Method Article

Optymalizacja, projektowanie i unikanie pułapek w manualnej multipleksowej immunohistochemii fluorescencyjnej

DOI:

10.3791/59915

⸱

July 26th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, University of Michigan, 3Department of Pathology, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multiplex fluorescencyjna immunohistochemia to nowa technologia, która umożliwia wizualizację wielu typów komórek w nienaruszonej, utrwalonej formaliną, zatopionej parafinie tkance (FFPE). Przedstawiono wytyczne dotyczące zapewnienia udanego 7-kolorowego multipleksu wraz z instrukcjami dotyczącymi optymalizacji przeciwciał i odczynników, przygotowaniem preparatów, projektem i wskazówkami dotyczącymi unikania typowych problemów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena mikrośrodowiska nienaruszonej tkanki do analizy infiltracji komórek i organizacji przestrzennej są niezbędne do zrozumienia złożoności procesów chorobowych. Główne techniki stosowane w przeszłości obejmują immunohistochemię (IHC) i immunofluorescencję (IF), które umożliwiają wizualizację komórek jako migawki w czasie przy użyciu od 1 do 4 markerów. Obie techniki mają wady, w tym trudności w barwieniu słabo antygenowych celów i ograniczenia związane z reaktywnością międzygatunkową. IHC jest niezawodny i powtarzalny, ale charakter składu chemicznego i zależność od widma światła widzialnego pozwala na użycie tylko kilku markerów i sprawia, że kolokalizacja jest wyzwaniem. Zastosowanie IF poszerza potencjalne markery, ale zazwyczaj opiera się na zamrożonej tkance ze względu na rozległą autofluorescencję tkanek po utrwaleniu formaliny. Cytometria przepływowa, technika, która umożliwia jednoczesne znakowanie wielu epitopów, znosi wiele braków IF i IHC, jednak potrzeba badania komórek jako zawiesiny pojedynczej komórki traci kontekst przestrzenny komórek odrzucających ważne relacje biologiczne. Multipleksowa immunohistochemia fluorescencyjna (mfIHC) łączy te technologie, umożliwiając fenotypowanie komórek z wieloma epitopami w tkance zatopionej w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE) przy jednoczesnym zachowaniu ogólnej architektury mikrośrodowiska i relacji przestrzennych komórek w nienaruszonej, niezakłóconej tkance. Fluorofory o wysokiej intensywności fluorescencji, które kowalencyjnie wiążą się z epitopem tkankowym, umożliwiają wielokrotne stosowanie przeciwciał pierwotnych bez obawy o specyficzną dla gatunku reaktywność krzyżową przez przeciwciała wtórne. Chociaż udowodniono, że technologia ta zapewnia wiarygodne i dokładne obrazy do badania chorób, proces tworzenia użytecznej strategii barwienia mfIHC może być czasochłonny i wymagający ze względu na rozległą optymalizację i projektowanie. W celu uzyskania wiarygodnych obrazów, które reprezentują dokładne interakcje komórkowe in situ i złagodzenia okresu optymalizacji dla analizy ręcznej, przedstawiono metody przygotowania preparatów, optymalizacji przeciwciał, projektowania multipleksów, a także błędów często spotykanych podczas procesu barwienia.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wizualizacja nienaruszonego mikrośrodowiska guza (TME) jest niezbędna do oceny nie tylko infiltracji komórkowej w litych nowotworach, ale także interakcji między komórkami. Multipleksowa immunohistochemia fluorescencyjna (mfIHC) stała się skutecznym narzędziem do fenotypowania komórek z wieloma antygenami w badaniu nowotworów i chorób pokrewnych1,2,3,4,5,6,7. To, w połączeniu z nowatorskim oprogramowaniem i programami przeznaczonymi do an....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie prace zostały zatwierdzone przez wewnętrzną komisję rewizyjną Uniwersytetu Michigan.

