Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar względnego wydzielania insuliny za pomocą współwydzielanego surogatu lucyferazy

7.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59926

⸱

25 czerwca 2019

 , 
1Department of Pharmacology, University of Texas Southwestern Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić szybkie, tanie testy lucyferazy przy średniej przepustowości przy użyciu lucyferazy Gaussia połączonej z insuliną jako wskaźnika wydzielania insuliny z komórek beta. Test można wykonać za pomocą większości czytników płytek luminescencyjnych i pipet wielokanałowych.

Streszczenie

Wykonywanie testów opartych na przeciwciałach do pobierania wydzielanej insuliny po pobraniu próbki zwykle wymaga od kilku godzin do jednego dnia czasu testu i może być kosztowne, w zależności od konkretnego testu. Testy wydzielanej lucyferazy przyspieszają wyniki i znacznie obniżają koszt testu na próbkę. Tutaj przedstawiamy stosunkowo rzadko stosowane podejście do oceny aktywności wydzielania insuliny z komórek β trzustki za pomocą lucyferazy Gaussia genetycznie wstawionej do peptydu C. Podczas proteolitycznego przetwarzania proinsuliny peptyd C jest wycinany, uwalniając lucyferazy w pęcherzyku wydzielniczym insuliny, gdzie jest współwydzielany z insuliną. Wyniki można uzyskać w ciągu kilku minut po pobraniu próbki ze względu na szybkość testów lucyferazy. Ograniczeniem testu jest to, że jest to względny pomiar wydzielania insuliny, a nie bezwzględna ocena ilościowa. Protokół ten jest jednak ekonomiczny, skalowalny i może być wykonywany przy użyciu większości standardowych czytników płytek luminescencyjnych. Analogowe i cyfrowe pipety wielokanałowe ułatwiają wykonywanie wielu etapów testu. Jednocześnie można testować wiele różnych wariantów eksperymentalnych. Po ustaleniu ukierunkowanego zestawu warunków, stężenia insuliny powinny być mierzone bezpośrednio za pomocą testów opartych na przeciwciałach ze standardowymi krzywymi, aby potwierdzić wyniki testu lucyferazy.

Wprowadzenie

Przedstawiona tutaj metoda pozwala na szybkie i niedrogie badanie wydzielania insuliny z genetycznie zmodyfikowanej linii komórek beta w formacie 96-dołkowej. Kluczem do tego protokołu jest zmodyfikowana wersja insuliny z naturalnie wydzielaną lucyferazy Gaussia (GLuc, ~18 kDa) wprowadzoną (patrz Rysunek 1) do peptydu C w celu wytworzenia insuliny-Gaussia (InsGLuc)1,2. Inne większe białka, takie jak GFP (~25 kDa), zostały z powodzeniem wprowadzone do peptydu C insuliny i wykazały oczekiwane przetwarzanie potranslacyjne z proinsuliny-GFP na insulinę i GFP-C-peptide3,4. Na potrzeby testu w tym protokole GLuc został zoptymalizowany pod kątem kodonów pod kątem ekspresji ssaków i wprowadzono dwie mutacje w celu poprawy kinetyki podobnej do świecenia5,6. Wiele kombinacji i powtórzeń warunków leczenia można łatwo przetestować w formacie płytki 96-dołkowej, a wyniki wydzielania można uzyskać natychmiast po eksperymencie.

