Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Podwójne linijki DNA do badania mechanizmu translokacji rybosomów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu

5.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59918

⸱

8 lipca 2019

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Houston, 2Department of Biology and Biochemistry, University of Houston

W tym artykule

Podsumowanie

Test podwójnej linijki DNA został opracowany w celu określenia pozycji mRNA podczas translokacji rybosomów, która opiera się na siłach dysocjacji utworzonych dupleksów DNA-mRNA. Dzięki rozdzielczości pojedynczego nukleotydu i zdolności dotarcia do obu końców mRNA, może dostarczyć mechanistycznych spostrzeżeń na temat translokacji rybosomów i sondować przemieszczenia innych kwasów nukleinowych.

Streszczenie

Translokacja rybosomów odnosi się do ruchu rybosomów na mRNA przez dokładnie trzy nukleotydy (nt), co jest centralnym etapem syntezy białek. Aby zbadać jego mechanizm, należy spełnić dwa zasadnicze wymagania techniczne. Pierwszą z nich jest rozdzielczość pojedynczego nt, która może rozwiązać normalną translokację z przesunięcia ramki, podczas której rybosom porusza się o inne niż 3 nt. Drugim jest zdolność do sondowania zarówno strony wejściowej, jak i wyjściowej mRNA w celu wyjaśnienia całego obrazu translokacji. Przedstawiamy test podwójnej linijki DNA, który opiera się na krytycznych siłach dysocjacji dupleksów DNA-mRNA, uzyskanych za pomocą spektroskopii magnetyzacji resztkowej indukowanej siłą (FIRMS). Przy rozdzielczości siły 2-4 pN test podwójnej linijki jest wystarczający do rozróżnienia różnych etapów translokacji. Wdrażając długi łącznik na sondujących DNA, mogą dotrzeć do mRNA po przeciwnej stronie rybosomu, dzięki czemu można określić pozycję mRNA dla obu stron. Dlatego test podwójnej linijki jest wyjątkowo odpowiedni do badania translokacji rybosomów i ogólnie ruchu kwasów nukleinowych. Pokazujemy reprezentatywne wyniki, które wskazywały na zapętloną konformację mRNA i rozwiązały normalną translokację z przesunięcia ramki.

Wprowadzenie

Przemieszczenie biomolekularne jest podstawowym parametrem w badaniu mechanizmu powiązanych funkcji biologicznych. Jednym szczególnym przykładem jest translokacja rybosomów1,2, podczas której rybosom porusza się normalnie o dokładnie trzy nukleotydy (nt) na informacyjnym RNA (mRNA) i o jedną, dwie lub inną liczbę nt, z wyjątkiem trzech w przypadku przesunięcia ramki. Dlatego wymagana jest rozdzielczość pojedynczego nt w systemie linijki molekularnej, aby rozróżnić różne rozmiary kroków. Większym wyzwaniem jest zbadanie ruchu rybosomów zarówno po stronie wejścia, jak i wyjścia. Innymi słowy, tylko dzięki systemowi podwójnej linijki będziemy w stanie ujawnić, czy mRNA jest płynnie przewlekane przez rybosom, czy też istnieją etapy pośrednie, w których obie strony mają różne rozmiary kroków, co prowadzi do załamanej lub zapętlonej konformacji mRNA wewnątrz rybosomu.

Opracowano kilka metod, aby sprostać pierwszemu wyzwaniu, jakim jest rozwiązanie różnych etapów po stronie wyjściowej rybosomu (koniec 3' mRNA). Test podwójnej lucyferazy rozwiązuje różne ramki odczytu, mierząc proporcje wynikowych różnych białek3,4. Ma zastosowanie tylko do końca 3' mRNA, a zatem jest niewystarczający do zapewnienia pełnego obrazu translokacji. Spektrometria mas może analizować różne fragmenty peptydów w wyniku odpowiednich przegrupowań kodu5. Ale nie może wskazać, ile nt rybosom porusza się na mRNA. Test odciskania palców u nóg jest inną powszechną metodą, która wykorzystuje odwrotną transkryptazę zaszczepioną na 3'-dystalnym końcu do transkrypcji mRNA w kierunku rybosomu6. Nie ma to jednak zastosowania do końca 5' mRNA, który wchodzi do rybosomu. Inne techniki, w tym podejścia oparte na pojedynczych cząsteczkach i metody fluorescencji7, są trudne do osiągnięcia rozdzielczości pojedynczego nt.

