Artykuł metodologiczny

Sieci kardiomiocytów pochodzące z ludzkich iPSC na wielodołkowych układach mikroelektrod do powtarzalnych zapisów potencjału czynnościowego

12.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59906

⸱

15 lipca 2019

 ,  ,  ,  , 
1Aurora Research Institute, Advocate Aurora Health Care, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering and Applied Science, University of Wisconsin-Milwaukee, 3Department of Medicine-Cardiovascular, School of Medicine, Johns Hopkins University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł zawiera zestaw protokołów do rozwoju ludzkich sieci indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-CM) hodowanych na wielodołkowych płytkach MEA w celu odwracalnego elektroportowania błony komórkowej do pomiarów potencjału czynnościowego. Nagrania o wysokiej przepustowości są uzyskiwane z tych samych lokalizacji komórkowych wielokrotnie przez kilka dni.

Streszczenie

Badania przesiewowe bezpieczeństwa serca mają ogromne znaczenie dla odkrywania leków i terapii. W związku z tym opracowanie nowatorskich, wysokoprzepustowych metod elektrofizjologicznych do wytwarzania preparatów kardiomiocytów pochodzących z hiPSC (hiPSC-CM) jest bardzo potrzebne do skutecznego testowania leków. Chociaż matryce wieloelektrodowe (MEA) są często stosowane do pomiarów potencjału pola komórek pobudliwych, niedawna publikacja Joshi-Mukherjee i współpracowników opisała i potwierdziła jej zastosowanie do zapisów rekurencyjnego potencjału czynnościowego (AP) z tego samego preparatu hiPSC-CM w ciągu kilku dni. Celem jest przedstawienie szczegółowych metod krok po kroku do zasiewania CM i pomiaru przebiegów AP za pomocą elektroporacji z dużą precyzją i rozdzielczością czasową 1 μs. Podejście to rozwiązuje problem braku łatwej w użyciu metodologii umożliwiającej uzyskanie dostępu wewnątrzkomórkowego do wysokoprzepustowych pomiarów AP w celu przeprowadzenia wiarygodnych badań elektrofizjologicznych. Omówiono szczegółowy przebieg pracy i metody powlekania hiPSC-CM na wielodołkowych płytkach MEA, kładąc nacisk na kluczowe etapy tam, gdzie jest to istotne. Ponadto raportowany jest niestandardowy skrypt MATLAB do szybkiej obsługi, ekstrakcji i analizy danych w celu kompleksowego zbadania analizy kształtu fali w celu ilościowego określenia subtelnych różnic w morfologii dla różnych parametrów czasu trwania AP związanych z arytmią i kardiotoksycznością.

Wprowadzenie

Ludzkie pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) są złotym standardem dla coraz większej liczby laboratoriów1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Pokonywanie ciał embrionalnych11,12,13 i monolayer3,7,10,11,12,13,14,15,16,17 preferowaną metodą produkcji kardiomiocytów jest różnicowanie, a matryca wieloelektrodowa (MEA) stała się powszechnym sposobem monitorowania elektrodynamiki tych sieci18,19,20. Podczas gdy parametry, które można wyodrębnić z potencjałów pola (FP), takie jak szybkość dudnienia, amplituda, czas trwania i interwały RR, są podstawowymi reakcjami elektrofizjologicznymi spontanicznie bijących monowarstw18,21,22,23, składowe potencjału czynnościowego (AP) leżące u podstaw tych zewnątrzkomórkowych sygnałów FP są trudne do ekstrapolacji24. Nasza niedawna publikacja na temat odkrycia zastosowania MEA do bezpośrednich powtarzających się pomiarów AP stanowi dowód metodologii dla przykładowych wewnątrzkomórkowych odczytów AP z obszerną analizą kształtu fali w różnych fazach repolaryzacji w wielu partiach sieci kardiomiocytów pochodzących z hiPSC3. W badaniu wykazaliśmy, że dostarczanie impulsów elektroporacyjnych do sieci kardiomiocytów pochodzących z hiPSC umożliwia wewnątrzkomórkowy dostęp do zapisów AP. Te przejściowe nagrania AP są zależne od odzyskiwania potencjału transbłonowego obserwowanego przez miejsce urazu3,25,26. Przebiegi zarejestrowane przez MEA i patch-clamp w naszym badaniu wykazały podobne morfologie AP, potwierdzając w ten sposób niezawodność podejścia3.

Kilka laboratoriów zgłosiło pomiary punktów dostępowych z różnych ogniw elektrogenicznych za pomocą specjalnie zbudowanych MEAs18,21,26,27,28,29,30, ale nie oceniono wiarygodności stosowania MEA do spójnych i powtarzających się pomiarów AP. Obecnie złoty standard techniki patch-clamp jest ograniczony do nagrań terminalowych7,31, podczas gdy pomiary AP oparte na MEA są przejściowe i dlatego mogą być przeprowadzane wiele razy na tej samej komórce. Pokazujemy również, że można łatwo nagrywać wysokiej jakości sygnały AP w zakresie miliwoltów, wymagające minimalnego filtrowania. Naukowcy mogą zatem prowadzić nie tylko badania nad ostrymi, ale także przewlekłymi lekami w tych samych preparatach za pomocą MEA. Dodatkowo technologia ta pozwala na jednoczesny pomiar FP/AP generujący biblioteki elektrobiomów w krótkim czasie. Biorąc pod uwagę rosnący nacisk na przewidywanie arytmii i kardiotoksyczności związanej z lekami24,32,33,34,35, integracja podejść do pomiaru AP poprawi ocenę bezpieczeństwa i skuteczności leków.

Tutaj prezentujemy protokoły do: 1) wstępnego powlekania kriokonserwowanych hiPSC-CM do dojrzewania, 2) dysocjacji i powlekania hiPSC-CM na wielodołkowych MEA, 3) nagrywania FP i AP z sieci hiPSC-CM, 4) segmentacji i ekstrakcji danych do analizy, oraz 5) przywracania tablic do wielokrotnego wykorzystania. Każdy krok został zoptymalizowany, kładąc nacisk na kluczowe kroki tam, gdzie jest to istotne. Omówiono wymagania dotyczące przyłączania komórek w celu zapewnienia bijącej monowarstwy syncytialnej oraz wyjaśniono procedury wielodołkowej odbudowy MEA w powtarzających się badaniach elektrofizjologicznych. Na koniec zaprezentowano niestandardowy graficzny interfejs użytkownika opracowany w laboratorium do ekstrakcji sygnału AP, zapewnienia jakości i przepływu pracy segmentacji w celu ilościowego określenia i analizy parametrów AP.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów i materiałów (patrz Tabela Materiałów)