Główną zaletą, jak wcześniej wspomniano2, jest niski koszt tego pomiaru wydzielania opartego na lucyferazie (< 0,01 USD/odwiert), co odróżnia go od stosunkowo wyższych kosztów i technicznych aspektów testów immunoenzymatycznych (ELISA) (> $2/odwiert) i jednorodnej fluorescencji czasowo-rozdzielczej (HTRF) lub innych testów opartych na przeciwciałach opartych na rezonansie Förstera (FRET) (> $1/studzienkę). W porównaniu z tymi testami opartymi na przeciwciałach, które mierzą stężenie insuliny poprzez odniesienie do krzywej wzorcowej, test InsGLuc mierzy aktywność wydzielniczą jako względne porównanie z dołkami kontrolnymi na płytce. Z tego powodu każdy eksperyment wymaga włączenia odpowiednich kontroli. To rozróżnienie jest kompromisem, który umożliwia szybkie i niedrogie pomiary. Wykazano jednak, że wydzielanie InsGLuc jest silnie skorelowane z wydzielaniem insuliny, mierzonym za pomocą ELISA1,2. Technologia ta została rozbudowana pod kątem wysokoprzepustowych badań przesiewowych1,2,7 i doprowadziła do zidentyfikowania nowych modulatorów wydzielania insuliny, w tym bramkowanego napięciem inhibitora kanału potasowego7 oraz naturalnego inhibitora funkcji komórek β, chromomycyny A28. Stosowanie InsGLuc jest najbardziej odpowiednie dla badaczy, którzy planują ciągłe testowanie wielu różnych warunków leczenia pod kątem ich wpływu na wydzielanie insuliny. W dalszych eksperymentach konieczne jest powtórzenie kluczowych wyników w linii komórkowej β rodzicielskiej, a optymalnie w mysich lub ludzkich wyspach trzustkowych, a także pomiar wydzielania insuliny za pomocą testu opartego na przeciwciałach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników, pożywek i (Tabela 1)

  1. Przygotuj kompletną pożywkę MIN6 w 500 ml modyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy (4,5 g/l) firmy Dulbecco z następującymi dodatkami: 15% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 jednostek/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 292 μg/ml L-glutaminy i 50 μM β-merkaptoetanolu.
    UWAGA: Stabilna linia komórkowa w tym przypadku jest utrzymywana w 250 μg/ml antybiotyku G418.
  2. Przygotować bufor wodorowęglanowy Krebsa-Ringera (KRBH), sporządzając roztwór zawierający 5 mM KCl, 120 mM NaCl, 15 mM HEPES (pH 7,4), 24 mM NaHCO3, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 i 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do testu radioimmunologicznego. Glukoza jest dodawana, o ile jest to przewidziane, z 2 M zapasów.
    UWAGA: KRBH służy do inkubacji komórek ze stymulacją i bez stymulacji w celu oceny wydzielania insuliny i/lub lucyferazy Gausia.
  3. Przygotować roztwór podstawowy coelenterazine (CTZ) w następujący sposób. Przygotować zakwaszony metanol, dodając 106 μl stężonego HCl do 10 ml metanolu. Następnie rozpuścić liofilizowany CTZ w zakwaszonym metanolu w stężeniu 1 mg/ml i przechowywać w temperaturze -80 °C w zakrętkach.
    UWAGA: Zapasy te zachowują wystarczającą aktywność w rutynowych testach lucyferazy, nawet po 1 roku prawidłowego przechowywania.
  4. Przygotuj bufor testowy lucyferazy Gaussia (GLuc) w oparciu o literaturę9, a także informacje patentowe10, aby pomóc w okresie półtrwania testu lucyferazy Gaussia w formacie płytki 96-dołkowej. Użyj wzoru: 25 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA, 5% glicerol, 1 mg/ml Na2PO4, 300 mM askorbinian sodu, 200 mM Na2SO3 w wodzie. Zamrażać zapasy w temperaturze -20 °C. Po rozmrożeniu przechowywać bufor w temperaturze 4 °C.
  5. Aby przygotować roztwór roboczy lucyferazy Gaussa, dodać 4,2 μl/ml roztworu podstawowego CTZ o stężeniu 1 mg/ml (2,36 mM) do buforu do oznaczania GLuc. W ten sposób powstaje 2x roztwór roboczy 10 μM CTZ, który będzie miał końcowe stężenie 5 μM w teście.

2. Hodowla komórek InsGLuc MIN6 i wysiewanie do testów wydzielania

  1. Aby wyhodować komórki MIN6, trypsynizuj i wysiewaj komórki raz w tygodniu przy użyciu standardowych technik hodowli komórkowych. Zmieniaj pochodne w komórkach co dwa do trzech dni. Dołącz odpowiednio dobrany antybiotyk, taki jak 250 μg/ml G418 w pożywce.
    1. Aby zapewnić wystarczającą liczbę komórek tygodniowo do eksperymentów, należy utrzymywać komórki w kolbach T75. Wysiew 6 x 106 komórek na T75 w 10 ml pożywki zwykle daje 30 x 106 do 40 x 106 komórek na T75 po 7 dniach hodowli.
  2. Aby przygotować komórki do posiewu na 96-dołkowe płytki, należy dwukrotnie przemyć zlewający się T75 komórek InsGLuc MIN6 PBS i dodać 2 ml trypsyny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez ~5 minut lub do momentu, gdy komórki oddzielą się od kolby. Określ stężenie komórek na mililitr.
    1. Rozcieńczyć komórki w kompletnej pożywce do 1 x 106 komórek/ml, aby uzyskać 1 x 105 komórek w 100 μl na dołek na płytce 96-dołkowej. Komórki powinny być wystarczająco zlewające się do testu po 3–4 dniach.
      UWAGA: Aby przedłużyć okres hodowli, można posiać połowę stężenia komórek. Zmiany pożywki nie są wymagane przed dniem testu, chyba że komórki mają zostać poddane obróbce doświadczalnej.

