Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Optymalizacja, projektowanie i unikanie pułapek w manualnej multipleksowej immunohistochemii fluorescencyjnej

9.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59915

⸱

26 lipca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, University of Michigan, 3Department of Pathology, University of Michigan

W tym artykule

Podsumowanie

Multiplex fluorescencyjna immunohistochemia to nowa technologia, która umożliwia wizualizację wielu typów komórek w nienaruszonej, utrwalonej formaliną, zatopionej parafinie tkance (FFPE). Przedstawiono wytyczne dotyczące zapewnienia udanego 7-kolorowego multipleksu wraz z instrukcjami dotyczącymi optymalizacji przeciwciał i odczynników, przygotowaniem preparatów, projektem i wskazówkami dotyczącymi unikania typowych problemów.

Streszczenie

Ocena mikrośrodowiska nienaruszonej tkanki do analizy infiltracji komórek i organizacji przestrzennej są niezbędne do zrozumienia złożoności procesów chorobowych. Główne techniki stosowane w przeszłości obejmują immunohistochemię (IHC) i immunofluorescencję (IF), które umożliwiają wizualizację komórek jako migawki w czasie przy użyciu od 1 do 4 markerów. Obie techniki mają wady, w tym trudności w barwieniu słabo antygenowych celów i ograniczenia związane z reaktywnością międzygatunkową. IHC jest niezawodny i powtarzalny, ale charakter składu chemicznego i zależność od widma światła widzialnego pozwala na użycie tylko kilku markerów i sprawia, że kolokalizacja jest wyzwaniem. Zastosowanie IF poszerza potencjalne markery, ale zazwyczaj opiera się na zamrożonej tkance ze względu na rozległą autofluorescencję tkanek po utrwaleniu formaliny. Cytometria przepływowa, technika, która umożliwia jednoczesne znakowanie wielu epitopów, znosi wiele braków IF i IHC, jednak potrzeba badania komórek jako zawiesiny pojedynczej komórki traci kontekst przestrzenny komórek odrzucających ważne relacje biologiczne. Multipleksowa immunohistochemia fluorescencyjna (mfIHC) łączy te technologie, umożliwiając fenotypowanie komórek z wieloma epitopami w tkance zatopionej w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE) przy jednoczesnym zachowaniu ogólnej architektury mikrośrodowiska i relacji przestrzennych komórek w nienaruszonej, niezakłóconej tkance. Fluorofory o wysokiej intensywności fluorescencji, które kowalencyjnie wiążą się z epitopem tkankowym, umożliwiają wielokrotne stosowanie przeciwciał pierwotnych bez obawy o specyficzną dla gatunku reaktywność krzyżową przez przeciwciała wtórne. Chociaż udowodniono, że technologia ta zapewnia wiarygodne i dokładne obrazy do badania chorób, proces tworzenia użytecznej strategii barwienia mfIHC może być czasochłonny i wymagający ze względu na rozległą optymalizację i projektowanie. W celu uzyskania wiarygodnych obrazów, które reprezentują dokładne interakcje komórkowe in situ i złagodzenia okresu optymalizacji dla analizy ręcznej, przedstawiono metody przygotowania preparatów, optymalizacji przeciwciał, projektowania multipleksów, a także błędów często spotykanych podczas procesu barwienia.

Wprowadzenie

Wizualizacja nienaruszonego mikrośrodowiska guza (TME) jest niezbędna do oceny nie tylko infiltracji komórkowej w litych nowotworach, ale także interakcji między komórkami. Multipleksowa immunohistochemia fluorescencyjna (mfIHC) stała się skutecznym narzędziem do fenotypowania komórek z wieloma antygenami w badaniu nowotworów i chorób pokrewnych1,2,3,4,5,6,7. To, w połączeniu z nowatorskim oprogramowaniem i programami przeznaczonymi do analizy dużych zbiorów danych, umożliwia obserwację złożonych interakcji między komórkami1,2,4. Czynnikiem ograniczającym szybkość pozyskiwania danych jest często jakość barwionej tkanki przed analizą.

