymywać na lodzie.
9. Ostrożnie oddzielić supernatant od osadu, obracając probówkę do góry nogami w jednorazowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, aby oddzielić supernatant od osadu.
   UWAGA: Przechowywać supernatant zawierający niekapsułkowane białko w temperaturze 4 °C. Zostanie on wykorzystany do określenia skuteczności enkapsulacji. Granulka ma postać półprzezroczystej galaretki.
10. Zawiesić osad zawierający kapsułkowane białko w buforowanym roztworze soli fizjologicznej HEPES (3 ml 1x HBS).
    UWAGA: HBS 2x (roztwór podstawowy) przygotowuje się przez rozcieńczenie następujących ilości odczynników w wodzie destylowanej: 140 mM NaCl, 1,5 mM Na₂HPO₄, 50 mM HEPES, a następnie dostosowanie pH do 7,4 i końcowej objętości do 100 ml. Na₂HPO₄ można zastąpić NaHCO₃lub pominąć, aby uniknąć zakłóceń, jeśli ma być określone stężenie liposomów. Roztwór podstawowy HBS 2x należy rozcieńczyć w wodzie destylowanej w celu uzyskania HBS 1x przed użyciem.

2. Skuteczność enkapsulacji

UWAGA: Określ skuteczność enkapsulacji za pomocą protokołu Petersona¹⁷, aby uniknąć interferencji lipidów w kwantyfikacji białek. Wszystkie próbki (wzorce BSA i supernatant liposomowy) należy przeanalizować w trzech egzemplarzach. Przygotuj również pustą probówkę.

1. Przygotowanie odczynników podstawowych i roztworów roboczych¹⁷
   1. W przypadku odczynników podstawowych należy przygotować węglan miedzi (CTC), mieszając 10 ml 20% węglanu sodu, 200 μl 0,1% siarczanu miedzi, 200 μl 0,2% winianu potasu z 9,6 ml wody destylowanej. Przygotuj 100 ml 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 0,8 N wodorotlenku sodu (NaOH).
   2. Do roztworów roboczych przygotuj 10 ml 0,15% deoksycholanu sodu (DOC) i 72% kwasu trichlorooctowego (TCA). Rozpuścić 10 mg albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 10 ml wody destylowanej, aby otrzymać roztwór wzorcowy o stężeniu 1 mg/ml. Przygotować odczynnik A, dodając równe części CTC, NaOH, SDS i_H2O. Przygotować odczynnik B, rozcieńczając odczynnik fenolowy Folin-Ciocalteu w stosunku 1:5 w wodzie destylowanej.
      UWAGA: Odczynnik A wymaga 1 ml na każdą probówkę reakcyjną, podczas gdy odczynnik B wymaga 0,5 ml. Aby określić końcowe objętości odczynników A i B, należy najpierw określić liczbę probówek reakcyjnych, które mają być użyte, biorąc pod uwagę trzy różne stężenia BSA, próby ślepej i próbek w trzech egzemplarzach. Odczynnik A musi być dobrze zhomogenizowany przed użyciem i może być przechowywany w temperaturze 25 °C (RT) przez 2 tygodnie. Odczynnik B jest również stabilny w temperaturze 25 °C (RT), jeśli jest przechowywany w bursztynowej butelce.
2. Opady
   UWAGA: Ten krok jest wykonywany w probówkach do mikrowirówek.
   1. Rozcieńczyć supernatant liposomów wodą do końcowej objętości 1 ml zawierającej 5-100 μg białka.
      UWAGA: Pustą probówkę należy napełnić 1 ml wody destylowanej.
   2. Dodać 0,1 ml 0,15% DOC, homogenizować przez wirowanie i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Dodać 0,1 ml 72% TCA, dobrze wymieszać i odwirować przy 3 000 x g i RT przez 15 min.
      UWAGA: DOC-TCA wspomaga wytrącanie białek, tworząc dwie odrębne fazy. Białko docelowe można odzyskać przez odwirowanie, unikając interferencji lipidów.
   4. Ostrożnie wyrzucić supernatant, obracając probówkę w dół i kładąc ją na chłonnym papierze. Zachowaj granulkę na następny krok.
      UWAGA: Śrut może być bardzo trudny do zauważenia, ale rurkę należy odwrócić do góry nogami, nawet jeśli nie jest widoczna.
3. Spektrofotometria
   1. Zawiesić osad otrzymany z kroku 2.2.4 w 1 ml wody destylowanej. Dokładnie wymieszaj, aby upewnić się, że osadek jest rozpuszczony i przenieś próbkę do nowej probówki.
   2. Przygotować roztwory wzorców albumin (BSA) do końcowej objętości 1 ml.
      UWAGA: Wzorce białka muszą być przygotowane w przedziale 5-100 μg/ml.
   3. Dodać 1 ml odczynnika A do probówek z kroków 2.3.1 i 2.3.2 bez wyjątku, dobrze wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze RT.
      UWAGA: SDS może złagodzić ewentualne zakłócenia lipidowe, jednocześnie pomagając w rozpuszczaniu białek.
   4. Dodać 0,5 ml odczynnika B do probówek z kroku 2.3.1 i 2.3.2, dobrze wymieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
      UWAGA: Odczynnik fenolowy Follin-Ciocalteu jest mieszaniną fosfomolibdenianu i fosfotangu stosowaną do barwienia kolorymetrycznego niektórych związków zawierających azot, takich jak białka. Kompleksowanie miedzi zwiększa reaktywność fenoli w stosunku do tego odczynnika, wytwarzając kompleks niebiesko-fioletowy w zależności od stężenia białka.
   5. Oznaczyć absorbancję przy długości fali 750 nm za pomocą spektrofotometru.
   6. Obliczyć stężenie białka w supernatancie na podstawie krzywej wzorcowej w następujący sposób.
      1. Wykreślić wartość absorbancji (Abs) w funkcji stężenia BSA (mg/ml), aby uzyskać współczynnik kątowy (k) z uwzględnieniem linii tendencji liniowej.
      2. Oznaczyć stężenie białka sklarowanego nad osadem (C) przez stosunek wartości absorbancji do współczynnika kątowego (k), a następnie pomnożyć przez całkowitą objętość w następujący sposób:
         
