Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie testów wnikania wirusa i molekularnej analizy dokowania do identyfikacji kandydatów na leki przeciwwirusowe przeciwko wirusowi Coxsackie A16

DOI:

10.3791/59920

⸱

15 lipca 2019

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Biosciences, University of Texas at Austin, 2School of Pharmacy, College of Pharmacy, Kaohsiung Medical University, 3Graduate Institute of Medical Sciences, College of Medicine, Taipei Medical University, 4Department of Microbiology and Immunology, Dalhousie University, 5Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem protokołu jest zilustrowanie różnych testów związanych z wnikaniem wirusa, które mogą być użyte do identyfikacji potencjalnych inhibitorów wnikania wirusa.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy przeciwwirusowe, które mechanicznie badają wejście wirusa, są niezbędne do określenia, na którym etapie oceniane czynniki są najbardziej skuteczne, i pozwalają na identyfikację potencjalnych inhibitorów wnikania wirusa. W tym miejscu przedstawiamy eksperymentalne podejścia do identyfikacji małych cząsteczek zdolnych do blokowania infekcji przez bezotoczkowy wirus Coxsackievirus A16 (CVA16) poprzez celowanie w cząsteczki wirusa lub określone etapy wczesnego wnikania wirusa. Testy obejmują analizę czasu dodania leku, test wiązania wirusa oparty na cytometrii przepływowej oraz test inaktywacji wirusa. Przedstawiamy również protokół dokowania molekularnego wykorzystujący białka kapsydu wirusa do przewidywania potencjalnych pozostałości, na które ukierunkowane są związki przeciwwirusowe. Testy te powinny pomóc w identyfikacji potencjalnych środków przeciwwirusowych, które działają na wnikanie wirusa. Przyszłe kierunki mogą badać te potencjalne inhibitory w celu dalszego rozwoju leków.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba rąk, stóp i jamy ustnej (HFMD) jest najczęściej wywoływana przez wirus Coxsackie A16 (CVA16) i enterowirus 71 (EV71) u małych dzieci. W ostatnim czasie w regionie Azji i Pacyfiku nastąpił znaczny wzrost HFMD wywołanej przez CVA16. Chociaż objawy mogą być łagodne, mogą wystąpić poważne powikłania, które wpływają na mózg i serce, z potencjalną śmiertelnością1,2. Obecnie nie ma licencjonowanych terapii przeciwwirusowych ani szczepionek przeciwko CVA16, a zatem istnieje pilna potrzeba opracowania strategii przeciwwirusowych w celu ograniczenia przyszłych epidemii i związanych z nimi powikłań.

CVA16 to wirus bezotoczkowy, który ma dwudziestościenny kapsyd złożony z pentamerów, z których każdy zawiera 4 białka strukturalne, a mianowicie VP1, VP2, VP3 i VP4. Wokół każdej pięciokrotnej osi pentameru znajduje się obszar "kanionu", który objawia się jako depresja i jest znany ze swojej roli w wiązaniu receptorów3. Na dnie tego kanionu znajduje się hydrofobowa kieszeń w regionie VP1, która zawiera naturalny ligand tłuszczowy o nazwie sfingozyna (SPH). Sugeruje się, że receptory komórkowe, takie jak ludzki ligand 1 glikoproteiny selektyny selektyny P (PSGL-1) i receptor zmiatacza klasy B 2 (SCARB2), odgrywają rolę w wiązaniu wirusa poprzez wypieranie tego ligandu, co powoduje zmiany konformacyjne kapsydu, a następnie wyrzucenie genomu wirusa do komórki gospodarza4,5,6. Zidentyfikowanie możliwych inhibitorów, które blokują kolejne zdarzenia w procesie wnikania wirusa, może dostarczyć potencjalnych strategii terapeutycznych przeciwko zakażeniu CVA16.

