Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mysi model przewlekłego hamowania CDK9 oparty na linii komórkowej w celu zbadania rozległych niegenetycznych wad wydłużenia transkrypcji(zdecydowanie TE) w nowotworach

5.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59910

⸱

26 września 2019

 ,  , 
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cancer and Blood Diseases Institute, Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC)

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół szczegółowo opisuje model raka mysiego in vitro o niegenetycznym wadliwym wydłużeniu transkrypcji. W tym przypadku przewlekłe hamowanie CDK9 jest wykorzystywane do tłumienia produktywnego wydłużania RNA Pol II wzdłuż genów odpowiedzi prozapalnej w celu naśladowania i badania klinicznie obserwowanego zjawiska zdecydowanie TE, obecnego w około 20% wszystkich typów raka.

Streszczenie

Wcześniej informowaliśmy, że podzbiór nowotworów jest definiowany przez globalne deregulacje transkrypcji z powszechnymi niedoborami w wydłużaniu transkrypcji mRNA (TE) - takie nowotwory nazywamyzdecydowanie TE. Warto zauważyć, że nowotwory TEzdecydowanie charakteryzują się fałszywą transkrypcją i wadliwym przetwarzaniem mRNA w dużym zestawie genów, takich jak szlaki interferonu/JAK/STAT i TNF/NF-κB, co prowadzi do ich supresji. Zdecydowanie podtyp TE nowotworów u pacjentów z rakiem nerkowokomórkowym i czerniakiem z przerzutami istotnie koreluje ze słabą odpowiedzią i wynikami immunoterapii. Biorąc pod uwagę znaczenie badania TEzdecydowanie nowotworów - ponieważ zwiastuje to istotną przeszkodę na drodze do immunoterapii - celem tego protokołu jestustanowienie zdecydowanie mysiego modelu TE in vitro w celu zbadania tych powszechnych, niegenetycznych nieprawidłowości transkrypcji w nowotworach i uzyskania nowych spostrzeżeń, nowych zastosowań istniejących leków lub znalezienia nowych strategii przeciwko takim nowotworom. Szczegółowo opisujemy zastosowanie przewlekłego hamowania CDK9 za pośrednictwem flawopirydolu w celu zniesienia fosforylacji reszty seryny 2 na C-końcowej domenie powtórzeń (CTD) polimerazy RNA II (RNA Pol II), hamując uwalnianie RNA Pol II do produktywnego wydłużania transkrypcji. Biorąc pod uwagę, że nowotworyTE zdecydowanie nie są klasyfikowane do żadnej konkretnej mutacji somatycznej, model farmakologiczny jest korzystny i najlepiej naśladuje obserwowane w nich powszechne defekty transkrypcyjne i epigenetyczne. Zastosowanie zoptymalizowanej subletalnej dawki flawopirydolu jest jedyną skuteczną strategią w tworzeniu uogólnionego modelu niegenetycznego powszechnego zaburzenia wydłużania transkrypcji i defektów przetwarzania mRNA, ściśle naśladując klinicznie obserwowanecechy zdecydowanie TE. Dlatego ten model TEzdecydowanie może być wykorzystany do analizy, autonomicznych czynników komórkowych, umożliwiając im oparcie się atakowi komórkowemu za pośrednictwem układu immunologicznego.