Poprzednie techniki używane do fenotypowania komórek w TME obejmują immunohistochemię (IHC), immunofluorescencję (IF) i cytometrię przepływową, z których wszystkie mają znaczące ograniczenia. IHC wykorzystuje skrawki tkanek zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE), które są odparafinowane i ponownie uwodnione przed zabarwieniem najczęściej jednym przeciwciałem. Zastosowanie przeciwciała drugorzędowego związanego z peroksydazą chrzanową (HRP) i reakcji chemicznej pozwala na wizualizację pojedynczego epitopu antygenowego8. Podczas gdy IHC jest niezawodny i wykonywany na tkance FFPE, która jest łatwa w obróbce, ograniczenia w zakresie widma światła widzialnego oznaczają, że tylko jeden lub dwa markery mogą być wiarygodnie rozróżnione, a kolokalizacja antygenów jest dość trudna8. Sposobem na rozszerzenie dostępnych markerów, a tym samym antygenów, które można badać na jednym odcinku, jest przejście na fluorescencję, która pozwala na wykorzystanie szerszego zakresu spektrum wzrokowego. W przypadku IF, zamrożona tkanka lub FFPE jest przenoszona na szkiełka i stosuje przeciwciała, które są sprzężone z różnymi fluoroforami. Chociaż zwiększa to liczbę antygenów, które można zbadać, istnieje kilka ważnych ograniczeń. Po pierwsze, ponieważ każde przeciwciało zazwyczaj ma przyłączony tylko jeden fluorofor, jasność często nie jest wystarczająco silna, aby przezwyciężyć autofluorescencję tkanek. Z tego powodu większość IF jest wykonywana na zamrożonej tkance, która jest kosztowna w przechowywaniu i trudna w obróbce. Ograniczona liczba znaczników fluorescencyjnych jest dostępna do użytku ze względu na nakładanie się widma i reaktywność międzygatunkową, szczególnie w przypadku stosowania przeciwciał niesprzężonych. Cytometria przepływowa, która polega na przetwarzaniu świeżych tkanek na zawiesinę pojedynczej komórki i znakowaniu przeciwciałami fluorescencyjnymi, od dziesięcioleci jest złotym standardem immunofenotypowania9,10. Zaletą cytometrii przepływowej jest możliwość znakowania wielu przeciwciał bez obawy o reaktywność krzyżową gatunków, ponieważ większość z nich jest sprzężona. Ponieważ komórki są "wizualizowane" przez maszynę, a nie przez ludzkie oczy, dostępnych jest znacznie więcej fluoroforów, ale wiąże się to z kosztami. Kompensacja musi być wykonywana ręcznie, co może znacząco zmienić wyniki, powodując populacje fałszywie dodatnie i ujemne. Najważniejszym ograniczeniem cytometrii przepływowej jest to, że architektura tkankowa, a co za tym idzie cała informacja przestrzenna, jest tracona przez konieczność zawieszenia pojedynczych komórek.