4. Określ skuteczność enkapsulacji według następującego wzoru:
   
5. gdzie załadowane białko = 10 mg, białko niekapsułkowane = wartość C uzyskana w kroku 2.3.6.2.
   UWAGA: W tym przypadku do przeprowadzenia procedury enkapsulacji używa się łącznie 10 mg taryny rozpuszczonej w roztworze siarczanu amonu (1 mg/ml), ponieważ stężenie to jest wystarczające do uzyskania zadowalających efektów in vitro^13,16,18.

3. Określanie rozmiaru i stabilności

UWAGA: Rozkład wielkości i wskaźnik polidyspersyjności (PdI) preparatów liposomalnych są oceniane za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS). PdI bliskie 0,1 wskazuje na jednorodny preparat. W celu określenia stabilności należy przechowywać liposomy w temperaturze 4 °C i regularnie sprawdzać rozkład wielkości i średnią wielkość.

1. Włącz sprzęt DLS 30 minut przed użyciem, aby rozgrzać laser lamp.
2. Przenieść preparat liposomalny otrzymany w kroku 1.10 do jednorazowej kuwety do sortowania produktów.
3. Ustaw parametry sprzętu w następujący sposób: rodzaj dyspergatora = woda (RI = 1,33); materiał = lipidy (RI = 1,45); i RT.
4. Naciśnij Start i poczekaj, aż urządzenie zakończy odczyt.
5. Wyjmij kuwetę i wyłącz urządzenie.
   UWAGA: Albo przenieść próbkę z kuwety z powrotem do jednorazowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml w celu przeprowadzenia dalszych analiz, albo wyrzucić ją, jeśli jest wystarczająca ilość do nowych odczytów.

4. Charakterystyka morfologiczna

UWAGA: Charakterystyka liposomów jest wykonywana zgodnie z Murtey i Ramasamy¹⁹. Próbki zawierające nanoliposomy uzyskane w kroku 1.10 przygotowuje się w trzech egzemplarzach.