Opracowaliśmy test podwójnej linijki DNA, który może jednoznacznie określić zarówno pozycje wejścia, jak i wyjścia odkrytego mRNA w kompleksach rybosom-mRNA. DNA linijki to oligomery DNA, które tworzą dupleksy pewnej liczby par zasad (bp) z mRNA odkrytym przez rybosom, niezależnie od tego, który koniec mRNA. Liczby bp precyzyjnie ujawniają następnie pozycję rybosomu na mRNA podczas translokacji. Liczby bp dupleksów są określane przez ich krytyczne siły dysocjacji uzyskane ze spektroskopii magnetyzacji resztkowej indukowanej siłą (FIRMS)8. Przy niepewności siły 2-3 pN, siły krytyczne są wystarczające, aby zapewnić rozdzielczość pojedynczego nt. Poprzez zaimplementowanie cząsteczki łącznikowej na linijkach DNA, można zbadać sterycznie utrudnioną stronę mRNA przez rybosom. W ten sposób można dokładnie rozwiązać różne przemieszczenia rybosomalne. Udało nam się odkryć unikalną zapętloną konformację mRNA uwięzionego przez antybiotyki podczas translokacji9 i rozwiązaliśmy różne ramki odczytu, które współistniały na śliskiej sekwencji mRNA10. W artykule opisano szczegóły testu podwójnej linijki, który obejmuje przygotowanie kompleksów rybosomów, funkcjonalizację powierzchni szkiełek szkiełkowych, immobilizację kompleksów rybosomów i ich hybrydyzację z magnetycznie znakowanymi cząsteczkami linijki DNA, detekcję magnetyczną i analizę widma sił przez FIRMS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie kompleksów rybosomów

  1. Przygotuj 1,000 ml buforu TAM10, który składa się z 20 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Mg (OAc)2, 30 mM NH4Cl, 70 mM KCl, 5 mM EDTA, 7 mM BME (2-merkaptoetanol) i 0,05% Tween20.
  2. Przygotować pięć mieszanin wymienionych w tabeli 1.
    UWAGA: Rybosom pochodził ze szczepu MRE600 klasy 11. EF-Tu: współczynnik wydłużenia niestabilny termicznie. EF-Ts: współczynnik wydłużenia termostabilny. GTP: trifosforan guanozyny. PEP: pirogronian fosfo(enolu).
  3. Inkubować pięć mieszanek oddzielnie w temperaturze 37 °C przez 25 minut przed utworzeniem kompleksów rybosomów. Przygotuj pięć kompleksów rybosomów zgodnie z tabelą 2.
    UWAGA: Poczta: po translokacji; Wstęp: przed translokacją.
  4. Dodaj każdy z pięciu kompleksów rybosomów na 1,1 M poduszkę sacharozy osobno, w stosunku objętościowym 1:1. Oczyść każdy z nich za pomocą 450 000 × g przez 2 godziny w ultra-wirówce. Za pomocą pipety usunąć supernatant i przywrócić kompleksy rybosomów w temperaturze -80 °C po ponownym zawieszeniu osadu z buforem TAM10.