Multipleksowa immunohistochemia fluorescencyjna (mfIHC) przy użyciu automatycznego mikroskopu fluorescencyjnego w połączeniu z nowatorskim oprogramowaniem łączy zalety IHC, IF i cytometrii przepływowej, umożliwiając barwienie tkanek wieloma antygenami ze wzmocnieniem sygnału i zachowaniem relacji przestrzennych bez potrzeby kompensacji. Tkankę FFPE umieszcza się na naładowanych szkiełkach, które po pobraniu antygenu poddawane są rundzie aplikacji przeciwciał pierwszorzędowych do docelowego antygenu będącego przedmiotem zainteresowania, a następnie przeciwciała drugorzędowego ze znacznikiem chemicznym HRP, podobnym do IHC. Po umieszczeniu przeciwciała drugorzędowego, reakcja specyficzna dla HRP powoduje kowalencyjne wiązanie fluoroforu z epitopem będącym przedmiotem zainteresowania11. Po znakowaniu tkanki kończy się kolejna runda podgrzewania szkiełków, usuwając wcześniej nałożony pierwszorzędowy i drugorzędowy kompleks przeciwciał, pozostawiając tylko znacznik fluorescencyjny związany z epitopem tkanki11. Pozwala to na ponowne zastosowanie wielu przeciwciał dowolnego gatunku bez obawy o reaktywność krzyżową11,12. Aby zminimalizować potrzebę ręcznej kompensacji wielu barwników fluorescencyjnych, do uzupełnienia mfIHC stosuje się zbiór fluoroforów o niewielkim nakładaniu się widmowym, w tym jądrowe barwienie przeciwjądrowe. Aby uwzględnić autofluorescencję występującą w tkance FFPE, oprogramowanie odejmuje autofluorescencję od końcowego obrazu za pomocą obrazu z pustego szkiełka, co jest możliwe ze względu na siłę fluorescencji specyficznej dla antygenu po wzmocnieniu sygnału fluoroforu. Korzystając z nowatorskich programów zaprojektowanych dla dużych zbiorów danych, lokalizacje komórek mogą być identyfikowane i analizowane pod kątem kontekstu przestrzennego1,2,4. Najważniejszym ograniczeniem tej techniki jest czas optymalizacji. Szczegółową metodologię wraz z instrukcjami dotyczącymi projektowania eksperymentu oraz strategii barwienia i obrazowania można znaleźć tutaj. mfIHC będzie przydatny dla laboratoriów, które obecnie nie posiadają zoptymalizowanego zautomatyzowanego systemu barwienia, a które chciałyby lepiej zrozumieć kontekst przestrzenny interakcji między komórkami w nienaruszonej tkance FFPE przy użyciu techniki ręcznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie prace zostały zatwierdzone przez wewnętrzną komisję rewizyjną Uniwersytetu Michigan.

1. Optymalizacja przeciwciał pierwszorzędowych i przygotowanie preparatów

  1. Określ idealne stężenie przeciwciał dla multipleksu przy użyciu konwencjonalnego IHC.
    1. Przetestuj przeciwciała dla multipleksu za pomocą ręcznej konwencjonalnej immunohistochemii (IHC)13.
    2. Używaj określonych tkanek, które mają obfity typ komórek dla każdego badanego przeciwciała, na przykład używając tkanki migdałków do testowania przeciwciał CD3.
    3. Należy zastosować stężenie referencyjne dla IHC zalecane przez firmę, a następnie uzupełnić IHC o stężenia przeciwciał w zalecanych stężeniach, a także stężenia powyżej i poniżej zalecanego stężenia.
  2. Przygotować utrwaloną w formalinie tkankę zatopioną w parafinie na szkiełkach.
    1. Za pomocą mikrotomu wyciąć bloki tkanki FFPE o grubości od 4 do 6 μm i nałożyć na naładowane szkiełka.
      UWAGA: Użycie wody destylowanej zapewnia prawidłowe zamontowanie tkanki i przyleganie w całym multipleksie.
    2. Ułóż szkiełka płasko chusteczką do góry i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze 37 °C na noc.
    3. Przechowuj slajdy w pudełku na slajdy z dala od ekstremalnych temperatur, aż będą gotowe do ukończenia multipleksu.

