Artykuł metodologiczny

Identyfikacja śladów RNA:Kompleksy białkowe poprzez immunoprecypitację RNA w tandemie, a następnie sekwencjonowanie (RIPiT-Seq)

DOI:

10.3791/59913

⸱

10 lipca 2019

 ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Center for RNA Biology, The Ohio State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół wzbogacania endogennych miejsc wiązania RNA lub "śladów" kompleksów RNA:białko (RNP) z komórek ssaków. Podejście to obejmuje dwie immunoprecypitacje podjednostek RNP i dlatego nazywa się immunoprecypitacją RNA w tandemie (RIPiT).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunoprecypitacja RNA w tandemie (RIPiT) to metoda wzbogacania śladów RNA pary białek w kompleksie RNA:białko (RNP). RIPiT wykorzystuje dwa etapy oczyszczania. Po pierwsze, po immunoprecypitacji znakowanej podjednostki RNP następuje łagodne trawienie RNazy, a następnie elucja powinowactwa bez denaturacji. Druga immunoprecypitacja innej podjednostki RNP pozwala na wzbogacenie zdefiniowanego kompleksu. Po denaturującej elucji RNA i białek, ślady RNA są przekształcane w wysokoprzepustowe biblioteki sekwencjonowania DNA. W przeciwieństwie do bardziej popularnego sieciowania ultrafioletowego (UV), a następnie podejścia immunoprecypitacyjnego (CLIP) w celu wzbogacenia miejsc wiązania RBP, RIPiT jest niezależny od sieciowania UV. W związku z tym RIPiT może być stosowany do wielu białek obecnych w interaktomie RNA i poza nim, które są niezbędne do regulacji RNA, ale nie stykają się bezpośrednio z RNA lub wiązaniem UV z RNA. Dwa etapy oczyszczania w RIPiT zapewniają dodatkową zaletę polegającą na identyfikacji miejsc wiązania, w których białko będące przedmiotem zainteresowania działa w partnerstwie z innym kofaktorem. Strategia podwójnego oczyszczania służy również wzmocnieniu sygnału poprzez ograniczenie tła. W tym miejscu przedstawiamy krok po kroku procedurę wykonywania RIPiT i generowania wysokoprzepustowych bibliotek sekwencjonowania z izolowanych śladów RNA. Przedstawiamy również zalety i zastosowania RIPiT oraz omawiamy niektóre z jego ograniczeń.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W komórkach RNA występuje w kompleksie z białkami, tworząc RNA:kompleksy białkowe (RNP). RNP są składane wokół białek wiążących RNA (RBP, te, które bezpośrednio wiążą RNA), ale zawierają również inne niż RBP (te, które wiążą RBP, ale nie RNA) i często mają charakter dynamiczny. RBP i ich kofaktory funkcjonują wspólnie w RNP w celu wykonywania funkcji regulacyjnych. Na przykład w szlaku rozpadu mRNA za pośrednictwem nonsensu (NMD) białka UPF (UPF1, UPF2 i UPF3b) rozpoznają przedwcześnie zakończony rybosom. Każde z białek UPF może wiązać się z RNA, ale dopiero gdy łączą się ze sobą, zaczyna tworzyć się aktywny kompleks NMD. W tym kompleksie UPF1 jest dalej aktywowany przez fosforylację przez SMG1 inny niż RBP, a taka aktywacja UPF1 ostatecznie prowadzi do rekrutacji czynników indukujących rozpad mRNA1,2. W tym przykładzie RBP wymagają kofaktorów innych niż RBP do rekrutacji i aktywacji kompleksu RNP, który wyzwala NMD. Kolejną właściwością RNP jest ich niejednorodność składowa. Weźmy pod uwagę spliceosom, który występuje w odrębnych kompleksach E, A, B lub C. Różne kompleksy spliceosomów mają nakładające się na siebie i odrębne białka3. Aby zbadać funkcje RNP, ważne jest wyjaśnienie, które RNA są związane przez RBP i związane z nim białka. Istnieje wiele metod, które to umożliwiają, a każde podejście ma swoje wady i zalety4,5,6,7.

Bardzo popularne metody identyfikacji miejsc wiązania RBP - sieciowanie, a następnie immunoprecypitacja (CLIP) i jej różne odmiany - polegają na świetle ultrafioletowym (UV) do sieciowania RBP z RNA8. Nie jest to jednak skuteczne podejście w przypadku nie-RBP w RNP, które nie kontaktują się bezpośrednio z RNA. W tym miejscu opisujemy alternatywne podejście, które ma zastosowanie zarówno do RBP, jak i innych niż RBP, w celu wyizolowania i zidentyfikowania ich miejsc wiązania RNA. To podejście, zwane immunoprecypitacją RNA w tandemie (RIPiT), składa się z dwóch etapów immunoprecypitacji, które pomagają osiągnąć wyższą swoistość w porównaniu z pojedynczym oczyszczaniem (ryc. 1)9,10. Ze względu na to, że poszczególne etapy immunoprecypitacji (IP) mogą być przeprowadzane z mniejszą rygorystycznością w porównaniu z CLIP, RIPiT nie zależy od dostępności przeciwciał, które są odporne na obecność silnych detergentów podczas immunoprecypitacji. Najbardziej unikalną zaletą RIPiT jest możliwość celowania w dwa różne białka w dwóch etapach oczyszczania; Jest to skuteczny sposób na wzbogacenie składu kompleksu RNP różniącego się od innych podobnych kompleksów11.