2. Przygotowanie szkiełek szklanych pokrytych biotyną

  1. Wstępne czyszczenie szkiełek
    1. Umieść 12 szkiełek o wymiarach 60,0 × 4,0 × 0,3 mm3 (dł. × szer. × T) w krótkim i szerokim szklanym naczyniu.
    2. Napełnij szklane naczynie acetonem i sonikuj przez 5 minut. Następnie umyj szkiełka ultraczystą wodą 5 razy i napełnij 3/4 naczynia wodą.
    3. Dodaj 10 M KOH, aby napełnić naczynie i sonikować szklane szkiełka przez 20 minut. Umyj szkiełka wodą 5 razy.
    4. Dodać etanol i sonikować przez 5 minut, wylać etanol, a następnie suszyć je oddzielnie w temperaturze 300 °C przez 3 godziny.
  2. Powłoka aminozelanu
    1. Umieść 12 oczyszczonych szkiełek z powrotem w szklanym naczyniu zawierającym metanol. Oczyść kolbę PEGylacyjną metanolem przez sonikację przez 5 minut, a następnie napełnij ją 25 ml metanolu, 1,25 ml wody, 0,125 ml HAc, 0,25 ml 3-aminopropylotrietoksysilanu (AMEO).
    2. Natychmiast zastąp metanol w szklanym naczyniu przygotowanym roztworem AMEO. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    3. Kilkakrotnie spłucz szkiełka wodą, a następnie wysusz je przez przedmuchiwanie azotem. Umieść wysuszone szkiełka w czystych szklanych naczyniach.
  3. PEGlacja
    1. Przygotować roztwór NaHCO3 (8,4 mg/ml) i bufor PEGylacyjny (37,5 mg PEG, 6 mg biotynylowanego PEG, 150 μl roztworu NaHCO3). Dobrze je wymieszaj, wirując z prędkością 6 000 obr./min przez 1 min.
    2. Umieść 25 μl roztworu PEG na każdym szkiełku. Przykryj go drugim szkiełkiem na górze. Upewnij się, że między dwoma szkiełkami nie ma pęcherzyków powietrza. Umieść szkiełka w pustym pudełku z końcówkami do pipet. Upewnij się, że pudełko jest wypoziomowane i umieść je w ciemnej szufladzie na około 3 godziny.
    3. Opłucz szkiełka wodą i ponownie wysusz. Wysuszone szkiełka należy przechowywać w temperaturze pokojowej w próżni do 2 tygodni.

3. Przygotowanie próbki przed pomiarami magnetycznymi i siłowymi

  1. Obrobić plastyczną studzienkę na próbkę o wymiarach 4 × 3 × 2 mm3 (dł. × szer. × gł.). Przyklej kawałek szkła pokrytego biotyną (o długości około 5 mm, wycięty z szkiełek o długości 60 mm przygotowanych w sekcji 2) na dolnej powierzchni za pomocą żywicy epoksydowej.
  2. Dodać 20 μl 0,25 mg/ml wodnego roztworu streptawidyny do dołka na próbkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Następnie dwukrotnie przepłukać próbkę buforem TAM10.
  3. Unieruchomić kompleksy rybosomów.
    1. Bez antybiotyków: Za pomocą pipety usunąć bufor z dołka próbki, a następnie dodać 20 μl 0,1 μM kompleksu rybosomów (MF-Pre lub MF-Post) do dołka próbki. Kompleks rybosomów zwiąże się ze streptawidyną na powierzchni za pośrednictwem biotyny na końcu 5' na mRNA. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, a następnie przepłukać raz buforem TAM10.
    2. W doświadczeniu z użyciem zarówno neomycyny, jak i kwasu fusydowego: inkubować kompleks MF-Pre z neomycyną w temperaturze 37 °C przez 10 minut; inkubować EF-G z kwasem fusydowym w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Stężenia są następujące: 0,1 μM kompleksu rybosomów, 2 μM EF-G, 4 mM GTP, 4 mM PEP, 0,02 mg/ml kinazy pirogronianowej, 0,2 mM neomycyny i 0,25 mM kwasu fusydowego.
    3. W podobny sposób przeprowadź inne eksperymenty z antybiotykami. Stężenia są następujące: 0,2 mM wiomycyny, 0,4 mM higromycyny B i 0,25 mM kwasu fusydowego.
    4. W celu badania przesunięcia ramki powtórzyć powyższe kroki dla kompleksów MFNF-Pre i MFNF-Post z udziałem śliskiego motywu U6A. Należy użyć odpowiednio antybiotyków: kwasu fusydowego i neomycyny oraz samego kwasu fusydowego.
  4. Usunąć bufor z dołka próbki, a następnie dodać 20 μl 1 μM biotynylowanej nici sondującego DNA i inkubować w temperaturze pokojowej przez noc. Przepłukać utworzony dupleks DNA-mRNA raz buforem TAM10.
  5. Usunąć bufor ze studzienki na próbkę. Następnie dodać 20 μl kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną o stężeniu 0,5 mg/ml do dołka na próbkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  6. Ostrożnie włożyć próbkę do uchwytu i umieścić ją w wirówce. Usunąć wolne cząstki magnetyczne z powierzchni przez odwirowanie przy 84 x g przez 5 minut.