  1. 6-dołkowa powłoka podłoża na płytce do hodowli tkankowej
    1. Rozmrozić podłoże powlekające na lodzie lub w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotować rozcieńczenie podłoża do powlekania w stosunku 1:100 w zimnym podłożu DMEM/F12. Wymieszać roztwór, powoli pipetując.
    3. Przenieść 2 ml roztworu podłoża powlekającego (etap 1.1.2) na dołek 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.
    4. Natychmiast umieścić powlekaną płytkę do hodowli tkankowej w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 7 godzin i zużyć w ciągu 7 dni.
  2. Pożywka hodowlana hiPSC-CM
    1. Dodać 10 ml suplementu pożywki CM rozmrożonego w temperaturze 4 °C do 500 ml pożywki bazowej CM. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
    2. Podać wymaganą ilość pożywki na dzień i doprowadzić do temperatury pokojowej przed użyciem.
  3. Pożywka do rozmrażania hiPSC-CM: Przygotować świeżą, mieszając pożywkę hodowlaną hiPSC-CM (krok 1.2) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Doprowadź podłoże do temperatury pokojowej przed rozmrożeniem CM do zawiesiny.
  4. Fibronektyna 1 mg/ml roztwór podstawowy: Podwielokrotność 200 μl do 1,5 ml sterylnych probówek do mikrofuge i przechowywana w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia. Roztwór roboczy o stężeniu 50 μg/ml przygotować świeżo na lodzie.
  5. Roztwór czyszczący Multiwell: Połącz 0,5 g detergentu enzymatycznego z 50 ml sterylnej podwójnie destylowanej wody (ddH2O). Wiruj, aby wymieszać zawartość. Przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia.

2. Wstępne posiewanie kriokonserwowanego hiPSC-CM do dojrzewania (Rysunek 1)

UWAGA: Ta sekcja jest przeznaczona do rozmrażania i hodowli hiPSC-CM, które zostały zróżnicowane przy użyciu metody monowarstwowej bez zasilania3,16 i kriokonserwowane w ciekłym azocie 10 dni po różnicowaniu przy 1-2 milionach komórek/fiolkę. Komórki z jednej fiolki umieszcza się w dwóch dołkach pokrytych substratem na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Kardiomiocyty mają tendencję do osadzania się na dnie probówki, dlatego delikatne mieszanie w czasie wstępnego powlekania jest ważne dla uzyskania równomiernej gęstości komórek w dołkach.

  1. Podwielokrotność 2 ml FBS na fiolkę hiPSC-CM rozmraża się w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i doprowadza do temperatury pokojowej.
  2. Rozmrażaj fiolki z kriokonserwowanymi hiPSC-CM, umieszczając je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i delikatnie obracaj, aby uzyskać równomierne rozmrażanie nie dłużej niż 3 minuty.
  3. Natychmiast przenieść zawartość fiolki do probówki zawierającej FBS (patrz krok 2.1), mieszać wirując i odwirowywać przy 200 x g przez 5 minut.
  4. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki do rozmrażania hiPSC-CM (patrz krok 1.3) na rozmrożoną fiolkę. Użyć pipety transferowej, aby ponownie zawiesić osad przez delikatne rozcieranie. Oceń żywotność komórek.
  5. Dodać dodatkowe 3 ml pożywki do rozmrażania na fiolkę hiPSC-CM rozmrożonego w kroku 2.4 i delikatnie zawiesić za pomocą pipety transferowej, aby jeszcze bardziej zdysocjować grudki komórek.
  6. Delikatnie dozować 2 ml zawiesiny komórkowej do każdej studzienki 6-dołkowych płytek pokrytych substratem (patrz krok 1.1). Umieścić w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  7. Po 24 godzinach zastąpić nową pożywką do hodowli hiPSC-CM, a następnie 3 razy w tygodniu przez 20 dni.
    UWAGA: Komórki powinny przylegać do powłoki podłoża przez 24 godziny i bić samoistnie po 48 godzinach po posiewie (patrz Rysunek 1 i Rysunek 2).

3. Sterylizacja i powlekanie płytek wielodołkowych MEA (Rysunek 2 i Rysunek 3)

UWAGA: Opisany tutaj protokół służy do przygotowania 24-dołkowych płytek MEA z 12 mikro złotymi elektrodami pokrytymi PEDOT na szkle do powlekania hiPSC-CM. Unikaj dotykania dolnej części płytki, ponieważ może to spowodować uszkodzenie elektrod.

  1. Dwa dni przed posiewem komórek dodać 0,5 ml pożywki hodowlanej hiPSC-CM (patrz krok 1.2) do każdego dołka i przeprowadzić zapis podstawowy w celu sprawdzenia stosunku sygnału do szumu w celu sprawdzenia jakości MEA.
  2. Odessać pożywkę, spłukać sterylnym ddH2O i wysterylizować w świetle UV w okapie z przepływem laminarnym przez noc.
  3. Dzień przed posiewem komórek dodaj 0,1 ml FBS do każdej studzienki w celu hydrofilowej obróbki powierzchni MEA. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Ten krok jest niezbędny do podłączenia komórki.
  4. Odessać FBS i spłukać 0,5 ml sterylnego ddH2O na studzienkę. Powtórz jeszcze raz.
  5. Pozostaw płytkę do wyschnięcia na noc w okapie z przepływem laminarnym.
  6. Przygotować robocze rozcieńczenie 50 μg/ml fibronektyny w zimnym podłożu DMEM/F12 z podstawki (patrz krok 1.4). Utrzymuj roztwór na lodzie.
  7. Pobrać pipetę z 5 μl roboczego rozcieńczenia fibronektyny (patrz ppkt 3.6) i ostrożnie dozować kroplę do środka każdej studzienki, aby pokryć wszystkie 12 elektrod. Ważne jest, aby pracować szybko w 24 dołkach, aby zapobiec wysychaniu kropli.
  8. Natychmiast umieść pokrytą fibronektyną wielodołkową płytkę MEA na podniesionej powierzchni wewnątrz komory nawilżającej zawierającej sterylne ddH2O, aby pokryć całą powierzchnię naczynia. Umieścić komorę z wielodołkową płytką MEA na 3 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych.
    UWAGA: Umieszczenie 24-dołkowej płytki MEA w komorze nawilżającej ma kluczowe znaczenie, aby zapobiec wysychaniu kropelek fibronektyny w okresie inkubacji.