Małe zmiany w procedurze RIPiT mogą jeszcze bardziej wzbogacić RNP. Na przykład niektóre interakcje RNA-białko lub białko-białko w RNP są przejściowe i może być trudno skutecznie oczyścić ślady takich kompleksów. Aby ustabilizować takie interakcje, RNP mogą być sieciowane w komórkach za pomocą formaldehydu przed lizą komórek i RIPiT. Na przykład zaobserwowaliśmy, że słaba interakcja między czynnikiem rdzeniowym kompleksu złączy eksonowych (EJC), EIF4AIII a czynnikiem demontażu EJC, PYM12 może być ustabilizowana za pomocą obróbki formaldehydem, dzięki czemu wzbogaconych jest więcej śladów RNA (dane nie pokazane). Przed pobraniem komórek i RIPiT komórki można również leczyć lekami w celu ustabilizowania lub wzbogacenia RNP w określonym stanie. Na przykład podczas badania białek, które są usuwane z mRNA podczas translacji (np. EJC13, UPF114), leczenie inhibitorami translacji, takimi jak puromycyna, cykloheksymid lub harringtonina, może prowadzić do zwiększonego zajmowania białek na RNA.

Ilość RNA odzyskanego z RIPiT jest zazwyczaj niska (0,5-10 pmoles, czyli 10-250 ng RNA, biorąc pod uwagę średnią długość RNA wynoszącą 75 nt). Głównym tego powodem jest to, że tylko niewielka część danego białka jest obecna w kompleksie z innymi białkami w RNP (każde "wolne" białko IP wytworzone w pierwszym etapie jest tracone w drugim IP). Aby wygenerować biblioteki RNA-Seq z tego RNA, przedstawiamy tutaj również adaptację wcześniej opublikowanego protokołu odpowiedniego dla tak niskich danych wejściowych RNA15,16 (Rysunek 2), co daje próbki gotowe do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości w ciągu 3 dni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ustanowienie stabilnych linii komórkowych HEK293 wyrażających indukowane tetracykliną białko o znaczeniu (POI) oznaczone flagą

  1. Nasiona komórek HEK293 ze stabilnie zintegrowanym miejscem docelowym rekombinacji Flp (FRT) o gęstości 10 x 104 komórek/ml w pożywce wzrostowej (zmodyfikowana pożywka Eagle's Dulbecco [DMEM] + 10% płodowa surowica bydlęca [FBS] + 1% penicylina-streptomycyna [penn/paciorkowiec]) na płytkach 6-dołkowych. Pozostawić komórki do wzrostu przez noc w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 (standardowe warunki wzrostu dla wszystkich kolejnych etapów).
  2. Następnego dnia komórki powinny być w ~70% zlewne. Zgodnie z protokołem odczynnika do transfekcji, transfekuj komórki HEK293 zawierające miejsce FRT w stosunku 9:1 pcDNA5-TETO-FLAG-POI:pOG44.
    nuta: Na etykiecie FLAG znajduje się motyw sekwencji DYKDDDDK (D = kwas asparaginowy, Y = tyrozyna i K = lizyna).
  3. Po 24 godzinach rozpocznij selekcję antybiotyków. Usuń pożywkę i dodaj świeże podłoże wzrostowe uzupełnione 100 μg/ml higromycyny. W ciągu 72 godzin nietransfekowane komórki powinny zacząć obumierać.
  4. Co 48-72 h zmieniaj pożywkę wzrostową i uzupełniaj świeżą higromycyną.
  5. Po ~2 tygodniach selekcji zaczną pojawiać się dyskretne kolonie stabilnie transfekowanych komórek. Gdy kolonie są widoczne gołym okiem, dodać 1 ml trypsyny do płytki i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Ponownie zawiesić komórki w DMEM, przenieść komórki na nową 10 cm płytkę i dostosować objętość do 10 ml świeżej pożywki wzrostowej uzupełnionej 100 μg/ml higromycyny. Pozwól, aby płytka osiągnęła ~80% konfluencji, aby dalej rozszerzać komórki w celu przygotowania trwałych zapasów.
  6. Określ ilość tetracykliny (Tet) wymaganą do uzyskania optymalnego poziomu ekspresji FLAG-POI dla eksperymentu. Hoduj komórki w formacie 12-dołkowym i przeprowadzaj miareczkowanie Tet w zakresie 0-1,000 ng / ml przez 16-24 godziny. Wykonać western blot na próbkach miareczkowania z przeciwciałem przeciwko POI.
    nuta: W przypadku białek do ~60 kDa, znakowana FLAG i endogenna kopia białka mogą być rozdzielone w elektroforezie w żelu dodecylosiarczanowo-poliakrylamidowym dodecylu sodu (SDS-PAGE) w celu porównania poziomów ekspresji FLAG-POI z jego endogennym odpowiednikiem. W przypadku większych białek intensywność sygnału w próbkach indukowanych przez Tet można porównać z próbkami nieindukowanymi. Roztwór podstawowy tetracykliny można przygotować w stężeniu 1 mg/ml w 100% etanolu. Rozcieńczenia preparatu do pracy z hodowlą komórkową powinny odbywać się w sterylnej wodzie lub roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wywar z tetracykliny należy przygotowywać na świeżo raz w miesiącu.

2. Hodowla komórek do indukcji tetracykliny i procedury RIPiT

  1. Nasiona stabilnie zintegrowane FLAG-POI HEK293 o gęstości 3 x 105 komórek/ml w podłożu wzrostowym w płytkach 15 cm. Pozwól komórkom rosnąć w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
    nuta: Ogólnie rzecz biorąc, od trzech do pięciu 15-centymetrowych płytek da ~ 2-20 pmol śladów RNA, w zależności od obfitości interesującego RNP. Jeśli RNP będą sieciowane formaldehydem i oczyszczane w rygorystycznych warunkach, może być wymagane dwa razy więcej wkładu.
  2. Dodać tetracyklinę do wcześniej ustalonego optymalnego stężenia do pożywki w celu wywołania ekspresji FLAG-POI (patrz krok 1.6) 16-24 godziny przed pobraniem komórek.
    nuta: Nie jest konieczna zmiana podłoża wzrostowego. Komórki powinny być gotowe do zbioru około 72 godzin po wysiewie lub gdy płytki są zlewające się w ~80%. Ważne jest, aby uniknąć zlewania się komórek.