4. Pomiary magnetyczności i siły

  1. Włączanie lasera
    1. Włącz laser za pomocą klucza. Następnie naciśnij przycisk zasilania.
    2. Dostosuj czułość wzmacniacza lock-in 1 (LIA1) na 500 mV i odczekaj około 2 godzin, aby rozgrzać się i ustabilizować magnetometr atomowy.
  2. Ustawianie magnetometru atomowego
    1. Uruchom oprogramowanie sterujące przyrządu i ustaw parametry pomiaru. Niektóre parametry mogą się nieznacznie różnić w każdym pomiarze.
      UWAGA: Magnetometr atomowy składa się z lasera (opisanego powyżej), wzmacniacza blokującego SR830 (określanego jako LIA1), wzmacniacza blokującego SR530 (określanego jako LIA2), generatorów funkcyjnych DS345 (określanego jako FG1) i ATF20B (określanego jako FG2), silnika o wysokiej rozdzielczości i komputera. Wszystkie te elementy powinny być włączone na tym etapie protokołu.
    2. Ustaw tryb ruchu silnika na Hałas i domyślną pozycję na 0. Naciśnij Lock na panelu przednim, dostosuj czułość LIA1 z powrotem do 200 mV.
    3. Dostosuj prąd i napięcie lasera i znajdź odpowiedni szczyt rezonansu oraz poziom sygnału do szumu. Naciśnij przycisk Sweep na panelu przednim. Należy pamiętać, że stosunek amplitudy do szerokości powinien wynosić powyżej 0,5, a wartość fazy powinna być mniejsza niż 5 stopni. Jeśli nie, powtórz krok zamiatania.
    4. Podłącz wyjście LIA2 do sprzężenia zwrotnego lasera, aby zablokować jego częstotliwość. Ten wzmacniacz mierzy skręcalność optyczną pomocniczego ogniwa cezowego w celu utrzymania częstotliwości lasera w rezonansie12. Stan ten utrzymuje się do końca pomiaru.
    5. Wtykowy generator funkcyjny FG2 do wprowadzania fali prostokątnej (500 mVpp, 100 mHz) jako sygnału odniesienia. Fala prostokątna odpowiada 100 pT i służy do konwersji prądu wyjściowego wzmacniacza na sygnał magnetyczny. Odłącz generator funkcyjny.
    6. Ustaw tryb ruchu silnika na dwukierunkowy i domyślną pozycję na 260 mm. Sprawdź stan regulatora temperatury, aby zapewnić prawidłową temperaturę (~37 °C) czujnika atomowego.
    7. Sprawdź stabilność całego systemu, mierząc dwukrotnie sygnały z pustego uchwytu na próbkę. Oceń stabilność i poziom hałasu po odjęciu dwóch ścieżek. Typowy poziom hałasu i wahania powinny wynosić ±2 pT przy czasie integracji 30 ms.
  3. Magnesowanie próbki
    1. Delikatnie umieść próbkę na stacji magnetyzującej i pozostaw ją na 2 minuty.
      UWAGA: Stacja magnesująca składa się z magnesu trwałego (~0,5 T) i plastikowej przekładki.
    2. Umieścić próbkę z powrotem w uchwycie na próbkę. Użyj siły odśrodkowej 335,4 × g, aby usunąć niespecyficznie związane cząstki magnetyczne
      3. .
  4. Pomiary magnetyczne po przyłożeniu sił
    1. Użyj pęsety, aby załadować próbkę na silnik. Kliknij Zablokuj na panelu przednim, aby uruchomić program. W międzyczasie użyj pęsety, aby załadować drugą próbkę do uchwytu i umieścić ją w wirówce. Należy pamiętać, że strona ze szkła powlekanego powinna być skierowana w stronę środka wirówki.
      UWAGA: Stosowana jest technika spektroskopii namagnesowania resztkowego indukowanego siłą (FIRMS), która wykorzystuje magnetometr atomowy do pomiaru sygnału magnetycznego próbki po przyłożeniu siły mechanicznej do oddziaływań molekularnych w próbce. W tym przypadku interakcje molekularne zachodzą między cząsteczkami władcy DNA a mRNA w kompleksie rybosomów. Siła jest zwiększana stopniowo poprzez zwiększanie prędkości odśrodkowej. Po przyłożeniu każdej siły silnik przekazuje próbkę do czujnika atomowego, a następnie cofa się. W ten sposób uzyskuje się dwa profile pola magnetycznego, jeden podczas skanowania do przodu, a drugi podczas skanowania wstecznego13. Tego ostatniego używamy tylko do wyodrębnienia wysokości piku ze względu na lepszy stosunek sygnału do szumu. Wysokość piku w prądzie (nA) jest przekształcana na amplitudę sygnału magnetycznego (pT) na podstawie kalibracyjnej fali prostokątnej.
    2. Każdy pomiar trwa około 5 minut. Gdy silnik powróci do 0, kliknij Zapisz na panelu przednim. Ostrożnie użyj pęsety, aby pobrać próbki z silnika i wirówki. Zastosować prędkość początkową odpowiadającą 335,4 × g (2000 obr./min, obroty na minutę dla wirówki podanej w tabeli materiałów).
    3. Zamień dwie próbki i zastosuj większą siłę, zwiększając prędkość odśrodkową o 100 obr./min lub podobny rozmiar kroku. Przetwarzaj naprzemiennie, aby stopniowo zwiększać siłę; Pełne spektrum sił uzyskuje się po 10-12 punktach danych.
  5. Zakończenie eksperymentu
    1. Po zakończeniu wszystkich zaplanowanych eksperymentów wyłącz urządzenie, postępując w odwrotnej kolejności, w jakiej zostało włączone.