Wprowadzenie

Kluczowym krokiem ograniczającym szybkość ekspresji prawie wszystkich aktywnych genów jest przejście polimerazy RNA II (RNA Pol II) od promotora-proksymalnej pauzy do produktywnego wydłużenia1,2. Biorąc pod uwagę, że epigenetyczna dysregulacja wydłużenia transkrypcji pomaga w progresji wielu ludzkich nowotworów złośliwych definiowanych jako TEdefinitywnie, prowadząc do nieoptymalnej sygnalizacji w szlakach odpowiedzi pro-zapalnej, co oznacza słabą odpowiedź i wynik immunoterapii3, nadrzędnym celem tego protokołu jest ustanowienie użytecznego modelu in vitro do badania tych powszechnych niegenetycznych nieprawidłowości transkrypcyjnych w nowotworach. W tym świetle zastosowanie przewlekłego farmakologicznego hamowania CDK9 jest skuteczną strategią tworzenia uogólnionego modelu niegenetycznego powszechnego zakłócenia w wydłużaniu transkrypcji i defektach przetwarzania mRNA. Uzasadnieniem stosowania przewlekłego hamowania CDK9 jest to, że znosi on fosforylację reszty seryny 2 na C-końcowej domenie powtórzeń (CTD) RNA Pol II, hamując w ten sposób uwalnianie RNA Pol II do produktywnego wydłużania transkrypcji. Również nowotwory TE, opisane wcześniej przez naszą grupę3, nie są klasyfikowane do żadnej konkretnej mutacji somatycznej. Dlatego korzystny jest model niegenetyczny (farmakologiczny), który najlepiej naśladuje obserwowane w nich powszechne defekty transkrypcyjne i epigenetyczne. Przedstawiona w niniejszym dokumencie metoda szczegółowo opisuje generowanie i charakterystykę modelu przewlekłego leczenia flawopirydolem mysich komórek rakowych. Metoda ta w sposób oczywisty zakłóca wydłużanie transkrypcji wzdłuż genów charakteryzujących się dłuższymi długościami genomu, z przygotowanymi promotorami i indukowalnymi ekspresjami, takimi jak TNF/NF-κB i sygnalizacja interferonu/STAT, głęboko kontrolowanymi na poziomie wydłużenia transkrypcji3,4,5. Ogólnie rzecz biorąc, ten zoptymalizowany model defektów wydłużenia transkrypcji linii komórkowej myszy – jedyny model, o którym wiemy, do badania nowo opisanych guzów TE– napędza oporność na przeciwnowotworowy atak immunologiczny, tworząc użyteczny system do wykorzystywania i badania podatności niegenetycznych wad w podstawowej maszynerii transkrypcyjnej w nowotworach w porównaniu z atakiem komórek za pośrednictwem układu immunologicznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt oraz Instytucjonalny Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego Fundacji Badań nad Dziećmi w Cincinnati zatwierdziły wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach (protokół IACUC #2017-0061 i protokół IBC #IBC2016-0016), a te eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami opisanymi w Przewodniku NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Przewlekłe hamowanie RNA Pol II przez leczenie flawopirydolem—podstawowa strategia

  1. Wysiewaj mysie komórki czerniaka B16/F10 o niskiej gęstości (0,2 x 106) na 10 cm płytce hodowlanej w odpowiadającej im pożywce (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM], 10% płodowa surowica bydlęca [FBS], 1% penicylina i streptomycyna [Pen/Strep]) i inkubować przez noc w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  2. Następnego dnia przemyj komórki 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i dodaj nową partię pożywki hodowlanej z subletalną dawką (szacowaną na 25 nM) flawopirydolu - inhibitora czynnika elongacji RNA Pol II p-TEFb (cyklina T / CDK9) - przez jeden tydzień bez dalszej hodowli.
  3. Po tygodniu leczenia flawopirydolem należy przeprowadzić testy potwierdzające, aby ocenić zdolność modelu do podsumowania różnych atrybutów wad wydłużenia transkrypcji obserwowanych w zdecydowanie nowotworach TE.

2. Konfirmacyjny test immunoblot do oceny wadliwej funkcji RNA Pol II i upośledzenia szlaku interferonu (IFN) i sygnalizacji szlaku czynnika martwicy nowotworu (TNF) w wygenerowanym mysim modelu TEzdecydowanie