4. dysocjacja i posiew hiPSC-CM na płytce Multiwell MEA (Rysunek 3)

UWAGA: Rozpocznij ten krok około 1 godziny przed zakończeniem inkubacji fibronektyny MEA. Upewnij się, że roztwór do dysocjacji komórek ma temperaturę 37 °C, a podłoże do rozmrażania iPSC-CM ma temperaturę pokojową. Metody dysocjacji zostały zoptymalizowane pod kątem 30 dni po zróżnicowanych hiPSC-CM hodowanych na 6-dołkowych płytkach pokrytych podłożem (patrz krok 2) w celu uzyskania około 90% żywotnych CM do posiewu MEA. Należy zachować ostrożność, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza podczas rozcierania, aby zapobiec śmierci komórki.

  1. Odessać pożywkę hodowlaną z każdej studzienki 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej za pomocą 30-dniowej hodowli hiPSC-CM po 30 dniach od różnicowania (patrz krok 2.7) i przemyć 2 ml sterylnego D-PBS na studzienkę.
  2. Dodać 1 ml wstępnie podgrzanego roztworu do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) do studzienki i inkubować przez 4 minuty w temperaturze 37 °C. Użyć pipety transferowej, aby delikatnie rozcierać w celu rozluźnienia komórek w celu dysocjacji. Jeżeli większość komórek nadal przylega, inkubować przez kolejne 3 minuty w temperaturze 37 °C i ponownie rozcierać. Ta dodatkowa inkubacja powinna pomóc w maksymalnym odzyskaniu komórek. Nie inkubować dłużej niż 7 minut, ponieważ może to spowodować niską żywotność komórek.
  3. Za pomocą pipety transferowej zbierz wszystkie zdysocjowane komórki w stożkowej probówce zawierającej pożywkę do rozmrażania hiPSC-CM (patrz krok 1.3). Zaleca się zawieszenie komórek w co najmniej dwukrotnie większej objętości pożywki (2 ml na pobrany studzienek) w celu zablokowania aktywności roztworu dysocjacji komórek.
  4. Wirować przy 200 x g przez 5 min.
  5. Ostrożnie odessać roztwór, ponieważ osad jest luźno przylegający do powierzchni i ponownie zamieszać w 0,1 ml pożywki do rozmrażania hiPSC-CM. Za pomocą pipety transferowej kilkakrotnie zawiesić osad przez delikatne rozcieranie.
  6. Podamy 2 μl zdysocjowanych komórek i rozcieńczyć 18 μl pożywki w probówce do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. Dodać 20 μl błękitu trypanowego i wymieszać w celu oceny liczby komórek i żywotności.
  7. Dostosuj gęstość komórek do 6 000 komórek/μl, dodając odpowiednią objętość pożywki do rozmrażania hiPSC-CM. Zawieś pellet, delikatnie przesuwając kilka razy. HiPSC-CM łatwo odklejają się od powierzchni szklanych, zwłaszcza gdy są powlekane o dużej gęstości. Zoptymalizowaliśmy gęstość wysiewu i warunki poszycia, aby uzyskać 15 dni nagrań elektrycznych.
  8. Gdy będzie gotowa, przenieś wielodołkową płytkę MEA do okapu z przepływem laminarnym w celu wysiewu komórek. Bardzo ważne jest, aby wykonać następujące dwa kroki pojedynczo, aby zapobiec wysuszeniu fibronektyny.
    1. Ostrożnie usuń kroplę fibronektyny za pomocą pipety P10, nie dotykając elektrod.
    2. Natychmiast dozuj kroplę ogniwa o pojemności 5 μl (30 000 komórek) do środka dołka płytki MEA, obejmującej wszystkie 12 elektrod. Powtarzaj ten krok, aż wszystkie 24 dołki zostaną pokryte. Zaleca się przerywane mieszanie zawiesiny komórkowej przez trzepanie.
  9. Umieścić wielodołkową płytkę MEA z powrotem w luźno przykrytej komorze nawilżania i wrócić do inkubatora do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 3 godziny w celu przyłączenia komórek.
  10. Ostrożnie dodać 200 μl pożywki do rozmrażania hiPSC-CM do każdego dołka, nie naruszając komórek, za pomocą pipety P200. Dodaj pożywkę kroplami z boku studzienki.
  11. Umieścić wielodołkową płytkę MEA z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych.
  12. Zastąp świeżą pożywką hodowlaną hiPSC-CM po 24 godzinach od posiewu. W tym momencie można zaobserwować spontaniczne bicie kardiomiocytów (patrz wideo 3).
  13. Zmieniaj podłoże co 2 dni, aż do końca eksperymentów.

5. Elektroporacja hiPSC-CM i akwizycja sygnału (Rysunki 4 – 6)

UWAGA: Ten protokół służy do jednoczesnego rejestrowania sygnałów elektrod o wysokiej przepustowości (12 miejsc dla każdej z 24 studni). 24-dołkowy system wielodołkowy MEA jest używany z oprogramowaniem do akwizycji (patrz Tabela materiałów). Wszystkie zapisy MEA prowadzone są w temperaturze 37 °C.

  1. Włącz kartę interfejsu i uruchom oprogramowanie do akwizycji. Poczekaj, aż wielostudzienkowy stopień główny MEA osiągnie temperaturę 37 °C (patrz strzałka nr 1 w Rysunek 4).
  2. Włóż wielodołkową płytkę MEA z kroku 4 do wielodołkowej płyty czołowej MEA, umieszczając ją przykrytą nad platformą nagrywającą i kliknij przycisk Wstaw (patrz strzałka nr 2 w Rysunek 4). Poczekaj, aż temperatura się ustabilizuje przed rozpoczęciem nagrywania.
  3. Dostosuj ustawienia akwizycji i elektroporacji
    1. Kliknij ikonę Define Experimental Flow (patrz strzałka nr 3 w Rysunek 4) i ustaw czas nagrywania na 2 minuty lub według potrzeb.
    2. Kliknij ikonę Data Acquisition Setup (patrz strzałka nr 4 w Rysunek 4) i ustaw częstotliwość próbkowania na 20 kHz, filtr górnoprzepustowy na 0,1 Hz, a filtr dolnoprzepustowy na 3500 Hz.
    3. Kliknij ikonę Ustawienia stymulatora (patrz Rysunek 5). W zakładce Definicja bodźca zdefiniuj stymulację jako dwufazowe symetryczne impulsy napięcia o napięciu 1 mV, 1 ms i 1 Hz. W zakładce Elektrody stymulacyjne wybierz miejsca elektroporacji, podświetlając wszystkie odpowiednie elektrody.
  4. Kliknij przycisk Eksploruj, aby wyświetlić sygnały we wszystkich studzienkach. Sprawdź jakość sygnału i warunki stanu ustalonego. Rób notatki na elektrodach z sygnałami FP w zakresie mV. Kliknij ten sam przycisk, aby zatrzymać eksplorację. Do tej pory nie zarejestrowano żadnych danych.
  5. Rozpocznij nagrywanie, klikając przycisk Go!. Elektrody w każdej studzience będą pokazywać sygnały FP w oknie surowych danych (Rysunek 6). Po 30 s nagrania kliknij przycisk Stymuluj i pozwól, aby elektroporacja odbywała się w wybranych miejscach przez 30 s; Następnie kliknij ten sam przycisk, aby zatrzymać stymulację i kontynuować nagrywanie przez pozostałe 60 S.
    UWAGA: Nagrany plik można odtworzyć, przełączając się na "Tryb odtwarzacza" w menu rozwijanym "Aplikacja".

