Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku do badania dynamiki lokalizacji subkomórkowej białek i monitorowania zmian morfologicznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości u Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych i zmian morfologii komórek u bakterii
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badania czynników wpływających na podział komórek i kształt komórek u bakterii są zwykle wykonywane w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną o wysokiej rozdzielczości, ponieważ obserwacje wykonane na poziomie populacji mogą nie odzwierciedlać tego, co dzieje się na poziomie pojedynczej komórki. Mikroskopia poklatkowa żywych komórek pozwala badaczom monitorować zmiany w podziale komórek lub morfologii komórek, co dostarcza cennych informacji na temat subkomórkowej lokalizacji białek i czasu ekspresji genów, jak to się dzieje, aby potencjalnie pomóc w udzieleniu odpowiedzi na ważne pytania biologiczne. Tutaj opisujemy nasz protokół monitorowania zmian fenotypowych u Bacillus subtilis i Staphylococcus aureus za pomocą mikroskopu dekonwolucyjnego o wysokiej rozdzielczości. Celem tego raportu jest dostarczenie prostego i przejrzystego protokołu, który może zostać przyjęty przez innych badaczy zainteresowanych przeprowadzeniem eksperymentów z mikroskopią fluorescencyjną w celu zbadania różnych procesów biologicznych u bakterii, a także innych organizmów.
Wprowadzenie
Dziedzina biologii komórek bakteryjnych została znacznie rozszerzona dzięki najnowszym postępom w technikach mikroskopowych1,2. Cennym narzędziem pozostają między innymi mikroskopy, które są w stanie przeprowadzać eksperymenty z poklatkową mikroskopią fluorescencyjną. Badacze mogą monitorować różne zdarzenia fizjologiczne w czasie rzeczywistym za pomocą białek fluorescencyjnych, takich jak transkrypcyjne i translacyjne fuzje reporterowe oparte na zielonym białku fluorescencyjnym (GFP), fluorescencyjne D-aminokwasy (FDAA) 3 lub używać innych barwników do znakowania ściany komórkowej, bło....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Ogólne warunki wzrostu
- Zaszczepić 2 ml odpowiedniej pożywki wzrostowej uzupełnionej antybiotykami (w razie potrzeby) pojedynczą kolonią szczepu (szczepów), który ma być zobrazowany. Inkubować te kultury nasienne przez noc w temperaturze 22 °C w inkubatorze z wytrząsaniem.
UWAGA: Konkretne warunki wzrostu bakterii użyte w tym artykule są podane w sekcji dotyczącej reprezentatywnych wyników. - Rozcieńczyć nocne kultury w stosunku 1:20 na świeżych podłożach w kolbie o pojemności 125 ml, uzupełnić antybiotykami (jeśli jest to wymagane).
- Hodować kulturę(-y) w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem do środkowej fazy logarytmi....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Fenotypy GpsB
Wcześniej wykazaliśmy, że Sa-GpsB jest białkiem niezbędnym, ponieważ deplecja GpsB przy użyciu antysensownego RNA prowadzi do lizy komórek9. W niniejszym opracowaniu opisujemy, w jaki sposób pojawienie się różnych fenotypów podziału komórkowego oraz zmiany w lokalizacji białek mogą zostać zarejestrowane przy użyciu protokołu mikroskopii timelapse opisanego w tym artykule. W tym celu szczepy S. aureus RB143 [SH1000 zawierający pEPSA5 (pusty wektor)] oraz .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Mikroskopia pozostała podstawą badań nad organizmami drobnoustrojów. Biorąc pod uwagę rozmiar komórek w skali mikronowej, badania na poziomie pojedynczej komórki tradycyjnie opierały się na mikroskopii elektronowej (EM). Chociaż EM stał się w ostatnich latach dość potężną techniką, oprócz ograniczonego dostępu użytkowników ma swoje wewnętrzne ograniczenia16. Udoskonalenia w technikach mikroskopii fluorescencyjnej i opracowanie różnych sond fluorescencyjnych, takich jak FDAA3
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy członkom naszego laboratorium za komentarze do tego artykułu. Praca ta została sfinansowana z grantu na rozpoczęcie działalności z University of South Florida (PE).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Agarose | Fisher BioReagents | BP160-100 | Klasa biologii molekularnej - Niska EEO |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Mikroskopia |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Mikroskopia |
| Naczynie ze szklanym dnem | MatTek | P35G-1.5-14-C | Mikroskopia |
| IPTG | Fisher BioReagents | BP1755-10 | Nie zawiera |
| Mikroskop | GE | DeltaVision Elite | Dostosowany odwrócony statyw mikroskopowy Olympus IX-71; Niestandardowa wieża oświetleniowa i moduł oświetlacza światła przechodzącego. Obiektywy: PLAPON 60X (N.D. 1,42, WD 0,15 mm); OLY 100X OLEJ (N.D. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski do obiektywu 100x; Aparat fotograficzny CoolSnap HQ2; Montaż SSI 7-kolorowy; Komora kontroli środowiska - nieprzezroczysta. |
| PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | Inhibitor FtsZ |
| SoftWorx | GE | Oprogramowanie do obrazowania dostarczone przez producenta |
Bibliografia
- Coltharp, C., Xiao, J. Superresolution microscopy for microbiology. Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).
- Holden, S. Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy. Current Opinion in ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