  1. Hodowla równej liczby (10,5) mysich komórek czerniaka B16/F10 traktowanych flawopirydolem i rodzicielskich mysich komórek czerniaka B16/F10 w dwóch różnych zestawach 12-dołkowych płytek (jeden zestaw do charakterystyki funkcjonalnej RNA Pol II, a drugi zestaw do stymulacji cytokin) w temperaturze 37 °C w inkubatorze nawilżanym o stężeniu 5% CO2 przez noc.
  2. Następnego dnia potraktuj komórki w zestawie do stymulacji cytokin mysim IFN-γ, IFN-α (5 ng / ml) lub TNF-α (5 ng / ml) przez 45 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Teraz wyekstrahuj białko z komórek zarówno w zestawach charakterystyki funkcjonalnej cytokin, jak i RNA Pol II, używając buforu do lizy testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) w następujący sposób:
    1. Przemyć komórki 1x PBS i poddać je lizie za pomocą 50 μl buforu do lizy na studzienkę. Zeskrobać, a następnie zagnieździć lizane komórki w temperaturze 4 °C, 21,130 x g.
    2. Zmierzyć białko w supernatantach lizatu komórkowego przy użyciu standardowego testu kolorymetrycznego dla stężenia białka po solubilizacji detergentem (test Bradforda lub podobny test).
  4. Załaduj równą ilość mierzonego białka (15 μg) z każdej próbki, aby uruchomić w żelu poliakrylamidowym 4%-18% dodecylosiarczanu sodu (SDS) i przenieś je na membrany z polifluorku winylidenu (PVDF).
  5. Zawiesić membrany PVDF w 5% suchym mleku w tris-buforowanym soli fizjologicznej 20 (TBST) przez 1 godzinę, a następnie przez noc inkubować w temperaturze 4 °C z pierwszorzędowymi przeciwciałami (RNA Pol II 1:1000; p-SER2 RNA Pol II 1:1000; p-SER5 RNA Pol II 1:1000; H3K36me3 1:2000; ogółem H3 1:2000; STAT1 1:1000; p-STAT1 1:1000; NFκB 1:1000; p-NFκB 1:1000; β-aktyna 1:5000) w 5% albuminie surowicy bydlęcej.
  6. Następnego dnia przemyć membrany PVDF 1x TBST przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT) i inkubować je z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi (anty-szczur [1:5000] dla RNA Pol II, p-SER2 RNA Pol II i p-SER5 RNA Pol II; anty-królik (1:5000) dla H3K36me3, całkowita H3, STAT1, p-STAT1, NFκB i p-NFκB) przez 50 minut w RT. Wykryj sygnały białkowe za pomocą dostępnego na rynku substratu peroksydazy chrzanowej (HRP) o zwiększonej chemiluminescencji.
    UWAGA: Stosowana β-aktyna pierwotna jest sprzężona z HRP, dlatego może być rozwijana bez wtórnej.