6. Czyszczenie płytek wielodołkowych MEA do ponownego użycia

  1. Po końcowych eksperymentach wyczyść wszystkie dołki w płytce wielodołkowej, odsysając całą zawartość pożywki z każdej studzienki i ostrożnie unikając dotykania powierzchni elektrody.
  2. Dodać 1 ml sterylnego ddH2O do każdego dołka. Zassać i powtórzyć raz.
  3. Dodać 0,3 ml wielodołkowego roztworu czyszczącego (patrz krok 1.5) do studzienki. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej, aby usunąć komórki i zanieczyszczenia.
  4. Następnego ranka odessać roztwór i spłukać 1 ml jałowego ddH2O. Inkubować przez 5 - 7 minut i aspirować. Powtórz 5 razy.
  5. Dodać 0,5 ml sterylnego ddH2O do dołka. Zapisz linię bazową oczyszczonej płytki wielodołkowej w celu sprawdzenia jakości oczyszczonych MEA (Rysunek 7).
  6. Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do użycia.

7. Konwersja i eksport plików danych

UWAGA: Dla każdego nagrania zostaną wygenerowane cztery pliki danych: pliki MWR, MWC, MWD i MWS. Za pomocą oprogramowania konwertującego plik MWD można przekonwertować na plik H5 w celu późniejszej analizy za pomocą niestandardowego skryptu (patrz Plik uzupełniający 1).

  1. Uruchom oprogramowanie konwertera (patrz Tabela materiałów).
  2. Wybierz opcję Ustaw ścieżkę wejściową z menu Plik. Wybierz folder zawierający interesujące Cię pliki danych.
  3. Wybierz opcję Ustaw ścieżkę wyjściową z menu Plik. Wybierz folder, w którym mają zostać zapisane przekonwertowane pliki.
  4. Zaznacz interesujący Cię plik MWD.
  5. Kliknij przycisk EKSPORTUJ do HDF5.

8. Segmentacja i analiza danych (Rysunki 8-10)

UWAGA: Niestandardowe oprogramowanie oparte na Matlabie służy do segmentacji i wyodrębniania różnych parametrów danych FP i AP. Oprogramowanie jest dostępne na żądanie.

  1. Uruchom kod Waveform Analysis za pomocą Matlaba (zobacz Rysunek 8, aby zobaczyć widok głównego okna GUI).
  2. Kliknij Plik i wybierz Proces .h5.
  3. Znajdź i wybierz plik mwd.h5 utworzony zgodnie z krokiem 7 powyżej.
  4. Kliknij przycisk Zapisz katalog, aby zmienić lokalizację przechowywania plików wyjściowych.
  5. Utwórz kolejkę przetwarzania sygnału, wybierając interesujące kombinacje elektrod/studzienek, a następnie klikając przycisk Kolejka. Powtórz ten krok, aby dodać więcej kombinacji elektroda/studzienka do przetworzenia do kolejki.
  6. Edytuj kolejkę, klikając bezpośrednio na Nazwa Med / Stężenie Med, jeśli komórki były leczone lekami (Rysunek 8).
  7. Gdy kolejka jest ostateczna, kliknij przycisk Initialize Waveforms (Zainicjuj przebiegi). Spowoduje to rozpoczęcie wstępnego przetwarzania, w którym sygnały są identyfikowane i wyodrębniane w celu segmentacji.
  8. Kliknij przycisk Powiększ i wybierz kursorem obszar potencjalnego działania (Rysunek 9).
  9. Kliknij przycisk Zachowaj i przejrzyj panele. Szczyty (czerwony 'x') i dołki (żółte kółka) są wykrywane dla każdego kształtu fali, a znormalizowane potencjały czynnościowe są nakładane na siebie. Kliknij przycisk Keep i przejdź do następnego śladu w kolejce (Rysunek 10).
  10. Powtórz kroki 8.8-8.9 dla pozostałych sygnałów kombinacji elektroda/studzienka w kolejce.
    UWAGA: Zostanie wygenerowany plik .csv z parametrami APD zmierzonymi dla każdego przebiegu. Plik .mat dla każdego pliku .h5 jest również zapisywany, aby umożliwić dodatkowe przetwarzanie danych podzielonych na segmenty.

Wyniki

Żywotność i gęstość wysiewu kardiomiocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC-CMs) po rozmrożeniu są kluczowe dla hodowli na wielodołkowych matrycach elektrod (MEA). Wstępny wysiew 1-2 milionów hiPSC-CMs/fiolka do dwóch dołków płytki hodowlanej z 6 dołkami, przy żywotności wynoszącej 50% lub więcej, pozwoli na uzyskanie zdrowej hodowli monowarstwy z autonomicznym skurczem po 48 h. Niska żywotność kardiomiocytów doprowadzi do powstania hodowli z wysokim odsetkiem populacji innych niż miocyty. Takie monowarstwy po dysocjacji w celu wysiewu na wielodołkową MEA zazwyczaj dają niespójne wyniki i sygnały złej jakości, dlatego powinny zostać odrzucone. Rysunek 1 przedstawia przykłady optymalnych oraz suboptymalnych hodowli hiPSC-CMs 48 h po wysiewie. Rozmrażanie kardiomiocytów na płytkach hodowlanych pokrytych substratem, zamiast bezpośrednio na wielodołkowych MEA, umożliwia regenerację i dojrzewanie komórek3. Bezpośredni wysiew kriozachowanych kardiomiocytów na matrycę nie jest zalecany, ponieważ prowadzi do niespójnych wyników.