1. Optymalizacja przeciwciał pierwszorzędowych i przygotowanie preparatów

  1. Określ idealne stężenie przeciwciał dla multipleksu przy użyciu konwencjonalnego IHC.
    1. Przetestuj przeciwciała dla multipleksu za pomocą ręcznej konwencjonalnej immunohistochemii (IHC)13.
    2. Używaj określonych tkanek, które mają obfity typ komórek dla każdego badanego przeciwciała, na przykład używając tkanki migdałków do testowania przeciwciał CD3.
    3. Należy zastosować stężenie referencyjne dla IHC zalecane przez firmę,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cały proces uzyskiwania 7-kolorowego testu multipleksowego przebiega według powtarzalnego wzorca. Rysunek 1 opisuje proces w formie diagramu. Po pocięciu i wysuszeniu szkiełek lub otrzymaniu ich z laboratorium i wypieku w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę, następnie przystąpić do deparafinowania i ponownego nawodnienia, ponownie umieścić szkiełka w formalinie, a następnie pobrać antygen. Każda runda multipleksowania rozpoczyna się od pobrania antygenu i kończy na usu.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nienaruszone próbki tkanek z biopsji guza litego i resekcji chirurgicznej pozostają ważnymi narzędziami diagnostycznymi i prognostycznymi do analizy choroby, a także rokowania pacjentów. Multipleksowa immunohistochemia fluorescencyjna (mfIHC) to nowatorska technika, która łączy w sobie zalety immunohistochemii (IHC), immunofluorescencji (IF) i cytometrii przepływowej. Dotychczasowe metody badania komórek in situ pozwalały na ocenę układów międzykomórkowych w środowisku tkankowym8, jednak niewielka.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Edowi Stackowi, poprzednio z Perkin Elmer, za pomoc w konfiguracji i optymalizacji oryginalnego barwienia multipleksowego. Autorzy chcieliby również podziękować Kristen Schmidt z Akoya Biosciences za wskazówki dotyczące korzystania z oprogramowania analitycznego. Badania przedstawione w tej publikacji były wspierane przez National Cancer Institutes of Health w ramach nagrody numer P30CA046592, K08CA201581 (tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, hc), CA170568 (hc). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów Nationa....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100% etanolFisherHC8001GAL
70% etanolFisherHC10001GL
95% etanolOprogramowanie FisherHC11001GL
AnalysisAkoya BiosciencesCLS135783inForm wersja 2.3.0
Mocowanie zapobiegające blaknięciuThermoFisherP36961ProLong Diamond
Blocking solutionVectorSP-6000Bloxall
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma Life SciencesA9647-100G
Szkiełka nakrywkoweFisher12-548-5E
Delikatna chusteczka do zadańKimberly-Clark34120
Rozcieńczalnik fluorescencyjnyAkoya BiosciencesARD1A01EAOpal TSA rozcieńczalnik
Fluorophore 520Akoya Nauki biologiczneFP1487001KT1:100
Fluorofor 540Akoya BiosciencesFP1494001KT1:100
Fluorofor 570Akoya BiosciencesFP1488001KT1:100
Fluorofor 620Akoya BiosciencesFP1495001KT1:100
Fluorofor 650Akoya BiosciencesFP1496001KT1:100
Fluorofor 690Akoya BiosciencesFP1497001KT1:100
Fluorofor DAPIAkoya BiosciencesFP14903 krople w TBST lub PBS
Pudełko żaroodporneTissue-Tek25608-904Plastikowe pudełko na prowadnice-zielone
Komora nawilżanaIbi ScientificAT-12
Piec do hybrydyzacjiFisherBiotech
Hydrofobowy długopis barierowyVectorH-4000Mikroskop ImmEdge
Perkin ElmerCLS140089Stacja robocza do patologii ilościowej Mantra
Kuchenka mikrofalowaPanasonicNN-A661Sz technologią inwerterową
Neutralna buforowana formalinaFisher ScientificSF100-410% neutralny buforowany
formalin pH 6 bufor do odzyskiwania antygenuAkoya BiosciencesAR600
Bufor do odzyskiwania antygenuAkoya BiosciencesAR900AR9
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiFisherBP3994PBS
Plastikowe pudełko na suwakiTissue-Tek25608-906
FoliaFisherNC9070936
Polisorbat 20FisherBP337-800Tween 20
Podstawowy przeciwciało CD163LeciaNCL-LCD1631:400
Przeciwciało pierwszorzędowe CD3DakoA04521:400
Przeciwciało pierwszorzędowe CD8Spring BioM53901:400
Przeciwciało pierwszorzędowe FOXP3DakoM35151:400
Przeciwciało pierwszorzędowe pancytokeratynaSygnalizacja komórkowa126531:500
Przeciwciało pierwotne Komórka PD-L1 Sygnalizacja136841:200
Przeciwciało drugorzędoweAkoya BiosciencesARH1001EAPolimer opalowy
Zestaw barwników do szkiełekMikroskopia elektronowa Sciences6254001
Sól fizjologiczna buforowana TrisCorning46-012-CMTBS
Stojak pionowyMikroskopia elektronowa Sciences50-294-72
KsylenFisher
AR6 pH 9 X3P1GAL

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
  2. Barua, S., et al. A Funct....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplex Fluorescent ImmunohistochemistryFormalin Fixed Paraffin Embedded TissueAntibody OptimizationMultiplex DesignSlide PreparationAntigen RetrievalFluorophore ApplicationMonoplex AssaySpatial AnalysisTumor Microenvironment

Related Articles