3. Test potwierdzający do oceny defektów przetwarzania mRNA w wygenerowanym mysim modelu TEzdecydowanie

  1. Wysiew: równą liczbę nasion (0,2 x 106) mysich komórek czerniaka B16/F10 traktowanych flaworidydolem i rodzicielskich mysich komórek czerniaka B16/F10 na 6-dołkowych płytkach w temperaturze 37 °C w inkubatorze nawilżanym o stężeniu 5% CO2 przez noc.
  2. Ekstrahować całkowite RNA z hodowanych komórek przy 60% zbiegu za pomocą odczynnika lub zestawu do ekstrakcji RNA (tabela materiałów).
  3. Zubożyć rRNA z całkowitego wyekstrahowanego RNA w następujący sposób:
    UWAGA: Protokół o niskim nakładzie wejściowym został dokooptowany z dostępnego na rynku zestawu w celu wyczerpania rRNA
    1. Ustaw jedną łaźnię wodną lub blok grzewczy na 70−75 °C, a drugą łaźnię wodną lub blok grzewczy na 37 °C.
    2. Dodać całkowity RNA (100−500 ng w 2 μl wody wolnej od nukleaz) z 1 μl sondy do selektywnego zmniejszania rRNA i 30 μl buforu hybrydyzacyjnego w probówce mikrowirówkowej, delikatnie wymieszać przez wirowanie i inkubować w temperaturze 70−75 °C przez 5 min.
    3. Teraz przenieść probówki do łaźni wodnej/bloku grzewczego o temperaturze 37 °C i pozostawić próbkę do ostygnięcia do 37 °C przez okres 30 minut.
    4. Ponownie zawiesić kulki magnetyczne sondy selektywnego zubożania rRNA przez wirowanie i podaniec 75 μl kulek w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml wolnej od RNaz.
    5. Umieść zawiesinę koralików na separatorze magnetycznym na 1 minutę. Pozwól, aby koraliki opadły. Delikatnie odessać i wyrzucić supernatant. Powtórzyć mycie kulek jeszcze raz, dodając 75 μl wody wolnej od nukleaz i odrzucając supernatant po separacji magnetycznej.
    6. Ponownie zawiesić umyte kulki w 75 μl buforu hybrydyzacyjnego, a następnie przelać 25 μl do innej probówki i utrzymywać w temperaturze 37 °C do późniejszego użycia.
    7. Umieść pozostałe 50 μl kulek na separatorze magnetycznym na 1 minutę i wyrzuć supernatant. Ponownie zawiesić kulki w 20 μl buforu hybrydyzacyjnego i utrzymywać go w temperaturze 37 °C do późniejszego wykorzystania.
    8. Po schłodzeniu mieszaniny RNA/sondy do selektywnego zubożenia rRNA do temperatury 37 °C przez 30 minut, należy krótko odwirować probówkę w celu zebrania próbki na dno probówki.
    9. Przenieść 33 μl mieszaniny RNA/sondy do selektywnego zmniejszania zużycia rRNA do przygotowanych kulek magnetycznych z kroku 3.3.7. Mieszaj przez wirowanie z małą prędkością.
    10. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Podczas inkubacji od czasu do czasu delikatnie mieszaj zawartość. Następnie następuje krótkie odwirowanie w celu pobrania próbki na dno probówki.
    11. Umieść probówkę na separatorze magnetycznym na 1 minutę, aby zagnieździć kompleks sondy rRNA. Tym razem nie należy wyrzucać supernatantu. Supernatant zawiera RNA zubożone w rRNA.
    12. Umieścić probówkę z 25 μl kulek z kroku 3.3.6 na separatorze magnetycznym na 1 minutę. Odessać i wyrzucić supernatant. Dodać supernatant z kroku 3.3.11 do nowej probówki z kulkami. Mieszaj przez wirowanie z małą prędkością.
    13. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Podczas inkubacji od czasu do czasu delikatnie mieszaj zawartość. Krótko odwirować probówkę, aby pobrać próbkę na dno probówki.
    14. Umieść probówkę na separatorze magnetycznym na 1 minutę, aby zagnieździć kompleks sondy rRNA. Nie należy wyrzucać supernatantu. Przenieść supernatant (około 53 μl) zawierający RNA zubożone w rRNA do nowej probówki.
    15. Zmierz stężenie wydajności RNA za pomocą spektrofotometru.
  4. Użyj połowy próbek zubożonych w rRNA jako danych wejściowych do kulek magnetycznych zawierających oligo (dT)25, aby wyekstrahować poliA+ RNA w następujący sposób:
    UWAGA: Ten protokół izolowania RNA przekaźnika ogona poliA za pomocą sekwencji oligo dT związanych z powierzchnią kulek magnetycznych został dokooptowany z komercyjnie dostępnego zestawu (Tabela materiałów).
    1. Zawiesić kulki oligo dT w fiolce, krótko wirując przez >30 s i przenieść 200 μl kulek oligodT do probówki. Dodać taką samą objętość (200 μl) buforu wiążącego i ponownie zawiesić.
    2. Umieść probówkę w magnesie na 1 minutę i wyrzuć supernatant. Teraz wyjmij rurkę z magnesu i ponownie zawieś umyte kulki oligo dT w 100 μl buforu wiążącego.
    3. Dostosuj objętość wejściowej próbki całkowitego RNA zubożonej w rRNA do 100 μl przy 10 mM Tris-HCl pH 7,5. Teraz dodaj 100 μl buforu wiążącego.