Oprócz jakości dysocjowanych kardiomiocytów (CMs), przyleganie komórek do wielodobojowej MEA jest w dużym stopniu zależne od gęstości komórek oraz techniki powlekania fibronektyną. Rozmiar kropli fibronektyny jest krytyczny, ponieważ CMs będą dostosowywać się do granic obszaru pokrytego fibronektyną. Z tego powodu bezpośrednio nad obszarem macierzy elektrod dozuje się tylko 5 µL roztworu fibronektyny. Aby zapobiec rozprzestrzenianiu się kropli, powierzchnia studzienki musi być całkowicie sucha w momencie powlekania. Rycina 2 przedstawia układ wielodobojowej płytki MEA wraz ze schematami etapowego przygotowania wstępnego dla optymalnego procesu. Dodatkowo, aby zapobiec wysychaniu fibronektyny, wielodobojowe płytki MEA muszą być umieszczone w komorze nawilżającej podczas okresu inkubacji trwającego nie dłużej niż 3 h (patrz krok 3.8). Po zakończeniu inkubacji ważne jest usunięcie kropli fibronektyny z każdej studzienki bezpośrednio przed wysianiem CMs i dopiero wtedy przejście do wysiewania w kolejnej studzience. Kluczem do skutecznego przylegania komórek jest sprawne i uważne dozowanie CMs.

Kultury hiPSC-CM w 30. dniu po dyferencjacji poddaje się dysocjacji w celu wysiania na wielodołkowe MEA, stosując enzymatyczną metodę dysocjacji komórek (patrz krok 4). Kardiomiocyty przytwierdzą się do pokrytych fibronektyną powierzchni MEA w ciągu 3 h, a monowarstwa pokrywająca matryce będzie widoczna po 24 h od wysiania (Rycina 3). Synchroniczne skurcze monowarstwy zostaną zaobserwowane w przedziale 24–48 h. Rozproszenie kropel z zawiesiną komórkową wpłynie na gęstość kultury lub może nawet doprowadzić do wyschnięcia i śmierci komórek. Precyzyjne umieszczenie komórek bezpośrednio na matrycy jest kluczowe, dlatego technikę tę należy przećwiczyć w celu optymalnego wysiania. Adhezja komórek do elektrody referencyjnej będzie utrudniać generowanie sygnału elektrycznego. Obrazy optymalnego rozmieszczenia CM oraz kultury po 24 h przedstawiono na Rycinie 3.

Kardiomiocyty (CM) hodowane na wielodołkowych MEA poddawane są kontroli jakości aktywności elektrycznej 48 h po wysiewaniu. Zazwyczaj amplituda sygnału FP wzrasta z zakresu µV do mV w ciągu około 4 dni3. Jeśli 50% elektrod w ramach jednej sieci oraz 70% wszystkich sieci nie generuje sygnałów FP, sieć lub hodowla są uznawane za suboptymalne i powinny zostać odrzucone. Do analizy FP i AP przekazuje się wyłącznie hodowle, które przeszły kontrolę jakości. Na Rysunku 6 przedstawiono przykłady poprawnych i substandardowych sygnałów FP.

Rejestracje potencjałów czynnościowych (AP) za pomocą elektroporacji można przeprowadzać wielokrotnie z kultur 48 h po wysianiu na MEA. Dzięki zastosowaniu elektroporacji uzyskaliśmy dostęp wewnątrzkomórkowy, co pozwoliło na rejestrację wysokorozdzielczych AP z wielu sieci kardiomiocytów pochodzących z hiPSC. W celu przejściowej i odwracalnej konwersji potencjałów polowych (FP) na AP zastosowano impulsy o niskim napięciu (1 V, 1 ms, 1 Hz) przez 30 s. Elektroporacja umożliwia skuteczny dostęp wewnątrzkomórkowy do pomiaru AP w około 75% elektrod. Sygnały elektryczne rejestrowano przez 2 min, w tym 30 s przed elektroporacją, 30 s w trakcie oraz 1 min po elektroporacji. W celu oceny jakości sygnału i analizy we wszystkich punktach oceniano serie przebiegów AP trwających 10 s, zarejestrowane 10 s po elektroporacji. Wszystkie ślady niezgodne z czystym sygnałem AP zostały odrzucone. Aby zbadać, czy amplitudy AP korelują z sygnałem FP, poddano elektroporacji wszystkie 288 punktów w celu jednoczesnej rejestracji przebiegów. Reprezentatywne sygnały FP i AP zarejestrowane z tego samego punktu komórkowego z dwóch różnych elektrod przedstawiono na Rysunku 11A. Nie zaobserwowano korelacji między amplitudami FP a amplitudami AP po elektroporacji zarejestrowanymi z tego samego punktu komórkowego. Dodatkowo wielokrotna elektroporacja tego samego punktu komórkowego w odstępach 0, 24, 48, 72 i 96 h nie miała istotnego wpływu na kształt AP w czasie (Rysunek 11B).

Ze względu na wysokoprzepustowy charakter systemu, ręczna technika wyodrębniania i ilościowego określania interesujących parametrów, takich jak odstęp RR, częstotliwość chwilowa i różnicowy czas trwania potencjału czynnościowego, jest nieefektywna i czasochłonna. Do wykonywania pomiarów przebiegów z rozdzielczością 1 µs wykorzystuje się specjalnie napisany skrypt MATLAB, dostępny dla społeczności badawczej na żądanie. Punkty czasowe elektroporacji są nałożone na wyodrębniony sygnał, aby zidentyfikować 10 s AP po elektroporacji w celu przeprowadzenia ekstrakcji sygnału, zapewnienia jakości i segmentacji (Rysunek 8, Rysunek 9, Rysunek 10). Interfejs użytkownika umożliwia wybór pożądanego segmentu, wykorzystując nałożone wskaźniki elektroporacji jako pomoc. Segmentowany przebieg jest przetwarzany przez procedury pomocnicze w celu dalszej identyfikacji poszczególnych przebiegów AP. Odbywa się to poprzez detekcję piku, w której identyfikuje się najwyższe i najniższe napięcie dla każdego cyklu. Po zakończeniu tego procesu amplitudy są normalizowane, a powiązane wektory czasu są przesunięte, aby zdefiniować czas zero przy wartości piku równej 1. Do wyznaczenia pomiarów APD wykorzystano interpolację punktów przecięcia wzdłuż poszczególnych cykli. Tym samym częściowo zautomatyzowany proces segmentacji przebiegów AP umożliwia efektywną analizę danych dla różnych parametrów APD w wielu partiach kultur w krótkim czasie. Trwają prace nad dalszą automatyzacją kryteriów włączenia i wykluczenia dla FP i AP w celu analizy danych w czasie rzeczywistym.