3. Test wydzielania lucyferazy Gaussia stymulowany glukozą

  1. W dniu testu należy przygotować wystarczającą ilość KRBH do przeprowadzenia eksperymentu (krok 1.2). Wymagane jest co najmniej 50 ml KRBH na płytkę 96-dołkową, dlatego należy przygotować co najmniej 75 ml, aby zapewnić wystarczający bufor do eksperymentu. Należy przygotować dodatkowy bufor, jeśli różne kombinacje warunków leczenia farmakologicznego będą wymagały KRBH do rozcieńczenia.
  2. Przygotuj zbiornik z KRBH bez glukozy. Zdekantować pożywkę z 96-dołkowej płytki (płytek), szybko odwracając płytkę nad zlewem laboratoryjnym, a następnie mocno osuszyć na stosie ręczników papierowych, aby usunąć nadmiar pożywki.
  3. Używając pipety elektronicznej lub ręcznej 8-kanałowej, odpipetuj 100 μl/studzienka KRBH ze zbiornika przez 96-dołkową płytkę. Powtórz w sumie dwa prania.
  4. (Fakultatywny etap leczenia ostrego związku) Jeśli nie wykonujesz leczenia farmakologicznego, postępuj zgodnie z krokami 3.5 i 3.6 bez modyfikacji. Aby przetestować wpływ małych cząsteczek na wydzielanie insuliny, związki mogą być dodawane do komórek w okresie preinkubacji, okresie stymulacji lub w obu tych okresach.
    1. Jedną z technik jest dodawanie związków w partii do KRBH w probówkach o pojemności 1,5 ml i użycie regulowanej 8-kanałowej pipety cyfrowej do przeniesienia leku-KRBH z probówek do komórek w 96-dołkowych płytkach.
      UWAGA: Jeśli pipeta regulowana nie jest dostępna, można wykonać replikę 96-dołkowej płytki leku-KRBH, a do transferu buforu można użyć standardowej pipety 8-kanałowej. Dalsze modyfikacje paradygmatu leczenia można wprowadzić w celu traktowania komórek przez 24 godziny w pożywce przed testem, jak opisano wcześniej1,8.
  5. Dodać 100 μl KRBH zawierającego pożądane stężenie glukozy lub związków i umieścić naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1 h.
    UWAGA: W zależności od układu eksperymentalnego, niezwykle pomocne jest posiadanie elektronicznej pipety wielokanałowej, która umożliwia przejście odległości kanałów od kolumny ośmiu probówek o pojemności 1,5 ml do 8 rzędów płytki 96-dołkowej.
  6. Po 1 godzinie wstępnej inkubacji zdekantować bufor do zlewu i mocno osuszyć na ręczniku papierowym. Dodaj 100 μl bezglukozowego KRBH do dołka, aby zmyć nagromadzone tło lucyferazy Gaussa. Ponownie zdekantować płytkę i dodać do niej warunki kontrolne i stymulujące w ilości 100 μl na studzienkę. Umieść naczynie w inkubatorze w temperaturze 37°C na 1 godzinę.
  7. Ostrożnie zebrać 50 μl supernatantu za pomocą pipety wielokanałowej, w razie potrzeby zmieniając końcówki między warunkami obróbki, i przenieść supernatant na czystą, nieprzezroczystą, białą, 96-dołkową płytkę testową.
    UWAGA: W razie potrzeby można użyć płyt o przezroczystych ściankach o białych ściankach, chociaż znaczna ilość sygnału lucyferazy zostanie utracona.
  8. Po pobraniu 50 μl supernatantu KRBH próbkę można natychmiast oznaczyć. W razie potrzeby należy zapieczętować i przechowywać próbki w temperaturze 4 °C przez kilka dni (okres półtrwania aktywności GLuc ~6 dni) lub -20 °C przez okres do jednego miesiąca11,12.