Etapy cyklu życia wirusa mogą być analizowane za pomocą eksperymentalnych metod jako cele, aby pomóc zidentyfikować środki przeciwwirusowe specyficzne dla danego trybu. Analiza czasu dodania leku bada efekt leczenia lekiem w różnych momentach infekcji wirusowej, w tym przed wejściem (dodane przed infekcją wirusową), wejście (dodane równocześnie z infekcją wirusową) i po wejściu (dodane po infekcji wirusowej)7. Wpływ można ocenić za pomocą standardowego testu płytki nazębnej, określając ilościowo liczbę blaszek wirusowych utworzonych w każdym z warunków leczenia. Test wiązania wirusa oparty na cytometrii przepływowej określa, czy lek zapobiega przyczepianiu się wirusa do komórek gospodarza. Osiąga się to poprzez przesunięcie temperatury z 37 °C, w której występuje większość infekcji wirusowych u ludzi, do 4 °C, gdzie wiriony są w stanie związać się z powierzchnią komórki gospodarza, ale nie są w stanie dostać się do komórek7. Cząsteczki wirusa związane z błoną komórkową są następnie oznaczane ilościowo poprzez barwienie immunologiczne antygenów wirusowych i oceniane za pomocą cytometrii przepływowej. Z drugiej strony test inaktywacji wirusa pomaga ocenić potencjalne fizyczne interakcje leku z wolnymi cząsteczkami wirusa, osłaniając lub neutralizując wiriony, lub powodując agregacje lub zmiany konformacyjne, które sprawiają, że są one nieaktywne do kolejnych interakcji z powierzchnią komórki gospodarza podczas infekcji8,9. W tym eksperymencie inokulum wirusa może najpierw inkubować z lekiem, a następnie zostać rozcieńczone w celu miareczkowania leku przed zakażeniem monowarstwy komórki gospodarza i wykonaniem standardowego testu płytki nazębnej8. Wreszcie, dokowanie molekularne jest potężnym narzędziem do przewidywania potencjalnych miejsc interakcji leków na powierzchni wirionu, w tym glikoprotein wirusowych z wirusów otoczkowych i białek kapsydu wirusa z wirusów bezotoczkowych, przy użyciu algorytmów obliczeniowych. Pomaga to w mechanicznym określeniu celów działania leku i dostarcza przydatnych informacji, które można dalej walidować za pomocą dalszych testów.

Ostatnio zastosowaliśmy wyżej opisane metody do identyfikacji związków przeciwwirusowych, które skutecznie blokowały infekcję przez nieotoczkowy CVA169. W niniejszym artykule opisano i omówiono szczegółowe protokoły, które zostały zastosowane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie hodowle komórkowe i infekcje wirusowe muszą być przeprowadzane w certyfikowanych kapturach bezpieczeństwa biologicznego, które są odpowiednie dla poziomu bezpieczeństwa biologicznego próbek, z którymi się obchodzimy. Dwie małe cząsteczki z klasą taniny, kwas chebulagowy () i punikalagina (PUG), które, jak zaobserwowano, skutecznie blokują infekcję CVA169, są używane jako przykłady potencjalnych środków hamujących. Aby zapoznać się z podstawowymi zasadami technik wirusologicznych, rozprzestrzenianiem się wirusa, określaniem miana wirusa oraz pojęciami jednostek tworzących blaszkę (PFU) lub wielości infekcji (MOI), czytelnik jest odsyłany do reference10.

1. Hodowla komórkowa, preparat wirusa, preparat złożony i cytotoksyczność złożona

  1. Ludzkie komórki mięsaka prążkowanokomórkowego (RD) są komórkami gospodarza podatnymi na infekcję CVA1611. Hoduj komórki RD w 10 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 200 U/ml penicyliny G, 200 μg/ml streptomycyny i 0,5 μg/ml amfoterycyny B w kolbach T-75 w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
  2. Przygotować CVA16 poprzez namnażanie wirusa w komórkach RD i określić miano wirusa w PFU/ml. Aby zoptymalizować protokół, zapoznaj się z reference11.
  3. Przygotować badane związki i kontrole, używając ich odpowiednich rozpuszczalników: na przykład rozpuścić i PUG w dimetylosulfotlenku (DMSO). Dla wszystkich etapów infekcji podłoże podstawowe składało się z DMEM plus 2% FBS i antybiotyków.
    nuta: Końcowe stężenie DMSO w traktowaniu badanym związkiem jest równe lub mniejsze niż 0,25% w doświadczeniach; 0,25% DMSO jest uwzględnione jako leczenie kontrolą ujemną w testach dla porównania.
  4. Przeprowadzić test cytotoksyczności badanych związków na komórkach RD przy użyciu odczynnika określającego żywotność komórek, takiego jak XTT (((2,3-bis[2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo]-5-fenyloamino)-karbonylo]-2H-tetrazolowy wodorotlenek). Szczegółowy protokół można znaleźć na stronie reference12. Określić stężenia cytotoksyczności badanych związków za pomocą oprogramowania analitycznego, takiego jak GraphPad Prism, zgodnie z protokołem producenta. Stężenia leków, które nie wpływają znacząco na żywotność komórek ( ≥95% żywotnych komórek) są wykorzystywane do pozostałej części badania.