    4. Podgrzewać do 65 °C przez 2 minuty, aby rozbić drugorzędowe struktury RNA. Teraz natychmiast umieść na lodzie.
    5. Dodaj 200 μl całkowitego RNA do 100 μl przemytych kulek. Dokładnie wymieszać i umożliwić związanie, obracając się w sposób ciągły na wirniku przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Umieść probówkę na magnesie na 1-2 minuty i ostrożnie usuń cały supernatant i ostrożnie usuń cały supernatant.
    7. Wyjmij rurkę z magnesu i dodaj 200 μl buforu myjącego.
  5. Zmierzyć czystość i stężenie wyekstrahowanego poliA+ RNA za pomocą spektrofotometru.
    UWAGA: Stosunek 260/280 wynoszący 1,90−2,00 i stosunek 260/230 wynoszący 2,00−2,20 dla wszystkich próbek RNA są uważane za dopuszczalne.
  6. Pozostałą połowę próbek zubożonych w rRNA z sekcji 3.3 należy wykorzystać jako dane wejściowe do kolumn białka A (dostarczonych w zestawie immunoprecypitacji RNA [RIP], tabela materiałów) do immunoprecypitacji pięciu pierwszych czapeczkowanych RNA przy użyciu monoklonalnego przeciwciała 7-metyloguanozyny w następujący sposób:
    UWAGA: Ten protokół izolowania informacyjnego RNA z pokrywką m7G przy użyciu dostępnego na rynku zestawu do immunoprecypitacji RNA został dokooptowany i dalej zmodyfikowany.
    1. Umyj kulki magnetyczne białka A uzyskane z zestawu RIP zgodnie z protokołem producenta, aby wstępnie związać przeciwciało z kulkami.
    2. Przenieść 3 μg przeciwciała 7-metyloguanozyny (królicze IgG dostarczone w zestawie może być użyte do kontroli ujemnej) do kulek w probówce mikrowirówkowej zawieszonej w 100 μl buforze do płukania z zestawu.
    3. Inkubować z niską prędkością obrotową przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Krótko odwirować probówki, a następnie umieścić probówki na separatorze magnetycznym, usunąć i wyrzucić supernatant.
    4. Wyjmij probówki i dodaj 500 μl buforu do płukania z zestawu i krótko wymieszaj. Odwirować probówki na krótko, a następnie ponownie oddzielić magnetycznie, usunąć i wyrzucić supernatant.
    5. Powtórz krok 3.6.4 jeszcze raz.
    6. Dodać około 120 ng zubożonego rRNA (z sekcji 3.3) do wstępnie umytych kulek związanych z przeciwciałem 7-metyloguanozyny. Dodać 1 μl inhibitora RNazy. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1-1,5 godziny z łagodnym mieszaniem.
    7. Odwirować kulki w odległości 300 x g przez 10 s i usunąć supernatant zawierający niezabezpieczone (nie-7-metyloguanozynę) mRNA do nowej probówki do mikrowirówki.
    8. Dodaj 100 μl buforu do płukania i umyj go jeszcze dwa razy w podobny sposób. Zebrać zebrany supernatant w tej samej probówce do mikrowirówki, oznaczonej nieosłoniętym (nie-7-metyloguanozyną) mRNA. Przechowywać na lodzie.
    9. Eluować zakryte (7-metyloguanozynę) mRNA z kulek za pomocą 300 μl buforu do lizy mocznika (ULB) zawierającego 7 M mocznika, 2% SDS, 0,35 M NaCl, 10 mM EDTA i 10 mM Tris, pH 7,5 poprzez ogrzewanie kulek w temperaturze 65 °C przez 2-3 min.
    10. Zmieszać 300 μl eluowanych próbek (mRNA z czapeczką i bez czapeczki) z 300 μl alkoholu fenolowo-chloroformowego:izoamylowego (25:24:1; dostępny w handlu) (przechowywany w temperaturze 4 °C). Dobrze wymieszaj, odwracając i pozostaw na około 10 minut, a następnie ponownie delikatnie wymieszaj.
    11. Odwirować przy 18 928 x g przez 2 minuty i ostrożnie odpipetować górną warstwę do świeżej probówki i wyrzucić dolną warstwę.
    12. Do próbek dodać 300 μl fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (25:24:1; przechowywanego w temperaturze 4 °C). Dobrze wymieszać przez odwrócenie, a następnie odwirować przy 18 928 x g przez 1 min. Ostrożnie odpipetuj górną warstwę do świeżej probówki i wyrzuć dolną warstwę.
    13. Dodać 300 μl 2-porpanolu i 30 μl 3 M octanu sodu (pH 5,2) do zamkniętego i nieosłonkowanego RNA. Odwrócić próbkę kilka razy i umieścić ją w temperaturze -20 °C na 20 godzin.
    14. Następnie odwirować próbki o stężeniu 18 928 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć sklarowany osad i dodać 500 μl 70% etanolu.
    15. Ponownie odwirować przy 18,928 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie wyrzucić supernatant i wysuszyć osad w temperaturze pokojowej przez mniej niż 5 minut. Zawiesić osad w wodzie wolnej od nukleaz.
  7. Zmierzyć czystość i stężenie wydajności RNA za pomocą spektrofotometru. Stosunek 260/280 powinien mieścić się w zakresie 1,90−2,00, a stosunek 260/230 w zakresie 2,00−2,20 dla wszystkich próbek RNA.