2. Ogólna metoda barwienia

  1. Przygotowanie roztworów do przemywania i pobierania antygenu
    1. Przygotować roztwór płuczący o stężeniu 0,1% TBST, mieszając 9 l wody dejonizowanej, 1 l soli fizjologicznej buforowanej tris (TBS) i 10 ml polisorbatu 20.
    2. Przygotować oba roztwory do pobierania antygenu (pH 6 i pH 9; Tabela materiałów) rozcieńczając do 1x wodą dejonizowaną.
  2. Deparafinowanie i ponowne nawodnienie
    1. Piecz szkiełka, leżąc płasko, chusteczką do góry w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę w piecu do hybrydyzacji1. Wyjmij szkiełka z piekarnika i pozostaw do ostygnięcia na co najmniej 5-10 minut, a następnie umieść na pionowym ruszcie do szkiełków.
    2. Preparaty należy traktować kolejno następującymi roztworami: ksylen w trzech powtórzeniach, a następnie pojedyncza obróbka 100% etanolem, 95% etanolem i wreszcie 70% etanolem przez 10 minut każde, używając zestawu do barwienia szkiełek1.
    3. Myj stojak szkiełek przez 2 minuty wodą dejonizowaną, zanurzając w plastikowym pudełku na szkiełka, a następnie utrwalając przez zanurzenie w plastikowym pudełku na szkiełka wypełnionym neutralną buforowaną formaliną przez 30 minut13. Umyj szkiełka w wodzie dejonizowanej przez 2 minuty, a następnie przystąp do pobierania antygenu.
  3. Pobieranie antygenu
    1. Umieść stojak ze szkiełkami w żaroodpornym pudełku wypełnionym do linii wewnętrznej (około 300 ml) buforem
      do pobierania antygenu o pH 6 lub 9.UWAGA: Bufor do pobierania antygenu może mieć pH 6 lub pH 9, które mogą wymagać optymalizacji dla każdego epitopu. Zacznij jednak od użycia pH 9 dla przeciwciał, które wiążą się z epitopami jądrowymi i pH 6 dla wszystkich innych przeciwciał.
    2. Przykryj pudełko folią i użyj gumki, aby zabezpieczyć. Umieść pudełko w kuchence mikrofalowej na krawędzi obracającej się płyty (kuchenka mikrofalowa musi być wyposażona w technologię inwerterową, aby zapewnić równomierne ogrzewanie). Podgrzewaj slajdy przez 45 s przy 100% mocy, a następnie 15 minut przy 20% mocy13.
      UWAGA: Obróbka mikrofalowa może wymagać optymalizacji w zależności od używanej kuchenki mikrofalowej.
    3. Pozostaw szkiełka do ostygnięcia przez około 15-20 minut.
  4. Przygotuj roztwory robocze przeciwciał i fluoroforów, gdy szkiełka ostygną.
    1. Przygotować pierwszorzędowy rozcieńczalnik przeciwciał, rozpuszczając 0,5 g granulek albuminy surowicy bydlęcej w 50 ml TBST. Alternatywnie użyj 50 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) do rozpuszczenia granulek.
    2. Przygotować każdy roztwór roboczy przeciwciała pierwszorzędowego do optymalnego stężenia określonego w sekcji 1 w rozcieńczalniku przeciwciał pierwszorzędowych. Oszacuj około 200 μl na szkiełko.
    3. Przygotować roztwór roboczy fluoroforu, rozcieńczając każdy fluorofor w rozcieńczalniku fluoroforowym w stężeniu 1:100.
      UWAGA: Może to wymagać optymalizacji w zależności od przeciwciała. Oszacuj około 100 μl na szkiełko.
    4. W ostatnim dniu barwienia przygotuj roztwór roboczy 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI), dodając 3 krople DAPI do 1 ml TBST.
  5. Barwienie szkiełek (mycie i blokowanie)
    1. Po schłodzeniu wyjmij pudełko z kuchenki mikrofalowej i zdejmij folię, umyj szkiełka wodą dejonizowaną przez 2 minuty, a następnie umyj 2 minuty w plastikowym pudełku na szkiełka wypełnionym TBST13.