2. Test czasu dodania leku

  1. Ocena wpływu leków na komórki gospodarza przed infekcją wirusową (leczenie wstępne)
    1. Wysiewaj komórki RD na 12-dołkowych płytkach o gęstości wysiewu 2 x 105 komórek/dołek. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w celu uzyskania monowarstwy.
    2. Traktować komórki RD związkami testowymi w stężeniach niecytotoksycznych (określonych od kroku 1.4) w 1 ml objętości podłoża podstawowego przez 1 godzinę lub 4 godziny.
    3. Przemywać komórki 1-2 ml PBS przed dodaniem 50 PFU/studzienkę wirusa w pożywce podstawowej (końcowa objętość inokulum wynosi 300 μl) przez 1 godzinę. Kołysz płytką co 15 minut.
    4. Po zakażeniu ponownie przemyć monowarstwy za pomocą PBS, a następnie nałożyć 1 ml podłoża podstawowego zawierającego 0,8% metylocelulozy do dalszej inkubacji w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
    5. Po 72 godzinach inkubacji usunąć pożywkę wierzchnią i umyć studzienki za pomocą 2 ml PBS.
    6. Napraw studzienki za pomocą 0,5 ml 37% formaldehydu przez 15 minut.
    7. Usunąć supernatant i ponownie przemyć za pomocą PBS.
    8. Zabarwić studzienki za pomocą 0,5 ml 0,5% roztworu fioletu krystalicznego. Następnie usuń roztwór plamy w ciągu 2 minut i umyj studzienki delikatnym strumieniem wody przed wysuszeniem na powietrzu.
    9. Policz blaszki wirusowe, umieszczając płytkę na pudełku z białym światłem. Oblicz procentowy (%) zakażenie CVA16 w następujący sposób: (Średnia # wirusa płytki nazębnej + lek / Średnia # wirusa płytki nazębnej + kontrola DMSO) × 100%.
  2. Ocena wpływu jednoczesnego dodawania leków i wirusa (koaddycja)
    1. Wysiewaj komórki RD na 12-dołkowych płytkach o gęstości wysiewu 2 x 105 komórek/dołek. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w celu uzyskania monowarstwy.
    2. Traktować komórki RD związkami testowymi w odpowiednich stężeniach i 50 PFU/basenik CVA16 jednocześnie przez 1 godzinę (końcowa objętość inokulum wynosi 300 μl). Kołysz płytką co 15 minut.
    3. Przemyć komórki 1 ml PBS, a następnie nałożyć na 1-2 ml podłoża podstawowego zawierającego 0,8% metylocelulozy w celu dalszej inkubacji w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
    4. Zabarwić blaszki wirusowe fioletem krystalicznym po 72 godzinach od zakażenia i określić % infekcji CVA16 zgodnie z powyższym opisem.
  3. Ocena skuteczności leczenia farmakologicznego po wniknięciu wirusa (po zakażeniu)
    1. Wysiewaj komórki RD na 12-dołkowych płytkach o gęstości wysiewu 2 x 105 komórek/dołek. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w celu uzyskania monowarstwy.
    2. Zaszczepić komórki RD 50 PFU/studzienkę CVA16 (końcowa objętość inokulum wynosi 300 μl) przez 1 godzinę. Kołysz płytką co 15 minut.
    3. Przemyć studzienki 1-2 ml PBS i pokryć komórki pożywką podstawową zawierającą 0,8% metylocelulozy i odpowiednimi stężeniami badanych związków.
    4. Zabarwić blaszki wirusowe fioletem krystalicznym i policzyć po 72 godzinach od zakażenia i określić % inkubacji infekcji CVA16 opisanych powyżej.
      nuta: Wszystkie mycia PBS wykonuj delikatnie, aby uniknąć podnoszenia komórek.