4. Test potwierdzający do oceny odpowiedzi mysiego modelu TEna śmierć komórki, w której pośredniczy FasL.

  1. Wysiewać równą liczbę (30 000 komórek) mysich komórek czerniaka B16/F10 traktowanych flaworidydolem i rodzicielskich mysich komórek czerniaka B16/F10 na 96-dołkowej płytce hodowlanej w odpowiadającej im pożywce (DMEM) i inkubować przez noc w inkubatorze z wilgotnością 37 °C, 5% CO2
    2. .
  2. Traktować komórki w kapturze hodowlanym różnymi stężeniami hhis6FasL (0,1−1000 ng / ml) w obecności 10 μg / ml przeciwciała anty-His i inkubować przez 24 godziny w 37 °C, 5% CO2 wilgotnym inkubatorze.
  3. Usuń martwe komórki, przemywając je buforem 1x PBS. Utrwal przyczepione komórki w 4% paraformaldehydzie przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzuć 4% paraformaldehydu (nie ma potrzeby mycia) i zabarwij roztworem fioletu krystalicznego (20% metanolu, 0,5% fioletu krystalicznego w 1x PBS) przez 30 minut.
  4. Usuń nadmiar plamy, delikatnie spłukując płytki w wodzie z kranu. Utrzymuj talerze do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
  5. Ponownie rozpuść fiolet krystaliczny w 100 μl 1x niejonowego środka powierzchniowo czynnego rozpuszczonego w 1x PBS i zmierz gęstość komórek, mierząc absorbancję przy 570 nm w czytniku mikropłytek.

5. Test eksploracyjny do oceny odpowiedzi mysiego modelu TEna pewno na atak cytotoksycznych limfocytów T specyficznych dla antygenu