3. Pobieranie komórek, obróbka formaldehydem i liza komórek

  1. Delikatnie umyj komórki jednowarstwowe 15 ml schłodzonego PBS na każdą 15 cm płytkę. Następnie zeskrob komórki w 30 ml PBS. Jeśli komórki były traktowane lekami przed pobraniem, uzupełnij PBS lekiem. Zbierz wszystkie komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    nuta: Aby zachować słabe interakcje, komórki można usieciować formaldehydem: dodać formaldehyd do zawiesiny komórek od kroku 3.1 do końcowego stężenia 0,1% i inkubować na kołysce w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Dodać 3 ml buforu hartowniczego (Tabela 1) i rozdrabniać przez dodatkowe 5 minut.
  2. Osadzać komórki w temperaturze 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
  3. Lizować komórki w 4 ml lodowatego hipotonicznego buforu do lizy (HLB; Tabela 1). Użyj pipety P1000 do ponownego zawieszenia komórek. Przenieść do probówki o pojemności 5 ml i inkubować lizat na lodzie przez 10 minut.
  4. Umieść lizat w łaźni lodowej i poddaj sonikacji przy amplitudzie 10% przez 30 s z impulsami 1 s z przerwami 2 s. Następnie dostosuj stężenie soli do 150 mM, dodając 108 μl 5 M NaCl.
    nuta: Próbki usieciowane formaldehydem mogą być poddawane bardziej rygorystycznej lizie i oczyszczaniu poprzez włączenie po 0,1% SDS i deoksycholanu sodu do buforu do lizy.
  5. Oczyścić lizat przez odwirowanie przy 21 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać 20 μl supernatantu (ekstraktu komórkowego) w znakowanej probówce do analizy Western blot poziomu białka na wejściu (patrz Rysunek 3A).
    nuta: Podczas gdy lizat znajduje się w wirówce, kulki agarozy FLAG można myć (patrz krok 4.1). Koraliki agarozowe FLAG należy wstępnie umyć 3x w 4 ml lodowatego izotonicznego buforu do płukania (IsoWB, Tabela 1).

4. FLAG Immunoprecypitacja

  1. Nałóż pozostały supernatant z etapu 3,5 do 750 μl wstępnie umytych kulek agarozowych FLAG w probówce o pojemności 5 ml (objętość złoża umytych kulek agarozowych FLAG wyniesie 375 μl). Inkubować kulki agarozy i ekstrakt komórkowy FLAG przez 1-3 godziny w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając.
    nuta: Ta objętość kulek agarozowych FLAG powinna być wystarczająca dla szerokiej gamy białek, ale w razie potrzeby może zostać zoptymalizowana.
  2. Granulki agarozowe FLAG przez odwirowanie w 400 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Zebrać 20 μl supernatantu w znakowanej probówce do analizy Western blot poziomu białka w ekstrakcie ze zubożonych komórek (patrz Rysunek 3A). Odrzucić pozostały supernatant.
  3. Aby umyć kulki agarozowe FLAG, dodaj 4 ml IsoWB i ponownie zawieś. Granulki w ilości 400 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant. Powtórz 4x.
    nuta: W przypadku rygorystycznego mycia usieciowanych formaldehydem IP, po 0,1% SDS i deoksycholanu sodu można włączyć do buforu płuczącego dla pierwszych dwóch etapów płukania.

5. Trawienie RNazy I

  1. Rozcieńczyć RNazę I do 0,002-0,01 jednostki/ml w 750 μl IsoWB (należy empirycznie określić odpowiednie stężenie dla pożądanych rozmiarów śladu). Dodać IsoWB-RNazę I do umytych kulek agarozy FLAG i inkubować, delikatnie mieszając w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
  2. Granulki w 400 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Zebrać 20 μl supernatantu (elucja RNazy I) w oznakowanej probówce do analizy Western blot. Wyrzuć IsoWB-RNazę I i umyj kulki agarozy FLAG 4x za pomocą IsoWB, jak opisano w kroku 4.3.

6. Eliminacja powinowactwa

  1. Przygotować zapas buforu elucyjnego (peptyd FLAG o stężeniu 250 ng/ml w IsoWB). Nanieść 375 μl buforu elucyjnego na kulki agarozy FLAG i delikatnie wstrząsać w temperaturze 4 °C przez 1-2 godziny. Granulować kulki agarozy FLAG i zebrać 15 μl podwielokrotności elucji dla Western blot białek w FLAG IP (patrz Rysunek 3A).
    nuta: Gdy elucja powinowactwa jest w toku, można wykonać sekcję 7.