1. Przymocuj szklane szkiełka nakrywkowe (o średnicy 13 mm) na dnie szalki Petriego za pomocą taśmy dwustronnej. Pokrój taśmę na małe kawałki (odpowiedni rozmiar do zamocowania szkiełek nakrywkowych), usuń papier ochronny znajdujący się pod spodem i przymocuj go do dna szalki Petriego. Za pomocą pęsety usuń papier ochronny z wierzchu taśmy i przymocuj do niego szkiełka nakrywkowe.
   UWAGA: Zachowaj ostrożność w poniższych krokach, aby nie zwolnić szkiełek nakrywkowych i użyj mocnej taśmy.
2. Pokryj szkiełka nakrywkowe poli-L-lizyną. Umieścić mokre bibuły filtracyjne wewnątrz płytki Petriego w celu utrzymania wilgoci i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (25 °C).
3. Po nałożeniu powłoki spłucz szkiełka nakrywkowe wodą destylowaną.
4. Wypełnić szkiełka nakrywkowe kroplą próbki z kroku 1.10 i pozostawić do wyschnięcia na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
5. W celu utrwalenia próbek należy pokryć je 4% aldehydem glutarowym przygotowanym w 0,1 M buforze fosforanowym o pH = 7,2. Umieść mokre bibuły filtracyjne wewnątrz szalki Petriego i uszczelnij naczynie, aby utrzymać poziom wilgoci. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 48 godzin.
6. Szkiełka nakrywkowe płukać 3x przez 5 minut tym samym buforem fosforanowym.
7. Próbki należy odwodnić w następujący sposób: 35% etanolu 1x przez 15 min, 50% etanolu 1x przez 15 min, 75% etanolu 1x przez 15 min, 95% etanolu 2x przez 15 min i etanolu absolutnego 3x przez 20 min.
8. Wysuszyć chemicznie próbki przez zanurzenie 2x w 1−2 ml heksametyldisilazanu (HMDS) przez 10 min.
   UWAGA: HMDS należy ostrożnie obchodzić się z nim wewnątrz dygestoria. Próbki należy pozostawić do wyschnięcia przez noc w eksykatorze lub w dygestorium w temperaturze pokojowej.
9. Zamontuj wysuszone próbki na króćcu za pomocą taśmy klejącej przewodzącej węgiel.
10. Napylić powierzchnię szkiełka nakrywkowego w próżni za pomocą przewodzącej prąd elektryczny warstwy (o grubości 20 nm) ze złota-palladu.
11. Rejestruj obrazy za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) w trybie niskiej próżni i niskim napięciu (20 kV).

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia przygotowanie nanoliposomów^16,20,21. Fosfolipidy, 1,2-dioleoilo-sn-glicerol-3-fosfoetanoloamina (DOPE), 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-[amino(glikol polietylenowy)-2000] (sól amonowa; DSPE-MPEG 2000) i cholesterylhemibursztynian (CHEMS), główne składniki liposomów, najpierw rozpuszczono w chloroformie w celu uzyskania filmu lipidowego. Folia lipidowa została następnie ponownie uwodniona w roztworze siarczanu amonu zawierającym białko hydrofilowe (taryna), które miało zostać uwięzione, a inkubację przeprowadzono przez noc. Następnie zastosowano techniki sonikacji i ekstruzji w celu wygenerowania małych pęcherzyków jednowarstwowych. Etap ultrawirowania oddzielił preparat liposomalny od wolnych lipidów i niekapsułkowanego białka, podczas gdy supernatant wykorzystano do określenia skuteczności uwięzienia.

Nanoliposomy wyprodukowane przy użyciu wyżej wymienionej metodologii wykazywały rozkład wielkości w zakresie od 51−396 nm do średniej wielkości 155 nm (Tabela 2). Preparat był jednorodny, ponieważ wskaźnik polidyspersyjności wynosił 0,168. Wysoką skuteczność uwięzienia wynoszącą 83% można osiągnąć, jeśli liposomy są wytłaczane przez membranę o wielkości porów 0,2 μm (tabela 2).