Istotną zaletą wielodołkowej płytki MEA jest możliwość jej wielokrotnego ponownego użycia. Taka regeneracja umożliwia powtarzalne badania elektrofizjologiczne, co zapewnia kosztowo efektywne i spójne gromadzenie danych. Rejestracje potencjałów czynnościowych (AP) z tej samej matrycy po 6 regeneracjach przedstawiono na Rysunku 12. Stosunek sygnału do szumu jest zbliżony przy wielokrotnych ponownych użyciach. Aby wykazać niezawodność matrycy w powtarzalnych badaniach elektrofizjologicznych, z trzech partii po regeneracji zgromadzono łącznie 3815 kształtów fal AP i wyekstrahowano dane dotyczące czasu trwania AP w celu zbadania powtarzalności wyników. Przedstawiono wykresy rozkładu dla poszczególnych kształtów fal dla APD30, APD80, triangulacji (APD80—APD30) oraz skrócenia frakcyjnego ((APD80—APD30)/(APD80)) (Rysunek 13).

figure-results-1
Rysunek 1: Wstępne wysiewanie krio konserwowanych hiPSC-CM w celu dojrzewania. (A) Przetwarzanie komórek do wstępnego wysiewania 1 ampułki krio konserwowanych hiPSC-CM 10 dni po dyferencjacji. (B) Obrazy w kontraście fazowym udanych (lewo) i nieudanych (prawo) kultur hiPSC. Pasek skali: 275 µm. Przykłady udanych kultur 14 i 24 dni po dyferencjacji znajdują się w Wideo 1 i Wideo 2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Konfiguracja i przygotowanie wielodołkowej płytki MEA. (A) Schemat wielodołkowej płytki MEA: Płytka składa się z 24 dołków (od A1 do D6), z których każdy zawiera 12 macierzy mikroelektrod oraz 4 obwodowe elektrody referencyjne. Średnica elektrod: 30 µm / Odległość między elektrodami: 300 µm. Rejestracje mogą być pobierane z 288 elektrod jednocześnie. (B) Etapy sterylizacji i obróbki hydrofilowej, które należy przeprowadzić przed wysiewem hiPSC-CM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Dysocjacja hiPSC-CM i wysiew na wielodobową płytkę MEA. (A) Schematy etapów wysiewu hiPSC-CM na MEA dla każdego dołka. (B) Obraz mikroskopowy ilustrujący prawidłowe umieszczenie kropli komórek pokrywającej wszystkie 12 elektrod, bez rozprzestrzeniania się na 4 elektrody referencyjne. (C) Obrazy mikroskopowe w kontraście fazowym przykładowego (lewo) i nieoptymalnego (prawo) wysiewu hiPSC-CM na MEA w 24 h po wysiewie. Pasek skali = 275 µm. Przykładowy prawidłowy wysiew na MEA przedstawiono w Wideo 3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rycina 4: Oprogramowanie do akwizycji w badaniach przesiewowych w wielu studniach. Strzałki wskazują położenie kluczowych funkcji i elementów opisanych w tekście: panel Sterowania Temperaturą (1) umożliwia monitorowanie temperatury w czasie rzeczywistym podczas całego eksperymentu. Przycisk Wsuń/Wysuń (2) służy do mocowania i uwalniania płytki Multiwell MEA. Funkcja Definiowania Przepływu Eksperymentalnego (3) pozwala użytkownikowi ustawić czas trwania rejestracji. Funkcja Konfiguracji Akwizycji Danych (4) umożliwia ustawienie częstotliwości próbkowania oraz parametrów filtrów akwizycyjnych. Aby zobaczyć większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

figure-results-5
Rycina 5: hiPSC-CM (kardiomiocyty pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych) elektroporacja i akwizycja sygnałuDefinicja bodźca Karta ta umożliwia użytkownikowi zdefiniowanie parametrów impulsu elektroporacyjnego. Elektrody stymulacyjne Karta umożliwia użytkownikowi wybór elektrod do elektroporacji. Można wybrać dowolną kombinację z 288 elektrod. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Kontrola jakości wielodołkowych MEA pod kątem aktywności elektrycznej. Oprogramowanie-Multiwell-Screen wyświetlające okna z surowymi danymi z reprezentatywnymi przykładami optymalnych (A) i poniżej standardu (B) sygnałów FP. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rycina 7: Sygnały FP i AP z nowej oraz odnowionej macierzy. Etapy enzymatycznego czyszczenia wielodołkowej MEA (A). Sygnał bazowy nowej macierzy wykazuje minimalny stosunek sygnału do szumu (B), a sygnały FP obrazują aktywność elektryczną sieci (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-8
Rycina 8: Segmentacja i analiza danych. Widok głównego okna interfejsu graficznego (GUI) dla analizy przebiegów falowych (Waveform Analysis). Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

figure-results-9
Rysunek 9: Segmentacja i analiza danych. Przycisk Initialize Waveforms służy do identyfikacji i ekstrakcji przebiegów AP w celu ich segmentacji oraz do rozpoczęcia wstępnego przetwarzania poprzez powiększenie i zaznaczenie interesującego obszaru potencjału czynnościowego. Czerwone okręgi to wskaźniki elektroporacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-10
Rycina 10: Segmentacja i analiza danych. Wyznacza się piki (czerwone „x”) i minima (żółte kółka) dla każdej fali, a znormalizowane potencjały czynnościowe (APs) są naniesione na siebie w celu kontroli jakości przebiegów fal. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-11
Rycina 11: Zależność amplitudy AP od sygnału FP dla wielu pomiarów z tego samego miejsca komórki. Amplituda FP w zakresie µV (A, górny lewy panel) lub mV (A, górny prawy panel) zarejestrowana z dwóch niezależnych elektrod generuje amplitudę AP w zakresie mV (A, dolne panele lewy i prawy), co wskazuje na brak korelacji między amplitudami FP a amplitudami AP po elektroporacji. Znormalizowane przebiegi AP dla każdego pomiaru są nałożone na siebie, jak pokazano dla każdego zapisu. Wielokrotne elektroporacje tego samego miejsca komórki w czasie od 0 do 96 h pozwoliły uzyskać wysokiej jakości przebiegi AP, umożliwiając śledzenie elektrodynamiki błony (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-12
Rysunek 12: Rejestracje AP po sześciu regeneracjach. Przedstawiono kształty fal AP rejestrowane jednocześnie 10 s po elektroporacji z 12 elektrod w tej samej studzience. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-13
Rycina 13: Histogramy parametrów APD z wielu rekonstytucji. Przedstawiono wykresy rozkładu dla poszczególnych kształtów fali: APD30 (A), APD80 (B), triangulacji (APD80—APD30) (C) oraz frakcyjnego skrócenia ((APD80—APD30)/(APD80)) (D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Pliki uzupełniające. Filmy 1-3. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Z biegiem lat zastosowanie MEA ograniczało się do przeprowadzania pomiarów FP komórek pobudliwych w celu zbadania ich właściwości elektrofizjologicznych 36,37,38,39. Tylko kilka grup zgłosiło ślady AP z ogniw elektrogenicznych przy użyciu niestandardowej technologii opartej na MEA 18,29,30. Podejścia te nie zostały jednak zbadane w przypadku powtarzających się nagrań z tych samych preparatów. Opracowaliśmy innowacyjną i dokładną metodologię badania punktów dostępowych z tej samej lokalizacji komórkowej przez kilka dni w wielu sieciach hiPSC-CMjednocześnie 3. W opublikowanym przez nas badaniu wykorzystano wielodołkową platformę MEA z mikro-złotem do generowania bibliotek przebiegów AP z wielu partii kultur hiPSC-CM z dużą precyzją i rozdzielczością czasową 1 μs. Opisany tutaj protokół wyjaśnia rozsiewanie hiPSC-CM w macierzy w celu efektywnego rozwoju syncytialnych sieci CM dla wysokoprzepustowych nagrań AP. Kilka krytycznych etapów protokołu to: 1) produkcja wielu partii CM o wysokiej czystości o kontrolowanej jakości do kriokonserwacji, 2) wysoce opłacalne CM po rozmrożeniu do wstępnego powlekania i dojrzewania, 3) obróbka wielodołkowej płytki MEA do wysiewu CM, 4) dysocjacja kultur hiPSC-CM po 30 dniach od różnicowania w celu posiewu MEA oraz 5) przywrócenie MEA do wielokrotnego ponownego użycia.