    2. Po wysuszeniu każdego szkiełka wokół tkanki za pomocą delikatnego zadania przetrzyj, uważając, aby tkanka nie wyschła, obrysuj wokół zewnętrznej strony tkanki za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego. Nie dotykaj chusteczki delikatną chusteczką lub pisakiem.
    3. Umieść każde szkiełko w nawilżonej komorze i dodaj roztwór blokujący (około 4 krople) do tkanki. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  6. Barwienie szkiełka (aplikacja przeciwciał pierwotnych)
    1. Weź każde szkiełko i usuń roztwór blokujący, stukając bokiem szkiełka w stos ręczników papierowych i używając delikatnej chusteczki do zadań, aby usunąć nadmiar środka blokującego z okolic tkanki.
    2. Umieścić szkiełko z powrotem w wilgotnej komorze i dodać około 200 μl działającego przeciwciała pierwotnego. Inkubować w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    3. Myć TBST przez 2 minuty przez zanurzenie w triplicate13.
      UWAGA: Po każdym etapie prania zmiana TBST pomoże zapewnić czystszy obraz.
  7. Barwienie szkiełka (wtórne zastosowanie przeciwciał)
    1. Zetrzyj pozostałą TBST z każdego szkiełka i nałóż około 3 do 4 kropli przeciwciała drugorzędowego (mieszanina drugorzędowych przeciwciał sprzężonych z HRP królika i myszy). Inkubować przez 10 minut w wilgotnej komorze w RT13.
      UWAGA: Jeśli planujesz użyć przeciwciała pierwszorzędowego, które wymaga przeciwciała drugorzędowego innego niż mysz lub królik, lub decydujesz się na użycie alternatywnego przeciwciała drugorzędowego, zastosuj odpowiednie sprzężone z HRP wtórne do szkiełek i inkubuj w RT przez 45 minut. Optymalizacja czasu inkubacji może być potrzebna dla alternatywnego secondary14.
    2. Po inkubacji przemyć TBST przez 2 minuty w trzech egzemplarzach13.
  8. Barwienie szkiełka (aplikacja fluoroforu)
    1. Nałożyć około 100 μl roztworu roboczego fluoroforu i inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze RT przez 10 min13.
    2. Myć TBST przez 2 minuty w trzech egzemplarzach13.
  9. Usuwanie przeciwciał
    1. Szkiełka mikrofalowe (45 s przy 100%, a następnie 15 min przy 20%) w pudełku żaroodpornym (patrz krok 2.3.2) w celu usunięcia przeciwciał13,14.
      UWAGA: Na tym kończy się jedna runda multipleksu. Jest to jedyny punkt, w którym protokół może zostać wstrzymany. Aby wstrzymać protokół, pozostaw szkiełka zanurzone w buforze do odzyskiwania antygenu na noc w temperaturze pokojowej.
  10. Kontynuuj dodatkowe rundy barwienia. Powtórz kroki 2.5.1−2.9.1 dla pozostałych par przeciwciało-fluorofor. Po wykorzystaniu wszystkich przeciwciał i fluoroforów należy przejść do punktu 2.11.
  11. Aplikacja i montaż DAPI
    1. Po ostatniej rundzie barwienia w multipleksie, usuń ostatnią aplikację przeciwciał za pomocą roztworu do pobierania antygenu pH 613. Myj wodą dejonizowaną, a następnie TBST przez 2 minuty każdy13.
    2. Nanieść około 150 μl roboczego roztworu DAPI na szkiełka podstawowe i inkubować w wilgotnej komorze przez 10 minut w temperaturze RT1.
    3. Myć TBST przez około 30 sekund i zamocować szkiełka nakrywkowe za pomocą środka zapobiegającego blaknięciu. Po wyschnięciu nośnika nakrywkowego nałóż przezroczysty lakier do paznokci w czterech rogach szkiełka nakrywkowego, aby zabezpieczyć szkiełko nakrywkowe (opcjonalnie).