7. Magnetyczne koniugacja koralików i przeciwciał

  1. Umyj 50 μl kulek magnetycznych (np. Dynabeads; Tabela materiałów) 3x w 1 ml IsoWB w probówce 1,5 ml. Zawiesić kulki magnetyczne w 100 μl buforu koniugacyjnego. Dodaj odpowiednią ilość przeciwciała (dokładna ilość przeciwciała, która ma być użyta do IP, będzie musiała zostać empirycznie określona dla każdego przeciwciała).
    nuta: Kulki magnetyczne białka A są optymalne dla przeciwciał wytwarzanych u królika, podczas gdy kulki magnetyczne białka G są bardziej odpowiednie dla przeciwciał myszy. Tabela kompatybilności kulek magnetycznych jest dostępna na stronie internetowej dostawcy, aby wybrać kulki odpowiednie dla każdego przeciwciała.
  2. Umyj kulki magnetyczne 2x w buforze koniugacyjnym (Tabela 1). Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 10 minut. Zawiesić kulki magnetyczne w 375 μl buforu rozcieńczającego RIPiT. Przechowywać na lodzie do następnego kroku.

8. Drugie immunoprecypitacja

  1. Zastosuj pozostałą elucję powinowactwa do flagi z kroku 6.1 do kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania. Inkubować z delikatnym mieszaniem w temperaturze 4 °C przez 1-2 godziny. Uchwyć kulki magnetyczne na magnesie i zbierz 15 μl supernatantu do analizy niezwiązanych białek za pomocą Western blot. Umyj kulki magnetyczne 7x 1 ml IsoWB.

9. Denaturacja Elucji

  1. Dodać 100 μl klarownego buforu do próbki (tabela 1) do kulek magnetycznych i ponownie zawiesić za pomocą pipety P200. Inkubować na lodzie przez 10 minut. Delikatnie przesuwaj, aby okresowo ponownie zawiesić koraliki.
  2. Uchwyć kulki magnetyczne na magnesie i zbierz 15 μl elucji do analizy białek w elucji RIPiT za pomocą western blot (patrz Rysunek 3A). Przenieść pozostałą elucję do nowej oznakowanej probówki o pojemności 1,5 ml.
    nuta: Jeżeli próbki były sieciowane formaldehydem, wówczas próbki muszą być inkubowane w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę w celu odwrotnego sieciowania.
  3. Wykonaj western blot na próbkach pobranych na różnych etapach (wejście, wyczerpanie IP FLAG, IP FLAG, drugie zubożenie IP, druga elucja IP). Osusz przeciwciałami przeciwko dwóm białkom przynęty, ich innym interaktorom, jeśli są znane, i co najmniej jednemu nieoddziałującemu RBP jako kontroli negatywnej (Rysunek 3A).

10. Ekstrakcja RNA i utwardzanie końcowe

  1. Do elucji RIPiT dodać 320 μl wolnego od RNaz ddH2O, 400 μl alkoholu fenolowo-chloroformowego izoamylowego (PCIAA, pH 4,5) i wirować przez 30 s i wirować w temperaturze pokojowej przy 12 000 x g przez 5 min. Zebrać 350 μl fazy wodnej do osobnej probówki. Dodać 35 μl 3 M octanu sodu, 1 μl 1 M MgCl2, 10 μg glikogenu i 1 ml 100% etanolu. Inkubować przez noc w temperaturze -20 °C.
  2. Aby uzyskać granulat RNA, odwirować przy 12 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przepłukać RNA w 70% etanolu.
  3. Aby usunąć 3' fosforan pozostały na RNA po rozszczepieniu RNazy I, ponownie zawieś osad RNA w 17 μl wolnego od RNaz ddH2O i dodaj 2 μL 10x buforu kinazy polinukleotydowej T4 (PNK) (tabela materiałów) i 1 μl T4 PNK. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.
    nuta: Aktywność 3'fosfatazy T4 PNK ma optymalną aktywność przy pH 617. Bufor reakcyjny PNK jest zoptymalizowany pod kątem aktywności kinazy 5' T4 PNK i ma pH 7,6. Chociaż podjęto próbę dostosowania pH reakcji utwardzania końcowego, krok ten można jeszcze bardziej zoptymalizować.
  4. Do probówki dodać 380 μl ddH2O bez RNaz i 400 μl PCIAA pH 4,5. Wirować przez 30 s, wirować przy 12 000 x g przez 5 min. Zebrać fazę wodną i dodać 35 μl 3 M octanu sodu, 1 μl 1 M MgCl2, 10 μg glikogenu i 1 ml 100% etanolu.
  5. Inkubować przez noc w temperaturze -20 °C. Osadzać osad i przemywać RNA 70% etanolem, jak wyżej. Zawiesić RNA w 4,5 μl wody wolnej od RNaz.

11. Oszacowanie wielkości i obfitości śladu RNA

  1. Oczekuje się, że udany RIPiT dostarczy 1 lub więcej fragmentów RNA. Aby określić ilościowo rzeczywistą wydajność, przenieś 0,7 μl RNA RIPiT (~1/6 całkowitej wydajności) do nowej probówki. Dodać 2 μL 10x buforu T4 PNK, 1 μL 1 mM ATP, 40 μCi γ32P-ATP (0,5−1,0 μL podstawy) i 1 μL T4 PNK. Zwiększyć objętość do 10 μl i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    1. W równoległych reakcjach PNK oznacz drabinkę DNA niskiego zakresu i 0,1 pmol syntetycznego RNA lub oligo DNA (20-40 nt), aby użyć wzorców wielkości i ilości.
  2. Rozpuścić znakowane RNA/DNA na 26% żelu mocznikowym PAGE (20 x 27 x 0,45 mm3). Żel musi być wstępnie uruchomiony przez 30 minut z mocą 35 W. Przepłukać studzienki przed uruchomieniem wstępnym i przed załadowaniem próbek, a następnie uruchomić z mocą 35 W, aż czoło barwnika błękitu bromofenolowego prawie osiągnie koniec żelu.
  3. Ostrożnie usuń żel ze szklanych płytek na kawałek bibuły filtracyjnej o wymiarach 8 x 11 cali. Z żelem na wierzchu papieru, umieść w aparacie do suszenia żelu i przykryj kawałkiem folii. Suszyć żel w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę z próżnią.
  4. Wysuszony żel należy wystawić na działanie fosfoekranu przez noc lub do momentu wykrycia odpowiedniego sygnału. Obraz fosfoekran. Dobrej jakości RNA z RIPiT powinno pojawić się jako rozmaz na pasie, z minimalnymi widocznymi prążkami (Rysunek 3B). Aby określić ilościowo RNA, porównaj intensywność sygnału fragmentów RNA o pożądanej wielkości w pasie RIPiT z sygnałem z 0,1 pmol znakowanego syntetycznego oligo.
    nuta: Alternatywnie, rozmiar i ilość śladu RNA można zweryfikować za pomocą bioanalizatora o wysokiej czułości (Rysunek 3C).