Morfologiczne cechy nanoliposomów zostały ocenione przez SEM. Rysunek 2A,B przedstawia okrągłe pęcherzyki liposomalne w zakresie 121 nm i analizowane przy napięciu 20 kV, podczas gdy Rysunek 2C,D przedstawia nieodpowiednio przygotowane próbki. Nanoliposomy zostały po prostu wysuszone na powietrzu bez wcześniejszego utrwalenia lub jakiegokolwiek innego leczenia opisanego w tym badaniu. W efekcie zaobserwowano większe i uszkodzone pęcherzyki w zakresie 332 μm i analizowane przy napięciu 5 kV.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie preparatu nanoliposomów. DOPE, PEG i CHEMS, główne składniki liposomów, najpierw rozpuszczono w chloroformie w celu uzyskania filmu lipidowego (1, 2, 3). Folia lipidowa została następnie ponownie uwodniona w buforze soli fizjologicznej zawierającym hydrofilowe białko (tarynę), które miało zostać uwięzione, a inkubację przeprowadzono przez noc (4). Następnie zastosowano techniki sonikacji i ekstruzji w celu wygenerowania SUV-ów (5, 6). Etap ultrawirowania oddzielił preparat liposomalny od wolnych lipidów i niekapsułkowanego białka, podczas gdy supernatant wykorzystano do określenia skuteczności uwięzienia (7). Ten rysunek został zmodyfikowany z Correa et al.¹⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Fotomikroskopia nanoliposomów metodą SEM. Panie przewodniczący, panie i panowie! Obrazy okrągłych pęcherzyków liposomalnych w zakresie 121 nm i analizowane przy napięciu 20 kV. (C,D) Obrazy nieodpowiednio przygotowanych próbek. Niewłaściwie przetworzone próbki pozwoliły na obserwację większych i/lub uszkodzonych pęcherzyków, które nie są odporne na warunki podciśnienia i/lub napięcia przy napięciu 5 kV. Ten rysunek został zmodyfikowany z Correa et al.¹⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

piksela pkt.

Składniki liposomów	Waga (g)	Stężenie (mM)	Ostatni tom
narkotyk	0,0420	5,7	10 ml
MPEG 2000-DSPE	0,1059	3.8
TECHNOLOGIE CHEMS	0,0024	0,5

DOPE - 1,2-dioleoilo-sn-glicerol-3-fosfoetanoloamina); MPEG 2000-DSPE - 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-[amino (glikol polietylenowy)-2000] (sól amonowa); CHEMS – cholesteriolhemibursztynian.

Tabela 1: Przygotowanie liposomalnych nanokapsułek taryny.

pkt. Rozdział pkt.

Wielkość porów membrany (μm)	Rozkład wielkości (nm)	Średnia wielkość (nm)	Wskaźnik polidyspersyjności (PdI)	Szczyt (nm)	Skuteczność uwięzienia
0,2	Nr 51 - 396	Rozdział 155	0. 168	94 ± 39	0,83

Rozmiar i wskaźnik polidyspersyjności zostały ocenione za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, podczas gdy skuteczność enkapsulacji została określona według Peterson¹⁷.

Tabela 2: Rozmiar, wskaźnik polidyspersyjności i skuteczność uwięzienia preparatu nanoliposomowego.

Dyskusja

Opisany w niniejszym dokumencie protokół został przetestowany przez Correa i ^wsp.16 w celu enkapsulacji taryny, immunomodulującej i przeciwnowotworowej lektyny oczyszczonej z Colocasia esculenta²². Metodologia ta przyniosła pomyślne wyniki, co pozwoliło na produkcję stabilnych nanoliposomów o rozmiarach odpowiednich do zastosowań terapeutycznych. Preparat charakteryzuje się kontrolowanym uwalnianiem na różnych poziomach pH w warunkach fizjologicznych. Nasila również właściwości farmakologiczne taryny, takie jak hamowanie linii komórkowych ludzkiego glejaka U-87 MG i raka piersi MDA-MB-231 oraz stymulację komórek szpiku kostnego myszy. Preparat liposomalny nie wykazywał działania toksycznego w zdrowych komórkach myszy¹⁶.