  1. Izolacja i aktywacja ataku cytotoksycznych limfocytów T OT-I CD8 + (CTL)
    1. Oczyść komórki CD8 + ze śledziony myszy OT-I TCR Tg RAG-1−/− przez magnetyczną separację komórek za pomocą mysiego zestawu do izolacji limfocytów T CD8 w następujący sposób:
      1. Zbierz dwie śledziony od dwóch myszy OT-I TCR Tg RAG-1−/− w kompletnych pożywkach RPMI.
      2. Rozgnieć śledziony w filtrze o wielkości 70 μm umieszczonym w probówce o pojemności 50 ml wypełnionej 20 ml RPMI, używając tylnej części strzykawki, aż w filtrze pozostanie tylko tłuszcz.
      3. Odwirować przepływ przy ciśnieniu 220 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
      4. Dodać 1 ml buforu do lizy krwinek czerwonych (RBC) do osadu śledziony z poprzedniego etapu wirowania i pipetować mieszaninę przez 1 minutę.
      5. Zneutralizuj roztwór, dodając do 10 ml RPMI.
      6. Wirować przy 220 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 10 ml RPMI.
      7. Weź małą porcję do liczenia. Pozostałą część odwirować przy 220 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      8. Na każdy milion zliczonych komórek należy ponownie zawiesić osad w 1 ml dostępnego na rynku bufora systemu separacji magnetycznej (bufor Mojo lub podobny bufor).
      9. Przygotować koktajl przeciwciał o objętości 100 μl na każdy 1 ml granulowanych komórek w kroku 5.1.1.8. W skład koktajlu przeciwciał wchodzą: biotyna anty-CD4, CD105, CD45R/B220, CD11c, CD49b, TER-119, CD19, CD11b, TCR γ/δ i CD44.
      10. Dodaj ten koktajl do 1 ml granulowanych komórek i trzymaj na lodzie przez 15 minut.
      11. Dodać 100 μl kulek magnetycznych (streptawidyny) do każdych 100 μl koktajlu przeciwciał dodanego do 1 ml zawieszonych granulowanych komórek śledziony. Trzymaj na lodzie przez 15 minut.
      12. Dodać 7 ml dostępnego w handlu buforu systemu separacji magnetycznej. Teraz podwielokrotność około 3-4 ml mieszaniny do świeżej probówki. Dobrze wymieszaj i przymocuj do magnesu na 5 minut.
      13. Zdekantować płyn (zawiera komórki CD8+) do świeżej probówki na lodzie. Teraz podwielokrotnić pozostałe 3-4 ml mieszaniny z kroku 5.1.1.12 do probówki i przymocować ją do magnesu na 5 minut. Zdekantować płyn (drugą partię wyizolowanych komórek CD8+) do tej samej probówki zawierającej pierwszą partię komórek CD8+ trzymanych na lodzie.
    2. Fibroblasty adherentne APC-(MEC. Klasa B7. SigOVA) do ekspresji specyficznego epitopu peptydu OVA257-264 (SIINFEKL) pochodzącego z albuminy jaja kurzego (OVA), ograniczonego H-2Kb (SIINFEKL), wraz z cząsteczką kostymulującą B7.1, w 75 000 komórek na studzienkę na płytkach 24-dołkowych, w temperaturze 37 °C, 5% CO2 nawilżany inkubator.
      UWAGA: Zastosowany adherentny fibroblast jest prezentem od laboratorium dr Edith Janssen w CCHMC. Linia została pierwotnie stworzona w laboratorium dr Stephena P. Schoenbergera w Instytucie Alergii i Immunologii La Jolla6.
    3. Po 24 godzinach przemyć jednowarstwę APC zmodyfikowanym pożywką Dulbecco firmy Iscove (IMDM) dostępną w handlu z buforem HEPES, pirogronianem sodu, L-glutaminą i wysoką glukozą) i dodać 0,5 x 106 naiwnych komórek OT-I CD8+ (z kroku 5.1.1.13) w 2 ml IMDM uzupełnionego 50 mM β-ME, 2 ml EDTA, 4 mM L-glutaminy i HEPES oraz 10% FBS.
    4. Po 20 godzinach delikatnie zebrać nieprzylegające komórki OT-I (zbierając pożywkę w naczyniu hodowlanym z pływającymi komórkami OT-I i granulując komórki w ilości 191 x g przez 2 minuty; policz zdolne do życia komórki OT-I) i przenieś je do kohodowli.
  2. Kohodowla komórek CD8+ z komórkami B16/F10-OVA
    1. Nasiona komórek CD8 + pochodzących z OT-I w stosunku 1:1 (300 000 komórek każda) w kohodowli z B16 / F10 (bez antygenowej albuminy jaja), nietraktowanych komórek B16 / F10-OVA i B16 / F10-OVA wstępnie potraktowanych flawopirydolem (25 nM) przez 1 tydzień, w 6-dołkowych naczyniach z kompletnymi pożywkami DMEM przez 20 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 .
    2. Po 20 godzinach usunąć komórki CD8 + pochodzące z OT-I (zbierając pożywkę w naczyniu hodowlanym z pływającymi komórkami CD8 + pochodzącymi z OT-I). Umyj przylegające komórki B16/F10-OVA w 1x PBS.
    3. Trypsynizować trzy grupy przyłączonych komórek B16/F10-OVA w 0,05% EDTA zawierającym trypsynę przez 5 min. Osadzać trypsynizowane komórki w 191 x g przez 5 min.
    4. Pobrane komórki B16 / F10-OVA wybarwić poprzez inkubację ich w zimnym PBS (zawierającym 0,5% FBS i 0,05% azydku sodu) barwnikiem żywotności i odpowiednimi znakowanymi przeciwciałami (możliwy do utrwalenia barwnik barwienia żywotności e780, mysz CD8 sprzężona z AF647 i mysz CD45 sprzężona z BV421).
    5. Przeanalizuj żywotność trzech grup komórek B16 / F10-OVA za pomocą cytometrii przepływowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy szczegółowy schemat (Rycina 1) ustanowienia modelu komórkowego TEdeff, otrzymanego poprzez chroniczną subletalną (Rycina 2) terapię flavopiridolem w stężeniu 25 nM. Na Rycynie 3 widać, że po 3 dniach traktowania flavopiridolem komórki B16 OVA wykazują częściowe cechy TEdeff, natomiast po tygodniu terapii komórki B16/F10 OVA wykazują głęboki...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kontrola elongacji RNA Pol II stała się decydującą dźwignią do regulacji ekspresji genów reagujących na bodźce z korzyścią dla komórek nowotworowych 5,7,8. Pokonanie proksymalnej pauzy promotora do elongacji i późniejszej produkcji mRNA wymaga aktywności kinazy P-TEFb 9,10,11. Nasz model wykorzystuje flawopirydol (25 nM), inhibitor niez...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez NCI (CA193549) i CCHMC Research Innovation Pilot Award dla Kakajana Komurova oraz nagrodę Departamentu Obrony (BC150484) dla Navneet Singh. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Cancer Institute lub Departamentu Obrony. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ani przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
hhis6FasLSygnalizacja komórkowa5452
10X TBSBio-Rad170-6435
12-dołkowe płytkiFalcon353043
20% metanoluFisher ChemicalA412-4
24-dołkowe płytkiFalcon351147
4– 18% SDS żel poliakrylamidowyBio-Rad4561086
4% ParaformaldehydThermo Fisher ScientificAAJ19943K2
5% mleczko w proszkuBio-Rad170-6404
Przeciwciało 7-metyloguanozynoweBioVision6655-30T
Płytki 96-dołkoweCellstar655180
AF647-skoniugowana mysz CD8Biolegend
antybiotyk i antybiotyk przeciwgrzybiczyGibco15240-062
przeciwciało anty-HeSygnalizacja komórkowa2366  Sygnalizacja
Anti-Rabit7074Rozcieńczenie 1:5000
Sygnalizacjakomórkowa przeciw szczuromRozcieńczenie 7077S1:5000
Zestaw testowy BradfordaBio-Rad5000121
BSAACROS Organics24040-0100
BV421-sprzężona mysz CD45Biolegend109831
krystaliczny fioletSigmaC3886-100G
DMEMGibco11965-092
Dynabeads Oligo (dT)25Ambion61002
FBSGibco45015
Fixable Live/Dead baring dye e780eBioscience65-0865-14
FlavopiridolSelleckchemS1230
H3k36me3Abcamab9050Rozcieńczenie 1:2000
IFN-αR& Systemy D12100-1
IFN-γR& D systems485-MI-100
IMDMGibco12440053
Immobilon Western Chemiluminescencyjny substrat HRPMilliporeWBKLS0500
MojoSort Mouse CD8 Zestaw do izolacji komórek TBiolegend480007
NF-κ Sygnalizacjakomórkowa8242sRozcieńczenie 1:1000
PBSGibco14190-144
p-NF-κ Sygnalizacjakomórkowa3033sRozcieńczenie 1:1000
p-Ser2-RNAPIIAktywny motyw61083Rozcieńczenie 1:500
p-Ser5-RNAPIIAktywny motyw61085Rozcieńczenie 1:1000
p-STAT1Sygnalizacja komórkowa7649sRozcieńczenie 1:1000
Zestaw eukariotów RiboMinuAmbion A10837-08
Bufor RIPASanta Cruz Biotechnologiasc-24948
RNAPIIAktywny motyw61667Rozcieńczenie 1:1000
STAT1Sygnalizacja komórkowa9175sRozcieńczenie 1:1000
TNF-&alfa;R& Systemy D410-MT-010
sygnalizacja komórkowaH34499Rozcieńczenie 1:2000
Tri odczynnikSigmaT9424
TritonSigmaT8787-50ML
Tween 20AA Hoefer9005-64-5
β-Sygnalizacja komórkowa aktyny12620SRozcieńczenie 1:5000
β-MEG Nauki biologiczneBC98
100727 komórkowa P B B całkowita