4. Test lucyferazy wydzielanej Gaussia

  1. Aby przygotować roztwór roboczy do oznaczania GLuc, należy odpipetować wymaganą ilość roztworu podstawowego CTZ (4,2 μL/ml) do buforu do testu GLuc. Aby zapobiec podgrzaniu CTZ, należy szybko odpipetować CTZ w zamrażarce o temperaturze -80 °C lub trzymać probówkę na suchym lodzie.
  2. Za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej szybko dodaj 50 μl roztworu roboczego do testu GLuc na studzienkę przez 96-dołkową szalkę zawierającą zebrane supernatanty KRBH. Jeśli po bokach studzienek znajdują się kropelki, krótko obróć płytkę w wirówce stołowej z wiadrem wahadłowym.
  3. Odczytaj luminescencję w odpowiednim czytniku płytek w ciągu kilku minut i odczytaj każdą studzienkę z czasem całkowania 0,1 s.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby ocenić wydajność testu w warunkach kontrolnych, można sporządzić prostą krzywą odpowiedziami na dawkę glukozy lub przeprowadzić stymulację zgodnie z paradygmatem diazoksydu. W pierwszym przypadku inkubacja wstępna komórek przez 1 h w warunkach bezglukozowych, a następnie traktowanie przez 1 h rosnącymi stężeniami glukozy, powinna skutkować bardzo niską aktywnością wydzielniczą przy stężeniu 5 mM i poniżej, podczas gdy zwiększone wydzielanie obserwuje się powyżej 8 mM glukozy (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym artykule przedstawiono metodę szybkiej oceny stymulowanych glukozą odpowiedzi komórek β na wydzielanie insuliny przez komórki MIN6. Aby uzyskać najlepsze odpowiedzi w teście, ważne jest, aby wysiać komórki MIN6 o odpowiedniej gęstości i pozwolić im na zlewanie się w 85-95%. Poprawia to β odpowiedzi komórek na glukozę ze względu na poprawę kontaktów komórka-komórka i synchronizacji, która występuje zarówno w pierwotnych wyspach trzustkowych 17,18,19,20,21, jak i komórkach MIN6