Ważne jest, aby pamiętać, że różnice w różnicowaniu hiPSC między partiami mogą wpływać na wyniki eksperymentalne. Jednowarstwowa metoda różnicowania została zoptymalizowana wewnętrznie pod kątem wysokiego procentu produkcji kardiomiocytów 3,40. Analiza FACS markerów MLC2v i TNNT2 naszych kultur wykazuje ≥90% podobny do komorowego fenotypu3. Te kultury o kontrolowanej jakości są kriokonserwowane do badań eksperymentalnych. Obecne podejścia różnicowania dają niejednorodną mieszaninę komórek węzłowych, przedsionkowych i komorowych 3,16,17,41. W związku z tym strategie stosowane w celu wzbogacenia populacji podtypów CM mogą jeszcze bardziej poprawić specyficzność kultur. Ponadto można zastosować podejścia inżynierii tkankowej w celu przyspieszenia ich dojrzewania. Proponowane tutaj metody można łatwo wdrożyć w odniesieniu do innych źródeł syntezy zdolności wytwórczych.

Przebiegi AP zarejestrowane za pomocą MEA były podobne do tych zarejestrowanych z sieci kardiomiocytów za pomocą mapowania optycznego42,43, komplementarnego MEA opartego na półprzewodnikach tlenku metalu18,21 i symulowanego AP za pomocą zapisów FP20. Aby zająć się mechanizmem pomiarów AP za pomocą MEA, Hai i Spira,25 wykazało, że interfejs elektropore-elektroda naśladuje sprawdzoną technikę mikroelektrod z ostrego szkła. Jednak spoczynkowy potencjał błonowy i rzeczywiste wartości amplitudy w naszym badaniu nie mogą być ustalone, biorąc pod uwagę, że granica faz elektroporę-elektroda w systemach MEA nie jest skalibrowana, a amplituda jest funkcją czułości i rozdzielczości techniki. Nasze podejście ma podobne ograniczenia jak mapowanie optyczne, jeśli chodzi o amplitudę AP.

Odczyty FP/AP oparte na wielu dołkach MEA, o których mowa tutaj, otwierają nowe możliwości oceny bezpieczeństwa leków. Chociaż spontaniczne, te monowarstwy hiPSC-CM biją w stałym tempie. Analiza parametrów APD w wielu sieciach dostarcza informacji na temat niejednorodności elektrycznej (rysunek 13). Jednak kompleksowe analizy restytucji APD muszą uwzględniać wcześniejsze interwały rozkurczowe. Co więcej, wysokiej jakości przebiegi AP zarejestrowane z tego samego miejsca w komórce przez 96 godzin (ryc. 11B) są pierwszym raportem śledzącym elektrodynamikę błony w czasie, co będzie przydatne w rozwoju i chorobie.

Opisany tutaj protokół do ilościowego określania parametrów AP może być wykorzystany do generowania krzywych dawka-odpowiedź w celu badania związków. Jak niedawno donieśli Edwards i wsp.3, odpowiedź na dawkę noradrenaliny, izoproterenolu i E 4031 jest wykreślona dla APD w różnych fazach repolaryzacji. Opublikowane badanie wykazało dokładność i niezawodność podejścia do identyfikacji zależnych od dawki subtelnych zmian w przebiegach AP w czasie rzeczywistym. Technikę tę można łatwo rozszerzyć na inne związki lub biblioteki małych cząsteczek w celu zrozumienia różnych reakcji elektrofizjologicznych.

Podejście oparte na MEA do pomiarów AP przedstawione w tym badaniu będzie interesujące nie tylko dla elektrofizjologów, ale także dla biologów komórkowych i osób zajmujących się modelowaniem in silico . Co więcej, nagrania FP/AP z tego samego miejsca w komórce hiPSC-CM umożliwią naukowcom wygenerowanie bibliotek danych bioelektrycznych szerokiej gamy pobudliwych sieci komórkowych w krótkim czasie. Dostępność tych zasobów będzie cenna dla odkrywania leków i modelowania chorób.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AccutaseSigmaAldrich A6964-100MLroztwór do dysocjacji komórek
Oprogramowanie do akwizycjiSystemy wielokanałoweMultiwell-Screen v 1.9.2.0
B27 SuplementThermoFisher17504-044CM
Dodatek do mediów Oprogramowanie konwerteraSystemy wielokanałoweMultiChannel DataManager
DMEM/F12ThermoFisher11330-032
D-PBSThermoFisher14190-250
FBSFisher ScientificSH3007103HI
FibronectinSigma AldrichF1141-5MG
GeltrexThermoFisherA1413202podłoże powłokowe
Płyta interfejsu SystemywielokanałoweInterfejs Multiboot MCS-IFB 3.0 Płyta
Multiwell MEA PlateMultichannel Systems24W300/30G-288
RPMI 1640ThermoFisher11875-093CM podłoże bazowe
Terg-a-zymeSigma AldrichZ273287-1EAdetergent enzymatyczny
Pipety transferowe, pakowane pojedynczoFisher Scientific1371148
Trypan BlueSigma AldrichT8154-100ML
Ultraczysta sterylna wodaThermoFisher10977-023
6-dołkowe płytki poddane kulturom tkankowymFisher Scientific08-772-1B