Bibliografia

  1. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews Genetics. 13 (10), (2012).
  2. Margaritis, T., Holstege, F. C. Poised RNA polymerase II gives pause for thought. Cell. 133 (4), 581-584 (2008).
  3. Modur, V., et al. Defective transcription elongation in a subset of cancers confers immunotherapy resistance. Nature Communications. 9 (1), 4410(2018).
  4. Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-145 (2009).
  5. Adelman, K., et al. Immediate mediators of the inflammatory response are poised for gene activation through RNA polymerase II stalling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (43), 18207-18212 (2009).
  6. van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. Naïve CTLs Require a Single Brief Period of Antigenic Stimulation for Clonal Expansion and Differentiation. Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).
  7. Gilchrist, D. A., et al. Regulating the regulators: the pervasive effects of Pol II pausing on stimulus-responsive gene networks. Genes & Development. 26 (9), 933-944 (2012).
  8. Danko, C. G., et al. Signaling pathways differentially affect RNA polymerase II initiation, pausing, and elongation rate in cells. Molecular Cell. 50 (2), 212-222 (2013).
  9. Nechaev, S., Adelman, K. Pol II waiting in the starting gates: Regulating the transition from transcription initiation into productive elongation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms. 1809 (1), 34-45 (2011).
  10. Zhou, M., et al. Tat modifies the activity of CDK9 to phosphorylate serine 5 of the RNA polymerase II carboxyl-terminal domain during human immunodeficiency virus type 1 transcription. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5077-5086 (2000).
  11. Palancade, B., Bensaude, O. Investigating RNA polymerase II carboxyl‐terminal domain (CTD) phosphorylation. European Journal of Biochemistry. 270 (19), 3859-3870 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

leczenie flawopirydolemfosforylacja polimerazy RNA IIredukcja H3K36me3defekty przetwarzania mRNAanaliza cytometrycznaizolacja za pomoc kulek magnetycznychmodel raka TEdeffmechanizm unikania odpowiedzi immunologicznej
Mysi model przewlekłego hamowania CDK9 oparty na linii komórkowej w celu zbadania rozległych niegenetycznych wad wydłużenia transkrypcji(zdecydowanie TE) w nowotworach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.