Klasyczna metoda, po raz pierwszy opisana przez Banghama i wsp.7, pozwala na wytwarzanie dużych wielopłytkowych pęcherzyków liposomowych, niejednorodnych pod względem wielkości i kształtu. Adaptacje tej metody, jak opisano w niniejszym badaniu, są z powodzeniem stosowane poprzez włączenie dodatkowych etapów, takich jak sonikacja i wytłaczanie przez membranę poliwęglanową o grubości 0,2 μm. Pozwala to na uzyskanie bardziej jednorodnej dyspersji pod względem wielkości w zakresie^nanometrów 16,23,24. Dlatego, aby zapewnić pomyślne wyniki, należy ściśle przestrzegać opisanego tutaj protokołu enkapsulacji i preparatu liposomalnego.

Skład nanoliposomów został starannie dobrany, aby zapewnić utworzenie dwuwarstwowej membrany, której głównymi składnikami są DOPE, MPEG 2000-DSPE i CHEMS. Są to naturalne składniki dwuwarstwowe błony zwierzęcej, które mogą nadawać płynność architekturze nanoliposomów, zapewniając szerokie zastosowanie w dostarczaniu związków bioaktywnych u ludzi.

Pegylacja nanoliposomów jest niezbędna do zagwarantowania stabilności struktury liposomów. Brak PEG prowadzi do powiększenia rozmiaru, wysokiego wskaźnika polidyspersyjności i niskiej skuteczności uwięzienia. Optymalne wyniki można uzyskać stosując DOPE jako główny składnik liposomów. Jest to jednak kosztowny fosfolipid. Koszty finansowe produkcji nanoliposomów można osiągnąć poprzez zastąpienie DOPE innymi podobnymi lipidami, takimi jak DOPC (1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina). CHEMS to cząsteczka cholesterolu naturalnie występująca w błonach komórek zwierzęcych, której nie należy wykluczać z preparatu, ponieważ ważne jest zapewnienie płynności i plastyczności dwuwarstwy lipidowej¹⁶.

Inne aspekty protokołu enkapsulacji również mogą zostać dostosowane. Chloroform używany do rozpuszczania składników liposomalnych można łatwo zastąpić metanolem bez wpływu na średnią wielkości, jednorodność i skuteczność uwięzienia. Jednakże podczas przechowywania w temperaturze poniżej 4 °C¹⁶ może dojść do pewnego wycieku białka. Etap inkubacji przez noc z roztworem siarczanu amonu zawierającym tarynę nie jest obowiązkowy; jednak dla wygody można go wykonać bez uszkodzenia nanoliposomalnych cech biofizycznych, enkapsulacji lub utraty wydajności stabilności, jak wykazano przez Correa i ^wsp.16. Etap wytłaczania odbywa się w temperaturze pokojowej, co może zmniejszyć natężenie przepływu między strzykawkami, jeśli używana jest membrana o wielkości porów 0,1 μm.

Aby rozwiązać ten problem, należy rozważyć zastosowanie membrany o wielkości porów 0,2 μm lub podgrzanie uchwytu ekstrudera powyżej temperatury przemiany lipidowej. Analityk musi uważać, aby nie uszkodzić lipidów lub białek, które mogą zostać dezaktywowane i stracić aktywność biologiczną. Alternatywnie, preparat liposomalny można dializować przeciwko HBS zamiast ultrawirowania, przy użyciu membrany odcinającej zgodnie z masą cząsteczkową białka. Wybór chemicznego charakteru buforu, w którym zawieszone są nanoliposomy po ultraodwirowaniu, jest bezpośrednio związany z jego późniejszym zastosowaniem. Ponieważ perspektywy tego badania obejmują testy in vivo i in vitro, zawiesina w buforowanym roztworze soli fizjologicznej HEPES była wystarczająca, aby zapewnić brak działania cytotoksycznego i zakres pH zbliżony do warunków fizjologicznych.