Bibliografia

  1. Dambrot, C., Passier, R., Atsma, D., Mummery, C. L. Cardiomyocyte differentiation of pluripotent stem cells and their use as cardiac disease models. Biochemical Journal. 434 (1), 25-35 (2011).
  2. Dunn, K. K., Palecek, S. P. Engineering Scalable Manufacturing of High-Quality Stem Cell-Derived Cardiomyocytes for Cardiac Tissue Repair. Frontiers in medicine. 5, (2018).
  3. Edwards, S. L., et al. A Multiwell Cardiac muGMEA Platform for Action Potential Recordings from Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
  4. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).
  5. Huebsch, N., et al. Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses. Scientific Reports. 6, 24726(2016).
  6. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
  7. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), H2006-H2017 (2011).
  8. Sharma, A., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to assess drug cardiotoxicity. Nature Protocols. , (2018).
  9. Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
  10. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
  11. Burridge, P. W., Holmstrom, A., Wu, J. C. Chemically Defined Culture and Cardiomyocyte Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Human Genetics. 87, (2015).
  12. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  13. Burridge, P. W., Zambidis, E. T. Highly efficient directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into cardiomyocytes. Methods in Molecular Biology. , 149-161 (2013).
  14. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
  15. Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
  16. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), (2014).
  17. Zhang, J., et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).
  18. Jans, D., et al. Action potential-based MEA platform for in vitro screening of drug-induced cardiotoxicity using human iPSCs and rat neonatal myocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 87, 48-52 (2017).
  19. Strauss, D. G., Blinova, K. Clinical Trials in a Dish. Trends in Pharmacological Science. 38 (1), 4-7 (2017).
  20. Tertoolen, L. G. J., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 497 (4), 1135-1141 (2018).
  21. Braeken, D., et al. Open-cell recording of action potentials using active electrode arrays. Lab Chip. 12 (21), 4397-4402 (2012).
  22. Otsuji, T. G., et al. Progressive maturation in contracting cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: Qualitative effects on electrophysiological responses to drugs. Stem Cell Research. 4 (3), 201-213 (2010).
  23. Shinozawa, T., Imahashi, K., Sawada, H., Furukawa, H., Takami, K. Determination of appropriate stage of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug screening and pharmacological evaluation in vitro. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1192-1203 (2012).
  24. Raphel, F., et al. Identification of Ion Currents Components Generating Field Potential Recorded in MEA From hiPSC-CM. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 65 (6), 1311-1319 (2018).
  25. Hai, A., Spira, M. E. On-chip electroporation, membrane repair dynamics and transient in-cell recordings by arrays of gold mushroom-shaped microelectrodes. Lab Chip. 12 (16), 2865-2873 (2012).
  26. Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation. Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).
  27. Cohen, A., Shappir, J., Yitzchaik, S., Spira, M. E. Reversible transition of extracellular field potential recordings to intracellular recordings of action potentials generated by neurons grown on transistors. Biosensors and Bioelectronics. 23 (6), 811-819 (2008).
  28. Ojovan, S. M., et al. A feasibility study of multi-site,intracellular recordings from mammalian neurons by extracellular gold mushroom-shaped microelectrodes. Scientific Reports. 5, 14100(2015).
  29. Shmoel, N., et al. Multisite electrophysiological recordings by self-assembled loose-patch-like junctions between cultured hippocampal neurons and mushroom-shaped microelectrodes. Scientific Reports. 6, 27110(2016).
  30. Lin, Z. C., Xie, C., Osakada, Y., Cui, Y., Cui, B. Iridium oxide nanotube electrodes for sensitive and prolonged intracellular measurement of action potentials. Nature Communications. 5, 3206(2014).
  31. Stett, A., Burkhardt, C., Weber, U., van Stiphout, P., Knott, T. CYTOCENTERING: a novel technique enabling automated cell-by-cell patch clamping with the CYTOPATCH chip. Receptors Channels. 9 (1), 59-66 (2003).
  32. Kanda, Y., Yamazaki, D., Osada, T., Yoshinaga, T., Sawada, K. Development of torsadogenic risk assessment using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Japan iPS Cardiac Safety Assessment (JiCSA) update. Journal of Pharmacological Sciences. 138 (4), 233-239 (2018).
  33. Yang, X., Papoian, T. Moving beyond the comprehensive in vitro proarrhythmia assay: Use of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to assess contractile effects associated with drug-induced structural cardiotoxicity. Journal of Applied Toxicology. 38 (9), 1166-1176 (2018).
  34. Sala, L., Bellin, M., Mummery, C. L. Integrating cardiomyocytes from human pluripotent stem cells in safety pharmacology: has the time come. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3749-3765 (2017).
  35. Zlochiver, V., Edwards, S., Joshi-Mukherjee, R. Longitudinal Cardiotoxic Effect of Doxorubicin in a Multicellular Cardiac Model. Biophysical Journal. 116 (3), (2019).
  36. Del Alamo, J. C., et al. High throughput physiological screening of iPSC-derived cardiomyocytes for drug development. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (7 Pt B), 1717-1727 (2016).
  37. Clements, M. Multielectrode Array (MEA) Assay for Profiling Electrophysiological Drug Effects in Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Current Protocols in Toxicology. 68, 21-22 (2016).
  38. Navarrete, E. G., et al. Screening drug-induced arrhythmia [corrected] using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and low-impedance microelectrode arrays. Circulation. 128 (11 Suppl 1), S3-S13 (2013).
  39. Harris, K., et al. Comparison of electrophysiological data from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to functional preclinical safety assays. Toxicological Sciences. 134 (2), 412-426 (2013).
  40. Zlochiver, V., Edwards, S. L., Joshi-Mukherjee, R. Longitudinal Cardiotoxic Effect of Doxorubicin in a Multicellular Cardiac Model. Biophysical Journal. 116 (3), (2019).
  41. Waas, M., et al. Are These Cardiomyocytes? Protocol Development Reveals Impact of Sample Preparation on the Accuracy of Identifying Cardiomyocytes by Flow Cytometry. Stem Cell Reports. , (2019).
  42. Gorospe, G., et al. Automated grouping of action potentials of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 61 (9), 2389-2395 (2014).
  43. Zhu, W., Varga, Z., Silva, J. R. Molecular motions that shape the cardiac action potential: Insights from voltage clamp fluorometry. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 120 (1-3), 3-17 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kardiomiocyty pochodz ce z ludzkich iPSCwielodo kowe p ytki MEAmetoda elektroporacjianaliza danych w programie MATLABsygna y potencja w polowychprotok wysiewania kom rekbadania elektrofizjologiczneanaliza kszta tu falitestowanie lek w

Powiązane artykuły