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują wszystkim obecnym i byłym członkom laboratorium Cobba za cenną pracę i dyskusje, a Dionne Ware za pomoc administracyjną. Michael Kalwat jest wspierany przez Fundację Badań nad Cukrzycą Nieletnich-2019-702-Q-R. Praca ta była możliwa dzięki DK34128 NIH R37 i grantowi I1243 Fundacji Welch dla Melanie Cobb. Wczesne części tej pracy były również wspierane przez NIH F32 DK100113 dla Michaela Kalwata.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały do hodowli komórkowych
rIns-GLuc stabilne komórkiRodzicielska linia komórkowa MIN6 stabilnie eksprymująca pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc i utrzymywana w 250 ug/ml G418
DMEMSigmaD64294,5 g/l pożywka glukozowa
płodowa surowica bydlęca, inaktywowana termicznieSigmaF4135
Penicylina/ StreptomycynaThermo-Fisher ScientificSV30010
beta-merkaptoetanolThermo-Fisher ScientificBP 176-100
glutaminaThermo-Fisher ScientificBP379-100
Trypsin-EDTASigmaT3924-500
G418Gold BiotechnologyG418-10Roztwór podstawowy 250 mg/ml w wodzie. Zamroź podwielokrotności w temperaturze -20C.
Kolby do hodowli tkankowych T75Fisher Scientific07-202-000
96-dołkowe płytki do hodowli tkankowychCelltreat229196
Zbiorniki na odczynniki (50 ml)Corning4870
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki do oznaczania wydzielania
BSA (klasa RIA)Thermo-Fisher Scientific50-146-952
D-(+)-GlucoseSigmaG8270-1KG
KClThermo-Fisher ScientificP217-500
NaClThermo-Fisher ScientificS271-3
Hepes, pH 7,4Thermo-Fisher Scientific50-213-365
NaHCO3Thermo-Fisher Scientific15568414
MgCl2Thermo-Fisher ScientificM9272-500G
CaCl2SigmaC-7902
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Opcjonalne leki do eksperymentów stymulacyjnych
DiazoxideSigmaD9035Roztwór podstawowy: 50 mM w 0,1N NaOH. Dodać równą ilość 0,1 N HCl do dowolnego buforu, do którego dodaje się diazoksyd.
epinefryna (sól dwuwinianowa)SigmaE4375Roztwór podstawowy: 5 mM w wodzie
PMA (12-mirystynian forbolu)SigmaP1585Roztwór podstawowy: 100 &mikro; M w DMSO
silny>Nazwa<silny>FirmaNumer katalogowyUwagi
>Guassia materiały testowe
Fosforan disodowy (Na2HPO4)Thermo-Fisher ScientificS374-500
GlicerolThermo-Fisher ScientificG334
Bromek soduThermo-Fisher ScientificAC44680-1000
EDTAThermo-Fisher ScientificAC44608-5000Roztwór podstawowy: 0,5 M pH 8
Tris baseRPIT60040-1000.0Roztwór podstawowy: 1 M pH 8
Kwas askorbinowyFisher ScientificAAA1775922Amerykański patent US7718389 sugerował, że askorbinian może zwiększać stabilność celendrazyny.
Na2SO3SigmaS0505-250GSugerowany US8367357 patentowy USA siarczyn może zmniejszać tło z powodu BSA
Coelenterazine (natywny)Nanolight / Prolume3035MGRoztwór podstawowy: 1 mg / ml w zakwaszonym MeOH (2,36 mM)
OptiPlate-96, biała nieprzezroczysta 96-dołkowa mikropłytkaPerkin Elmer6005290Każda nieprzezroczysta biała płytka 96-dołkowa powinna wystarczyć. Przezroczyste płyty dolne również będą działać, jednak część sygnału zostanie utracona.
NazwaFirma>Numer katalogowyKomentarze
Equipment
Synergy H1 Hybrydowy czytnik płytek lub równoważnyBioTek8041000Wymagany jest czytnik płytek z detekcją luminescencji i możliwością stosowania płytek 96-dołkowych.
Pipeta 8-kanałowa VOYAGER (50-1250 µ L)Integra4724Automatyczna pipeta wielokanałowa jest niezwykle przydatna do szybkiego dodawania odczynników lucyferazy i komórek galwanicznych w formacie 96-dołkowym
8-kanałowym 200 &mikro; Pipeta LTransferpette S 20-200 µ L2703710
MIN6 <

Bibliografia

  1. Kalwat, M. A., et al. Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways. ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).
  2. Burns, S. M., et al. High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function. Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).
  3. Rajan, S., et al. In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).
  4. Watkins, S., et al. Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide. Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).
  5. Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence. Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).
  6. Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo. Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).
  7. Compounds and methods for regulating insulin secretion. World patent. , WO2018175324A1 (2018).
  8. Kalwat, M. A., et al. Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells. Journal of General Physiology. , (2018).
  9. Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15 (1), 14(2014).
  10. Ohmiya, Y., Wu, C. Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity. U.S. Patent. , 7,718,389 B2 (2010).
  11. Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).
  12. Wurdinger, T., et al. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes. Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).
  13. Henquin, J. C. Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose. Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).
  14. Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification. Molecular & Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).
  15. Straub, S. G., Sharp, G. W. Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).
  16. Cheng, K., et al. High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation. PLoS One. 7 (7), e40868(2012).
  17. Head, W. S., et al. Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious. Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).
  18. Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet. The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).
  19. Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129 (2), 359-370 (2007).
  20. Jaques, F., et al. Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion. Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).
  21. Calabrese, A., et al. Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells. Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).
  22. Bielefeld-Sevigny, M. AlphaLISA immunoassay platform- the "no-wash" high-throughput alternative to ELISA. Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).
  23. Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
  24. Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles. Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835(2018).
  25. Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion. Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).
  26. Frank, J. A., et al. Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release. Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).
  27. Zhu, S., et al. Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test lucyferazykom rki betalucyferaza GaussiaC peptydpipeta wielokana owaczytnik p ytek luminescencyjnychstymulacja glukozparadygmat diazoksydowyELISA oparta na przeciwcia ach
Pomiar względnego wydzielania insuliny za pomocą współwydzielanego surogatu lucyferazy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.