3. Szczegóły biblioteki, monopleksów i multipleksów

  1. Wybierz slajdy do budowy biblioteki fluoroforów.
    1. W przypadku 7-kolorowego multipleksu zbierz 7 szkiełek tkankowych bogatych w komórki odpornościowe (tj. migdałki, śledziona itp.) do biblioteki.
      UWAGA: Wybierz slajdy kontrolne, które mają być używane w bibliotece fluoroforów, przy czym każdy slajd reprezentuje każdy unikalny fluorofor, który będzie używany w multipleksie. Szkiełka kontrolne powinny mieć obfity epitop do wyboru i mogą być tym samym typem tkanki dla każdego fluoroforu.
  2. Slajdy z biblioteki plam i obrazów do użytku z monopleksami i multipleksami.
    1. Wykonaj kroki 2.1−2.9.1, korzystając z wybranych szkiełek kontrolnych i szkiełek kontrolnych tkankowych. Umieść inny fluorofor na każdym szkiełku w stężeniu 1:100; jeden slajd powinien zawierać tylko DAPI.
    2. Przejdź do sekcji 2.11, z wyjątkiem pominięcia barwienia DAPI i zamiast tego użyj TBST i zamontuj zgodnie z opisem.
    3. Po pozostawieniu szkiełek do wyschnięcia przez noc, obraz ze wszystkimi kanałami DAPI, CY3, CY5, CY7, Texas Red, półprzewodnikowymi kropkami kwantowymi i izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) ustawiając ekspozycję na 250 ms z funkcją ochrony przed nasyceniem1.
      UWAGA: Czasy naświetlania można ustawić na 50−250 ms13.
    4. Prześlij obrazy biblioteki do oprogramowania i wykorzystaj je w analizie monopleksów i multipleksów.
  3. Wybierz slajdy do monopleksów.
    1. Wybierz szkiełka kontrolne, które mają obfity epitop z wyboru w oparciu o zoptymalizowane przeciwciała (sekcja 1). Dla każdej rundy barwienia, która ma być wykonana w multipleksie, wybierz tę liczbę slajdów kontrolnych, aby utworzyć monopleksy.
      UWAGA: Celem monopleksu jest określenie najlepszej pozycji (kolejności) dla każdego przeciwciała, które ma być użyte w multipleksie.
  4. Bejce monopleksy.
    1. Postępuj zgodnie z sekcjami 2.1−2.11, używając przeciwciała pierwszorzędowego w innej kolejności (pozycji) dla każdego ze szkiełków. Na każde szkiełko powinno być nałożone tylko jedno przeciwciało pierwszorzędowe w kolejności (pozycji) innej niż pozostałe szkiełka.
      UWAGA: Dla każdego slajdu, w którym runda nie wymaga pierwszorzędowego przeciwciała ani fluoroforu, zamiast tego użyj pierwszorzędowego rozcieńczalnika przeciwciał i rozcieńczalnika fluoroforowego13.
  5. Slajdy obrazu i analiza monopleksu.
    1. Używając mikroskopu i ustawiając czas ekspozycji na 250 ms dla wszystkich kanałów, uchwyć każdy obraz, wykorzystując DAPI do ustawiania ostrości.
      UWAGA: Czasy naświetlania można ustawić na 50−250 ms14.
    2. Korzystając z oprogramowania analitycznego, oceń każdy szkiełko monopleksowe, patrząc na intensywność fluorescencji zabarwionego markera.
    3. Porównaj tę intensywność z tłem. Jeśli jest co najmniej 5-10 razy wyższa niż tło, pozycja tego slajdu jest optymalna do wykorzystania w końcowym multipleksie.
  6. Wybierz slajdy do multipleksu.
    1. Wybierz interesujące Cię preparaty i dodaj dodatkowe szkiełko, które będzie używane jako puste szkiełko do odejmowania autofluorescencji po barwieniu i obrazowaniu.
  7. Splamić multipleks.
    1. Na podstawie wyników monopleksu wybierz odpowiednią kolejność (pozycje) dla każdego przeciwciała w oparciu o krok 3.5.3. Przypisz każdy fluorofor do przeciwciała.
      UWAGA: Może to wymagać optymalizacji; Jednak zaplanuj użycie jasnych przeciwciał dla mniej licznych markerów1, przeciwciała kolokalizujące powinny być dopasowane do fluoroforów w odległych od siebie widmach < klasa SUP = "xref">13, a fluorofory o widmie 540 i 570 nie powinny być kolokalizowane z powodu problemów z nakładaniem się widma1.
    2. Postępuj zgodnie z sekcjami 2.1−2.11, upewniając się, że ślepe szkiełko nie otrzymuje pierwszorzędowego przeciwciała, fluoroforu lub DAPI, zamiast tego użyj odpowiednio rozcieńczalnika przeciwciał, rozcieńczalnika fluoroforowego i TBST.
  8. Multipleksowanie obrazu i analiza pod kątem integralności barwienia
    1. Używając mikroskopu i ustawiając czas ekspozycji na 250 ms dla wszystkich kanałów, uchwyć każdy obraz, wykorzystując DAPI do ustawiania ostrości.
    2. Korzystając z oprogramowania analitycznego (Tabela materiałów), oceń każdy multipleks za pomocą fluorescencyjnego fałszywego koloru.