12. Podwiązanie adaptera

  1. Przygotować RIPiT RNA w taki sposób, aby co najmniej 3 pmol RNA rozpuścić w 3,8 μl wody.
  2. W probówce o pojemności 0,2 ml do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) wymieszaj 3,8 μl RNA, 1 μl wstępnie adenylowanego adaptera miR-CAT-33 (7 μM) (tabela materiałów). Inkubować mieszaninę na termocyklerze w temperaturze 65 °C przez 10 minut, w temperaturze 16 °C przez 5 minut, a następnie utrzymywać w temperaturze 4 °C.
    nuta: Wstępnie adenylowany łącznik można zamówić w usłudze syntezy oligo lub niestandardowy niedenylowany oligo DNA z dowolnej usługi syntezy oligo można adenylować przy użyciu ligazy Mth RNA (tabela materiałów) i oczyścić żelem.
  3. Do tej samej probówki dodaj 1,5 μl 10x buforu ligazy RNA T4, 7,5 μl 50% glikolu polietylenowego 8000 (PEG-8000), 0,75 μl 20 mM ditiotreitolu (DTT) i 0,45 μl T4 RNL2 Tr. K227Q (tabela materiałów).
    UWAGA: 50% PEG-8000 jest dostarczany z zakupioną ligazą RNA i buforem. Roztwory PEG-8000 są lepkie i należy je pipetować powoli.
  4. Inkubować reakcję w termocyklerze w temperaturze 30 °C przez 6 godzin, podgrzewać ligazę w temperaturze 65 °C przez 10 minut, następnie utrzymywać w temperaturze 4 °C.

13. Odwrotna transkrypcja

  1. Do probówki z mieszanką ligacyjną z kroku 12.4 dodać 11,25 μl mieszaniny 4x trifosforanu deoksynukleotydu (dNTP), która zawiera mieszaninę zwykłych i biotynylowanych dNTP (patrz Tabela 1), 1,0 μl 10 μM starterów RT (tabela materiałów) i 6,8 μl wody wolnej od RNaz. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut, a następnie utrzymywać w temperaturze 4 °C.
  2. Przenieść probówki do lodu i dodać 9,0 μl 5x buforu pierwszej nici (FS) bez MgCl2 (Tabela 1), 2,25 μL 100 mM DTT, 1,2 μL enzymu odwrotnej transkryptazy do końcowej objętości 45 μL (tabela materiałów).
  3. Inkubować w termocyklerze w temperaturze 55 °C przez 30–60 minut. Ogrzewać inaktywację odwrotnej transkryptazy w temperaturze 70 °C przez 15 minut i utrzymywać próbkę w temperaturze 4 °C.

14. Oczyszczanie produktu RT

  1. Dodać 45 μl 2x buforu obciążenia mocznika (Tabela 1) do reakcji RT. Rozcieńczyć 1 μg drabinki DNA niskiego zakresu w 45 μl i dodać 45 μl 2x buforu mocznikowego.
  2. Przygotuj 10% żel mocznikowy (20 x 28 x 0,15 cm3; Tabela 1) z 8-dołkowym grzebieniem. Za pomocą strzykawki lub pipety przepłukać studzienki 0,5x buforem Tris/boran/EDTA (TBE).
    nuta: Powyższe domowe żele oferują lepszą rozdzielczość w oddzielaniu rozszerzonego produktu RT od nieprzedłużonego podkładu RT. Alternatywnie można również zastosować prefabrykowane żele mocznikowe PAGE (tabela materiałów). Ponieważ żele prefabrykowane pozwalają na mniejsze maksymalne objętości na studzienkę, próbki będą musiały zostać podzielone na wiele dołków. Prefabrykowane żele powinny być uruchamiane przy napięciu 150−200 V.
  3. Uruchom żel z mocą 35 W przez 30 minut. Ponownie przepłucz studzienki, załaduj próbki i uruchom żel z mocą 35 W, aż czoło barwnika błękitu bromofenolowego przesunie się na około 1 cal od końca żelu.
    nuta: Użyj metalowego radiatora podczas biegu wstępnego i końcowego, aby zapobiec przegrzaniu żelu.
  4. Barwić żel przez 5 minut w 1x roztworze barwienia w żelu złotego kwasu nukleinowego przygotowanym w 0,5x TBE. Ten barwnik jest wrażliwy na światło, więc unikaj ekspozycji na światło.
  5. Żel obrazowy na skanerze fluorescencyjnym do celów dokumentacyjnych z wykorzystaniem filtrów wzbudzenia 520 nm i emisji 580 nm. Jeśli skaner fluorescencyjny jest niedostępny, użyj transiluminatora światła niebieskiego. Produkt RT powinien wyglądać jak rozmaz zaczynający się nad nieprzedłużonym starterem RT (Rysunek 4).
    nuta: Chociaż barwnik barwiący żel ze złotym kwasem nukleinowym można łatwo zwizualizować na żelu doc ze źródłem światła UV, ważne jest, aby nie wystawiać cennego produktu RT na działanie promieniowania UV, aby zapobiec uszkodzeniom.
  6. Zobrazuj żel na transiluminatorze światła niebieskiego i wytnij produkt RT z żelu. Zaleca się cięcie DNA z przedłużeniami w zakresie od 30 do 200 nt (Ryc. 4). Umieść wycięte kawałki żelu na czystej powierzchni i zmiel plasterek na małe kawałki, aby zwiększyć powierzchnię. Ostrożnie przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml i dodać 800 μl buforu elucji DNA (Tabela 1).
  7. Inkubować kawałki żelu, delikatnie mieszając z buforem elucji DNA przez noc w temperaturze pokojowej.
  8. Oddzielić bufor elucyjny od żelu, przepuszczając zawiesinę przez kolumnę filtracyjną z octanu celulozy (tabela materiałów) umieszczoną w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
  9. W probówce o pojemności 1,5 ml przemyć 10 μl kulek magnetycznych streptawidyny 500 μl buforu do płukania kulek streptawidyny (Tabela 1). Powtórz dla trzech prań łącznie. Nie pozwól, aby koraliki wyschły. Zawiesić kulki w 10 μl buforu elucji DNA (Tabela 1).
  10. Przenieść bufor elucyjny oddzielony od kawałków żelu w kroku 14.8 do probówki zawierającej przemyte kulki magnetyczne streptawidyny.
  11. Inkubować z delikatnym mieszaniem przez co najmniej 8 godzin w temperaturze pokojowej. Uchwyć kulki na magnesie, usuń supernatant i ponownie zawieś kulki magnetyczne w 10 μl wody wolnej od RNaz i przenieś do probówki PCR o pojemności 0,2 ml.