3. Test wiązania oparty na cytometrii przepływowej

  1. Wysiewaj komórki RD na 12-dołkowych płytkach o gęstości wysiewu 2 x 105 komórek/dołek. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w celu uzyskania monowarstwy.
  2. Wstępnie schłodzić monowarstwę komórek w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
  3. Zakażone komórki RD CVA16 (MOI = 100) w obecności i bez badanych związków przez 3 godziny w temperaturze 4 °C.
    nuta: Przeprowadzić inokulację wirusa na lodzie i następującą po niej inkubację w lodówce o temperaturze 4 °C w celu utrzymania temperatury na poziomie 4 °C, co pozwala na wiązanie wirusa, ale nie na wnikanie.
  4. Usunąć inokulum wirusa i przemyć raz 1-2 ml lodowatego PBS.
  5. Podnieś komórki, dodając 1 ml lodowatego buforu dysocjacyjnego do studzienek na lodzie na 3 minuty, przed zebraniem komórek i ponownym ich umieszczeniem w lodowatym buforze cytometrii przepływowej (1x PBS plus 2% FBS).
  6. Umyj komórki dwukrotnie za pomocą lodowatego buforu cytometrii przepływowej i utrwal komórki 0,5 ml 4% paraformaldehydu przez 20 minut na lodzie.
  7. Przemyć komórki za pomocą PBS w celu usunięcia wszelkich niezwiązanych lub słabo związanych wirusów, a następnie wybarwić komórki 1 ml przeciwciała anty-VP1 (1:2000; rozcieńczonego PBS zawierającego 3% BSA) na lodzie przez 1 godzinę, a następnie inkubować z drugorzędową anty-mysią IgG sprzężoną z Alexa 488 (1:250; rozcieńczoną w PBS zawierającym 3% BSA) na lodzie przez 1 godzinę. Wykonać płukanie PBS (3 razy) po każdym leczeniu przeciwciałami.
  8. Ponownie zawiesić komórki w 0,5 ml lodowatego bufora cytometrii przepływowej i przeprowadzić analizę cytometrii przepływowej na cytometrze przepływowym przy użyciu standardowych procedur. Prezentuj dane na histogramach za pomocą powiązanego oprogramowania i określaj ilościowo w celu reprezentacji wykresu słupkowego.

4. Test inaktywacji wirusów

  1. Wykonaj test inaktywacji wirusa zgodnie z wcześniejszym opisem12, stosując następujące warunki:
    - Stężenie wyjściowe 106 PFU/ml CVA16.
    - Monowarstwy komórek RD w płytkach 12-dołkowych o gęstości wysiewu 2 x 105 komórek/dołek.
    - 50-krotne rozcieńczenie do miareczkowania związków leczniczych, w wyniku czego końcowe stężenie wirusa wynosi 50 PFU/basen.
    - Umyj etapy przy użyciu 1-2 ml PBS.
    - Podłoża nakładkowe zawierające 0,8% metylocelulozy.
  2. Wykonaj ostateczny odczyt infekcji wirusowej za pomocą procedury barwienia blaszek wirusowych fioletem krystalicznym, jak opisano powyżej.