      UWAGA: Wyraźny obraz powinien wyraźnie pokazywać każdy znacznik. Jeśli marker wygląda na rozproszony i ziarnisty lub nie istnieje, prawdopodobnie marker nie działał i wymaga ponownej optymalizacji.
    3. Korzystając z oprogramowania analitycznego, oceń każdy multipleks według widoku patologii. Widok patologii potwierdzi specyficzność każdego markera. Porównaj z wcześniej zoptymalizowanym IHC (sekcja 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Cały proces otrzymywania 7-kolorowego testu multipleksowego przebiega według powtarzalnego schematu. Rysunek 1 przedstawia ten proces w formie schematycznej. Po pocięciu i wysuszeniu preparatów lub ich otrzymaniu z laboratorium i wypieczeniu w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 60 °C przez 1 h, należy przystąpić do deparafinyzacji i rehydratacji, ponownie utrwalić preparaty w formalinie, a następnie przeprowadzić odblokowanie antygenów. Każda runda multipleksowania rozpoczyna się od odblok...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Nienaruszone próbki tkanek z biopsji guza litego i resekcji chirurgicznej pozostają ważnymi narzędziami diagnostycznymi i prognostycznymi do analizy choroby, a także rokowania pacjentów. Multipleksowa immunohistochemia fluorescencyjna (mfIHC) to nowatorska technika, która łączy w sobie zalety immunohistochemii (IHC), immunofluorescencji (IF) i cytometrii przepływowej. Dotychczasowe metody badania komórek in situ pozwalały na ocenę układów międzykomórkowych w środowisku tkankowym8, jednak niewielka...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Edowi Stackowi, poprzednio z Perkin Elmer, za pomoc w konfiguracji i optymalizacji oryginalnego barwienia multipleksowego. Autorzy chcieliby również podziękować Kristen Schmidt z Akoya Biosciences za wskazówki dotyczące korzystania z oprogramowania analitycznego. Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez National Cancer Institutes of Health w ramach nagrody numer P30CA046592, K08CA201581 (tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, hc), CA170568 (hc). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health. Dodatkowego wsparcia udzieliły Jeffery A. Colby, Colon Cancer i Tom Liu Memorial Research Funds.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100% etanolFisherHC8001GAL
70% etanolFisherHC10001GL
95% etanolOprogramowanie FisherHC11001GL
AnalysisAkoya BiosciencesCLS135783inForm wersja 2.3.0
Mocowanie zapobiegające blaknięciuThermoFisherP36961ProLong Diamond
Blocking solutionVectorSP-6000Bloxall
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma Life SciencesA9647-100G
Szkiełka nakrywkoweFisher12-548-5E
Delikatna chusteczka do zadańKimberly-Clark34120
Rozcieńczalnik fluorescencyjnyAkoya BiosciencesARD1A01EAOpal TSA rozcieńczalnik
Fluorophore 520Akoya Nauki biologiczneFP1487001KT1:100
Fluorofor 540Akoya BiosciencesFP1494001KT1:100
Fluorofor 570Akoya BiosciencesFP1488001KT1:100
Fluorofor 620Akoya BiosciencesFP1495001KT1:100
Fluorofor 650Akoya BiosciencesFP1496001KT1:100
Fluorofor 690Akoya BiosciencesFP1497001KT1:100
Fluorofor DAPIAkoya BiosciencesFP14903 krople w TBST lub PBS
Pudełko żaroodporneTissue-Tek25608-904Plastikowe pudełko na prowadnice-zielone
Komora nawilżanaIbi ScientificAT-12
Piec do hybrydyzacjiFisherBiotech
Hydrofobowy długopis barierowyVectorH-4000Mikroskop ImmEdge
Perkin ElmerCLS140089Stacja robocza do patologii ilościowej Mantra
Kuchenka mikrofalowaPanasonicNN-A661Sz technologią inwerterową
Neutralna buforowana formalinaFisher ScientificSF100-410% neutralny buforowany
formalin pH 6 bufor do odzyskiwania antygenuAkoya BiosciencesAR600
Bufor do odzyskiwania antygenuAkoya BiosciencesAR900AR9
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiFisherBP3994PBS
Plastikowe pudełko na suwakiTissue-Tek25608-906
FoliaFisherNC9070936
Polisorbat 20FisherBP337-800Tween 20
Podstawowy przeciwciało CD163LeciaNCL-LCD1631:400
Przeciwciało pierwszorzędowe CD3DakoA04521:400
Przeciwciało pierwszorzędowe CD8Spring BioM53901:400
Przeciwciało pierwszorzędowe FOXP3DakoM35151:400
Przeciwciało pierwszorzędowe pancytokeratynaSygnalizacja komórkowa126531:500
Przeciwciało pierwotne Komórka PD-L1 Sygnalizacja136841:200
Przeciwciało drugorzędoweAkoya BiosciencesARH1001EAPolimer opalowy
Zestaw barwników do szkiełekMikroskopia elektronowa Sciences6254001
Sól fizjologiczna buforowana TrisCorning46-012-CMTBS
Stojak pionowyMikroskopia elektronowa Sciences50-294-72
KsylenFisher
AR6 pH 9 X3P1GAL