15. Obieg zamknięty produktu RT

  1. Produkty RT uchwycone na kulkach streptawidyny są okrągłe, gdy są związane na koralikach. Do zawiesiny kulki magnetycznej dodać 2,0 μl 10x buforu reakcyjnego cyrkularyzacji, 1,0 μl 1 mM ATP, 1,0 μl 50 mM MnCl2, 4,0 μl 5 M betainy, 1,0 μl ligazy ssDNA I (tabela materiałów) i 1,0 μl wody wolnej od RNaz.
  2. Inkubować reakcję cyrkularyzacji na termocyklerze w temperaturze 60 °C przez 4 godziny. Ogrzewać dezaktywować ligazę ssDNA I przez ogrzewanie w temperaturze 80 °C przez 10 minut, a następnie utrzymywać w temperaturze 4 °C.

16. Test PCR

  1. Przed przystąpieniem do PCR na dużą skalę należy użyć porcji produktu w obiegu zamkniętym, aby określić idealną liczbę cykli amplifikacji dla każdej próbki. Ten krok pomaga zapobiegać nadmiernej amplifikacji i ograniczać artefakty PCR, ponieważ składniki reakcji PCR stają się ograniczające przy wyższych cyklach PCR.
  2. Przygotować 45 μl reakcji PCR z 4,0-6,0 μl cyrkularyzowanego produktu z kroku 15.2, 9,0 μl 5x buforu reakcyjnego, 0,9 μL 10 M dNTPs, 2,25 μL 10 μM startera PE1.0 (tabela materiałów), 2,25 μl 10 μM startera PE2.0 (tabela materiałów) i 0,045 μl polimerazy DNA o wysokiej wierności (tabela materiałów), i woda.
  3. Dobrze wymieszaj reakcję i podziel na trzy reakcje po 15 μl. Każda z tych trzech reakcji będzie podlegała zmiennej liczbie cykli PCR. Oczekuje się, że idealna liczba cykli wyniesie od 7 do 14. Wykonuj więc testowe PCR dla 8, 11 i 14 cykli.
  4. Stosować następujące warunki PCR: 98 °C - 30 s; 98 °C - 5 s; 65 °C - 10 s; 72 °C - 15 s; 72 °C - 2 min; 12 °C - trzymać.
  5. Dodaj 3 μl 6x barwnika ładującego żel i rozpuść na 10% natywnym żelu PAGE, aż niebieski przód barwnika przeniesie 3/4 żelu. Wybarwić żel za pomocą złotego żelu z kwasem nukleinowym i obrazu, jak w krokach 14.4 i 14.5 (Rysunek 5).
  6. Aby wybrać idealną liczbę cykli PCR, porównaj produkty PCR z coraz większej liczby cykli. Wybierz numer cyklu, który daje największą ilość produktu o oczekiwanej wielkości bez artefaktów nadmiernej amplifikacji (np. rozmaz DNA znacznie większy niż oczekiwany produkt i gdzie nie obserwuje się znaczącego wyczerpania starterów PE1.0 i PE2.0 (patrz czerwona strzałka w Rysunek 5).