    2. Wyjmij próbki z uchwytu i zanurz je w etanolu w celu oczyszczenia i wykorzystania w przyszłości. Wyczyść uchwyt próbki acetonem w przypadku zanieczyszczenia kulkami magnetycznymi.
  6. analiza danych
    1. Otwórz skrypt analizy języka Python i wprowadź wszystkie dane eksperymentalne. Kliknij przycisk Załaduj kwadrat, aby wprowadzić falę prostokątną jako odniesienie. Następnie kliknij Załaduj linię bazową, aby wprowadzić szczątkowy sygnał magnetyczny jako tło.
    2. Zdefiniuj całkowity spadek sygnału magnetycznego jako B0. Znormalizuj każdy sygnał magnetyczny, zmniejsz B do B0 i wyraź go w procentach. Wykreślić wartość procentową (B/B0) w funkcji siły odśrodkowej, aby uzyskać widmo FIRM.
      UWAGA: Siłę odśrodkową F oblicza się na podstawie masy wyporu kulek magnetycznych m (4,6 × 10−15 kg), prędkości odśrodkowej w i promienia wirówki r (tutaj 7,5 cm) za pomocą równania F = mw2r. Typowa rozdzielczość siły wynosi 2-4 pN, a zakres siły wynosi 15-95 pN w tej pracy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia schemat detekcji oraz fotografie głównych komponentów. Detekcja magnetyczna jest realizowana za pomocą magnetometru atomowego z wykorzystaniem schematu skanowania (Rycina 1A)13Próbkę umieszcza się na pręcie zamontowanym na silniku liniowym. Silnik transportuje próbkę do czujnika atomowego znajdującego się wewnątrz osłony magnetycznej, a następnie z powrotem do miejsca początkowego w celu jej wyjęcia....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W naszym teście z podwójną linijką koraliki magnetyczne odgrywają dwie zasadnicze role. Po pierwsze, służą jako przetworniki siły, ponieważ siła odśrodkowa jest proporcjonalna do ich masy wyporu. Po drugie, koraliki są nośnikami sygnału wykrywanymi przez magnetometr atomowy, który jest obecnie najdokładniejszym czujnikiem magnetycznym. Łącząc manipulację mechaniczną i detekcję magnetyczną, technika FIRMS jest w stanie rozwiązać dużą liczbę oddziaływań molekularnych w oparciu o ich krytyczne siły dysocjacji, które są pods...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłosili żadnego potencjalnego konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia (R01GM111452, Y.W., S.X.). Y. W. dziękuje za wsparcie ze strony Fundacji Welch (E-1721).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Taśma styrenowaMiasto PrzemysłuMS-861
Szkiełkaszklane Powłoki60,0 × 4,0 × 0,3 mm3
Acetic acidMillipore SigmaA6283-500ML
3-aminopropylotrietoksysilanUCT specialities21400088
mPEG-SVALaysan Bio154-82
Biotyna-PEG-SVALaysan Bio152-84
Wodorowęglan soduMillipore SigmaS5761-500G
Klej epoksydowyDevcon31345
StreptawidynaThermoFisher434301
Kwas fuzydowyMillipore SigmaF0756-1G
Siarczan neomycynyMillipore Sigma
Siarczan wiomycynyMillipore Sigma1715000
Higromycynainvitrogen10687-010
Tris-HClMillipore SigmaT5941-100G
Octan magnezuMillipore SigmaM5661-50G
Chlorek amonuMillipore SigmaA9434-500G
Potas chlorekMillipore SigmaP9333-500G
EDTAGIBCO774750
2-merkaptoetanolMillipore SigmaM6250-500ML
Tween20Millipore SigmaP1379-250ML
GTPMilipore SigmaG8877-100MG
PEPMilipore SigmaP7127-100MG
Kinaza pirogronianowaMillipore SigmaP1506-5KU
Sacharoza Millipore SigmaS7903-5KG
Dynabeads M-280 StreptawidynaThermoFisher11205D
mRNA OligoZintegrowane technologie DNA1338997275′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UAA AAA AAA GGA AAU AAAA AAA AUG UUU AAAA AUG UUUU UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU  
DNA OligoZintegrowane technologie DNA1574686303?- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5? 
DNA OligoZintegrowane technologie DNA1648453703?-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5'  
DNAOligo Integrated DNA Technologies1574686283?-AAA, ATC, CCG, CGT, TAG, AAC, UGG, GG/TEGBio/-5'  
DNA OligoIntegrated DNA Technologies1634727053?-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5'  
DNA OligoZintegrowane technologie DNA 1386781303?-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5'
DNA OligoZintegrowane technologie DNA1386781313?-T, AGA, TGA, CGA, CTT, CTC, GGG/TEGBio/-5'  
DNA OligoZintegrowane technologie DNA 1386781323?-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5? 
DNAOligo Zintegrowane technologie DNA1386781333?-GTT, AGA, TGA, CGA, CTT, CTC, GGG/TEGBio/-5'  
WirówkaEppendorf5427R
Micro UltrawirówkaHitachiCS150FNX
Mieszalnik wirowyVWRVM-3000
Wzmacniacz blokującyStanford Research SystemsSR530
Wzmacniacz blokującyResearch SystemsSR830
LaserNewportTLB-6918-D
Generator funkcyjnyStanford Research SystemsDS345
Detektory fotograficzneThorlabsDET36A
odparowane 1458009 Stanford