5. Molekularna analiza dokowania

  1. Pobierz cząsteczki 3D badanych związków z PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Jeśli cząsteczki nie mają wgranej struktury 3D, pobierz struktury 2D lub użyj sekwencji ciągów SMILES i przekształć je w cząsteczki 3D za pomocą programu molekularnego (np. CORINA).
  2. Pobierz biologiczny zespół wirusów z Banku Danych Białkowych RCSB (https://www.rcsb.org/) i przygotuj model struktury wirusa za pomocą programu biokomputerowego (np. UCSF Chimera). Na przykład w przypadku dojrzałej struktury krystalicznej wirionu CVA16 (PDB: 5C4W)3, usuń rozpuszczalniki z pliku PDB, zastąp niekompletne łańcuchy boczne danymi z biblioteki Rotamer Dunbrach 2010 i dodaj wodory i ładunki do struktury, jak wcześniej zgłoszono13. Obiektami docelowymi mogą być dowolne białka wirusowe istotne dla zamierzonej analizy wraz z informacjami o złożeniu biologicznym (Bank Danych o Białkach).
  3. Zadokuj związki testowe na przygotowanej jednostce wirusa, używając na przykład UCSF Chimera i przeanalizuj pliki wyjściowe za pomocą oprogramowania do wizualizacji (np. Autodock Vina, PyMol):
    1. Prześlij plik związku testowego do UCSF Chimera jako "ligand" i wykonaj dokowanie na ślepo, wybierając całe przygotowane białko wirusowe jako "receptor". Użyj myszy komputerowej lub gładzika, aby zmienić rozmiar woluminu wyszukiwania na cały "receptor". W "Opcjach zaawansowanych" ustaw maksymalną liczbę trybów wiązania. Ramki dokowania zostaną automatycznie uszeregowane od najwyższej do najniższej energii wiązania.
    2. (Opcjonalnie) Oprócz dokowania na ślepo, ogranicz miejsce dokowania do białka wirusa w obszarach zainteresowania pochodzących z wyników dokowania na ślepo, ponownie za pomocą myszy lub gładzika, aby zmniejszyć głośność wyszukiwania (np. 100 Å x 100 Å x 100 A). Ten krok pomaga potwierdzić wyniki dokowania na ślepo i zwiększa specyficzność.
    3. Użyj systemu grafiki molekularnej (np. PyMol), aby przeanalizować pozycje trybów wiązania, przesyłając plik dokowania. Znajdź kontakty biegunowe od związku do białka wirusa, wybierając "ligand" i identyfikując kontakty biegunowe za pomocą opcji "do dowolnych atomów"; Zapoznaj się z wynikami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test czasu dodania leku jest wskazany w Rysunek 1 i pokazuje wpływ leczenia przy użyciu małych cząsteczek i PUG na infekcję CVA16 zarówno przed wejściem wirusa (pre-leczenie), podczas wejścia wirusa (współdodawanie), jak i po wejściu wirusa (po infekcji). Obie małe cząsteczki miały jedynie marginalny wpływ na zakaźność CVA16, czy to w wstępnym traktowaniu komórek gospodarza przed infekcją wirusową (Rysunek 1A), czy w leczeniu po infekcji (...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym raporcie opisaliśmy protokoły, które są przydatne do identyfikacji kandydatów na leki przeciwwirusowe, które są ukierunkowane na wnikanie wirusa, w szczególności przeciwko CVA16 bez otoczki. Testy są zaprojektowane w taki sposób, aby przeanalizować wczesne zdarzenia podczas wnikania wirusa, co jest pomocne w wyjaśnieniu mechanizmu (mechanizmów) działania i potencjalnego celu (celów) aktywności przeciwwirusowej badanych czynników. "Test czasu dodania leku" pozwala na szerokie określenie potencjalnego celu badanych z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są wdzięczni dr Joshua Beckhamowi z University of Texas w Austin za wsparcie techniczne przy dokowaniu molekularnym. Badanie to było częściowo wspierane przez finansowanie z Ministerstwa Nauki i Technologii Tajwanu (MOST107-2320-B-037-002 dla C.-J.L. i L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 i MOST107-2320-B-038-034-MY3 do L.-T.L.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4% paraformaldehyduSigmaAL-158127-500G
Alexa 488-sprzężone anty-mysie IgGInvitrogenA11029
Amfoterycyna BGIBCO15290-018
Przeciwciało anty-VP1Przeciwciało Merck-MilliporeMAB979Anti-Enterovirus 71, reaguje krzyżowo z Coxsackie A16, klon 422-8D-4C-4D
Beckman Coulter CytometrBeckman CoulterFC500
CorinaMolecular Networks GmbH
Krystaliczny fioletSigmaC3886-100G
DMEMGIBCO11995-040
DMSOSigmaD5879
FBSGIBCO26140-079
FormaldehydSigmaF8775
Graphpad PrismGraphPad
Sól sodowa heparynySigmaH3393
Zestaw do testów toksykologicznych in vitro, SigmaTOX2
MetylocelulozaSigmaM0512-100G
PBS pH 7,4GIBCO10010023
Penicylina-StreptomycynaGIBCO15070-063
PyMolSchrö
Kalifornijski w SanFrancisco
na bazie XTTUniwersytet w Chimerze

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Legay, F., et al. Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult. Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).
  2. Wang, C. Y., Li Lu,, Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. Fatal coxsackievirus A16 infection. Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).
  3. Ren, J., et al. Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity. Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).
  4. Nishimura, Y., et al. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).
  5. Yamayoshi, S., et al. Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71. Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).
  6. Yamayoshi, S., et al. Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71. Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).
  7. Lin, L. T., et al. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).
  8. Lin, L. T., et al. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiology. 13, 187(2013).
  9. Lin, C. J., et al. Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding. Emerging Microbes & Infections. 7, 162(2018).
  10. Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of Virology. , 3rd edn, ASM Press. (2008).
  11. Velu, A. B., et al. BPR-3P0128 inhibits RNA-dependent RNA polymerase elongation and VPg uridylylation activities of Enterovirus 71. Antiviral Research. 112, 18-25 (2014).
  12. Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. Journal of Visualized Experiments. , e53124(2015).
  13. Lang, P. T., et al. DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes. RNA. 15, 1219-1230 (2009).
  14. Zhang, X., et al. Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor. Emerging Microbes & Infections. 6, 65(2017).
  15. Waterhouse, A., et al. SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes. Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Czas dodania lekuwi zanie w cytometrii przep ywowejtest inaktywacji wirusakom rki RDjednostki tworz ce plakibarwienie fioletem krystalicznymzwi zki z bazy PubChem

Powiązane artykuły