17. PCR na dużą skalę

  1. Przygotować 45 μl reakcji PCR, jak w kroku 16.2 i powtórzyć PCR. Rozwiąż PCR na 10% natywnej STRONIE przy 150 V, zabarwić 1x złotym barwnikiem żelowym z kwasem nukleinowym i obraz na transiluminatorze światła niebieskiego.
  2. Wyciąć produkt PCR z żelu i przenieść do strzykawki o pojemności 3 ml. Za pomocą strzykawki rozdrobnić żel i wytłoczyć go do probówki o pojemności 1,5 ml.
    nuta: Niewydłużony produkt RT po cyrkularyzacji daje produkt PCR o wartości 151 pz. Dlatego na tym etapie należy dobierać rozmiary produktów, które są większe niż 151 pz (Rysunek 6).
  3. Dodać 900 μl buforu elucyjnego DNA i inkubować w temperaturze pokojowej przez noc, delikatnie mieszając.
  4. Przenieść zawiesinę żelu do kolumny filtracyjnej z octanu celulozy umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Wirować z prędkością 12 000 x g przez 3 minuty, zbierając supernatant do świeżej probówki.
  5. Dodać kolejne 400 μl buforu elucyjnego DNA do rozdrobnionego żelu i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml. Inkubować z delikatnym mieszaniem przez dodatkowe 4 godziny do drugiej elucji.
  6. Zbierz wszystkie elucjacje i podziel je na 3 probówki po 400 μl każda. Wytrącić DNA, dodając 1 ml 100% etanolu i 10 μg glikogenu. Wirować i inkubować co najmniej 2 godziny w temperaturze -20 °C.
  7. Osad DNA w temperaturze 12 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć osad DNA 70% etanolem.
  8. Ostrożnie usunąć cały etanol za pomocą pipetowania i szybko zawiesić osad DNA w 20 μl wody.
    nuta: Na tym etapie ważne jest, aby nie dopuścić do wyschnięcia granulki DNA, ponieważ wysuszenie DNA może ją zdenaturować.
  9. Użyj niewielkiej porcji próbki DNA, aby określić wielkość i stężenie produktu PCR za pomocą fluorometru i bioanalizatora DNA o wysokiej czułości. Próbki można teraz przesyłać do sekwencjonowania na jednej z platform.
  10. Zsekwencjonowane odczyty mogą być przetwarzane (np. usuwanie adaptera, przycinanie w celu zachowania sekwencji >wynik 30 Phred), dopasowywane do genomu referencyjnego i wizualizowane w przeglądarce, takiej jak przeglądarka genomu UCSC (Rysunek 7).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udany RIPiT spowoduje immunoprecypitację zarówno interesujących białek, jak i innych znanych białek oddziałujących, oraz brak białek nieoddziałujących. Jak widać na Rysunek 3A, zarówno Magoh, jak i EIF4AIII zostały wykryte w elucji RIPiT, ale nie wykryto HNRNPA1 (pas 6). Równolegle ślady RNA, które uległy oczyszczeniu z kompleksami RNP, wykryto za pomocą autoradiografii ( Figura 3B) lub bioanalizatora ( Figura 3

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Omówiono tutaj kilka kluczowych kwestii, które należy wziąć pod uwagę, aby pomyślnie wykonać RIPiT. Przede wszystkim poszczególne adresy IP muszą być zoptymalizowane, aby osiągnąć najwyższą możliwą wydajność na każdym etapie. Ilość kulek agarozy FLAG w opisanej tutaj liczbie komórek wejściowych okazała się solidna dla szerokiego zakresu badanych przez nas białek. Ponieważ tylko niewielka frakcja białek partnerskich jest współimmunoprecypitowana z białkiem FLAG, ilość przeciwciała potrzebna do skutecznego drugiego IP jest...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez GM120209 grantowy NIH (GS). Autorzy dziękują OSUCCC Genomics Shared Resources Core za ich usługi (CCC Support Grant, NCI P30 CA16058).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Anti-FLAG Affinity GelSigmaA2220
ATP, [γ-32P]- 3,000 Ci/mmol 10 mCi/mL EasyTide, 250 &mikro; CiPerkinElmerBLU502A250UC
BD Jednorazowe strzykawki z końcówkami Luer-Lok (200)Fisher14-823-435
Betaina 5MSigmaB0300
biotyna-dATPTriLinkN-5002
biotyna-dCTPPerkin ElmerNEL540001EA
Sonifier Branson, model SSE-1Branson
CircLigase IVWR76081-606Ligaza ssDNA I
DMEM, wysoka zawartość glukozyThermoFisher11995-065
Bufor obciążenia DNA NEBNEB
Dynabeads Białko ALifeTech10002D
Flp-In-T-REx 293 Linia komórkowaThermoFisherR78007
GeneRuler DrabinaDNA niskiego zasięguThermoScientificFERSM1203
Hygromycyna BThermoFisher10687010
Mini-PROTEAN TBE Gel 10 dołkówBio-Rad4565013
Mini-PROTEAN TBE-Urea GelBio-Rad4566033
miRCAT-33 adapter 5′-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3′Każdyten protokół jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina
odczynnikiem do transfekcji Mirus transIT-X2ligazą MirusMIR 6004
MthNEBE2610S,
PE1.0, 5′-AATGATACGGCGACCGAGATCTACACT
CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′		Każdyz tych protokołów jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina
PE2.0 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC
GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3′		Każdyten protokół jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina
Fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (25:24:1, pH 6,7, 100 mLl)FisherBP1752I-100
Purple Gel Loading Dye (6x)NEBNEB #7025
Q5 Polimeraza DNANEBM0491S/L
RNase I, E. coli, 1,000U EppicenterN6901K
Kolumna SPIN-XCorningCLS8160-24EA
Koraliki streptawidynyThermoFisher60210
Indeks górny III (SSIII)ThermoScientific18080044enzym odwrotnej transkryptazy
SybrGold ThermoFisherS11494złoty barwnik żelowy kwasu nukleinowego
T4 Kinaza polinukleotydowa-2500UNEBM0201L
T4RNL2 Tr. K227QNEBM0351S Tetracyklina
Sigma87128
Termostabilna 5´ App DNA/RNA LigazaNEBM0319S
TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTGT 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Każdyten protokół jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina
TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTGT 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Każdyz tych protokołów jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina
TruSeq_SE11 5′-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA
GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTGT 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Każdyz tych protokołów jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina
TruSeq_SE12 5′-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTGT 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Każdyz tych protokołów jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina
TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Każdyz tych protokołów jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina
TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTGT 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Każdyz tych protokołów jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina
TruSeq_SE4 5′-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Każdyten protokół jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina
TruSeq_SE5 5′-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTGT 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Każdyz tych protokołów jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina
TruSeq_SE6 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC
CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Każdyz tych protokołów jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina
TruSeq_SE7 5′-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTGT 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTCTCT
TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Każdyz tych protokołów jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina
TruSeq_SE8 5′-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTGT 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT
CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Każdyz tych protokołów jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina
TruSeq_SE9 5′-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTGT 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC
CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Każdyz tych protokołów jest kompatybilny tylko z platformą sekwencjonowania Illumina,
Typhoon 5, Bimolecular ImagerGE Healthcare, Life Science, 29187191
, , , ,