Liposomy powinny być dokładnie traktowane, podobnie jak żywe komórki, aby uzyskać obrazy SEM o wyższej jakości. Procedury utrwalania i suszenia są ważne, aby zapewnić wizualizację mniejszych, nienaruszonych pęcherzyków, które utrzymują wartości wyższe niż 20 kV w warunkach próżni. Rysunek 2A,B przedstawia pęcherzyki o rozmiarach nano zgodne z procedurą ekstruzji. Wizualizacja pęcherzyków w zakresie od 51 do 396 nm jest możliwa, jeśli zostanie przeprowadzone odpowiednie przygotowanie próbki zgodnie z tą procedurą. Etapy obejmują utrwalanie, suszenie poprzez zwiększanie stężenia etanolu i odwadnianie chemiczne, aby uniknąć tworzenia się agregatów i pękniętych pęcherzyków spowodowanych przez próżnię i wiązkę elektronów. Z drugiej strony, rysunek 2C,D przedstawia pęcherzyki liposomowe wysuszone w temperaturze pokojowej i niepoddane żadnym opisanym tu zabiegom, co oznacza, że zostały przygotowane nieodpowiednio. W wyniku nieodpowiedniej procedury powstają gigantyczne pęcherzyki, nawet po wytłoczeniu przez membranę o wielkości porów 0,2 μm. W obu panelach obserwuje się również pęknięte pęcherzyki w wyniku uszkodzenia przez próżnię i wiązkę elektronów.

Pęcherzyki nanoliposomowe zostały zbadane jako system enkapsulacji i dostarczania cząsteczek hydrofobowych, w tym resweratrolu (3,5,4'-trihydroksystylbenu), bioaktywnego związku przeciwko komórkom raka jelita grubego. Procedura enkapsulacji może przezwyciężyć słabą rozpuszczalność związków lipofilowych, a także zapewnić biokompatybilność, biodegradowalność, nieimmunogenność i nietoksyczność charakterystyczne dla nanokapsułek liposomowych²⁵. W zależności od drogi i celu podawania należy wziąć pod uwagę adaptacje protokołu, takie jak opracowanie nowych preparatów liposomów do podawania doustnego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Siarczan amonu	Sigma-Aldrich Co	A4418
Analitycal Ballance Mettler H10Tw	Mettler Inc.	417870
Spektrofotometr Beckman DU-640	Beckman Coulter	8043-30-1090
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich Co	5470
BUCHI Rotavapor R-300 Parownik obrotowy ze sterownikiem i pompą V-300	Thermo Fischer Scientific	05-001-022PM
CHEMS (cholesterol hemisbursztynian)	Sigma-Aldrich Co	C6512
Chloroform	Sigma-Aldrich Co	48520-U	UWAGA
Siarczan miedzi (II) (pentahydrat)	Sigma-Aldrich Co	209198
Szkiełka nakrywkowe (średnica 13 mm)	Thermo Scientific Nunc	EW-01839-00
DOPE (1,2-dioleoilo-sn-glicerol-3-fosfoetanoloamina)	Lipoid GMBH	565600.1
Etanol Absolute	Sigma-Aldrich Co	32205
Odczynnik fenolowy Folin -Ciocalteu	Sigma-Aldrich Co	F9252
Aldehyd glutarowy	Sigma-Aldrich Co	G5882
HEPES	Sigma-Aldrich Co	H3375
Hexamethyldisilazan (HMDS)	Sigma-Aldrich Co	440191	CAUTION
JEOL JSM-6460 LV Mikroskop elektronowy do sacnningu	JEOL LTD
Mini ekstruder 7	Avanti Polar Lipids	610000
MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-[amino(glikol polietylenowy)-2000] (sól amonowa) Lipoid	GMBH	588200.1
Optima L-90k Ultrawirówka	Beckman Coulter	PN LL-IM-12AB
Bufor fosforanowy	Sigma-Aldrich Co	P3619
Poli-L-lizyna	Sigma-Aldrich Co	P8920
Jednozasadowy L-winian potasu	Sigma-Aldrich Co	243531
Węglan sodu	Sigma-Aldrich Co	S7795
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich Co	S7653
Deoksycholan sodu (DOC)	Sigma-Aldrich Co	D6750
Dodecylowy siarczan sodu	Sigma-Aldrich Co	L3771
Wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich Co	S8045
Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny	Sigma-Aldrich Co	RES20908-A7
TESCAN VEGA 3 Skaningowy mikroskop elektronowy	Tescan	#657874
Kwas trichlorooctowy (TCA)	Sigma-Aldrich Co	91230
Zetasizer Nano ZSP	Malvern Panalytical LTD
Ultradźwiękowa wanna czyszcząca model 2510	Branson