Bibliografia

  1. Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA. Quarterly Review of Biophysics. 50, 12(2017).
  2. Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation. Science. 345, 1188-1191 (2014).
  3. Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4, 479-486 (1998).
  4. Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).
  5. Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160, 870-881 (2015).
  6. Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Research. 38, 15(2010).
  7. Chen, J., et al. Dynamic pathways of -1 translational frameshifting. Nature. 512, 328-332 (2014).
  8. De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA. Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).
  9. Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers reveal an "mRNA looping" intermediate state during ribosome translocation. RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).
  10. Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. High-efficiency "-1" and "-2" ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).
  11. Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).
  12. Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance. Optics Letters. 35, 661-663 (2010).
  13. Yao, L., Xu, S. Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).
  14. Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics. Physical Biology. 5, 046005(2008).
  15. Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
  16. Jacks, T., et al. Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression. Nature. 331, 280-283 (1988).
  17. Schuwirth, B. S., et al. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 Å resolution. Science. 310, 827-834 (2005).
  18. Jia, H., Wang, Y., Xu, S. Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps. Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Analiza DNA Rulerspektroskopia pozostałej namagnesowania indukowanego siłądysocjacja dupleksów mRNAimmobilizacja kompleksu rybosomalnegowpływ antybiotyków na translokacjędetekcja przesunięcia ramki odczytuwypieranie kwasów nukleinowychkonfiguracja magnetometru atomowego
Podwójne linijki DNA do badania mechanizmu translokacji rybosomów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.