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Karousis, E. D., Nasif, S., Mühlemann, O. Nonsense-mediated mRNA decay: novel mechanistic insights and biological impact. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 7 (5), 661-682 (2016).
  2. Ivanov, P. V., Gehring, N. H., Kunz, J. B., Hentze, M. W., Kulozik, A. E. Interactions between UPF1, eRFs, PABP and the exon junction complex suggest an integrated model for mammalian NMD pathways. The EMBO Journal. 27 (5), 736-747 (2008).
  3. Papasaikas, P., Valcárcel, J. The Spliceosome: The Ultimate RNA Chaperone and Sculptor. Trends in Biochemical Sciences. 41 (1), 33-45 (2016).
  4. Jensen, K. B., Darnell, R. B. CLIP: Crosslinking and ImmunoPrecipitation of In Vivo RNA Targets of RNA-Binding Proteins. Methods in Molecular Biology. 488, Clifton, N.J. 85-98 (2008).
  5. Garzia, A., Morozov, P., Sajek, M., Meyer, C., Tuschl, T. PAR-CLIP for Discovering Target Sites of RNA-Binding Proteins. mRNA Decay: Methods and Protocols. 1720, 55-75 (2018).
  6. Konig, J., et al. iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638(2011).
  7. Sibley, C. R. Individual Nucleotide Resolution UV Cross-Linking and Immunoprecipitation (iCLIP) to Determine Protein-RNA Interactions. RNA Detection: Methods and Protocols. 1649, 427-454 (2018).
  8. Wheeler, E. C., Van Nostrand, E. L., Yeo, G. W. Advances and challenges in the detection of transcriptome‐wide protein-RNA interactions. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (1), (2018).
  9. Singh, G., et al. The Cellular EJC Interactome Reveals Higher-Order mRNP Structure and an EJC-SR Protein Nexus. Cell. 151, 750-764 (2012).
  10. Singh, G., Ricci, E. P., Moore, M. J. RIPiT-Seq: A high-throughput approach for footprinting RNA:protein complexes. Methods. 65, 320-332 (2014).
  11. Mabin, J. W., et al. The Exon Junction Complex Undergoes a Compositional Switch that Alters mRNP Structure and Nonsense-Mediated mRNA Decay Activity. Cell Reports. 25 (9), 2431-2446 (2018).
  12. Gehring, N. H., Lamprinaki, S., Kulozik, A. E., Hentze, M. W. Disassembly of Exon Junction Complexes by PYM. Cell. 137 (3), 536-548 (2009).
  13. Dostie, J., Dreyfuss, G. Translation Is Required to Remove Y14 from mRNAs in the Cytoplasm. Current Biology. 12 (13), 1060-1067 (2002).
  14. Zünd, D., Gruber, A. R., Zavolan, M., Mühlemann, O. Translation-dependent displacement of UPF1 from coding sequences causes its enrichment in 3' UTRs. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (8), 936-943 (2013).
  15. Gangras, P., Dayeh, D. M., Mabin, J. W., Nakanishi, K., Singh, G. Cloning and Identification of Recombinant Argonaute-Bound Small RNAs Using Next-Generation Sequencing. Argonaute Proteins: Methods and Protocols. 1680, 1-28 (2018).
  16. Heyer, E. E., Ozadam, H., Ricci, E. P., Cenik, C., Moore, M. J. An optimized kit-free method for making strand-specific deep sequencing libraries from RNA fragments. Nucleic Acids Research. 43 (1), 2(2015).
  17. Cameron, V., Uhlenbeck, O. C. 3'-Phosphatase activity in T4 polynucleotide kinase. Biochemistry. 16 (23), 5120-5126 (1977).
  18. Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
  19. Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237(2015).
  20. Metkar, M., et al. Higher-Order Organization Principles of Pre-translational mRNPs. Molecular Cell. 72 (4), 715-726 (2018).
  21. Giudice, G., Sánchez-Cabo, F., Torroja, C., Lara-Pezzi, E. ATtRACT-a database of RNA-binding proteins and associated motifs. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
  22. Paz, I., Kosti, I., Ares, M., Cline, M., Mandel-Gutfreund, Y. RBPmap: a web server for mapping binding sites of RNA-binding proteins. Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 361-367 (2014).
  23. Sundararaman, B., et al. Resources for the Comprehensive Discovery of Functional RNA Elements. Molecular Cell. 61 (6), 903-913 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

RNA ImmunoprecipitationRIPiT Seq MethodUV Crosslinking IndependentRNA Footprint AnalysisProtein Complex EnrichmentExon Junction ComplexHEK293 CellsFLAG Agarose BeadsMagnetic Bead ConjugationPhenol Chloroform Extraction

Powiązane artykuły