Bibliografia

  1. Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
  2. Barua, S., et al. A Functional Spatial Analysis Platform for Discovery of Immunological Interactions Predictive of Low-Grade to High-Grade Transition of Pancreatic Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms. Cancer Informatics. 17, 1176935118782880(2018).
  3. Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-beta signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
  4. Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095(2017).
  5. Steele, K. E., Brown, C. Multiplex Immunohistochemistry for Image Analysis of Tertiary Lymphoid Structures in Cancer. Methods In Molecular Biology. 1845, 87-98 (2018).
  6. Gorris, M. A. J., et al. Eight-Color Multiplex Immunohistochemistry for Simultaneous Detection of Multiple Immune Checkpoint Molecules within the Tumor Microenvironment. The Journal Of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
  7. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7, (2017).
  8. Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis. Methods In Molecular Biology. 784, 155-167 (2011).
  9. Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews In Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
  10. Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
  11. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  12. Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
  13. Phenoptics Research Solutions. Perkin Elmer Manual. , 32(2016).
  14. Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , Perkin Elmer Manual. (2014).
  15. Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tkanka utrwalona w formalinie i zatopiona w parafinieoptymalizacja przeciwciałprojekt multipleksowyprzygotowanie szkiełekodsłanianie antygenówaplikacja fluoroforówtest monopleksowyanaliza przestrzennamikrośrodowisko guza
Optymalizacja, projektowanie i unikanie pułapek w manualnej multipleksowej immunohistochemii fluorescencyjnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.